CN116814523B - 一种穿刺组织的消化处理方案 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种穿刺组织的消化处理方案，包括组织的分离和悬浮、组织的酶消化、消化液的过滤和初步离心、去除红细胞、再次离心、清洗细胞团、丢弃上清和重复清洗和鉴定，本发明通过各种消化酶的组合方案，处理成可以达到单细胞文库上机标准的单细胞悬液，高效的单细胞分离、高纯度的细胞悬液、保留细胞活性以及低样本消耗，有效从有限的穿刺样品中分离出足够数量的单个细胞或小块细胞团，满足下游应用需求，温和的分离条件和多重清洗，可以最大限度保留细胞的活性，并且通过分离设备，有效分离消化液中的小块细胞团，同时最大限度保留细胞的活性，并去除多余的基质，获得高纯度准备用于下游应用的细胞悬液和油包细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，更具体地说，涉及一种穿刺组织的消化处理方案。
背景技术
穿刺组织的消化处理是一种将组织分离成单个细胞或细胞群的常见方法。其基本步骤包括组织预处理、消化酶选择和消化条件优化、细胞分离和纯化，以及细胞培养等。通过这些步骤，可以得到较为纯净的细胞群，用于后续的细胞学研究。
组织穿刺，是临床项目中常使用的一种检测手段，但是受制于样品量少，容错率低，对其处理方式尤为重要，针对单细胞测序需要的细胞悬液，穿刺样品为珍贵样品，同时不能对患者穿刺更多量，避免导致医疗事故，穿刺样品如果需要做下游的单细胞测序分析，就需要更高的成功率以及更稳定的单细胞悬液消化方案，而目前的方案成功率低，只做单细胞悬液需要大量样品，穿刺样品处理失败率高。
因此，针对上述技术问题，有必要提供一种穿刺组织的消化处理方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种穿刺组织的消化处理方案，以解决上述的问题。
为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
一种穿刺组织的消化处理方案，包括以下步骤：
S1：组织的分离和悬浮：将组织取出并放入培养皿中，滴加2-3滴DMEM以保持组织湿润，使用刀片切碎；
S2：组织的酶消化：将切碎的组织转移到50mL离心管中，加入预热的胶原酶二型和1mL的Dispase混合液，充分混匀后置于摇床上进行消化；
S3：消化液的过滤和初步离心：待消化完全后，将消化液通过70um再过40um的筛网倒入分离设备过滤到新的50mL离心管中，将过滤后的清液立即置于冰上，进行400g离心5分钟；
S4：去除红细胞：观察细胞是否离心到管底，缓慢倒掉上清，用5mL的RBC Lysisbuffer重悬沉淀，用常规口径枪头充分混匀；
S5：再次离心：将细胞悬液置于冰上裂解，进行300g离心5分钟，观察细胞是否离心到管底；
S6：清洗细胞团：缓慢吸掉上清，用0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团，充分吹散后进行300g离心5分钟；
S7：丢弃上清：观察细胞是否离心到管底，缓慢吸取上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀细胞团块；
S8：重复清洗和鉴定：重复S6-S7步骤清洗细胞悬液，使用aopi试剂测定细胞活性，准备用于包封细胞的油滴，以制备10倍体积的油包水。
作为本发明的进一步改进，所述S2中摇床的温度设置为35-39℃，工作时间设置为30-50min。
作为本发明的进一步改进，所述S3中分离设备包括分离釜，所述分离釜底端固定连接有多个支撑柱，且分离釜底端安装有磁场传感器，所述分离釜外包围设置有多个均匀分布的固定环，多个所述固定环呈垂直等距分布，且多个所述固定环靠近分离釜一端均固定连接有多个均匀分布的固定杆，所述固定杆与分离釜外端固定连接。
作为本发明的进一步改进，所述固定环内安装有线圈，所述分离釜顶端安装有密封盖，所述密封盖顶端固定连接有放置盒，所述放置盒内安装有多个磁珠。
作为本发明的进一步改进，所述磁珠由磁粉、防护壳和吸附块构成，所述磁粉设置在防护壳内，所述防护壳外包围安装有多个均匀分布的吸附块。
