CN116042525A - 一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用 - Google Patents

一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、预处理肝肿瘤组织；步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。

Description

一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于肝肿瘤组织解离的方法，特别是肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用。
背景技术
肝脏是肿瘤好发部位之一，良性肿瘤较少见，多以原发性的恶性肿瘤为主，其中转移性肿瘤较多。原发性肿瘤可发生于肝细胞索、胆管上皮、血管或其他中胚层组织部位，成人、儿童均可发病。早期肝恶性肿瘤患者主要以手术切除、肝移植和消融法等方式开展治疗，晚期患者的治疗方法主要有经导管肝动脉化疗栓塞以及靶向药物治疗。尽管现有疗法取得了一定的进展，但是疗效依旧有限，因此研究肝恶性肿瘤的异质性将有助于解析疾病的演进及发现新的治疗靶点，为临床治疗提供新思路和方案。
单细胞测序技术越来越多地应用到解析肿瘤微环境中复杂细胞类型的相互作用关系，以阐述疾病的发生发展以及微环境中的动态演化过程。它可以在单细胞分辨率下探测细胞和微环境的异质性，通过单细胞基因组学、转录组学、表观基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多维度单细胞测序数据，解析肿瘤细胞和免疫细胞及其他微环境中的成员的种类、比例、状态等从而阐明肿瘤生物行为的潜在机制，其在促进肿瘤谱系诊断、靶向治疗和预后预测方面的应用前景十分广泛。然而由于单细胞测序需要大量来源于目标组织的高活性(活率80％以上)的单细胞，并且期望获得的细胞类型尽可能贴近在体组织的类型及比例。然而，当前常用的肝肿瘤解离方法获得的单细胞悬液整体细胞数有限、活率偏低，并且会造成某些较为脆弱的细胞，特别是肝实质细胞的缺失。而实际研究中肝实质细胞在肝肿瘤的演进中起举足轻重的作用，因此保持细胞比例接近真实体内环境对于研究疾病靶点和指导临床用药十分重要。
由于目前大多数通过分离新鲜组织来获得肝肿瘤组织细胞的方法，尚不适用于单细胞分析实验。因此，开发一种高效的、高细胞活力的、可用于单细胞实验的肝肿瘤单细胞悬液的制备方法，有利于提高单细胞实验结果的质量，加速单细胞相关实验在肝肿瘤研究中的应用。
发明内容
为了克服现有技术可能造成单细胞悬液活率低、细胞类型不够全面的缺陷，本发明提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法。通过分步酶解和梯度离心分离法确保多种细胞类型得率并保证细胞活性。
本发明提供的肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理预处理肝肿瘤组织(冲洗和修剪所述肝肿瘤组织，得到预处理后的组织)；
步骤2、分步酶解，利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液(使用一定量的酶解液对步骤1中获得的预处理后的肿瘤组织进行一定时间的酶解和孵育，通过细胞滤网过滤收集酶解液的上清液，得到细胞悬液；对酶解液剩余沉淀可继续加入一定量的酶解液，重复操作进行多次酶解)；
步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；(将一定量的密度梯度分离液和PBS混合均匀形成不同浓度的细胞分离液体。利用细胞分离液梯度离心，以分离免疫细胞和肝实质细胞，清洗并在一定条件下离心，获得细胞沉淀)；
步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀(用一定量的红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞沉淀进行红细胞裂解，清洗并在一定条件下离心，获得细胞沉淀)；
步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液(用一定量的细胞清洗液清洗清洗细胞沉淀并在一定条件下离心，用一定量的细胞重悬液重悬细胞并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液)。
