CN116004516A - 一种从猪皮肤组织中分离制备单细胞悬液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从组织中分离单细胞的研究技术领域，具体涉及猪的皮肤组织的解离及单细胞悬液制备的方法。所述方法包括：通过多种类型消化酶按一定比例混合配制的皮肤组织复合消化酶液，解离皮肤组织，释放出组织中的细胞，再通过过滤、裂解红细胞、去细胞结团等步骤，制备高质量的符合单细胞测序上机要求的皮肤组织单细胞悬液。本发明能够将猪皮肤中的胶原纤维、弹性蛋白等具有高“粘性”且高密度的组织结构与细胞有效分离，得到数量多、活率高的单细胞悬液，并成功在单细胞测序技术中应用，攻克了现有皮肤组织单细胞得率及细胞活率较低的难题。
Description
技术领域
本发明涉及从组织中分离单细胞的研究技术领域，具体涉及猪的皮肤组织的解离及单细胞悬液制备的方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，测序手段逐渐由组织水平发展到细胞水平。2009年，北京大学汤富酬教授在博士后期间发表了世界第一篇单细胞mRNA测序的文章。单细胞测序技术从细胞图谱的角度，以高分辨率水平探索生物体组织的细胞异质性。近十年来，单细胞测序技术有非常快速的发展，当前已有单细胞基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组及代谢组等多种测序组学技术被提出，标志着单细胞测序技术进入高通量时代。
皮肤作为人体最大的器官，具有物理屏障保护、体温调节、代谢调控、免疫调节等功能。皮肤组织主要由表皮和真皮组成，其中角质层、毛囊、血管、皮脂腺、汗腺、结缔组织等组织结构协同发挥皮肤组织的多种生理功能。然而目前对于皮肤组织中不同类型细胞的理解尚不清晰，亟需在单细胞的水平研究各种细胞类型的特征及功能，探索不同类型细胞间的协同运作方式，解析皮肤组织异质性问题。
单细胞测序已逐渐成为科研热点，但首先要解决的问题是如何高效获取高质量的单细胞。在单细胞分离及测序技术领域，现有许多从动物组织、植物组织中分离制备符合测序标准的单细胞悬液的技术方法，但在动物皮肤组织上的研究效果差强人意。由于皮肤组织中含有极其丰富的胶原蛋白、弹性蛋白及纤维蛋白，这种致密的结缔组织结构使得皮肤单细胞研究往往止步于第一步，即获取可供分析的皮肤组织单细胞。通过查阅文献可知，目前研究在皮肤组织单细胞分离过程中存在较多问题，如单细胞获得数量少、细胞活率低、细胞结团率高。因此当前开发能够有效分离皮肤组织单细胞悬液的制剂及技术方法，具有挑战性，也具有重要意义。
对于新鲜实体组织，一般经过物理机械法和生物酶解法进行细胞分散，制备单细胞悬液。不同类型的组织有着不同的细胞组成和细胞分布方式，因此针对不同组织的单细胞悬液制备，需要摸索不同的实验条件和方法，注意选择不同酶类型、不同酶解体系配比及不同的酶解条件，才能制备出各组织的高质量单细胞悬液。在单细胞样本制作过程中，胶原酶是最常用的组织消化酶种，还有其他消化酶如胰蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶等，适用于不同类型组织解离。现有关于皮肤组织单细胞解离的技术方案举例如下两个：
①专利：一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法
中国发明专利申请CN202110322990.0公开了一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法，该专利公开的皮肤组织解离混合酶优化体系为3.25mg/mL胶原酶II、2.5mg/mL胰蛋白酶和0.02mg/mL脱氧核糖核酸酶I。具体解离方法如下：
步骤C1：获取皮肤样本并放置于组织保存液中；
步骤C2：取出皮肤样本并使用缓冲液A(平衡盐溶液或无机盐溶液)进行冲洗；
步骤C3：取适量(优选为0.5g)冲洗后的皮肤样本放在培养皿中，并加入缓冲液C(2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液)对组织进行预处理；
步骤C4：向培养皿中加入缓冲液B(10％胎牛血清的DMEM/F12培养基)浸润皮肤样本后切碎皮肤样本获得皮肤组织；
步骤C5：将皮肤组织转移至装有所述混合酶的离心管中，将离心管置于37℃水浴锅中消化30min，每10min轻轻吹打一次；
步骤C6：将缓冲液B(10％胎牛血清的DMEM/F12培养基)加入离心管中进行消化终止，同时将消化剩余的组织放入新的对应浓度的混合酶中，继续消化30-50min，消化结束后按上述方法消化终止；
步骤C7：将消化终止后离心管内的溶液用30μm细胞筛进行过滤，去除杂质与未完全消化的皮肤组织后，1500rpm离心10min，弃上清；
