CN114181926B - 一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞分离的方法及其应用 - Google Patents
一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞分离的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于现有技术方法。这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，拿到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞单细胞悬液的制备方法及其应用。
背景技术
单细胞测序技术自问世以来，对生命科学研究产生了颠覆式的影响，革新了众多领域的研究范式与基本方法，如免疫生物学、肿瘤生物学、发育生物学等。在脑科学研究中，单细胞测序对解析神经元在特定生理、病理状态下的功能，鉴别不同细胞在发育或疾病进展中的作用带来了详尽的数据，揭示了深刻的分子机理机制，也已成为脑科学研究中最强有力的技术手段。其流程包括四个操作步骤：样本制备、单细胞分离、测序、数据分析。其中样本制备是最为关键的第一步，其质量决定了后续操作的成败。
目前，脑科学研究中小鼠是最为常用的模式动物，但不同时期的小鼠脑组织结构复杂，脑组织在样本制备过程中存在诸多问题，如细胞活率低、纯度低、部分细胞无法获得等，极大的限制了单细胞测序技术的应用，对结果的可靠性产生了很大影响，如《Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/NeuronMyelinating Co-Cultures from Post-Natal Murine Tissues》一文中对小鼠脑组织的解离方法。仅适用于新生鼠1-7天的脑组织细胞分离，对中年、老年鼠脑组织细胞分离则会出现细胞数量极少、结团率高等问题，无法应用于中年、老年鼠脑组织。而《PharmacologicalInhibition ofMitochondrial Carbonic Anhydrases Protects Mouse CerebralPericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress andApoptosis》文献报道的制备单细胞悬液的方法适用于12周小鼠脑组织的分离，对新生鼠单细胞分离效果不理想，呈现细胞数量及类型均偏少的现象。因此，现有技术中单一的酶解配方，无法适用于任一时期的鼠脑组织单细胞分离。
综上，现有技术对不同时期小鼠的解离结果差异较大。其关键点在于酶解液配方，酶解液配方的变化会改变组织解离的偏好性，而对于单细胞测序来说，解离的偏好性会导致本领域技术人员无法全面的更深层次挖掘数据，无法全面了解脑组织的内在机理。因此，急需一种同时适用于各个发育时期小鼠脑组织的细胞分离方法来解决这一问题，推进脑科学基础科研进程。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于目前现有技术方法(本发明制备的单细胞悬液中活细胞占比为90％-95％、碎片杂质占比为1％～10％、细胞结团占比为1％～5％，现有技术分别对应为80％-90％、10％-20％、1％-10％)。本发明可以使组织分离得到的单细胞数量更多酶解后得率为5×106-7×106，经过优化后的悬液质量更为优质，纯度更高，碎片占比为1％-10％，结团占比为1％-5％，损失更低，优化后细胞数量为3×106～6×106个。对于进行后续单细胞测序研究有着更高的价值，这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，得到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。
本发明提出了一种适用于小鼠脑组织细胞分离的酶解液，包括木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I。
其中，所述酶解液中各组分的浓度为木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL；优选地，为木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I30U/mL。
进一步地，本发明所述酶解液还包括HBSS(含钙镁离子)缓冲液作为酶解缓冲液，钙离子可以增强胶原酶的消化作用，所述缓冲液可以保障胶原酶有着较高的酶活。
所述酶解液组分分别购自木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich,P4762-1G)，胶原酶I(Gibco,17018029)，DNase I(Applichem,A3778-0050)。
其中，所述小鼠脑组织细胞任选任一时期小鼠脑组织细胞。
本发明还提出了所述酶解液在小鼠脑组织细胞分离中的应用。
本发明还提出了一种小鼠脑组织细胞分离的方法，具体包括以下步骤：
(1)配制酶解液：将木瓜蛋白酶，胶原酶I和DNase I同时加入HBSS缓冲液中配制酶解液，然后经过滤膜过滤后使用。
(2)组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面，冲洗去除沾染的血液。
(3)组织酶解：将冲洗干净后的组织剪切成小块，加入所述步骤(1)配制的酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触。
(4)辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液以帮助细胞释放到悬液中。
(5)染色镜检：染色镜检并计算酶解后细胞数量和细胞活率。
(6)筛网过滤：使用细胞筛网过滤酶解液，滤液离心富集细胞。
(7)碎片去除：使用细胞碎片去除溶液(Debris removal solution)，并按照相关SOP操作去除悬液中的杂质。
(8)红细胞裂解：使用红细胞裂解液进行红细胞裂解。
(9)细胞洗涤：DPBS洗涤细胞，以去除环境RNA，得到鼠脑组织细胞。
在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：
(1)配制酶解液：木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I同时加入HBSS缓冲液中配制酶解液，然后经过滤膜过滤后使用。
(2)组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面，尽可能冲洗去除沾染的血液。
(3)组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触。
(4)辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
(5)染色镜检：染色镜检并计算酶解后细胞数量和细胞活率。
(6)筛网过滤：使用细胞筛网过滤酶解液，滤液离心富集细胞。
(7)碎片去除：使用细胞碎片去除溶液，并按照相关SOP操作去除悬液中的杂质。
(8)红细胞裂解：使用红细胞裂解液进行红细胞裂解。