所述步骤1具体为：将肝肿瘤组织用预冷的PBS溶液冲洗，并修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。
优选的，步骤1具体为：将所述肝肿瘤肿瘤组织用4℃预冷的PBS溶液冲洗2～3次，并用消毒过的剪刀修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。
步骤2中，所述的酶溶液是质量浓度为0.1％～0.5％的II型胶原酶，其酶活单位不低于125CDU/mg。
所述步骤2包括如下步骤：
步骤2.1、4-8℃条件下将步骤1所得的组织放入5-10mL酶解液中，在酶解液中用剪刀物理剪碎肿瘤组织至1 -2mm3的尺寸，进行初步酶解；初步酶解的处理条件为：37℃下，水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后利用70-100μm滤膜过滤，收集初步酶解的滤液，4 -8℃暂存；
步骤2.2、沉淀继续加入5 -10mL所述的酶溶液进行二次酶解，37℃水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后过滤，收集二次酶解滤液，和步骤2.1收集的初步酶解的滤液混合，即得细胞悬液。
可进行2-4次酶消化过程。
步骤3所述密度梯度分离液为Percoll细胞分离液。
所述步骤3具体为：4 -8℃，300-400g条件下将步骤2得到的细胞悬液离心，沉淀重悬于2～3mL的预冷PBS中，制备成细胞分散液；在离心管中依次加入3mL Percoll分离液3、3ml Percoll分离液2和2～3ml的细胞分散液进行梯度离心；所述梯度离心的条件为400g，4℃，升降速选择第4档，20～30min；离心后底层为免疫细胞红细胞，介于Percoll分离液3和Percoll分离液2的中间层为肝实质细胞层；分离并收集免疫细胞红细胞和肝实质细胞层。
所述Percoll分离液2的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10x PBS溶液按体积比3-4：7混匀得到Percoll分离液2；
所述Percoll分离液3的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10x PBS溶液按体积比1：1混匀得到Percoll分离液2。
步骤4具体包括如下步骤：
将步骤3收集的免疫细胞红细胞加入红细胞裂解液常温下裂解3-5min；红细胞裂解结束后加入细胞清洗液，400g，5～10min离心，收集免疫细胞。
所述Percoll分离液2和Percoll分离液3的配置方法是：先使用9倍体积Percoll和1倍体积10x PBS溶液混匀得到Percoll分离液1；使用3倍体积Percoll分离液1和7倍体积PBS溶液混匀得到Percoll分离液2；使用5倍体积Percoll分离液1和5倍体积PBS溶液混匀得到Percoll分离液3。
步骤4所述红细胞裂解液的量为1～3mL，仅对免疫细胞沉淀使用。红细胞裂解条件为常温裂解3min。所述清洗离心过程为利用5～10mL预冷PBS洗涤裂解红细胞后的细胞悬液并在500g离心处理5～10min以富集免疫细胞。
步骤5使用的细胞清洗液和细胞重悬液为含10％ FBS的DEME培养基溶液或者含0.1％BSA的PBS溶液。所述的细胞清洗液的量为5～15mL，所述离心的条件为400g，4℃，离心5～10min。
进一步地，步骤5所述的细胞重悬液的量为0.5～5mL，用于重悬组织单细胞悬液。所述过滤条件为30μm滤膜，以过滤去除双细胞和其他杂质。
本发明还提供一种如上所述的制备方法制得的肝肿瘤组织单细胞悬液。
本发明还提供一种肝肿瘤组织单细胞悬液的应用，单细胞测序、细胞分选，以及肿瘤机制的研究。
一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法各步骤在无菌条件下进行，除酶解孵育条件为37℃，其他步骤均为4℃或冰上操作完成。