步骤C8：在离心管中加入缓冲液E(1×红细胞裂解液)后，1000rpm离心5min，弃上清，加入缓冲液C(2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液)重悬细胞沉淀后，300rpm离心5min弃上清，得到皮肤组织的单细胞悬液；
步骤C9：对皮肤组织的单细胞悬液进行观察并计数，计算活率。
该发明提供一种用于皮肤组织解离的混合酶，将胶原酶II、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I三种酶组合制成混合酶，在机械法的基础上使用混合酶进行消化制备皮肤组织的单细胞悬液，在优化出最适配比和消化时间等条件后，得到比较符合单细胞测序上机标准的细胞悬液，通过观察单细胞悬液的细胞形态、统计细胞数量、检测细胞活性、对死细胞数和细胞碎片、细胞团块等进行计算，得出细胞活率、单细胞悬液的浓度等关键数据，结果表明该方法降低了时间成本，提高了细胞活率和实验效率，得到的最优条件和配比适用于人类皮肤组织的高效解离。
②文献：Isolating and cryopreservingpig skin cells for single-cell RNAsequencing study.PLoS One.2022Feb 17；17(2):e0263869.PMID:35176067
该文献中对新鲜猪皮肤组织的单细胞解离使用的是人类全皮肤解离试剂盒(Miltenyi Biotech Inc)。具体实施方案：用无菌的PBS缓冲液清洗猪皮肤组织三次，用手术刀刮去皮下脂肪，用一个直径为4mm的打孔器取一个完整的皮肤样本，包括表皮和真皮，然后使用人类全皮肤解离试剂盒对样本进行解离。试剂盒中酶液的具体成份无从得知，简而言之，将435μL的缓冲液L和12.5μL的酶P放入一个温和的MACS C管中并轻轻混合，然后加入50μL的酶D和2.5μL的酶A，将皮肤样本放入管中并在37℃下消化3h，每隔10min倒转试管进行搅拌，消化结束后加入0.5mL细胞培养液(DMEM+10％FBS)来终止酶促反应，然后用gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotech Inc)使用"h_skin_01"程序对样品进行机械解体。组织细胞悬液通过一个70μm的过滤网，以去除组织碎片(如果有的话)，通过在300g下离心5min来收集细胞，吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5mL细胞培养液(DMEM+10％FBS)中。最后细胞用0.2％的台盼蓝染色后用Countess II FL自动细胞计数器(ThermoFisherScientific)进行细胞计数，使用LIVE/DEADTM哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒(ThermoFisher Scientific)进一步评估细胞活力。结果显示该技术方案提取的猪皮肤细胞活率约为60％。
发明内容
针对于现有技术的缺点：
①专利(CN202110322990.0)：组织来源为人类的皮肤组织，对于像猪这种皮肤厚的样本不适用；胰蛋白酶的消化效果较强烈且具有细胞毒性，不好控制酶浓度和消化条件；单细胞上机测序效果未知(无应用环节)。
②文献(PMID:35176067)：样本来自30kg的小猪，皮肤厚度较薄，对于成年猪较厚的皮肤样本同样不适用；方案采用美天旎人类皮肤组织解离试剂盒，操作复杂，仪器昂贵，
不方便灵活调整酶解体系，并且对于猪皮肤组织的解离没有针对性。
由于猪的皮肤在解剖学结构及生理功能上，与人类皮肤较为相似，是在人类皮肤相关研究上比小鼠更为理想的模式动物。由于皮肤组织具有致密的结缔组织结构，其中的大多数细胞难以被同步解离释放出来。
本发明的目的在于能够将猪皮肤中的胶原纤维、弹性蛋白等具有高“粘性”且高密度的组织结构与细胞有效分离，得到数量多、活率高的单细胞悬液，并成功在单细胞测序技术中应用，攻克了现有皮肤组织单细胞得率及细胞活率较低的难题。并且本发明针对新生、青年、成年的不同年龄和不同厚度的猪皮肤，提出专门的单细胞解离方案，为皮肤发育单细胞研究提供技术参考。
本发明的目的可以通过以下方法实现：
本发明第一个方面公开了一种从猪皮肤组织中分离制备单细胞悬液的方法，该方法包括：
