TW201510223A

TW201510223A - 一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法

Info

Publication number: TW201510223A
Application number: TW103131629A
Authority: TW
Inventors: xiao-chun Xu; hai-rong Xiao
Original assignee: Boya Stem Cell Technology Co Ltd
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2015-03-16
Also published as: CN103469309B; TWI515299B; CN103469309A; HK1192290A1

Abstract

本發明公開一種組織勻漿法分離胎兒附屬物組織細胞構建細胞庫的方法，目的在於構建細胞庫時，步驟簡單、省時、易於品質控制和規範化。本發明由下述步驟組成：(1)胎兒附屬物組織的清洗；(2)組織的勻漿前處理；(3)組織勻漿處理分離細胞(團)；(4)勻漿後組織的過濾處理和細胞(團)的收集；(5)細胞(團)檢測；(6)凍存分離的細胞(團)，構建細胞庫。與現有方法相比，本發明方法具有操作簡單、耗時短、不引入外源試劑、易於標準化和品質控制以及細胞獲得量大等優點，對於提高胎兒附屬物細胞庫的構建效率，獲得高品質之用於治療的幹細胞具有重要的意義。

Description

一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法

本發明關於胎兒附屬物組織細胞庫的構建方法，更具體地說是一種從胎兒附屬物組織分離細胞以構建細胞(團)庫的物理方法。

胎兒附屬物組織主要由胎盤小葉、胎盤底座、基蛻膜、羊膜和臍帶組織構成。起源於胚胎發育期胚外中胚層的胎盤是由間質、血管及滋養細胞組成，是胎兒最早期的造血器官，含有大量的間質成分。最新的研究表示胎盤中含有間充質幹細胞、胎盤亞全能幹細胞和豐富的造血幹細胞，從胎盤中分離培養出這些多能幹細胞將為實驗研究和臨床應用開闢一個嶄新而豐富的來源。

胎盤亞全能幹細胞源自於胎盤組織，自胚胎形成的第5到7天開始出現，能分化形成200多種人體組織器官細胞，但不能形成一個完整的人體。具備多能幹細胞的許多生物學特徵，該細胞體外可向脂肪細胞、成骨細胞、神經細胞、肝上皮樣細胞等定向分化。

胎盤造血幹細胞是存在於胎盤組織中的一群原始造血細胞，是血細胞(紅血球、白血球、血小板等)的始祖，是高度未分化細胞，也可以說是一切血細胞(其中大多數是免疫細胞)的原始細胞。胎盤組織中造血幹細胞的含量是臍帶血中造血幹細胞含量的5~ 10倍，足以供小孩自用數次，或提供給1~2個成人患者的治療。同時有效解決了移植時骨髓或動員後外周血來源不足，臍帶血數量不夠等技術難題，將有望取代骨髓、動員後外周血和臍帶血，應用於造血幹細胞移植。

基蛻膜是母親妊娠時胚泡的滋養層細胞一經與子宮內膜接觸，引起其附近的內膜間質細胞肥大增殖形成的組織。基蛻膜形成胎盤隔，將叢密絨毛膜分隔成若干個絨毛小葉，其中含有母親源的基蛻膜幹細胞。

羊膜(amnion)是覆蓋在羊膜腔內表面的一層薄膜，從細胞滋養層演化而來，是人類兩層胎膜的內層，其厚度為0.02~0.05mm，是人體中最厚的基底膜，由羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cell,HAEC)、基底膜、實質層、纖維母細胞層、海綿層這5層結構組成。人羊膜上皮細胞位於羊膜的最內層，羊膜上皮細胞在受精後第8天從外胚葉發育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎幹細胞的可塑性，在治療中樞神經障礙方面具有獨特的應用價值：1996年，Sakuragawa等人最先發現培養的人羊膜上皮細胞表達神經元和神經膠質細胞的標誌。隨後的研究表示，培養的人羊膜上皮細胞能合成和釋放神經遞質如乙醯膽鹼、兒茶酚胺和多巴胺。人羊膜上皮細胞移植治療大鼠帕金森氏症(PD)的實驗表明其在體內不僅能存活並表達酪胺酸羥化酶(TH)活性，而且可以逆轉病情和防止神經元死亡。人羊膜上皮細胞對於靈長類的脊髓損傷同樣具有良好的治療效果。