本发明制备得到的肝肿瘤单细胞悬液中各细胞类型得率高且细胞活性高，各细胞类型比例更接近于体内真实比例，有利于开展下游单细胞测序等实验。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次提供一种用于单细胞测序的肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法。具有以下有益效果：
(1)该方法通过减少单细胞在酶液中的存在时间，并利用不同类型细胞漂浮密度的差异，通过梯度离心先分离出红细胞裂解步骤中耐受性较差的肝实质细胞，而仅对免疫细胞等其他细胞组分进行红细胞裂解，提升了细胞活性；
(2)该方法得到的单细胞悬液可以更大程度的还原体内各细胞类型的比例，有助于后续开展单细胞相关实验；
(3)该方法的细胞得率高，因此要求的离体组织起始量可以较低，适用于更广泛的样本，如穿刺样本；
(4)该方法不需要结合流式细胞术或其他试剂盒对活细胞进行分选或富集，因此节约了成本，降低操作复杂度和时长；
(5)本发明提供的方法可以根据裂解所得灵活选择多步解离的次数，且不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于操作和实施，具有良好的实际应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明实施例1经梯度离心分别获得的肝实质细胞层和免疫细胞层的细胞状态示意图，其中A为肝实质细胞层；B为免疫细胞层；
图2是本发明的实施例1获得的单细胞悬液的浓度计数和活力检测示意图；其中A显示的是单细胞悬液的组成；B显示的是同一视野活细胞的计数情况，C显示的是同一视野死细胞的计数情况；
图3是单细胞文库质检图；
图4是细胞分群二维展示图；
图5是本发明的对比例1获得的单细胞悬液的活力检测计数示意图；其中，A显示的是单细胞悬液的组成，B显示的是同一视野下单细胞悬液的死细胞情况；图C是总细胞情况；
图6是本发明的对比例2获得的单细胞悬液的活力检测计数示意图；其中A显示的是单细胞悬液的组成，可见细胞黏附较严重；图B显示的是同一视野下单细胞悬液的死细胞情况；图C是总细胞情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提出了一种用于单细胞相关实验的肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，所得的单细胞悬液得率高、活性好且细胞类型全面。本发明的实施例和对比例的步骤都包括试剂配制、组织酶解、红细胞裂解、细胞清洗和单细胞悬液质检。其中组织酶解，包括一步解离法和分步解离法两种方式；红细胞裂解包括直接红细胞裂解和梯度离心分离后仅对部分细胞进行红细胞裂解两种方式。以下提供一个以儿童恶性肝肿瘤，肝母细胞瘤样本为代表的实施例1和对比例1～2，其中实施例1是分步解离法和梯度离心后红细胞裂解法；对比例1为一步解离法加直接红细胞裂解；对比例2为其他酶的一步解离法加直接红细胞裂解。用对比例与实施例1技术效果相比较，说明本发明提供的用于单细胞相关实验的肝母细胞瘤组织单细胞悬液的制备方法，能够得到较高细胞得率、较高细胞活性和较多肝实质细胞存活的单细胞悬液，从而有利于开展下游的单细胞相关实验。
实施例1
实施步骤如下：
(一)试剂配制
1.组织解离液：将0.1g II型胶原酶(Sigma，C6885)溶解于50mL DMEM培养基(Gibco，10313021)中；
2.密度梯度分离液：将9mL Percoll(Solarbio，65455-52-9)和1mL 10x PBS(Gibco，70011044)溶液混匀得到Percoll分离液1；将3mL Percoll分离液1和7ml PBS(Gibco，10010023)溶液混匀得到10mL Percoll分离液2；将5mL Percoll分离液1和5mL PBS溶液混匀得到10mL Percoll分离液3；
3.细胞清洗液：将5mL FBS(Gibco，26140079)溶解于45ml DMEM培养基中；
4.细胞重悬液：将50mg的BSA(Gibco，11020039)粉末溶解于50mL PBS中。
(二)组织解离
1.使用10～20mL细胞冲洗液冲洗肝肿瘤组织，剪去血块后移除细胞冲洗液并补充新鲜的细胞冲洗液；
2.选择结构完整的组织加5mL组织解离液，用剪刀剪碎组织至1mm3大小；
3.37℃水浴摇床孵育8min，消化解离组织；
4.解离组织的上清层过70μm滤膜，并向滤液中补5mL细胞清洗液，于冰上保存；