S1：将正常新鲜的皮肤组织样本与复合消化酶液混合进行消化，所述消化酶液含有I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、V型胶原酶、弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和溶剂；其中胶原酶主要水解结缔组织中的胶原蛋白成分，本发明应用了包括I、II、IV和V型的胶原酶，目的是使皮肤中丰富的胶原蛋白被充分水解；弹性蛋白酶是一种广谱蛋白水解酶，能促进结缔组织中蛋白质的消化及分解，其特殊之处在于它能够作用于弹性蛋白，使得真皮组织中的弹性纤维也能被充分水解；DNase I是一种脱氧核糖核酸内切酶，可用于降解单链或双链DNA，在组织单细胞解离过程中，加入DNase I有助于去除细胞外的“粘性”DNA分子，减少细胞结团，同时提高活细胞数量。
S2：组织解离后获得的组织细胞混合液通过70μm和40μm细胞筛进行过滤，再经过裂解红细胞、消除细胞结团后，纯化得到皮肤组织单细胞悬液。
S1中所述皮肤组织样本先进行预处理：将皮肤组织取下后，刮除表皮毛发及污渍，将皮下脂肪组织剔除干净后，用DPBS缓冲液清洗组织，再将组织快速剪切成1mm3体积大小的碎块得到预处理的皮肤组织样本。
S1中所述脱氧核糖核酸酶为DNase I。
S1中所述I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、V型胶原酶、弹性蛋白酶和DNase I的酶浓度分别为0.5-3mg/mL、0.5-2mg/mL、0.5-2mg/mL、0.5-2mg/mL、1mg/mL、2U/mL；所述溶剂为DMEM高糖培养基。
一些实施方案中，皮肤较薄，真皮结缔组织较少，复合消化酶配比为：0.5mg/mL I型胶原酶、0.5mg/mL II型胶原酶、0.5mg/mL IV型胶原酶、0.5mg/mLV型胶原酶、1mg/mL弹性蛋白酶、2U/mLDNase I。
一些实施方案中，皮肤较厚，真皮结缔组织较多，复合消化酶配比为：3mg/mL I型胶原酶、2mg/mL II型胶原酶、2mg/mL IV型胶原酶、2mg/mLV型胶原酶、1mg/mL弹性蛋白酶、2U/mLDNase I。
S1中所述复合消化酶液体积和组织体积比例为5:1。
组织消化条件为37℃水浴消化，消化时间为90-180min。
所述消化时间由皮肤组织消化状态决定，皮肤组织消化状态判断指标包括胶原纤维残留量及分散度、细胞量和细胞完整性。
一些实施方案中，皮肤较薄，消化时间为90-120min，所述酶解过程用含血清的完全培养基终止消化。
一些实施方案中，皮肤较厚，消化时间为120-180min，所述酶解过程用含血清的完全培养基终止消化。
S2中对细胞悬液的过滤、裂解红细胞和去细胞结团的处理中，使用高速低温离心获得细胞沉淀，离心条件为4℃，350g，离心5min。
S2中裂解红细胞的试剂为RBC Lysis Solution；S2中去除细胞结团的酶为TrypLETM Express Enzyme。
组织解离后获得的组织细胞混合液分别依次通过70μm、40μm和40μm细胞筛过滤，再经过红细胞裂解液RBC Lysis Solution裂解红细胞，TrypLETM Express Enzyme消除细胞结团后，纯化得到细胞数量多、细胞活率高的皮肤组织单细胞悬液。其中红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行且较为温和的方法，它能减少红细胞对后续单细胞测序过程中的干扰。其中TrypLETM Express Enzyme是一种非动物源性重组酶，适用于解离各种贴壁哺乳动物细胞，可直接替代胰蛋白酶，其特点在于与胰蛋白酶相比，具有更温和的细胞解离作用，减少多种酶切割对细胞造成的损害，同时有助于从真皮的各种蛋白纤维中释放单细胞，减少细胞结团情况。
本发明第二个方面公开了利用上述制备猪皮肤组织单细胞悬液在用于单细胞测序的用途。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
本发明解离制备猪的皮肤组织单细胞悬液，在保证细胞质量的同时，还能一次性获得大量分离的皮肤组织来源细胞。本发明的单细胞悬液制备方法是简单的机械法结合酶解法，无需特制专业化仪器设备，不受时间地点的限制，只需要常见的试剂耗材，便可从皮肤组织中获得完整且足量的单细胞并能成功用于单细胞测序。
相比于中国发明专利申请CN202110322990.0，本发明使用的酶体系更温和，且更适用于较厚的皮肤组织样本，获得皮肤单细胞的细胞活率高于CN202110322990.0中的实例。本发明中所应用的消化酶是胶原酶、弹性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的复合酶液。其中胶原酶主要水解结缔组织中的胶原蛋白成分，本发明应用了包括I、II、IV和V型的胶原酶，目的是使皮肤中丰富的胶原蛋白被充分水解；弹性蛋白酶是一种广谱蛋白水解酶，能促进结缔组织中蛋白质的消化及分解，其特殊之处在于它能够作用于弹性蛋白，使得真皮组织中的弹性纤维也能被充分水解；DNase I是一种脱氧核糖核酸内切酶，可用于降解单链或双链DNA，在组织单细胞解离过程中，加入DNase I有助于去除细胞外的“粘性”DNA分子，减少细胞结团，同时提高活细胞数量。针对细胞结团问题，我们使用一种酶TrypLETM ExpressEnzyme，它是一种非动物源性重组酶，适用于解离各种贴壁哺乳动物细胞，可直接替代胰蛋白酶，其特点在于与胰蛋白酶相比，具有更温和的细胞解离作用，减少多种酶切割对细胞造成的损害，同时有助于从真皮的各种蛋白纤维中释放单细胞，减少细胞结团情况。