臍帶是胎兒和母體連接的紐帶。臍帶內有三根血管通過，一根靜脈和二根動脈，發揮連結母子間血液迴圈的作用。足月胎兒的臍帶長約30~70釐米。臍帶華通氏膠(Wharton's Jelly)中的幹細胞主要是臍帶間充質幹細胞。

間充質幹細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一種多能幹細胞，在胚胎發育中源自於中胚層。在機體正常的組織損傷修復過程中，MSC是一種重要的參與組織再生的細胞。在組織損傷引起的特殊信號作用下，MSC遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據不同的損傷信號沿著不同途徑分化。MSC易於分離擴增，體外倍增能力旺盛，即使擴增1億倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一種實用的組織修復種子細胞。

MSC具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下具有分化為：上皮幹細胞、神經幹細胞、肝幹細胞，肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。可以用來修復受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經系統疾病、肝臟疾病、骨組織病、角膜損傷、燒傷燙傷、肌病等多種疾病；並且，MSC具有免疫調節作用，透過負性免疫調節功能，抑制機體亢進的免疫反應，使機體免疫功能恢復平衡，從而可以用來治療造血幹細胞移植之後的免疫排斥反應以及克隆氏病、紅斑性狼瘡，硬皮病等自身免疫系統疾病；MSC還是人體微環境的重要組成部分，移植間充質幹細胞可以改變造血微環境，重建免疫系統，促進造血功能恢復，與造血幹細胞共移植能顯著提高白血病和難治性貧血等的治療效果。

胎兒附屬物細胞庫的構建，將原來作為醫療廢棄物直接處理掉的新生兒的臍帶和胎盤組織經由處理，提取其中豐富的幹細胞資源，並透過成熟的深低溫冷凍技術使之在休眠狀態下長時間儲存，作為一種寶貴的生物資源儲備，將來，可以應用於許多自體重大疾病的治療；同時，也可以用於異體的移植與治療；還可以藉由再研發和處理，開發成幹細胞藥物，造福全社會。

胎兒附屬物細胞庫構建包括細胞的組織分離、純化、冷凍保存、病原微生物的檢測以及品質控制等方面。本專利所涉及的胎兒附屬物細胞庫構建方法是其中組織中細胞分離的方法，尤其是細胞從實體組織中分離的技術。從組織中分離細胞構建細胞庫的方法目前有化學酶解法和細胞團培養法。其中化學酶解法是廣為採用的主要方法。

化學酶解法是利用消化酶將活體細胞從組織中分離的方法。具體分離過程先將組織剪切成約1~1.5mm³的小塊，再採用膠原酶或膠原酶和胰酶組合使用進行細胞團消化，並利用血清等酶消化終止液終止消化，最後過濾清洗獲取細胞。例如中國專利號CN101608174B《一種人臍帶間充質幹細胞庫的構建方法》的專利，間充質幹細胞的分離就是採用膠原酶消化的方法。中國專利號CN100344757C《人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法》的專利，建構細胞庫的間充質幹細胞採用的方法為膠原酶和胰酶依次消化法。化學酶解法具有以下特點：1)由於需要使用大量的化學酶和消化終止液，實驗成本較高；2)由於不同的操作方法和人員情況，每次獲得的細胞產量差異較大；3)由於採用的消化方法不同，整個消化酶解的時間長短不一，從30分鐘到幾小時都有。

細胞團培養法是一種物理和培養相結合，將細胞從組織中分離的方法，也是構建細胞庫可選用的一種方法。具體分離過程為，先將組織剪切成約1~1.5mm³的小塊，接種到培養皿中培養分離細胞。例如中國專利號CN102010850B《一種臍帶組織間充質幹細胞爬片分離的方法》的專利，臍帶組織間充質幹細胞的分離就是採用細胞團培養法。該方法具有以下特點：1)僅需將組織剪切成1~1.5mm³的細胞團和簡單的培養，操作比較簡單；2)細胞團的培養需要幾天的時間才能實現細胞的分離，耗時較長；3)細胞的長期培養，污染的可能性比較大。

由此可見，目前構建細胞庫的實體組織細胞分離方法操作流程比較繁瑣，耗時長，完全依賴於人工作業，對技術員的操作技能要求高。另外，化學酶解法又引入了動物來源的外源性試劑，會增加公共細胞庫的幹細胞藥物治療的風險性。