作为本发明的进一步改进，所述磁粉的材质采用纳米级铁磁材料，所述防护壳的材质采用聚合物材料，所述吸附块的材质采用硅基树脂材料和聚氨酯材料任意一种或多种。
作为本发明的进一步改进，所述S5中将细胞悬液置于冰上裂解的时间设置为5-7min。
作为本发明的进一步改进，所述S6中0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团的容量设置为3-7mL。
作为本发明的进一步改进，所述S7中吸取上清并丢弃的容量设置为2.5-4.5mL。
作为本发明的进一步改进，所述S8中使用aopi测定细胞活性具体操作步骤包括：
S81：取一定量的细胞悬液，加入适量的aopi染液，充分混合；
S82：将混合液滴在载玻片上，用盖玻片盖住，并排除气泡；
S83：在荧光显微镜下观察细胞，存活的细胞呈绿色荧光，死亡的细胞呈橙红色荧光；
S84：计算存活率，将绿色荧光的细胞数除以所有细胞数，即可得到细胞的存活率。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本方案提出的一种穿刺组织的消化处理方案，通过各种消化酶的组合方案，处理成可以达到单细胞文库上机标准的单细胞悬液，高效的单细胞分离、高纯度的细胞悬液、保留细胞活性以及低样本消耗，有效从有限的穿刺样品中分离出足够数量的单个细胞或小块细胞团，满足下游应用需求，温和的分离条件和多重清洗，可以最大限度保留细胞的活性，并且通过分离设备，有效分离消化液中的小块细胞团，同时最大限度保留细胞的活性，并去除多余的基质，获得高纯度准备用于下游应用的细胞悬液和油包细胞。
附图说明
图1为本发明的一种穿刺组织的消化处理方案流程示意图；
图2为本发明的分离设备立体结构示意图；
图3为本发明的磁珠正面剖视结构示意图；
图4为本发明的磁珠吸附过程示意图；
图5为本发明的分离设备流程示意图。
图中标号说明：
1、分离釜；3、磁珠；11、支撑柱；12、固定环；13、固定杆；21、密封盖；22、放置盒；31、磁粉；32、防护壳；33、吸附块。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
请参阅图1，一种穿刺组织的消化处理方案，包括以下步骤：
S1：组织的分离和悬浮：将组织取出并放入培养皿中，滴加2-3滴DMEM以保持组织湿润，使用刀片切碎；
S2：组织的酶消化：将切碎的组织转移到50mL离心管中，加入预热的胶原酶二型和1mL的Dispase混合液，充分混匀后置于摇床上进行消化；
S3：消化液的过滤和初步离心：待消化完全后，将消化液通过70um再过40um的筛网倒入分离设备过滤到新的50mL离心管中，将过滤后的清液立即置于冰上，进行400g离心5分钟；
S4：去除红细胞：观察细胞是否离心到管底，缓慢倒掉上清，用5mL的RBC Lysisbuffer重悬沉淀，用常规口径枪头充分混匀；
S5：再次离心：将细胞悬液置于冰上裂解，进行300g离心5分钟，观察细胞是否离心到管底；
S6：清洗细胞团：缓慢吸掉上清，用0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团，充分吹散后进行300g离心5分钟；
S7：丢弃上清：观察细胞是否离心到管底，缓慢吸取上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀细胞团块；
S8：重复清洗和鉴定：重复S6-S7步骤清洗细胞悬液，使用aopi试剂测定细胞活性，准备用于包封细胞的油滴，以制备10倍体积的油包水。
S2中摇床的温度设置为35-39℃，工作时间设置为30-50min，S5中将细胞悬液置于冰上裂解的时间设置为5-7min，S6中0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团的容量设置为3-7mL，S7中吸取上清并丢弃的容量设置为2.5-4.5mL，S8中使用aopi测定细胞活性具体操作步骤包括：
S81：取一定量的细胞悬液，加入适量的aopi染液，充分混合；
S82：将混合液滴在载玻片上，用盖玻片盖住，并排除气泡；
S83：在荧光显微镜下观察细胞，存活的细胞呈绿色荧光，死亡的细胞呈橙红色荧光；
