CN107541485A - 一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法。包括处死、卵巢处理、消化、过滤、离心洗涤、分离的步骤，其中卵巢处理步骤中对卵巢进行初步剪碎后，使用匀浆操作破碎卵巢组织3‑10min；分离步骤中在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。本发明首次通过采用匀浆‑消化的分离方法来分离鹅早期卵泡(原始、初级、次级卵泡)，解决了以前其他物种中卵泡分离方法中机械分离所用时间过长的问题，进而提高了分离后的卵泡活性，减小了对卵泡的损伤；消化后采取显微操作，即显微镜下使用拉伸玻璃巴氏吸管吸取卵泡，从而做到对卵泡的单个挑取，也能记录卵泡的直径与阶段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法。
背景技术
禽类产蛋性能与其卵泡生长发育能力密切相关，随着鹅产业的快速发展，鹅产蛋性能较低(平均年产蛋量仅为40～90枚)已成为制约鹅产业化发展的重要因素。鹅产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。鹅的早期卵泡主要分为原始、初级、次级卵泡，在鹅早期卵泡发育至等级前卵泡的过程中会涉及多种生物学进程，包括卵泡激活、募集、生长发育、凋亡等，这些过程为后期的鹅卵泡等级发育制度提供基础，进而影响鹅产蛋性能，因此研究卵泡的发育过程及其调控机理具有重要意义。卵泡分离方法具有重要的实用价值。卵泡体外培养无疑是研究早期原始卵泡激活、生长发育及闭锁等关键过程的重要技术手段(E.P.A.Jorssen等，2015)，而建立一种有效的且对卵泡损伤较小的分离方法是开展卵泡体外培养的前提。目前禽类早期卵泡的分离技术手段主要有酶消化法、机械分离法和酶加机械法等，但存在分离效果不佳、操作时间长、影响卵泡活性、不能实现确定阶段单个卵泡的分离、对卵泡损伤大的缺陷等缺点，且在水禽相关研究上并未发现成功的卵泡分离方法。
发明的内容
本发明解决的技术问题是，目前禽类早期卵泡的分离技术手段存在分离效果不佳、操作时间长、影响卵泡活性、不能实现确定阶段单个卵泡的分离、对卵泡损伤大的缺陷，且在水禽相关研究上并未发现成功的卵泡分离方法。
为解决上述问题，本发明首次通过采用匀浆-消化的分离方法来分离鹅早期卵泡(原始、初级、次级卵泡)，构建了一种分离效果好、操作时间短的单个卵泡分离方法，并且能针对实验要求分离特定阶段的单个卵泡，并解决了以前在其他物种上的卵泡分离方法中存在的机械分离所用时间过长的问题(传统机械分离用时半个小时以上，而本方法用时5分钟)，进而提高了分离后的卵泡活性，减小了对卵泡的损伤。消化后采取显微操作，即显微镜下使用拉伸玻璃巴氏吸管吸取卵泡，从而做到对卵泡的单个挑取，也能记录卵泡的直径与阶段。
为达到上述目的，本发明提供一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，包括处死、卵巢处理、消化、过滤、离心洗涤、分离的步骤，其中所述卵巢处理步骤中对卵巢进行初步剪碎后，使用匀浆操作破碎卵巢组织3-10min；所述分离步骤中在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。
由以下步骤组成：
(1)处死：将鹅颈动脉放血处死，取出卵巢清洗；
(2)卵巢处理：去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织；对卵巢进行初步剪碎后，使用匀浆操作破碎卵巢组织；过滤；
(3)消化：加入混合消化液消化，而后加入胎牛血清终止消化；
(4)过滤：过滤后获得卵泡悬液；
(5)离心洗涤：反复离心洗涤，收集细胞沉淀于α-MEM培养基中；
(6)分离：在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。
具体的由以下步骤组成：
(1)处死：将健康的5周龄四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭鹅腹部后剪开腹部皮肤取出卵巢，将取得的卵巢放入70％的酒精清洗两次(一次10s，对卵巢组织进行初步消毒)，用生理盐水冲洗3次(清除卵巢表面酒精、血污等不利于卵泡分离的物体)，转移至磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中清洗2次(创造适合卵泡长时间体外操作的环境。)。
(2)卵巢处理：在PBS溶液中，去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织等，而后转至装有10mlPBS的干净50ml离心管中；在无菌环境中用手术剪将卵巢初步剪碎(耗时2分钟)，而后使用匀浆机进行3-10min分钟的匀浆操作(将卵泡分散，变为单个，是比机械分离更高效的一种形式，匀浆操作为将装有卵巢悬液的离心管放于匀浆机转子下，保持水平使其匀速匀浆，多次试验验证匀浆不会损伤卵泡，卵泡能保持较好的形态特征)，优选为3600rpm转速下匀浆6min，匀浆过程中多次冲洗匀浆机柱头，匀浆结束后使用不锈钢过滤网过滤，优选为70目滤网，使用PBS清洗滤网2次并收集滤液，而后等待消化。