相比于文献PMID:35176067，本发明不仅能得到更高细胞活率的皮肤单细胞悬液，本发明实例中还使用了不同年龄及不同皮肤厚度的猪皮肤进行个性化单细胞解离方法的摸索，主要根据皮肤中胶原蛋白含量的差异，从消化酶体系及消化条件上进行优化，摸索出不同厚度皮肤组织的单细胞解离方法，且都获得了高质量的符合单细胞测序上机标准的单细胞悬液。
与现有技术相比，本发明所提供的方法可通过传统酶解方法解离皮肤组织，并获得足够细胞数量、高细胞活率、背景干净、少细胞碎片的猪皮肤单细胞悬液，可以解决目前在单细胞测序研究领域中对皮肤组织单细胞的获取问题。
附图说明
图1为新生、青年和成年猪皮肤组织样本实物图；
图2为新生、青年和成年猪皮肤组织厚度；
图3为新生、青年和成年猪皮肤组织消化解离后的细胞镜检图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所提供的一种从猪皮肤组织中分离制备单细胞悬液的方法，包括：
取新鲜的猪皮肤组织置于冰上装有DPBS缓冲液的培养皿中，用手术刀片刮去表面毛发及污物，并刮净皮下脂肪组织。
将预处理干净的皮肤组织置于无菌培养皿上，在碎冰上用手术刀片切成小块，收集到5mL离心管中，用眼科剪将小块组织快速剪成1mm3组织碎片。
将组织碎片转移至含复合消化酶解液的50mL离心管中，消化酶液体积与组织体积比例为5:1；其中，复合消化酶解液需用DMEM高糖培养基和消化酶干粉提前配置好，复合消化酶解液的浓度配比为I型胶原酶0.5-3mg/mL、II型胶原酶0.5-2mg/mL、IV型胶原酶0.5-2mg/mL、V型胶原酶0.5-2mg/mL、弹性蛋白酶1mg/mL、DNase I 2U/mL。
将离心管置于37℃水浴锅中消化，期间每隔5min摇晃一次离心管，大猪皮肤消化120-180min，小猪皮肤消化90min左右，期间每隔30min吸取1μL细胞悬液镜检一次并观察解离状态，完成后快速放回水浴锅继续消化。
消化总时长达90min后，将离心管置于冰上，将细胞悬液混匀后取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，镜检观察记录细胞状态，视野中无较多组织块及胶原纤维残留，表明基本消化彻底，用含10％胎牛血清的完全培养基终止消化。
将终止消化后的悬液依次通过70μm、40μm、40μm细胞筛，过滤后收集滤液至15mL离心管中，在4℃、350g条件下离心5min，去上清。
向细胞沉淀中加入2mL RBC Lysis Solution红细胞裂解液，混匀后室温静置5min，加DPBS缓冲液终止裂解，在4℃、350g条件下离心5min，去上清。
向细胞沉淀中加入2mLDMEM高糖培养基洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清。
结团较多的细胞悬液(大猪皮肤样本)需要进行去结团处理，向细胞沉淀中加入2mL TrypLETM Express Enzyme消化，消化条件为37℃，消化20-40min，根据具体情况调整消化时间，在4℃、350g条件下离心5min，去上清。
向沉淀中加入2mLDMEM高糖培养基洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清。
向沉淀中加入1mLDMEM高糖培养基重悬细胞，取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色后，镜检观察并估算细胞浓度、纯度和活率情况。
所得细胞悬液混匀，镜检观察后，用CountessTMCell Counting Chamber Slides进行细胞计数，调整细胞浓度，最终获得数量多，细胞活率高的单细胞悬液。
在华大基因DNBelab C4单细胞平台，对制备好的单细胞悬液进行RNA-Seq文库构建及上机测序，检测细胞捕获数、reads数、基因数和UMI数。先将细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，在显微镜下镜检并统计活率，活率大于80％即可进入建库环节，将准备好的单细胞悬液在C4 scRNA载片与装置中，将细胞悬液制备成液滴，在液滴中完成细胞裂解及磁珠捕获mRNA的过程，破乳后对捕获的mRNA进行反转录、cDNA二链合成、cDNA及oligo产物扩增、中间产物质检、oligo文库构建、cDNA文库构建及上机测序环节。