S84：计算存活率，将绿色荧光的细胞数除以所有细胞数，即可得到细胞的存活率。
其中，首先，将穿刺组织取出并放入培养皿中，滴加2-3滴DMEM以保持组织湿润，使用刀片切碎，接着，将切碎的组织转移到50mL离心管中，加入预热的胶原酶二型和1mL的Dispase混合液，充分混匀后置于摇床上进行消化。消化液通过70um再过40um的筛网倒入分离设备过滤到新的50mL离心管中，将过滤后的清液立即置于冰上，进行400g离心5分钟，以分离细胞。
观察细胞是否离心到管底，缓慢倒掉上清液，用5mL的RBC Lysis buffer重悬沉淀，用常规口径枪头充分混匀。将细胞悬液置于冰上裂解7min，进行300g离心5分钟，观察细胞是否离心到管底。缓慢吸掉上清液，用5ml的0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团，充分吹散后进行300g离心5分钟，观察细胞是否离心到管底，缓慢吸取3.5ml上清液并丢弃，用常规口径枪头充分混匀细胞团块。
重复S6-S7步骤清洗细胞悬液，以彻底去除残留的红细胞溶解液和洗涤缓冲液，并保证细胞悬液的纯度和活性，最终用aopi测定细胞活性，在aopi测定细胞活性时，取一定量的细胞悬液，加入适量的aopi染液，充分混合。将混合液滴在载玻片上，用盖玻片盖住，并排除气泡。在荧光显微镜下观察细胞，存活的细胞呈绿色荧光，死亡的细胞呈橙红色荧光。计算存活率时，将绿色荧光的细胞数除以所有细胞数，即可得到细胞的存活率。
最后，准备用于包封细胞的油滴，以制备10倍体积的油包水，方便后续操作和观察，将细胞悬液与10倍体积的油滴混合，充分混合后形成油包水，然后进行细胞计数、显微镜观察和细胞培养。
请参阅图2-5，S3中分离设备包括分离釜1，分离釜1底端固定连接有多个支撑柱11，且分离釜1底端安装有磁场传感器，分离釜1外包围设置有多个均匀分布的固定环12，多个固定环12呈垂直等距分布，且多个固定环12靠近分离釜1一端均固定连接有多个均匀分布的固定杆13，固定杆13与分离釜1外端固定连接，固定环12内安装有线圈，分离釜1顶端安装有密封盖21，密封盖21顶端固定连接有放置盒22。
放置盒22内安装有多个磁珠3，磁珠3由磁粉31、防护壳32和吸附块33构成，磁粉31设置在防护壳32内，防护壳32外包围安装有多个均匀分布的吸附块33，磁粉31的材质采用纳米级铁磁材料，防护壳32的材质采用聚合物材料，吸附块33的材质采用硅基树脂材料和聚氨酯材料任意一种或多种。
其中，在S3中经过Dispase酶的作用，组织已经被消化成小块细胞团，在将消化液通过70um再过40um的筛网过滤后，虽然可以去除较大的组织团块，但仍然可能存在一些小块的组织或细胞团块，通过将倒入到分离釜1内，完成后开启多个固定环12上安装的线圈，从而可以产生多方向磁场，后续再将放置盒22内安装的多个磁珠3放置在分离釜1内。
通过磁粉31的材质采用纳米级铁磁材料，防护壳32的材质采用聚合物材料，吸附块33的材质采用硅基树脂材料和聚氨酯材料任意一种或多种，通过多方向磁场对磁粉31产生的磁力，使得多个磁珠3在分离釜1内的消化液中随机运动，在运动的过程中，通过吸附块33提供特定的化学特性，硅基树脂和聚氨酯都具有亲水性，可以与细胞表面存在的多酰胺和糖蛋白相互作用，且硅基树脂和聚氨酯的三维网络结构可诱导细胞附着，利于吸附块33与细胞团块结合。
在结合完成后，磁珠3与细胞团结合成沉降体，由于增加重量和表面磁性减弱，其响应磁力的能力会降低，使得磁珠3与细胞结合后的复合体，逐渐聚集到容器的底部，再通过分离釜1底部安装的磁场传感器检测沉降后分离液中整体磁滞的降低，磁珠3与细胞结合后，整体磁性减弱，可通过磁场变化推断吸附进展，从而有效分离消化液中的小块细胞团，同时最大限度保留细胞的活性，并去除多余的基质，获得高纯度准备用于下游应用的细胞悬液和油包细胞。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：包括以下步骤：
S1：组织的分离和悬浮：将组织取出并放入培养皿中，滴加2-3滴DMEM以保持组织湿润，使用刀片切碎；
S2：组织的酶消化：将切碎的组织转移到50mL离心管中，加入预热的胶原酶二型和1mL的Dispase混合液，充分混匀后置于摇床上进行消化；
