CN103881968B - 一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法 - Google Patents
一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其分离培养方法如下：将鹅颈动脉放血处死，取出卵巢，用磷酸盐缓冲液冲去血污；剥净卵泡外层结缔组织和血管网；在卵泡柄的对面无血管区切开，稍微用力挤出卵黄，分离颗粒细胞；胶原蛋白酶水浴消化；加入胎牛血清终止消化；过滤，获得颗粒细胞悬液；反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含3%胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基；接种到细胞培养皿中，培养，使之贴壁，获得鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞。本发明公布了一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养的方法，采用本方案可以很好的将颗粒细胞分离，且能获得较纯的颗粒细胞，具有切实可行，可操作性强，稳定可靠，重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法。
背景技术
近年来，随着鹅产业的快速发展，鹅产蛋性能较低(一般年产蛋量仅为40～90枚)已成为制约鹅产业化发展的重要因素，是鹅产业亟待解决的关键问题之一。鹅产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。鹅卵泡经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系，原始卵泡经等级前发育进入小黄卵泡库，随后被选择并进入等级发育。家禽可通过调控起始发育卵泡的数量和小卵泡(白卵泡和小黄卵泡)闭锁来调节卵巢的功能，同时还可通过闭锁机制清除排卵前卵泡来调节排卵的速率，进而影响家禽的产蛋性能。
卵巢颗粒细胞是动物生殖过程中非常重要的一类细胞，在动物体内，颗粒细胞的增殖分泌功能与卵母细胞的生长和成熟紧密相关。从原始卵泡发育到卵泡成熟排卵，颗粒细胞作为主要的功能细胞，其增殖与分化直接影响到卵巢功能。原始卵泡发育完成后，颗粒细胞表达雌激素受体和促性腺激素释放激素受体，成为对激素具有应答能力的初级卵泡，之后依次发育成为等级卵泡。在体外，颗粒细胞能直接影响卵巢卵母细胞的发育，而颗粒细胞的凋亡则直接导致卵泡的闭锁。因此，作为卵泡体细胞的颗粒细胞，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞的发育、成熟及其功能起重要的调控作用，进而影响卵泡的启动、发育、成熟及闭锁的全过程。随着动物卵泡闭锁中颗粒细胞凋亡的发现，颗粒细胞在卵泡发育中的作用开始被人们重视。因此，探寻一种鹅卵泡颗粒细胞体外培养的方法，对颗粒细胞进行深入的研究，对于阐明颗粒细胞在鹅卵泡发育过程中所发挥的生物学功能以及调控机理具有重要的理论意义和实际意义。
发明内容
本发明提供一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，本发明解决了目前尚未有完善的鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养方法的问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其操作步骤是。
(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中，迅速拿入细胞培养室中。
(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污放入装有PBS的培养皿中。
(3)将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中。
(4)将初次分离的颗粒细胞放在37℃预热的装有PBS的培养皿中清洗5次，洗净卵黄。
(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中并加入有2mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织(机械分离持续5min)，再将其封口后，置于37℃水浴消化4min。
(6)向消化完全的颗粒细胞加入适量胎牛血清，终止消化。
(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rmp离心10min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次。
(8)加入含有胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eaglemedium,DMEM)培养液吹打细胞是细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×106个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2mL。
(9)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5％的CO2。
上述步骤中所述PBS溶液是：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压(121℃，100kpa)灭菌30min。
上述步骤中所述胶原蛋白酶是：100mg的胶原蛋白酶稀释于100mL的水中，其终浓度为1mg/mL。
上述步骤中所述不锈钢过滤网是：200目不锈钢过滤网。
上述步骤中所述含有胎牛血清的DMEM培养液是：含有3％胎牛血清的DMEM，其为体积百分比。
本发明是针对鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养而设计的方法。该分离培养方法具有以下优点。
本发明的培养方法中，采用的试剂及培养基均可市售获得，价格低廉，经济实用，操作简便易行。
采用本发明分离培养的鹅原代颗粒细胞纯度高，细胞贴壁牢，活力高，培养细胞的成活率高，稳定可靠。
附图说明
图1鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的显微照片：图中是鹅颗粒细胞分离培养0h、24h、48h和72h的显微照片。
图2鹅原代颗粒细胞4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染图片。
图3鹅原代颗粒细胞免疫荧光(FITC)鉴定图片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
仪器与试剂。