(9)细胞洗涤：DPBS洗涤细胞，以去除环境RNA。
(10)结果质检：使用Qubit4.0测量步骤9中洗涤上清液中环境RNA的浓度。使用含有BSA的DPBS重悬细胞，调整细胞浓度。AO/PI双染计算细胞活率、碎片占比、结团占比。
步骤1中，所述木瓜蛋白酶、胶原酶I、DNase I、HBSS缓冲液分别购自木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich,P4762-1G)，胶原酶I(Gibco,17018029)，DNase I(Applichem,A3778-0050)，HBSS缓冲液(Gibco,14065056)。
步骤1中，所述木瓜蛋白酶的浓度为10～20U/mL，胶原酶的浓度为I0.1～0.2％(m/v)，DNase I的浓度为30～75U/mL；优选地，为木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。
步骤1中，过滤酶解液用滤膜规格为0.22μm(Millipore,SLGPR33RB)。
步骤2中，所述小鼠脑组织为任一时期小鼠脑组织，包括刚出生1天小鼠脑组织、12周小鼠脑组织等。
步骤2中，预冷的DPBS的温度为0～4℃；优选地，为4℃。
步骤2中，预冷的DPBS冲洗组织次数为3～5次；优选地，为5次。
步骤3中，所述酶解液的用量为4～6mL；优选地，为6mL。
步骤3中，所述摇床的转速为90～120rpm；优选地，为90rpm。
步骤3中，所述酶解的温度为30～37℃；优选地，为37℃。
步骤3中，所述酶解的时间为30～45min；优选地，为45min。
步骤4中，所述FBS胎牛血清(Gibco,10099133C)的含量为20％(v/v)。
步骤4中，所述含有FBS胎牛血清的DPBS与酶解液的体积比为1：1。
步骤4中，所用宽口吸管为巴罗克30-0135A11毫升吸管,30-0135A1)，吹打酶解体系10～15次；优选地，为10次。
步骤5中，所述染色的方法为AO/PI双染。
步骤5中，所述镜检的方法为LUNA自动细胞计数仪(luna，L20001)计数。
步骤6中，所用的细胞筛为细胞筛(Corning,352340)，所述筛网的孔径为40μm。
步骤6中，滤液离心富集的条件为水平转子1270-1650rpm、4-6℃、10-15min离心；优选地，为1270rpm、4℃、10min。
步骤7中，所用细胞碎片去除溶液为细胞碎片去除溶液(Miltenyi Biotec,130-109-398)。
步骤8中，红细胞裂解液为(Miltenyi Biotec,170-080-033)，所述红细胞裂解液的添加体积为2～4mL，裂解的温度18-25℃，裂解的时间为1-2min；优选地，红细胞裂解液的体积为4mL，裂解的温度为25℃，裂解的时间为2min。
步骤9中，所述洗涤的条件为10mLDPBS；水平转子1270-1650rpm、4-6℃、10-15min离心；优选地，为1270rpm、4℃、10min。
步骤9中，所述洗涤的次数为2～4次；优选地，为3次。
步骤10中，所述BSA牛血清白蛋白(BSA；MACS,130091376)的含量为1～2％(m/v)；优选地，为1％，此步骤中血清的加入可以维持细胞活性，防止细胞结团。
步骤10中，染色方法为AO/PI双染，镜检方法为LUNA自动细胞计数仪(luna，L20001)计数。
本发明还提供了由上述方法制备得到的小鼠脑组织细胞。
所述小鼠脑组织细胞的活率为90％-95％，碎片占比为1％-10％，结团占比为1％-5％，酶解后细胞数量为5×106-7×106个，经过优化后细胞数量为3×106～6×106个。
本发明还提供了所述小鼠脑组织细胞在单细胞转录组测序中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提出的适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于现有技术方法。本发明可以使组织分离得到的单细胞数量更多酶解后得率为5×106-7×106，经过优化后的悬液质量更为优质，纯度更高，碎片占比为1％-10％，结团占比为1％-5％，细胞数量为3×106～6×106个。对于进行后续单细胞测序研究有着更高的价值。可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，得到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。
附图说明
图1为本发明实施例1最终细胞镜检图片。
图2为本发明实施例2最终细胞镜检图片。
图3为本发明实施例3最终细胞镜检图片。
图4为本发明实施例4最终细胞镜检图片。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
刚出生1天小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/ml，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/ml。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm的摇床中，酶解30min。
4.辅助释放，1:1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4mL红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10mLDPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞两次。
10.使用Qubit4.0测量步骤9中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比，如图1所示。
11.结果：如表10所示。
实施例2
12周小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/ml，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/ml。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解30min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4mL红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10mLDPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞两次。
10.使用Qubit4.0测量步骤9中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比，如图2所示。
11.结果：如表10所示。
实施例3
1天小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.2％(m/v)，DNase I 75U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min.