5.收集上一步滤网上剩余的未完全解离的组织，向其中加入5mL组织解离液进行10min裂解；
6.消化完成后过70μm滤膜，滤液同步骤4的滤液一起保存备用；
7.步骤6收集的滤液(即消化液300g)4℃离心6min；
8.离心后去除上清后沉淀重悬于10mL细胞清洗液中；
9.400g，4℃离心10min；
10.离心后3mL细胞重悬液重悬上述沉淀，制得细胞悬液。
(三)红细胞裂解及细胞清洗
1.4 -8℃，300-400g条件下将步骤(二)得到的细胞悬液离心，沉淀重悬于2～3mL的预冷PBS中，制备成细胞分散液
2.依次向15mL离心管中加3mL Percoll分离液3，3mL Percoll分离液2和3mL细胞分散液，组成梯度离心分离系统；
3.离心机升降速选择第4档，在400g，4℃条件下将梯度离心分离系统离心20min
4.离心后梯度离心分离系统最底层为免疫细胞红细胞，需要进行红细胞裂解。Percoll分离液3和Percoll分离液2的层中间为肝实质细胞层，不需要进行红细胞裂解；
5.使用1mL红细胞裂解液(Gibco ACK Lysing Buffer，A1049201)重悬底层免疫细胞红细胞，常温裂解3min；
6.红细胞裂解结束后补充9mL细胞清洗液，400g，10min离心富集免疫细胞；
7.将免疫细胞重悬后与步骤3所得肝实质细胞混匀后，使用细胞清洗液补充体积至15mL，再次400g，10min离心富集细胞；
8.使用1mL细胞重悬液体重悬细胞沉淀，过30μm滤膜即得单细胞悬液。
(四)细胞悬液质检
取Percoll梯度离心后肝实质细胞层悬液(第(三)步中第3步)10μL以及红细胞裂解后的免疫细胞重悬液(第(三)步中第7步)10μL，分别用10μL台盼蓝染色，通过荧光显微镜对细胞状态进行检查。结果如图1所示，图1A是肝实质细胞层，整体细胞直径较大，图1B是免疫细胞层，整体细胞直径较小。再取10μL最终单细胞悬液用10μL AOPI(Nexclome，CS-0106)染色，通过Countstar Altair智能细胞分析仪进行细胞活率和浓度分析。自动计数结果如图2所示，图2A显示的是单细胞悬液的组成，其中较大的细胞一般为肝实质细胞，图2B显示的是同一视野活细胞的计数情况，图2C显示的是同一视野死细胞的计数情况。总细胞浓度1.13×106/mL，其中活细胞浓度1.09×106/mL，占比96.5％，死细胞浓度3.97×104/mL，占比3.5％。
(五)文库构建、质检及测序
本发明基于10x Genomics平台，将上述细胞悬液加载到Chromium Chip G芯片中放入Chromium Controller进行油滴包裹，随后使用Chromium Next GEM Single Cell30Kit v3.1试剂盒进行文库构建。文库构建完成后对其进行质检(图3)，其片段分布集中于300-700bp之间。利用Illumina测序平台进行测序。
(六)数据分析
原始测序数据用，采用FastQC软件进行数据质量评估，提取cell-barcode，UMI(Unique Molecular Identifier)，RNA序列与参考基因组比对，基于RNA序列唯一比对结果和UMI序列，对UMI进行校正，进而去除测序中出现的PCR重复。识别有效细胞后，生成Gene-barcode矩阵，记录不同细胞基因的表达值。Cell ranger软件基于基因表达水平对细胞进行分群。对表达数据进行归一化，进行UMAP降维分析用于可视化，彼此靠近的细胞对具有更相似的基因表达谱，最终得到细胞分群结果。测序质控数据及细胞数结果见表1，为了深入分析样品的异质性，基于基因表达水平对细胞进行分群，结果见图4，通过本发明方法制备的单细胞悬液可以比较方便、快捷、高效应用于单细胞测序检测。上述结果均表明本发明制备得到的单细胞悬液质量高，活性高，具有很高的应用价值。
表1测序质控数据及细胞数结果
对比例1
实施步骤如下：
(一)试剂配制
1.组织解离液：将0.1g II型胶原酶(Sigma，C6885)溶解于50mL DMEM培养基(Gibco，10313021)中；
2.细胞清洗液：将5mL FBS(Gibco，26140079)溶解于45mL DMEM培养基中
3.细胞重悬液：将50mg的BSA(Gibco，11020039)粉末溶解于50mL PBS(Gibco，10010023)中
(二)组织解离
1.使用10～20mL细胞冲洗液冲洗组织，剪去血块后移除细胞冲洗液并补充新鲜的细胞冲洗液；