本發明之細胞庫構建方法，保證細胞分離方法簡單、省時、易於品質控制和規範化的原則，採用組織勻漿方法分離胎兒附屬物組織，獲得大量用於建構細胞庫的細胞，以滿足科研、醫藥和臨床等領域對細胞庫資源的需求。

本發明的目的是提供一種利用組織勻漿法分離胎兒附屬物細胞(團)而構建細胞庫的方法。

本發明優選使用的組織細胞處理器PlacentaPro是發明人為本發明設計的一種儀器，該儀器包含控制裝置和勻漿容器兩部分，如第1圖所示，控制裝置包括機身(1)、勻漿容器放置孔(2)、旋轉頭(3)、卡槽(4)以及散熱孔(5)；勻漿容器包括杯體(6)、杯蓋(7)、密封圈(8)、旋轉頭連接器(9)、固定軸(10)、刀頭(11)以及嵌卡頭(12)。

機身(1)側面設置有散熱孔(5)，機身(1)頂部為勻漿容器放置孔(2)，勻漿容器放置孔(2)內壁設有卡槽(4)，勻漿容器放置孔(2)底部設置有旋轉頭(3)。處理組織時，勻漿容器放置入勻漿容器放置孔(2)中，杯蓋(7)底部的旋轉頭連接器(9)下端與旋轉頭(3)接合，旋轉頭連接器(9)上端經由固定軸(10)與刀頭(11)連接，杯蓋(7)透過密封圈(8)與杯身(6)緊密接合，杯身(6)外側壁的嵌卡頭(12)與卡槽(4)接合。

其中關鍵構件為特殊設計的刀頭(11)。刀頭(11)呈四葉刀刃，由上下層疊放置且互相垂直的刀片(13)和刀片(14)組成。刀片(13)分為五段，包含四個彎折，兩端的兩個彎折呈130~150度(優選138度)，中間的兩個彎折呈140~160度(優選148度)；刀片(14)分為三段，包含兩個彎折，兩個彎折呈110~130度(優選123度)；工作時，將組織塊裝入杯身(6)，蓋上杯蓋(7)後，將勻漿容器放入勻漿容器放置孔(2)內，藉由控制器-旋轉頭(3) -旋轉頭連接器(9)-固定軸(10)-刀頭(11)的一系列傳動，帶動刀頭(11)轉動，從而發揮勻漿作用。

雖然目前市場上已經有少量與本發明所使用的組織細胞處理器PlacentaPro作用相似的儀器，如德國美天旎公司的gentleMACS標本處理器也能分離組織得到細胞懸液。但是，第一，市面上已有的儀器的處理量都相對較小，一般只能處理5克以下的樣本，而PlacentaPro最多能處理400克的樣本，為建立細胞庫和大規模細胞培養奠定了很好的基礎；第二，市面上已有的儀器由於結構限制，只能處理易破碎的組織，如脾臟、肝臟、肺等，對於具有很強韌性的胎兒附屬物組織，如含有大量華通氏膠的臍帶也無能為力，而PlacentaPro由於結構的特殊性，能夠在不破壞細胞活性的情況下，將韌性大的組織，如胎兒附屬物組織進行勻漿，直接分離得到細胞/細胞團。

本發明的技術方案包括組織的清洗、勻漿前處理、組織勻漿處理、過濾回收及細胞庫構建的過程，具體步驟如下：

(1)組織清洗：使用適量清洗液(例如含雙抗的PBS緩衝液)對獲得的胎兒附屬物組織進行沖洗，直到組織表面的殘留血液被沖洗乾淨。

(2)組織勻漿前處理：根據組織細胞處理器PlacentaPro的勻漿容器的大小，將得到的組織剪成小塊，放入組織細胞處理器中，加入0.5~2倍質量的緩衝液(例如PBS緩衝液)並密封組織細胞處理器；

(3)組織勻漿處理：組織細胞處理器PlacentaPro透過轉子帶動特殊刀頭的旋轉將組織切碎和勻漿，對組織進行細胞分離和提取；

(4)組織過濾處理，細胞收集：將步驟(3)得到的組織碎片轉移至過濾裝置，對胎盤組織進行研磨，收集濾液，對濾液進行細胞清洗，離心收集細胞；對臍帶組織收集過濾器上的細胞團，清洗細胞團並收集。