表1：试剂信息
| 试剂名称 | 规格 | 品牌及货号 |
| DPBS缓冲液 | 1X，500mL | Biosharp，Cat：BL310A |
| DMEM高糖培养基 | 1X，500mL | Meilunbio，Cat：MA0212 |
| FBS胎牛血清 | 100mL | 四季青，Cat：13011-8611 |
| I型胶原酶 | 0.25-1.0FALGPA units/mg，1g | Sigma，Cat：C0130 |
| II型胶原酶 | 0.5-5.0FALGPA units/mg，1g | Sigma，Cat：C6885 |
| IV型胶原酶 | 0.5-5.0FALGPA units/mg，1g | Sigma，Cat：C5138 |
| V型胶原酶 | ≥1FALGPA units/mg，1g | Sigma，Cat：C9263 |
| 弹性蛋白酶 | 30U/mg，1g | Coolaber，Cat：CE5001 |
| DNaseI | 10kU/mL，10kU | Coolaber，Cat：SL2076 |
| RBCLysisSolution | 100mL | Roche，Cat：11814389001 |
| <![CDATA[TrypLE<sup>TM</sup>Express Enzyme]]> | 1X，100mL | Gibco，Cat：12604013 |
本发明中，所述皮肤组织样本均为猪皮肤组织，本发明方法适用于新生、青年以及成年猪皮肤的解离及单细胞悬液的制备。
对比例1
文献：Isolating and cryopreserving pig skin cells for single-cell RNAsequencing study.PLoS One.2022Feb 17；17(2):e0263869.PMID:35176067
该文献中对新鲜猪皮肤组织的单细胞解离使用的是人类全皮肤解离试剂盒(Miltenyi Biotech Inc)。具体实施方案：用无菌的PBS缓冲液清洗猪皮肤组织三次，用手术刀刮去皮下脂肪，用一个直径为4mm的打孔器取一个完整的皮肤样本，包括表皮和真皮，然后使用人类全皮肤解离试剂盒对样本进行解离。试剂盒中酶液的具体成份无从得知，简而言之，将435μL的缓冲液L和12.5μL的酶P放入一个温和的MACS C管中并轻轻混合，然后加入50μL的酶D和2.5μL的酶A，将皮肤样本放入管中并在37℃下消化3h，每隔10min倒转试管进行搅拌，消化结束后加入0.5mL细胞培养液(DMEM+10％FBS)来终止酶促反应，然后用gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotech Inc)使用"h_skin_01"程序对样品进行机械解体。组织细胞悬液通过一个70μm的过滤网，以去除组织碎片(如果有的话)，通过在300g下离心5min来收集细胞，吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5mL细胞培养液(DMEM+10％FBS)中。最后细胞用0.2％的台盼蓝染色后用Countess II FL自动细胞计数器(ThermoFisherScientific)进行细胞计数，使用LIVE/DEADTM哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒(ThermoFisher Scientific)进一步评估细胞活力。结果显示该技术方案提取的猪皮肤细胞活率约为60％。
样本来自30kg的小猪，皮肤厚度较薄；方案采用美天旎人类皮肤组织解离试剂盒，操作复杂，仪器昂贵，不方便灵活调整酶解体系，并且对于猪皮肤组织的解离没有针对性，得到的单细胞活率较低。
实施例1：新生猪皮肤组织
本实施例以新生猪皮肤组织为例，进行单细胞悬液制备及上机测序，具体步骤如下：
取新生3天仔猪的新鲜皮肤组织置于冰上装有DPBS缓冲液的培养皿中，用手术刀片刮除表面毛发及污物，并刮净皮下脂肪组织。
将预处理干净的皮肤组织置于无菌培养皿上，在碎冰上用手术刀片切成小块，收集到5mL离心管中，用眼科剪将小块组织快速剪成1mm3组织碎片。
将组织碎片转移至含复合消化酶液的50mL离心管中，消化酶液体积与组织体积比例为5:1；其中，复合消化酶液需用DMEM高糖培养基与胶原酶、弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶提前配置；其中，消化酶体系为含0.5mg/mL胶原酶I、II、IV、V；1mg/mL弹性蛋白酶；2U/mLDNase I。