4.辅助释放：1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液15次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μL预冷的DPBS重悬细胞沉淀，加入4mL红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为2min。
9.细胞洗涤，10ml DPBS、1270rpm、12min、4℃洗涤细胞四次，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞
10.结果质检：使用Qubit4.0测量步骤9中洗涤上清液中环境RNA的浓度。使用含有2％(v/v)BSA的DPBS重悬细胞，调整细胞浓度。AO/PI双染计算细胞活率、碎片占比、结团占比，如图3所示。
11.结果：如表10所示。
实施例4
12周小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.2％(m/v)，DNase I 75U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min.
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液15次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μL预冷的DPBS重悬细胞沉淀，加入4mL红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为2min。
9.细胞洗涤，10mLDPBS、1270rpm、12min、4℃洗涤细胞四次，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞
10.结果质检：使用Qubit4.0测量步骤9中洗涤上清液中环境RNA的浓度。使用含有2％(v/v)BSA的DPBS重悬细胞，调整细胞浓度。AO/PI双染计算细胞活率、碎片占比、结团占比，如图4所示。
11.结果：如表10所示。
对比实施例1
1天小鼠脑解离实验参考<Derivation of Enriched Oligodendrocyte Culturesand Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-Cultures from Post-Natal MurineTissues>，酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数7.结果：见表1。
对比实施例2
12周小鼠脑解离实验参考<Derivation of Enriched OligodendrocyteCultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-Cultures from Post-NatalMurine Tissues>，酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL
1.具体实验步骤与对比实施例1相同。
2.结果：见表1。
对比实施例3
12周小鼠脑解离实验参考<Derivation of Enriched OligodendrocyteCultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-Cultures from Post-NatalMurine Tissues>，酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解1h。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表1。
对比实施例4
12周小鼠脑解离实验参考<Pharmacological Inhibition ofMitochondrialCarbonic Anhydrases Protects Mouse Cerebral Pericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress andApoptosis>，酶解液为胶原酶II0.1％(m/v)、DNA酶I30 U/mL
1.酶解液配置，胶原酶II0.1％(m/v)、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表1。
对比实施例5
1天小鼠脑解离实验参考<Pharmacological Inhibition ofMitochondrialCarbonic Anhydrases Protects Mouse Cerebral Pericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress andApoptosis>，酶解液为胶原酶II0.1％(m/v)、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，胶原酶II0.1％(m/v)、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表1。
对比实施例6
1天小鼠脑解离实验酶解液为0.25％(m/v)胰酶、DNA酶I30 U/mL.
1.酶解液配置，0.25％(m/v)胰酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例7
12周小鼠脑解离实验酶解液为0.25％(m/v)胰酶、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，0.25％(m/v)胰酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例8
1天小鼠脑解离实验酶解液为0.1％(m/v)胶原酶I、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，0.1％胶原酶I、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例9
12周小鼠脑解离实验酶解液为0.1％(m/v)胶原酶I、DNA酶I30 U/mL.