(5)分離的細胞(團)構建細胞庫：將步驟(4)分離的細胞(團)以液態氮保存，按其ABO/Rh血型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞資訊檔案，即構建出細胞庫。

根據本發明步驟(1)所述需要處理的樣品是胎兒附屬物組織，包括胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織、胎盤羊膜組織和臍帶組織。

根據本發明步驟(2)所述處理的組織樣品大小為：胎盤小葉和基蛻膜30~120g，優選為60~90g，加入的緩衝液或培養基的體積為20~110mL，優選為50~80mL；臍帶5~30g，優選為10~20g，加入的緩衝液或培養基的體積為10~45mL，優選為15~30mL；胎盤底座100~300g，優選為150~200g，加入的緩衝液或培養基的體積為100~300mL，優選為150~200mL；胎盤羊膜5~25g，優選為10~20g，加入的緩衝液或培養基的體積為10~40mL，優選為15~25mL；

根據本發明步驟(2)所述組織細胞處理器PlacentaPro處理：胎盤小葉和基蛻膜組織的處理轉速為1000~2400rpm，優選為1400~1800rpm；臍帶組織的處理轉速為1500~3500rpm，優選為2500~2800rpm；胎盤底座組織的處理轉速為1500~2500rpm，優選為2000rpm；胎盤羊膜組織的處理轉速為2000~3000rpm，優選為2300~2500rpm；根據本發明步驟(4)所述組織碎片過濾裝置為100~400目金屬過濾器；胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織過濾時優選200目的過濾器；臍帶組織、胎盤羊膜組織過濾時優選400目的過濾器。

本發明的有益效果為：本發明採用自行研製的組織細胞處理器PlacentaPro對胎兒附屬物組織細胞進行分離的方法，具有操作簡單、耗時短、無外源試劑加入、易於標準化和品質控制以及細胞獲得量大等優點，對於提高細胞庫的構建效率，保障細胞庫優質的品質具有重要的意義。

1‧‧‧機身

2‧‧‧勻漿容器放置孔

3‧‧‧旋轉頭

4‧‧‧卡槽

5‧‧‧散熱孔

6‧‧‧杯體

7‧‧‧杯蓋

8‧‧‧密封圈

9‧‧‧旋轉頭連接器

10‧‧‧固定軸

11‧‧‧刀頭

12‧‧‧嵌卡頭

13，14‧‧‧刀片

第1圖為組織細胞處理器PlacentaPro的結構示意圖。

第2圖為原代細胞的培養形態。

第3圖為臍帶組織處理得到的細胞團培養並傳至P3代的細胞培養形態。

第4圖為臍帶組織處理得到的細胞團培養並傳至P3代的細胞流式圖。

第5圖為胎盤羊膜組織處理後得到的細胞團的原代培養形態圖。

實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所使用的試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以利用市購獲得的常規產品。

實施例1：採用組織勻漿法分離胎盤小葉細胞構建細胞庫

胎盤小葉組織勻漿的方法包括以下步驟：

(1)胎盤組織清洗：胎盤組織是在生物安全櫃內進行處理，根據胎盤大小使用適量含1%雙抗的PBS緩衝液對胎盤組織進行沖洗，至胎盤組織表面殘留血液沖洗乾淨，胎盤表面無血液凝塊。

(2)胎盤小葉組織前期處理：使用手術剪，從步驟(1)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把胎盤小葉轉移到培養皿上並剪成小塊，把60~90克的胎盤小葉組織塊放入組織細胞處理器PlacentaPro的勻漿容器中，加入50~80毫升的PBS並密封處理杯。

(3)胎盤小葉組織勻漿處理：利用組織細胞處理器PlacentaPro將步驟(2)得到的胎盤小葉組織塊經由組織切碎和勻漿的物理處理進行細胞分離和提取，攪拌速度為1400rpm~1800rpm之間，處理時間為5分鐘。

(4)胎盤小葉組織過濾處理：將步驟(3)處理完畢後的胎盤小葉組織轉移到200目金屬過濾器上，對組織碎片進行研磨並利用另一個培養皿收集過濾完的液體，分2次往金屬過濾器加入10~15mL的PBS清洗組織並繼續研磨。