将离心管置于水浴锅中37℃消化，期间每隔5min摇晃一次离心管，消化90min左右，期间每隔30min吸取1μL细胞悬液镜检一次观察解离状态，完成后快速放回水浴锅继续消化；
消化总时长达90min后，将离心管置于冰上，将细胞悬液混匀后取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，镜检观察记录细胞状态，视野中无较多组织块及胶原纤维残留，表明基本消化彻底，用含10％胎牛血清的完全培养基终止消化；
将终止消化后的悬液依次通过70μm、40μm、40μm细胞筛，过滤后收集滤液至15mL离心管中，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
细胞沉淀中加入2mL RBC Lysis Solution红细胞裂解液，混匀后室温静置5min，加PBS缓冲液终止裂解，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入2mL DMEM洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入1mL DMEM重悬细胞，取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色后，镜检观察并估算细胞浓度、纯度和活率情况；
所得细胞悬液混匀，镜检观察后，用CountessTMCell Counting Chamber Slides进行细胞计数，调整细胞浓度，最终获得数量多，细胞活率高的单细胞悬液。
在华大基因DNBelab C4单细胞平台，对制备好的单细胞悬液进行RNA-Seq文库构建及上机测序，检测细胞捕获数、reads数、基因数和UMI数。先将细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，在显微镜下镜检并统计活率，活率大于80％即可进入建库环节，活细胞上样数量为20000个。将准备好的单细胞悬液在C4 scRNA载片与装置中，将细胞悬液制备成液滴，在液滴中完成细胞裂解及磁珠捕获mRNA的过程，破乳后对捕获的mRNA进行反转录、cDNA二链合成、cDNA及oligo产物扩增、中间产物质检、oligo文库构建、cDNA文库构建及上机测序环节。
实施例2：青年猪皮肤组织
本实施例以青年猪皮肤组织为例，进行单细胞悬液制备及上机测序，具体步骤如下：
取90天青年猪的皮肤组织置于冰上装有DPBS缓冲液的培养皿中，用手术刀片刮除表面毛发及污物，并刮净皮下脂肪组织。
将预处理干净的皮肤组织置于无菌培养皿上，在碎冰上用手术刀片切成小块，收集到5mL离心管中，用眼科剪将小块组织快速剪成1mm3组织碎片。
将组织碎片转移至含复合消化酶液的50mL离心管中，消化酶液体积与组织体积比例为5:1；其中，复合消化酶液需用DMEM高糖培养基与胶原酶、弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶提前配置；其中，消化酶体系含1.5mg/mL胶原酶I、1mg/mL胶原酶II、IV、V；1mg/mL弹性蛋白酶；2U/mL DNase I。
将离心管置于水浴锅中37℃消化，期间每隔5min摇晃一次离心管，消化120min左右，期间每隔30min吸取1μL细胞悬液镜检一次观察解离状态，完成后快速放回水浴锅继续消化；
消化总时长达120min后，将离心管置于冰上，将细胞悬液混匀后取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，镜检观察记录细胞状态，视野中无较多组织块及胶原纤维残留，表明基本消化彻底，用含10％胎牛血清的完全培养基终止消化；
将终止消化后的悬液依次通过70μm、40μm、40μm细胞筛，过滤后收集滤液至15mL离心管中，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
细胞沉淀中加入2mL RBC Lysis Solution红细胞裂解液，混匀后室温静置5min，加PBS缓冲液终止裂解，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入2mL DMEM洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入2mL TrypLETM Express Enzyme消化，消化条件为37℃，消化20-30min，根据具体情况调整消化时间，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向沉淀中加入2mL DMEM洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入1mLDMEM重悬细胞，取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色后，镜检观察并估算细胞浓度、纯度和活率情况；