1.酶解液配置，0.1％胶原酶I、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例10
1天小鼠脑解离实验酶解液为0.1％(m/v)胶原酶IV、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，0.1％(m/v)胶原酶IV、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例11
12周小鼠脑解离实验酶解液为0.1％(m/v)胶原酶IV、DNA酶I30 U/mL.
1.酶解液配置，0.1％(m/v)胶原酶IV、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例12
1天小鼠脑解离实验酶解液为10U/mL弹性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，10U/mL弹性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例13
12周小鼠脑解离实验酶解液为10U/mL弹性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，10U/mL弹性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数。
7.结果：见表2。
对比实施例14
1天小鼠脑解离实验酶解液为1U/mL中性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，1U/mL中性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6ml酶解液，至于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表2。
对比实施例15
12周小鼠脑解离实验酶解液为1U/mL中性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。
1.酶解液配置，1U/mL中性蛋白酶、DNA酶I30 U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6ml酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表2。
对比实施例16
1天小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表3。
对比实施例17
12周小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表3。
对比实施例18
1天小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNaseI30U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表3。
对比实施例19
12周小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I30U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶20U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表3。
对比实施例20
1天小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶4U/mL，胶原酶I 0.05％(m/v)，DNaseI10U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶4U/mL，胶原酶I 0.05％(m/v)，DNase I 10U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表4。
对比实施例21
12周小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶4U/mL，胶原酶I 0.05％(m/v)，DNase I10U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶4U/mL，胶原酶I 0.05％(m/v)，DNase I 10U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表4。
对比实施例22
1天小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶30U/mL，胶原酶I 0.25％(m/v)，DNase I125U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶30U/mL，胶原酶I 0.25％(m/v)，DNase I 125U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表4。
对比实施例23
12周小鼠脑解离实验酶解液为木瓜蛋白酶30U/mL，胶原酶I 0.25％(m/v)，DNaseI 125U/mL。
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶30U/mL，胶原酶I 0.25％(m/v)，DNase I 125U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出全脑后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面3次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表4。
对比实施例24
1天小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用30μm细胞筛网(Miltenyi；130-098-458)过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
8.结果:见表4。
对比实施例25
12周小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用30μm细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
8.结果:见表5。
对比实施例26
1天小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用40μm细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
8.结果:见表5。
对比实施例27