(5)細胞計數：用50mL離心管收集步驟(4)獲得的細胞懸液，以1400rpm/分鐘的速度離心10分鐘，去除上清液並加入PBS重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數。

胎盤小葉組織細胞分離處理測試共分8組分別進行，每一組進行兩個不同的測試設定，分別為(a)1400rpm，5分鐘和(b)1800rpm，5分鐘。胎盤組織源自於8個不同的提供者，處理量在60克左右。實驗結果如表1所示。

由以上結果可以看出，全自動胎盤組織器在測試條件為 (a)1400rpm，5分鐘和測試條件為(b)1800rpm，5分鐘的設定下處理胎盤小葉組織，最終得到的每克有核細胞的平均數分別為2.98×10⁶和2.8×10⁶，兩者得到的細胞數量沒有明顯差別，證明了速度的提升對於細胞提取的效率沒有明確的線性關係。而且，在補充的試驗中，經由流式細胞測試發現，其中的細胞表面標誌物CD34陽性表達的細胞分別是2.92×10⁴/g和2.78×10⁴/g；另一個補充實驗中，過高和過低的轉速以及勻漿時間的不合適都會影響細胞提取的效率。經由存活率測試可以發現，經過胎盤組織處理器分離並獲取的有核細胞依然保持良好的活力，8個測試結果存活率都能達到98%以上。以上結果表明，全自動組織細胞處理器PlacentaPro能有效地從胎盤小葉組織中分離並提取有核細胞，而且簡單易行、耗時短，為細胞庫的構建提供了有效保障。

實施例2：胎盤小葉組織勻漿處理和手工處理的比較實驗

比較實驗分8組進行。參考實施例1的方法進行全自動組織處理實驗。參考中國專利申請號CN201210292509.9(公開號CN102807966A)中所述方法進行手工處理(消化)實驗。胎盤組織源自8個不同的提供者，處理量在60~90克之間。對比實驗結果如表2所示。

結果表明，胎盤小葉組織經過全自動組織細胞處理器 PlacentaPro處理後獲得的每克平均細胞量是手工處理的2.4倍，明顯高於手工消化處理所得細胞量，為細胞庫的建立提供了大量細胞，節省了後續細胞擴增的時間。

實施例3：胎盤小葉組織經勻漿法分離的細胞原代生長情況

(1)細胞培養前準備：以1份細胞懸液比2~3份紅血球裂解液的比例加入紅血球裂解液(Roche)，在15~25℃的環境下培養10~15分鐘，放進離心機以1400rpm的速度離心10分鐘，去除上清液，觀察紅血球裂解情況，如有需要再重複此步驟進行裂解。裂解完畢後，加入PBS重懸細胞並抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機以1400rpm的速度離心10分鐘以清洗細胞，去除上清液，加入間充質幹細胞培養基(15% FBS+1% L-Glutamine+0.05% Gentamicin+ 84% DMEM-F12)重懸細胞，並以2~5×10⁴/cm²的密度把胎盤來源有核細胞接種到培養瓶中。

(2)原代細胞培養：把培養瓶放進CO₂濃度為5%，溫度為37℃的培養箱進行培養，培養至第6天時進行第一次半換液，在第9天進行第二次半換液，在第12天把平皿裡面的培養基抽走，重新加入15mL培養基，往後每2~3天進行一次全換液。透過顯微鏡觀察細胞培養形態，細胞貼壁生長呈典型的梭形，有胞漿突起為成纖維細胞樣，細胞漿豐富，核仁明顯，呈漩渦狀生長(見第2圖)。

(3)細胞傳代：當培養瓶裡面的貼壁細胞融合率達到 80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)把貼壁細胞脫離培養瓶底部，離心後把上清液抽走並加入細胞專用培養基重懸細胞，接種於細胞培養瓶進行傳代並繼續擴增培養，往後每2天換液一次直至融合率達到80%後，即得，必要時再進行傳代。

針對實施例3提取的8組細胞進行原代培養，生長結果如表3所示。

8組胎盤小葉經組織細胞處理器PlacentaPro分離獲得的有核細胞在相同培養條件，各組細胞的原代生長狀態基本一致，都在12~14天左右原代細胞長滿。這種一致性表示，全自動勻漿法在進行大規模樣品處理時，樣品間的差異性小，標準化程度高，具有較高的品質保證。