(3)消化：将卵泡悬液离心(条件为1次，1500RPM，5MIN)后，将浑浊PBS缓慢倒掉，加入3-5ml混合消化液，摇晃混匀后封口，置于37℃震荡水浴锅中消化40min(震荡水浴能为卵泡消化提供更好的条件)；再向消化完全的卵泡混合液加入适量胎牛血清，终止消化。
(4)过滤：将消化后的卵泡混合液用不锈钢过滤网过滤，优选为150目滤网，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，滤液使用灭菌培养皿收集，经过多次轻微吹打后备用。
(5)离心洗涤：反复离心洗涤(条件为2次，1500RPM，5MIN)，收集细胞沉淀于α-MEM培养基中；
(6)分离：将卵泡混合液放于体视显微镜的恒温操作板上，在显微镜先使用拉伸至目的直径的玻璃巴氏吸管吸取单个卵泡，将挑出的卵泡放入干净磷酸盐缓冲液中，而后放于倒置相差显微镜上，观察其直径和结构，按卵泡等级归类。
进一步的，上述步骤中所述PBS溶液的配置步骤如下：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压(121℃，100kpa)灭菌30min。
进一步的，上述步骤所述细胞培养基是：α-MEM。
进一步的，上述步骤所述匀浆机型号是：IKA T18 digital ULTRA TURRAX
进一步的，上述步骤所述消化混合液组成是：150IU/ml DNaseⅠ+0.75mg/ml胶原酶Ⅰ+α-MEM。
本研究首次采用机械匀浆辅以酶消化的方法建立出一种有效的、且对鹅原始和初级卵泡损伤较小的分离技术手段，旨在为后期探究鹅卵泡发育中基因表达模式、组织学结构变化和卵泡发育分子机理等研究提供技术支撑。
本发明具有以下有益效果：
(1)首次采用机械匀浆辅以酶消化的方法建立出一种有效的、且对鹅原始和初级卵泡损伤较小的分离技术手段，匀浆只用时5分钟左右，解决了以前分离方法中机械分离所用时间过长的问题，提高了分离后的卵泡活性，减小了对卵泡的损伤。
(2)消化后采取显微操作，即显微镜下使用拉伸玻璃巴氏吸管吸取卵泡，能够做到对卵泡的单个挑取，也能记录卵泡的直径与阶段。
附图说明
图1是分离的单个原始卵泡(10*10)；
图2是分离的单个初级卵泡(10*10)；
图3是分离的单个次级卵泡(10*10)；
图4是消化后卵泡整体图像(4*10)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，由以下步骤组成：
(1)处死：将健康的5周龄四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭鹅腹部后剪开腹部皮肤取出卵巢，将取得的卵巢放入70％的酒精清洗两次(一次10s)，用生理盐水冲洗3次，转移至磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中清洗2次。所述PBS溶液的配置步骤如下：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2，用去离子水定容至1L，高温高压(121℃，100kpa)灭菌30min。
(2)卵巢处理：在PBS溶液中，去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织等，而后转至装有10mlPBS的干净50ml离心管中；在无菌环境中用手术剪将卵巢初步剪碎(耗时2分钟)，而后使用匀浆机进行6min分钟的匀浆操作)，匀浆机型号是：IKA T18 digital ULTRA TURRAX，优选为3600rpm转速下匀浆6min，匀浆过程中多次冲洗匀浆机柱头，匀浆结束后使用70目不锈钢过滤网对卵泡悬液过滤，再使用磷酸盐缓冲液清洗滤网2次并收集滤液，而后等待消化。
(3)消化：将卵泡悬液离心(条件为1次，1500RPM，5MIN)后，将浑浊PBS缓慢倒掉，加入3ml混合消化液，摇晃混匀后封口，置于37℃震荡水浴锅中消化40min；再向消化完全的卵泡混合液加入适量胎牛血清，终止消化。混合消化液组成是：150IU/ml DNase Ⅰ、0.75mg/ml胶原酶Ⅰ和细胞培养液，所述细胞培养基是：α-MEM。
(4)过滤：将消化后的卵泡混合液用150目不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，滤液使用灭菌培养皿收集，经过多次轻微吹打后备用。
(5)离心洗涤：反复离心洗涤，收集细胞沉淀于α-MEM培养基中；
(6)分离：将卵泡混合液放于体视显微镜的恒温操作板上，在显微镜先使用拉伸至目的直径的玻璃巴氏吸管吸取单个卵泡，将挑出的卵泡放入干净磷酸盐缓冲液中，而后放于倒置相差显微镜上，观察其直径和结构，按卵泡等级归类。
实施例2：
一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，由以下步骤组成：