12周小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用40μm细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
8.结果:见表5。
对比实施例28
1天小鼠脑组织细胞分离实验，使用低速离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，加入10mL DPBS重悬细胞，560rpm 4℃10min水平离心后，去除上清，加入10mLDPBS重悬细胞，560rpm 4℃10min水平离心，去除上清。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例29
12周小鼠脑组织细胞分离实验，使用低速离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，加入10mL DPBS重悬细胞，560rpm 4℃10min水平离心后，去除上清，加入10mLDPBS重悬细胞，560rpm 4℃10min水平离心，去除上清。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例30
1天小鼠脑组织细胞分离实验，使用30％percoll离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，PercollTM(GE Healthcare 17-0891-01)，制备等渗Percoll(SIP)的储备溶液(9:1Percoll在10x HBSS[-]CaCl2/[-]MgCl2中，Gibco 14185)。在15mL离心管中，使用7mL 1x HBSS悬浮步骤6所得细胞沉淀，加入3mLSIP颠倒混匀，水平离心机300×g、30min、18℃、离心机降速0。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例31
12周小鼠脑组织细胞分离实验，使用30％percoll离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，PercollTM(GE Healthcare 17-0891-01)，制备等渗Percoll(SIP)的储备溶液(9:1Percoll在10x HBSS[-]CaCl2/[-]MgCl2中，Gibco 14185)。在15mL离心管中，使用7mL 1x HBSS悬浮步骤6所得细胞沉淀，加入3mLSIP颠倒混匀，水平离心机300×g、30min、18℃、离心机降速0。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例32
1天小鼠脑组织细胞分离实验，使用30-70％percoll离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，PercollTM(GE Healthcare 17-0891-01)，制备等渗Percoll(SIP)的储备溶液(9:1Percoll在10x HBSS[-]CaCl2/[-]MgCl2中，Gibco 14185)。在新的15mL离心管中，加入3mL 70％SIP(使用1×HBSS稀释)，使用10mL30％SIP(使用1×HBSS稀释)重悬步骤6所得细胞，平铺在3mL 70％SIP上形成密度梯度，水平离心机300×g、30min、18℃、离心机降速0。
8.荧光染色，吸取步骤7离心后的30–70％Percoll梯度中的中间层(4ml界面)，加入DPBS补至5mL后，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果：见表6。
对比实施例33
12周小鼠脑组织细胞分离实验，使用30-70％percoll离心法去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，PercollTM(GE Healthcare 17-0891-01)，制备等渗Percoll(SIP)的储备溶液(9:1Percoll在10x HBSS[-]CaCl2/[-]MgCl2中，Gibco 14185)。在新的15mL离心管中，加入3mL 70％SIP(使用1×HBSS稀释)，使用10mL30％SIP(使用1×HBSS稀释)重悬步骤6所得细胞，平铺在3mL 70％SIP上形成密度梯度，水平离心机300×g、30min、18℃、离心机降速0。
8.荧光染色，吸取步骤7离心后的30–70％Percoll梯度中的中间层(4ml界面)，加入DPBS补至5mL后，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果：见表6。
对比实施例34
1天小鼠脑组织细胞分离实验，使用MACS Debris Removal solution去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，按照MACS Debris Removal solution SOP完成去碎片实验。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例35
12周小鼠脑组织细胞分离实验，使用MACS Debris Removal solution去除碎片
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，按照MACS Debris Removal solution SOP完成去碎片实验。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例36
1天小鼠脑组织细胞分离实验，使用流式细胞仪纯化细胞
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，使用AO/PI进行标记染色，流式细胞仪仅按照荧光分选活细胞，分选后细胞悬液1270rpm、4℃、10min离心富集。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例37
12周小鼠脑组织细胞分离实验，使用流式细胞仪纯化细胞
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，使用AO/PI进行标记染色，流式细胞仪仅按照荧光分选活细胞，分选后细胞悬液1270rpm、4℃、10min离心富集。
8.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤7所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
9.结果，见表6。
对比实施例38
1天小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为30s。
9.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
10.结果，见表7。