實施例4：採用組織勻漿法分離臍帶細胞團

臍帶組織勻漿方法包括以下步驟：

(1)臍帶組織清洗：臍帶組織是在生物安全櫃內進行處理，將臍帶組織剖開，取出臍帶中的血管，然後用含1%雙抗的PBS緩衝液對臍帶組織進行沖洗，至臍帶組織表面殘留血液沖洗乾淨，臍帶表面無血液凝塊。

(2)臍帶組織前期處理：將步驟(1)得到的臍帶組織轉移到培養皿上，使用手術剪將臍帶組織剪成2cm*2cm小塊，把10~20克的臍帶組織塊放入組織細胞處理器PlacentaPro的勻漿容器中，加入20~30毫升含1%雙抗的PBS並密封勻漿容器。

(3)臍帶組織勻漿處理：使用組織細胞處理器PlacentaPro將步驟(2)得到的臍帶組織經由組織切碎和勻漿的物理處理進行細胞團分離和提取，攪拌速度為2500~2800rpm，處理時間為10分鐘。

(4)臍帶組織過濾處理：將步驟(3)處理完畢後的臍帶組織轉移到400目金屬過濾器上，收集過濾器上的細胞團，分2次用5mL的生理鹽水清洗細胞團。

(5)臍帶細胞團貼壁培養原代細胞：將步驟(4)得到的細胞團鋪在平皿中，加間充質幹細胞培養基(15% FBS+1% L-Glutamine+0.05% Gentamicin+84% DMEM-F12)，把平皿放進CO₂濃度為5%的37℃培養箱進行培養，培養至第6天時進行第一次半換液，在第9天進行第二次半換液，在第12天開始，每2到3天進行一次全換液。透過顯微鏡觀察細胞培養形態，細胞貼壁生長呈典型的梭形，有胞漿突起為成纖維細胞樣，細胞漿豐富，核仁明顯，呈漩渦狀生長。

(6)細胞傳代：當平皿裡面的貼壁細胞融合率達到80% 左右，可利用消化酶(TrypLE Express)把貼壁細胞脫離培養瓶底部，離心後把上清液抽走並加入細胞專用培養基重懸細胞，接種於細胞培養瓶進行傳代並繼續擴增培養，往後每2天換液一次直至融合率達到80%後，即得，必要時再進行傳代。第3圖為臍帶組織處理得到的細胞團培養並傳至P3代的細胞培養形態圖，第4圖為臍帶組織處理得到的細胞團培養並傳至P3代的細胞流式圖。

實施例5：採用組織勻漿法分離胎盤底座細胞

胎盤底座組織勻漿的方法包括以下步驟：

(1)胎盤組織清洗：胎盤組織是在生物安全櫃內進行處理，根據胎盤大小使用適量PBS緩衝液對胎盤組織進行沖洗2~3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗乾淨，胎盤表面無血液凝塊。

(2)胎盤底座組織前期處理：使用手術剪，從步驟(1)得到的胎盤組織上剪下胎盤底座，把胎盤底座轉移到培養皿上並剪成小塊，把150~200克之間的胎盤底座組織塊放入組織細胞處理器 PlacentaPro的勻漿容器中，加入150~200毫升的PBS並密封勻漿容器。

(3)胎盤底座組織勻漿處理：利用組織細胞處理器 PlacentaPro將步驟(2)得到的胎盤底座組織經由組織切碎和勻漿的物理處理進行細胞分離和提取，攪拌速度為2000rpm之間，處理時間為5分鐘。

(4)胎盤底座組織過濾處理：將步驟(3)處理完畢後的胎盤底座組織轉移到200目金屬過濾器上，對組織碎片進行研磨並利用另一個培養皿收集過濾完的液體，分2次往金屬過濾器加入20~25mL的PBS清洗組織並繼續研磨。

(5)細胞計數：用50mL離心管收集步驟(4)獲得的細胞懸液，以1400rpm/分鐘的速度離心10分鐘，去上清液並加入PBS重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數。