2.选择结构完整的组织加5mL组织解离液，用剪刀剪碎组织至1mm3大小；
3.37℃水浴摇床孵育20min，裂解组织；
4.将全部组织裂解液过70μm滤膜，并补加5mL细胞清洗液清洗滤膜，于冰上保存；
5.收集所有滤过液300g，4℃离心6min；
6.离心后去除上清后重悬于10mL细胞清洗液中；
7.400g，4℃离心10min；
8.离心后用3mL细胞重悬液重悬上述细胞沉淀。
(三)红细胞裂解及细胞清洗
1.使用1mL红细胞裂解液(Gibco ACK Lysing Buffer，A1049201)重悬细胞沉淀，常温裂解3min；
2.红细胞裂解结束后补充9mL细胞清洗液，400g，10min离心富集细胞；
3.将细胞重悬后再次使用细胞清洗液补充体积至15mL进行清洗，400g，10min离心富集细胞；
4.使用1mL细胞重悬液体重悬细胞沉淀，过30μm滤膜即得单细胞悬液。
(四)细胞悬液质检
取10μL单细胞悬液用10μL DAPI染色，通过荧光显微镜对细胞悬液的活性概况进行检查。结果如图5所示，图5A显示的是单细胞悬液的组成，图5B显示的是同一视野下单细胞悬液的死细胞情况，在视野中亮白色。再取10μL单细胞悬液用台盼蓝染色，通过CountessII FL Automated Cell Counter自动计数仪进行细胞活率和浓度统计。自动计数结果如图5C所示，总细胞浓度4.69×105/mL，其中活细胞浓度2.70×105/mL，占比57.6％，死细胞浓度1.99×105/mL，占比42.4％。
对比例2
实施步骤如下：
(一)试剂配制
1.组织解离液：将0.1g IV型胶原酶(Sigma，C5138)溶解于50mL DMEM培养基(Gibco，10313021)中；
2.密度梯度分离液：将9mL Percoll(Solarbio，65455-52-9)和1mL 10x PBS(Gibco，70011044)溶液混匀得到Percoll分离液1；将3mL Percoll分离液1和7ml PBS(Gibco，10010023)溶液混匀得到10mL Percoll分离液2；将5mL Percoll分离液1和5mL PBS溶液混匀得到10mL Percoll分离液3；
3.细胞清洗液：将5mL FBS(Gibco，26140079)溶解于45mL DMEM培养基中
4.细胞重悬液：将50mg的BSA(Gibco，11020039)粉末溶解于50mL PBS(Gibco，10010023)中。
(二)组织解离
1.使用10～20mL细胞冲洗液冲洗组织，剪去血块后移除细胞冲洗液并补充新鲜的细胞冲洗液；
2.选择结构完整的组织加5mL组织解离液，用剪刀剪碎组织至1mm3大小；
3.37℃水浴摇床孵育20min，裂解组织；
4.解离组织的上清层过70μm滤膜，并向滤液中补5mL细胞清洗液，于冰上保存；
5.收集上一步滤网上剩余的未完全解离的组织，向其中加入5mL组织裂解液进行10min裂解；
6.消化完成后过70μm滤膜，滤液同步骤4的滤液一起保存备用；
7.步骤6收集的滤液(即消化液300g)4℃离心6min；
8.离心后去除上清后沉淀重悬于10mL细胞清洗液中；
9.400g，4℃离心10min；
10.离心后3mL细胞重悬液重悬上述沉淀。
(三)红细胞裂解及细胞清洗
1.依次向15mL离心管中加3mL 50％ Percoll，3mL 30％ Percoll和3mL第二步来源的细胞悬液，组成梯度离心分离系统；
2.离心机升降速选择第4档，在400g，4℃条件下将梯度离心分离系统离心20min
3.离心后梯度离心分离系统最底层为免疫细胞红细胞，需要进行红细胞裂解。50％和30％的Percoll层中间为肝实质细胞层，不需要进行红细胞裂解；
4.使用1mL红细胞裂解液(Gibco ACK Lysing Buffer，A1049201)重悬底层免疫细胞红细胞，常温裂解3min；
5.红细胞裂解结束后补充9mL细胞清洗液，400g，10min离心富集免疫细胞；
6.将免疫细胞重悬后与步骤3所得肝实质细胞混匀后，使用细胞清洗液补充体积至15mL，再次400g，10min离心富集细胞；
7.使用1mL细胞重悬液体重悬细胞沉淀，过30μm滤膜即得单细胞悬液。
(四)细胞悬液质检