对比实施例39
12周小鼠脑组织细胞分离实验
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为30s。
9.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
10.结果，见表7。
对比实施例40
1天小鼠脑组织细胞分离实验，裂红时间3min
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为3min。
9.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
10.结果，见表7。
对比实施例41
12周小鼠脑组织细胞分离实验,裂红时间3min
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为3min。
9.荧光染色，使用5mLDPBS重悬步骤6所得细胞沉淀，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看过筛后细胞的细胞活率以及细胞数量。
10.结果，见表7。
对比实施例42
1天小鼠脑组织细胞分离，洗涤细胞一次上清环境RNA检测
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞1次。
10.使用Qubit4.0测量步骤8中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比。
11.结果：如表8所示。
对比实施例43
12周小鼠脑组织细胞分离，洗涤细胞一次上清环境RNA检测
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞1次。
10.使用Qubit4.0测量步骤8中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比。
11.结果：如表8所示。
对比实施例44
1天小鼠脑组织细胞分离，洗涤细胞一次上清环境RNA检测
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4ml红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞5次。
10.使用Qubit4.0测量步骤8中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比。
11.结果：如表8所示。
对比实施例45
12周小鼠脑组织细胞分离，洗涤细胞一次上清环境RNA检测
1.酶解液配置：木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。HBSS缓冲液(钙离子、镁离子)作为酶解缓冲液酶解，配置后的酶解液经过0.22μm滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠取出脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、毛发、油脂等。
3.组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10次以帮助细胞释放到悬液中。
5.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
6.筛网过滤，使用细胞筛网过滤酶解液。将得到的滤液1270rpm、4℃、10min离心富集。
7.碎片去除，移去步骤6中的上清，按照Debris removal solution的操作流程完成碎片去除操作。
8.红细胞裂解，使用400μLDPBS重悬细胞沉淀，加入4mL红细胞裂解液后混匀，裂解温度25℃，裂解时间为1min。
9.细胞洗涤，10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃洗涤细胞5次。
10.使用Qubit4.0测量步骤8中洗涤上清液中环境RNA的浓度，用含有1％BSA(m/v)的DPBS于冰上保存细胞，AO/PI双染LUNA自动细胞计数仪计算细胞活率、碎片占比、结团占比。
11.结果：如表8所示。
对比实施例46
1周小鼠脑组织细胞分离，具体操作步骤与实施例1相同。
实验结果如表9所示。
对比实施例47
6周小鼠脑组织细胞分离，具体操作步骤与实施例1相同。
实验结果如表9所示。
对比实施例48
小鼠卵巢组织细胞分离
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，解剖小鼠卵巢后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶解液，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表9。
对比实施例49
小鼠皮肤组织细胞分离
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，取小鼠皮肤组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表9。
对比实施例50
人脑组织细胞分离
1.酶解液配置，木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。配置后的酶解液经过滤膜过滤后备用。
2.组织清洗，保护液中取出人脑组织，使用预冷的DPBS冲洗组织表面5次，去除沾染的血液、油脂等。
3.组织酶解，用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入6mL酶，置于37℃、转速为90rpm摇床，酶解45min。
4.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数量。
5.辅助释放，1：1加入含有20％(v/v)FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10-15次以帮助细胞释放到悬液中。
6.荧光染色，AO/PI染色并使用荧光自动细胞计数仪查看细胞活率以及细胞数
7.结果：见表9。
本发明进行了一系列的对比实施例如下表。
表1对比实施例1～5结果