所得细胞悬液混匀，镜检观察后，用CountessTMCell Counting Chamber Slides进行细胞计数，调整细胞浓度，最终获得数量多，细胞活率高的单细胞悬液。
在华大基因DNBelab C4单细胞平台，对制备好的单细胞悬液进行RNA-Seq文库构建及上机测序，检测细胞捕获数、reads数、基因数和UMI数。先将细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，在显微镜下镜检并统计活率，活率大于80％即可进入建库环节，活细胞上样数量为20000个。将准备好的单细胞悬液在C4 scRNA载片与装置中，将细胞悬液制备成液滴，在液滴中完成细胞裂解及磁珠捕获mRNA的过程，破乳后对捕获的mRNA进行反转录、cDNA二链合成、cDNA及oligo产物扩增、中间产物质检、oligo文库构建、cDNA文库构建及上机测序环节。
实施例3：成年猪皮肤组织
本实施例以成年猪皮肤组织为例，进行单细胞悬液制备及上机测序，具体步骤如下：
取3年成年猪的皮肤组织置于冰上装有DPBS缓冲液的培养皿中，用手术刀片刮除表面毛发及污物，并刮净皮下脂肪组织。
将预处理干净的皮肤组织置于无菌培养皿上，在碎冰上用手术刀片切成小块，收集到5mL离心管中，用眼科剪将小块组织快速剪成1mm3组织碎片。
将组织碎片转移至含复合消化酶液的50mL离心管中，消化酶液体积与组织体积比例为5:1；其中，复合消化酶液需用DMEM高糖培养基与胶原酶、弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶提前配置；其中，消化酶体系含3mg/mL胶原酶I、2mg/mL胶原酶II、IV、V；1mg/mL弹性蛋白酶；2U/mL DNase I。
将离心管置于水浴锅中37℃消化，期间每隔5min摇晃一次离心管，消化180min左右，期间每隔30min吸取1μL细胞悬液镜检一次观察解离状态，完成后快速放回水浴锅继续消化；
消化总时长达180min后，将离心管置于冰上，将细胞悬液混匀后取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，镜检观察记录细胞状态，视野中无较多组织块及胶原纤维残留，表明基本消化彻底，用含10％胎牛血清的完全培养基终止消化；
将终止消化后的悬液依次通过70μm、40μm、40μm细胞筛，过滤后收集滤液至15mL离心管中，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
细胞沉淀中加入2mL RBC Lysis Solution红细胞裂解液，混匀后室温静置5min，加PBS终止裂解，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入2mL DMEM洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入2mL TrypLETM Express Enzyme消化，消化条件为37℃，消化30-40min左右，根据具体情况调整消化时间，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向沉淀中加入2mL DMEM洗涤细胞，在4℃、350g条件下离心5min，去上清；
向细胞沉淀中加入1mL DMEM重悬细胞，取1μL细胞悬液用0.4％台盼蓝染色后，镜检观察并估算细胞浓度、纯度和活率情况；
所得细胞悬液混匀，镜检观察后，用CountessTMCell Counting Chamber Slides进行细胞计数，调整细胞浓度，最终获得数量多，细胞活率高的单细胞悬液。
在华大基因DNBelab C4单细胞平台，对制备好的单细胞悬液进行RNA-Seq文库构建及上机测序，检测细胞捕获数、reads数、基因数和UMI数。先将细胞悬液用0.4％台盼蓝染色，在显微镜下镜检并统计活率，活率大于80％即可进入建库环节，活细胞上样数量为20000个。将准备好的单细胞悬液在C4 scRNA载片与装置中，将细胞悬液制备成液滴，在液滴中完成细胞裂解及磁珠捕获mRNA的过程，破乳后对捕获的mRNA进行反转录、cDNA二链合成、cDNA及oligo产物扩增、中间产物质检、oligo文库构建、cDNA文库构建及上机测序环节。
表2：不同年龄猪皮肤组织单细胞解离情况