胎盤底座組織細胞分離處理測試共分8組分別進行，測試條件為2000rpm，5分鐘。胎盤組織源自8個不同的提供者，處理量在150~200克之間。實驗結果如表4所示。

由以上結果可以看出，組織細胞處理器PlacentaPro在測試條件為2000rpm，5分鐘的設定下處理胎盤底座組織，最終得到的每克有核細胞平均數為6.1×10⁵。在補充的試驗中，過高和過低的轉速以及勻漿時間的不合適都會影響細胞提取的效率。經由存活率測試可以發現，經過組織細胞處理器分離並獲取的有核細胞依然保持良好的活力，8個測試結果存活率都能達到99%以上。以上結果表示，全自動組織細胞處理器PlacentaPro能有效地從胎盤底座組織中分離並提取有核細胞，而且簡單易行、耗時短，為細胞庫的構建提供了有效保障。

實施例6：採用組織勻漿法分離胎盤羊膜細胞

胎盤羊膜組織勻漿方法包括以下步驟：

(1)胎盤組織清洗：臍帶組織是在生物安全櫃內進行處理，根據臍帶大小使用適量PBS緩衝液對臍帶組織進行沖洗2~3遍，使臍帶組織表面殘留血液沖洗乾淨，臍帶表面無血液凝塊。

(2)胎盤羊膜組織前期處理：使用手術剪，從步驟(1)得到的胎盤組織上剪下胎盤羊膜，把羊膜組織轉移到培養皿上並剪成小塊，把10~20克的胎盤羊膜組織塊放入組織細胞處理器PlacentaPro的勻漿容器中，加入15~25毫升的PBS並密封勻漿容器。

(3)胎盤羊膜組織勻漿處理：使用組織細胞處理器PlacentaPro將步驟(2)得到的胎盤羊膜組織經由組織切碎和勻漿的物理處理進行細胞分離和提取，攪拌速度為2300~2500rpm，處理時間為8分鐘。

(4)胎盤羊膜組織過濾處理：將步驟(3)處理完畢後的胎盤羊膜組織轉移到400目金屬過濾器上，收集過濾器上的細胞團，分2次用5mL的PBS緩衝液清洗細胞團。

(5)原代細胞培養：在步驟(5)獲得的細胞團中加入羊膜上皮細胞培養基(10% FBS+90% DMEM+10ng/mL EGF+4mmol/L穀氨醯胺)，把平皿放進CO₂濃度為5%，溫度為37℃的培養箱進行培養，培養至第6天時進行第一次半換液，在第9天進行第二次半換液，在第12天開始，每2到3天進行一次全換液。透過顯微鏡觀察細胞培養形態，細胞貼壁生長呈飽滿的鵝卵石狀，如第5圖所示。

實施例7：胎兒附屬物組織勻漿法分離細胞(團)的凍存

經過組織細胞處理器勻漿處理、過濾並清洗的細胞/細胞團，若暫時不適用的話，可進行深低溫冷凍保存，待以後需要時再取出復甦培養。

胎盤細胞的凍存方法如下：取1×10⁶細胞加入到1mL細胞凍存液(含65份DMEM-F12+10份二甲基亞碸+15份人血白蛋白)中，經過程式降溫進行冷凍處理，最後將冷凍的樣品放入液態氮罐中凍存。

臍帶細胞團的凍存方法如下：取1mL細胞凍存液(含80份人血白蛋白+20份二甲基亞碸)加入凍存管中，將臍帶細胞團加入凍存液中，總體積不超過1.8mL，經過程式降溫進行冷凍處理，最後將冷凍的樣品放入液氮罐中凍存。

實施例8：胎兒附屬物細胞(團)庫的建立

1、細胞來源的調查

記錄胎盤提供者(父母)的詳細資料，並記錄在案。

2、細胞污染的檢測

利用少量細胞培養，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。利用病原學方法，檢測細胞是否受到B肝兩對半、C肝、愛滋、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST感染。

3、遺傳病的檢測

利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。

4、HLA-ABC/DR配型

檢測細胞HLA-ABC/DR表型，並記錄在案。

5、細胞活性的檢測

利用台盼藍染色法計數凍存前後活細胞的數目。

6、胎盤幹細胞資料庫的建立

在保存正常的胎盤幹細胞後，建立胎盤幹細胞的資料庫，其中包括前五項資料，並建立與凍存細胞的關聯。