首先选取了<Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures andOligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-Cultures from Post-Natal Murine Tissues>文献中引用的方法进行1天和12周小鼠脑组织进行细胞分离，结果显示仅有木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30 U/mL的酶解液中，可以完成刚出生1天小鼠脑组织的细胞分离实验，分离得到的细胞活性大于90％，杂质占比约40％。但对于12周小鼠脑组织，经过45min酶解后，释放的细胞数量较少，大量的细胞没有通过酶解释放出来。对比实施例3中，使用木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30U/mL的酶解液酶解12周小鼠脑，酶解时间延长至1h，悬液中细胞数量有少量增多，但细胞活率出现明显降低。因此，采用木瓜蛋白酶20U/mL、DNA酶I30U/mL的酶解液无法完成12周小鼠脑组织的细胞分离。对比实施例4中，选取了<PharmacologicalInhibition of Mitochondrial Carbonic Anhydrases Protects Mouse CerebralPericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress and Apoptosis>文献中引用的方法使用胶原酶II 0.1％(m/v)、DNA酶I 30U/ml对12周小鼠脑组织进行细胞分离，经过45min解离，细胞数量达到5×106个，细胞活率85％，杂质占比70％。对比实施例5中，选取了<Pharmacological Inhibition of Mitochondrial Carbonic Anhydrases ProtectsMouse Cerebral Pericytes from High Glucose-Induced Oxidative Stress andApoptosis>文献中引用的方法胶原酶II0.1％(m/v)、DNA酶I 30U/mL对1天小鼠脑组织进行细胞分离，经过45min酶解后，细胞数量4×105个，细胞活率50％，杂质占比大于90％。经过对比实施例1～5，得出木瓜蛋白酶对于鼠脑的细胞分离有着高活率的解离效果，胶原酶II对于鼠脑具有高效的解离效果，但是新生鼠鼠脑在0.1％(m/v)胶原酶II的作用下细胞活率很低，且有极多细胞破碎产生的碎片。对于不同时期的小鼠脑组织构成复杂，需要在酶解液成分中选择温和且水解蛋白位点较多的蛋白酶来更充分的酶解组织，提升酶解出细胞数，并且保障酶解得到细胞的活细胞占比。
表2对比实施例6～15结果
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接下来通过对比实施例6～15，分别验证了更换主要酶解成分为胰酶、胶原酶I、胶原酶IV、弹性蛋白酶、中性蛋白酶对1天、12周小鼠脑进行了细胞分离实验，结果显示0.1％(m/v)胶原酶I对于1天、12周小鼠脑细胞分离过程中都可以得到高活率的细胞悬液，1天小鼠脑解离得到的细胞数为2×106个，12周小鼠脑解离得到的细胞数为4×106个。每只小鼠全脑解离得到细胞数越多，则说明组织得到了更充分的酶解，得到的单细胞悬液继续进行单细胞测序才能有更好的真实性与可靠性。因此接下来本发明尝试对酶解效果比较好的酶进行组合验证。
表3对比实施例16～19结果
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通过对比实施例16～19进行了酶解液成分的组合测试并确定了酶解液的成分，对比实施例16～17结果显示，在缺少DNA酶I的酶解液进行细胞分离时，细胞结团的占比会明显升高，降低了酶解的细胞得率，DNA酶I需要保留在酶解液成分中。对比实施例18中，木瓜蛋白酶、胶原酶I与DNA酶I的组合下，1天小鼠脑经过解离细胞数相较于单个主要成分的酶解液提升至5×106个，细胞活率超过90％；对比实施例19中，12周小鼠脑经过解离细胞数7×106个，细胞活率超过90％，分离效果有着显著的提升。结果表明本专利所提到的酶解液其成分为木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I可以对小鼠脑组织进行细胞分离，且得到的细胞数量更多，活细胞占比更高。
表4对比实施例20～23结果
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接着通过对比实施例20～23行了酶解液成分浓度的验证，结果表明本专利所提到的酶解液其成分的主要浓度范围分别为木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL，且酶解液其主要成分浓度需要在该范围内才能完成小鼠脑组织细胞分离，得到数量多且活率高的细胞悬液。
小鼠脑组织经过酶解后的消化液中存在大量髓鞘、神经元碎片等，40μm筛网过滤仅仅可以去除极少部分体积较大的碎片，更多的碎片仍会通过筛网而保留到悬液中。因此，接下来尝试使用更小孔径的筛网进行过滤验证实验。
表5对比实施例24～27结果
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对比实施例24～27中，对比实施例24～25结果显示缩小筛网的孔径过滤酶解液，无法同时兼顾过滤后细胞得率与特大碎片去除。对比实施例26～27结果显示40μm筛网过滤酶解液可以有着与30μm筛网相差很小的大碎片去除结果，且细胞得率显著提升。本发明中酶解后的悬液选用40μm筛网进行消化液过滤来第一步纯化细胞。对于单细胞转录组测序等技术来说，大于35％杂质占比严重影响数据结果，需要对过滤后得到的酶解滤液进行优化来降低杂质的占比以满足单细胞测序的样本要求。
表6对比实施例28～37结果
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通过对比实施例28～37，分别使用低速离心法优化、30％percoll、30-70％percoll、MACS Debris Removal solution、流式细胞仪进行细胞悬液优化，结果显示MACSDebris Removal solution可以同时兼顾碎片去除效果、细胞回收率、细胞活率，1天与12周的小鼠脑细胞悬液经过MACS Debris Removal solution处理后的细胞悬液碎片率均能控制在15％以下。去除碎片优化后的得到的细胞需要经过红细胞裂解去除组织中残留的红细胞，保障捕获得到的细胞转录本信息中不含有红细胞的信息，可以有效的提高有效数据的占比。
表7对比实施例38～41结果
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通过对比实施例38～41结果显示，裂红时间小于1min时，红细胞裂解不充分，悬液中红细胞占比仍大于15％，残留的红细胞会降低单细胞测序的数据质量；裂红时间大于2min时，会出现细胞活率明显下降，实验失败。因此本专利中的小鼠脑细胞分离以及单细胞悬液优化中裂红时间应在1～2min。红细胞裂解后，裂解的红细胞以及在裂红过程中死亡的细胞其转录本会释放到缓冲液中，也就是环境RNA，环境RNA的存在会使单细胞测序的数据可靠性与真实性降低，洗涤去除环境RNA是利用比重差通过缓冲液漂洗细胞达到目的。
表8对比实施例42～45结果