注：D3为出生3天的新生猪，D90为90天的青年猪，Y3为3年的成年猪，分别对应实例1-3，每个实例有2个生物学重复。单细胞测序技术中对单细胞悬液的上机要求较为严格：1、细胞活率大于85％，因为死亡或受损的细胞会将核酸释放到细胞悬液中，这些核酸将在后续的实验步骤中保留下来，会影响实验结果；2、细胞单个不成团且细胞形态好、碎片少背景干净；3、细胞浓度达到600～1200个/μL，上样量不够或过多都将影响最终数据质量。
表3：试验样本单细胞悬液上机质检数据
注：D3为出生3天的新生猪，D90为90天的青年猪，Y3为3年的成年猪，分别对应实例1-3，每个实例有2个生物学重复。细胞捕获总数、每个细胞平均reads数、每个细胞基因数的中位数、每个细胞UMI数的中位数为DNBelab C4单细胞测序平台对单细胞悬液样本进行建库测序后获得的基础数据指标。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从猪皮肤组织中分离制备单细胞悬液的方法，其特征在于，该方法包括：
S1：将正常新鲜的皮肤组织样本与复合消化酶液混合进行消化，所述消化酶液含有I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、V型胶原酶、弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和溶剂；
S2：组织解离后获得的组织细胞混合液通过70μm和40μm细胞筛进行过滤，再经过裂解红细胞、消除细胞结团后，纯化得到皮肤组织单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述皮肤组织样本先进行预处理：将皮肤组织取下后，刮除表皮毛发及污渍，将皮下脂肪组织剔除干净后，用DPBS缓冲液清洗组织，再将组织快速剪切成1mm3体积大小的碎块，得到预处理的皮肤组织样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，S1中所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、V型胶原酶、弹性蛋白酶和DNaseI的酶浓度分别为0.5-3mg/mL、0.5-2mg/mL、0.5-2mg/mL、0.5-2mg/mL、1mg/mL、2U/mL；所述溶剂为DMEM高糖培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述复合消化酶液体积和组织体积比例为5:1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，组织消化条件为37℃水浴消化，消化时间为90-180min。
7.根据权利要求6所述，其特征在于，所述消化时间由皮肤组织消化状态决定，皮肤组织消化状态判断指标包括胶原纤维残留量及分散度、细胞量和细胞完整性。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中对细胞悬液的过滤、裂解红细胞和去细胞结团的处理中，使用高速低温离心获得细胞沉淀，离心条件为4℃，350g，离心5min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中裂解红细胞的试剂为RBCLysisSolution；S2中去除细胞结团的酶为TrypLETMExpressEnzyme。
10.根据权利要求1所述方法制备的猪皮肤组织单细胞悬液可用于单细胞测序。
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| CN202310137290.3A CN116004516A (zh) | 2023-02-20 | 2023-02-20 | 一种从猪皮肤组织中分离制备单细胞悬液的方法 |
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| CN (1) | CN116004516A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116926050A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-10-24 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种组织单细胞悬液的消化酶及其应用 |
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2023
- 2023-02-20 CN CN202310137290.3A patent/CN116004516A/zh active Pending
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