(1)处死：将健康的5周龄四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭鹅腹部后剪开腹部皮肤取出卵巢，将取得的卵巢放入70％的酒精清洗两次(一次10s)，用生理盐水冲洗3次，转移至磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中清洗2次。所述PBS溶液的配置步骤如下：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.4，用去离子水定容至1L，高温高压(121℃，100kpa)灭菌30min。
(2)卵巢处理：在PBS溶液中，去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织等，而后转至装有10mlPBS的干净50ml离心管中；在无菌环境中用手术剪将卵巢初步剪碎(耗时2分钟)，而后使用匀浆机进行6min分钟的匀浆操作，匀浆机型号是：IKA T18 digital ULTRA TURRAX，优选为3600rpm转速下匀浆6min，匀浆过程中多次冲洗匀浆机柱头，匀浆结束后使用70目不锈钢过滤网对卵泡悬液过滤，再使用磷酸盐缓冲液清洗滤网2次并收集滤液，而后等待消化。
(3)消化：将卵泡悬液离心(条件为1次，1500RPM，5MIN)后，将浑浊PBS缓慢倒掉，加入5ml混合消化液，摇晃混匀后封口，置于37℃震荡水浴锅中消化40min；再向消化完全的卵泡混合液加入适量胎牛血清，终止消化。混合消化液组成是：150IU/ml DNaseⅠ、0.75mg/ml胶原酶Ⅰ和细胞培养液，所述细胞培养基是：α-MEM。
(4)过滤：将消化后的卵泡混合液用150目不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，滤液使用灭菌培养皿收集，经过多次轻微吹打后备用。
(5)离心洗涤：反复离心洗涤，收集细胞沉淀于α-MEM培养基中；
(6)分离：将卵泡混合液放于体视显微镜的恒温操作板上，在显微镜先使用拉伸至目的直径的玻璃巴氏吸管吸取单个卵泡，将挑出的卵泡放入干净磷酸盐缓冲液中，而后放于倒置相差显微镜上，观察其直径和结构，按卵泡等级归类。
Claims (9)
1.一种鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，包括处死、卵巢处理、消化、过滤、离心洗涤、分离的步骤，其特征在于：所述卵巢处理步骤中对卵巢进行初步剪碎后，使用匀浆操作破碎卵巢组织3-10min；所述分离步骤中在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。
2.如权利要求1所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)处死：将鹅颈动脉放血处死，取出卵巢清洗；
(2)卵巢处理：去掉卵巢髓质部、血管、结缔组织；对卵巢进行初步剪碎后，使用匀浆操作破碎卵巢组织；过滤；
(3)消化：加入混合消化液消化，而后加入胎牛血清终止消化；
(4)过滤：过滤后获得卵泡悬液；
(5)离心洗涤：反复离心洗涤，收集卵泡沉淀于α-MEM培养基中；
(6)分离：在体视显微镜下分离并测量单个卵泡。
3.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(1)将鹅处死后，用75％酒精棉擦拭鹅腹部后剪开腹部皮肤取出卵巢，将取得的卵巢放入70％的酒精清洗两次，再用生理盐水冲洗3次，最后转移至磷酸盐缓冲液中清洗2次。
4.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(2)使用匀浆机进行3-10min分钟的匀浆操作，转速为3600rpm，匀浆过程中多次冲洗匀浆机柱头，匀浆结束后使用70目不锈钢过滤网对卵泡悬液过滤，再使用磷酸盐缓冲液清洗滤网2次并收集滤液。
5.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(3)为37℃震荡水浴锅中消化30-50min。
6.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(3)混合消化液组成是：以α-MEM培养基为溶剂配置的150IU/ml DNase Ⅰ和0.75mg/ml胶原酶的混合消化液。
7.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(4)将消化后的卵泡混合液用150目不锈钢过滤网过滤，并用细胞培养液冲洗过滤网，滤液使用灭菌培养皿收集，经轻微吹打后备用。
8.如权利要求6或7所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述细胞培养液为α-MEM。
9.如权利要求2所述的鹅原始、初级、次级卵泡的分离方法，其特征在于：所述步骤(6)为将卵泡混合液放于体视显微镜的恒温操作板上，在显微镜下使用已拉伸至目的直径的玻璃巴氏吸管吸取单个卵泡，将挑出的卵泡放入干净磷酸盐缓冲液中，而后放于倒置相差显微镜上，观察其直径和结构，按卵泡等级归类。
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