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结果如对比实施例42～45所示，通过检测缓冲液中RNA含量来判断环境中RNA的含量，结果显示，细胞悬液应通过2～4次10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃的洗涤来去除环境RNA以达到单细胞测序对于样本的要求，最终按照单细胞测序平台对缓冲液的要求，使用含有BSA的DPBS重悬洗涤后的细胞进行单细胞测序实验。
表9对比实施例46～50结果
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最后使用本专利中提出的实验方案分别进行了1周小鼠脑组织的细胞分离实验、6周小鼠脑组织的细胞分离实验、小鼠卵巢组织细胞分离实验与小鼠皮肤组织细胞分离实验以及人脑组织细胞分离实验，结果如对比实施例46～50所示。综上所述，通过对比实施例1～19确定了小鼠脑组织细胞分离酶解液的成分，接下来通过对比实施例20～23确定了酶解液中主要成分的浓度范围，本发明中涉及的一种适用于小鼠脑组织的细胞分离酶解液的配方应为木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I 0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/ml，接着通过对比实施例24～27确定了细胞悬液筛网过滤选择筛网的孔径应为40μm，又通过对比实施例28～37确定了悬液优化过程中去碎片步骤应选择细胞碎片去除溶液来完成，对比实施例38～41得出，红细胞裂解时间应为1～2min，最后通过对比实施例42～45得出，裂红后的单细胞悬液需要通过2～4次10ml DPBS、1270rpm、10min、4℃漂洗细胞去除环境中RNA后得到最终用于单细胞转录组测序实验的细胞悬液。对比实施例46～50为使用本专利中提出的实验方案分别进行了1周小鼠脑组织的细胞分离实验、6周小鼠脑组织的细胞分离实验、小鼠卵巢组织细胞分离实验与小鼠皮肤组织细胞分离实验以及人脑组织细胞分离实验，结果显示本专利提出的实验方案无法完成除小鼠脑组织外的细胞分离以及优化实验。综上所述，小鼠脑组织、酶解液木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I 0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL、去除碎片处理、短时红细胞裂解、2～4次细胞漂洗与实验结果一一对应，即小鼠脑组织、酶解液木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I 0.1～0.2％(m/v)，DNase I30～75U/mL、去除碎片处理、短时红细胞裂解、2～4次细胞漂洗之间存在配伍关系。
本发明专利通过酶解液木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I 0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL酶解、悬液优化、2～4次细胞漂洗等关键步骤完成符合单细胞转录组测序要求的1天、6周、12周小鼠脑组织单细胞悬液制备实验，填补了目前对于新生鼠与成年鼠无法通过同一实验方案得到高质量单细胞悬液的实验技术空白，取得了技术上的突破。
表10实施例1～4结果
通过使用本发明所描述的酶解液以及实验方法分离小鼠脑组织，组织经过酶解和滴管辅助吹打后，得到了5×106～7×106个细胞。经过碎片去除、环境RNA洗涤后优化仍能收集到3×106～6×106个细胞，且有着90％～95％的活细胞占比；1％～10％的碎片杂质占比；1％～5％的结团占比，优于目前实验技术方案。对于下游实验有着更高的保障。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (5)
1.一种小鼠脑组织细胞分离的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面；所述小鼠脑组织为任一时期小鼠脑组织；
（2）组织酶解：将所述步骤（1）冲洗后的组织剪切成小块，加入酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触；所述酶解液为适用于不同时期小鼠脑组织分离的酶解液，所述不同时期小鼠脑组织为新生小鼠及成年小鼠脑组织，所述酶解液中各组分及浓度为木瓜蛋白酶10~20 U/mL，胶原酶I 0.1~0.2% m/v，DNase I 30~75 U/mL；
（3）辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液以帮助细胞释放到悬液中；
（4）染色镜检：染色镜检并计算酶解后细胞数量和细胞活率；
（5）筛网过滤：使用细胞筛网过滤酶解液，滤液离心富集细胞；
（6）碎片去除：使用细胞碎片去除溶液，并按照试剂盒SOP操作去除细胞悬液中的杂质；
（7）红细胞裂解：使用红细胞裂解液进行红细胞裂解；
（8）细胞洗涤：DPBS洗涤细胞，以去除环境RNA，得到所述小鼠脑组织细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液的配制方法为将木瓜蛋白酶，胶原酶I和DNase I同时加入含有钙镁离子的HBSS缓冲液中配制，然后经过滤膜过滤后得到酶解液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，过滤酶解液用滤膜规格为0.22μmMillipore,SLGPR33RB。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1中，预冷的DPBS的温度为0~4℃；预冷的DPBS冲洗组织次数为3~5次；
步骤2中，所述酶解液的用量为4~6mL；所述摇床的转速为90~120rpm；所述酶解的温度为30~37℃；所述酶解的时间为30~45min；
步骤3中，所述FBS胎牛血清的体积百分含量为20%；所述含有FBS胎牛血清的DPBS与酶解液的体积比为1：1；所用宽口吸管为巴罗克30-0135A1 1毫升吸管，吹打酶解体系10~15次；
步骤4中，所述染色的方法为AO/PI双染；所述镜检的方法为LUNA自动细胞计数仪luna，L20001计数。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤5中，所用的细胞筛为细胞筛Corning, 352340，所述筛网的孔径为40μm；所述滤液离心富集的条件为水平转子1270-1650rpm、4-6℃、10-15min离心；
步骤7中，红细胞裂解液为Miltenyi Biotec,170-080-033，所述红细胞裂解液的添加体积为2~4mL，裂解的温度18-25℃，裂解的时间为1-2min；
步骤8中，所述洗涤的条件为10mL DPBS、1270-1650rpm、10-15min、4-6℃；所述洗涤的次数为2~4次。
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