取10μL单细胞悬液用10μL DAPI染色，通过荧光显微镜对细胞悬液的活性概况进行检查。结果如图6所示，图6A显示的是单细胞悬液的组成，可见细胞黏附较严重；图6B显示的是同一视野下单细胞悬液的死细胞情况，在视野中呈亮白色。再取10μL单细胞悬液用台盼蓝染色，通过Countess II FL Automated Cell Counter自动计数仪进行细胞活率和浓度统计。自动计数结果如图6C所示，总细胞浓度6.69×105/mL，其中活细胞浓度4.46×105/mL，占比66.7％，死细胞浓度2.23×105/mL，占比33.3％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、预处理肝肿瘤组织；
步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；
步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；
步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；
步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：将肝肿瘤组织用预冷的PBS溶液冲洗，并修剪组织块，选用结构完整的组织，避免血凝块。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的酶溶液是质量浓度为0.1％～0.5％的II型胶原酶，其酶活单位不低于125CDU/mg。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：
步骤2.1、4-8℃条件下将步骤1所得的组织放入5-10mL酶解液中，在酶解液中用剪刀物理剪碎肿瘤组织至1-2mm3的尺寸，进行初步酶解；初步酶解的处理条件为：37℃下，水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后利用70-100μm滤膜过滤，收集初步酶解的滤液，4-8℃暂存；
步骤2.2、沉淀继续加入5-10mL所述的酶溶液进行二次酶解，37℃水浴摇床孵育5～10min；孵育结束后过滤，收集二次酶解滤液，和步骤2.1收集的初步酶解的滤液混合，即得细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述细胞分离液为Percoll细胞分离液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体为：4-8℃，300-400g条件下将步骤2得到的细胞悬液离心，沉淀重悬于2～3mL的预冷PBS中，制备成细胞分散液；在离心管中依次加入3mL Percoll分离液3、3ml Percoll分离液2和2～3ml的细胞分散液进行梯度离心；所述梯度离心的条件为400g，4℃，升降速选择第4档，20～30min；离心后底层为免疫细胞红细胞，介于Percoll分离液3和Percoll分离液2的中间层为肝实质细胞层；分离并收集免疫细胞红细胞和肝实质细胞层。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述Percoll分离液2的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10xPBS溶液按体积比3-4：7混匀得到Percoll分离液2；
所述Percoll分离液3的制备方法为：Percoll和10x PBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10x PBS溶液按体积比1：1混匀得到Percoll分离液2。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4具体包括如下步骤：
将步骤3收集的免疫细胞红细胞加入红细胞裂解液常温下裂解3-5min；红细胞裂解结束后加入细胞清洗液，400g，5～10min离心，收集免疫细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得的肝肿瘤组织单细胞悬液。
10.一种如权利要求9所述的肝肿瘤组织单细胞悬液的应用，其特征在于，其应用为单细胞测序、细胞分选，以及肿瘤机制的研究。
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