S3：消化液的过滤和初步离心：待消化完全后，将消化液通过70um再过40um的筛网倒入分离设备过滤到新的50mL离心管中，将过滤后的清液立即置于冰上，进行400g离心5分钟；
S4：去除红细胞：观察细胞是否离心到管底，缓慢倒掉上清，用5mL的RBC Lysis buffer重悬沉淀，用常规口径枪头充分混匀；
S5：再次离心：将细胞悬液置于冰上裂解，进行300g离心5分钟，观察细胞是否离心到管底；
S6：清洗细胞团：缓慢吸掉上清，用0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团，充分吹散后进行300g离心5分钟；
S7：丢弃上清：观察细胞是否离心到管底，缓慢吸取上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀细胞团块；
S8：重复清洗和鉴定：重复S6-S7步骤清洗细胞悬液，使用aopi试剂测定细胞活性，准备用于包封细胞的油滴，以制备10倍体积的油包水；
所述S3中分离设备包括分离釜(1)，所述分离釜(1)底端固定连接有多个支撑柱(11)，且分离釜(1)底端安装有磁场传感器，所述分离釜(1)外包围设置有多个均匀分布的固定环(12)，多个所述固定环(12)呈垂直等距分布，且多个所述固定环(12)靠近分离釜(1)一端均固定连接有多个均匀分布的固定杆(13)，所述固定杆(13)与分离釜(1)外端固定连接，所述固定环(12)内安装有线圈，所述分离釜(1)顶端安装有密封盖(21)，所述密封盖(21)顶端固定连接有放置盒(22)，所述放置盒(22)内安装有多个磁珠(3)，所述磁珠(3)由磁粉(31)、防护壳(32)和吸附块(33)构成，所述磁粉(31)设置在防护壳(32)内，所述防护壳(32)外包围安装有多个均匀分布的吸附块(33)；所述磁粉(31)的材质采用纳米级铁磁材料，所述防护壳(32)的材质采用聚合物材料，所述吸附块(33)的材质采用硅基树脂材料和聚氨酯材料任意一种或多种；
在开启多个固定环(12)上安装的线圈时可以产生多方向磁场，将放置盒(22)内安装的多个磁珠(3)放置在分离釜(1)内，通过多方向磁场对磁粉(31)产生的磁力，使得多个磁珠(3)在分离釜(1)内的消化液中随机运动，在运动的过程中通过吸附块(33)提供特定的化学特性，可以与细胞表面存在的多酰胺和糖蛋白相互作用，且硅基树脂和聚氨酯的三维网络结构可诱导细胞附着，使其吸附块(33)与细胞团块结合，磁珠(3)与细胞团结合成沉降体，由于增加重量和表面磁性减弱，其响应磁力的能力会降低，使得磁珠(3)与细胞结合后的复合体，逐渐聚集到容器的底部，再通过分离釜(1)底部安装的磁场传感器检测沉降后分离液中整体磁滞的降低。
2.根据权利要求1所述的一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：所述S2中摇床的温度设置为35-39℃，工作时间设置为30-50min。
3.根据权利要求1所述的一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：所述S5中将细胞悬液置于冰上裂解的时间设置为5-7min。
4.根据权利要求1所述的一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：所述S6中0.1％BSA的PBST溶液重悬细胞团的容量设置为3-7mL。
5.根据权利要求1所述的一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：所述S7中吸取上清并丢弃的容量设置为2.5-4.5mL。
6.根据权利要求1所述的一种穿刺组织的消化处理方案，其特征在于：所述S8中使用aopi测定细胞活性具体操作步骤包括：
S81：取一定量的细胞悬液，加入适量的aopi染液，充分混合；
S82：将混合液滴在载玻片上，用盖玻片盖住，并排除气泡；
S83：在荧光显微镜下观察细胞，存活的细胞呈绿色荧光，死亡的细胞呈橙红色荧光；
S84：计算存活率，将绿色荧光的细胞数除以所有细胞数，即可得到细胞的存活率。
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