恒温细胞培养箱(WTC Binder,Germany)，6孔细胞培养皿(corning,America)，巴斯德吸管，超净工作台，水浴锅，200目的不锈钢过滤网(索莱宝，中国)，针头过滤器(corning,America)，Nikon ECLIPSE 90i荧光显微镜(Nikon,Japan)，OLYMPUS IX 70倒置显微镜(Nikon,Japan)，离心机(Thermo,Germany)，超纯水仪；
DMEM-F12(corning,USA)，胎牛血清(hyclone,USA)，PBS(碧云天，中国)，胶原蛋白酶Ⅱ型(solarbio,China)，DAPI(碧云天，中国)，多聚甲醛，TritonX-100，封闭液(碧云天，中国)，Tween-20(碧云天，中国)，Rabbit Anti-Goose FSHR Antibody(eiaab,USA)，FITC-Goat Anti-Rabbit Antibody(eiaab,USA)。
实施例1。
鹅原代颗粒细胞的分离培养方法，其操作步骤是。
(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用PBS冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中，迅速拿入细胞培养室中。
(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污放入装有PBS的培养皿中。
(3)将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄成分，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中。
(4)将初次分离的颗粒细胞放在37℃预热的装有PBS的培养皿中清洗5次，洗净卵黄。
(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中，用眼科剪剪成小块组织(机械分离持续5min)，再将其封口后，置于37℃水浴消化4min。
(6)向消化完全的颗粒细胞加入适量胎牛血清，终止消化。
(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rmp离心10min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次。
(8)加入含有胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞是细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×106个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2mL。
(9)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5％的CO2。
上述步骤中所述PBS溶液是：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压(121℃，100kpa)灭菌30min。
上述步骤中所述胶原蛋白酶是：100mg的胶原蛋白酶稀释于100mL的水中，其终浓度为1mg/mL。
上述步骤中所述不锈钢过滤网是：200目不锈钢过滤网。
上述步骤中所述含有胎牛血清的DMEM培养液是：含有3％胎牛血清的DMEM。其为体积百分比。
实施例2。
实验方法。
(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用PBS冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中，迅速拿入细胞培养室中。
(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污放入装有PBS的培养皿中。
(3)将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄成分，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中。
(4)将初次分离的颗粒细胞放在37℃预热的装有PBS的培养皿中清洗5次，洗净卵黄。
(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中并加入2mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织(机械分离持续5min)，再将其封口后，置于37℃水浴消化4min。
(6)向消化完全的颗粒细胞加入适量胎牛血清，终止消化。
(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rmp离心10min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次。
(8)加入含有胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞是细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×106个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2mL。
(9)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5％的CO2。
细胞形态观察。
在细胞接种后，每天在倒置显微镜下观察细胞形态，并照相。每个时间段用显微镜详细观察、记录细胞形态及生长情况。
颗粒细胞免疫荧光鉴定。
(1)取出培养24h的颗粒细胞细胞，PBS(无双抗)洗3次，每次3min，隔段时间轻摇一次。
(2)倒掉PBS，加4％的多聚甲醛固定30min之后倒掉多聚甲醛，用PBS清洗3次，3min/次，保湿避光。
(3)穿透液(0.05％的TritonX-100和1％的Tween-20溶于PBS溶液中)室温孵育30min，保湿避光。
(4)倒掉穿透液，用PBS清洗2次，2min/次；加入封闭液，37℃封闭1h，倒掉封闭液，PBS洗3次，3min/次。
(5)加入一抗稀释液兔抗鹅FSHR，(一抗按照2μL:800μL一抗稀释液稀释)4℃孵育过夜，注意避光孵育，保湿。
(6)倒掉一抗孵育液，PBS清洗3次，3min/次，加入二抗稀释液(1μL:800μL)37℃孵育1h。
(7)倒掉二抗稀释液，PBS清洗3次，3min/次，注意避光孵育。加入用PBS稀释好的DAPI(1ng/mL)核染溶液500μL，室温避光孵育10min。
(8)倒掉核染溶液，PBS清洗3次，3min/次。
(9)镜检观察，表达FSHR蛋白的细胞发出绿色荧光，在做成功的样品上尽量在24h内镜检，细胞荧光会因为时间过长淬灭。
实验结果。
原代培养的鹅颗粒细胞的形态学观察。
在倒置显微镜下对鹅颗粒细胞进行观察发现，刚分离出来的颗粒细胞呈椭圆形，饱满，透亮度好。培养24h的颗粒细胞贴壁良好，体积变大。培养48h的颗粒细胞体积进一步变大。培养72h后，细胞呈铺路石状。颗粒细胞培养72h后虽然形态发生变化，但应用FITC免疫荧光鉴定发现，培养的细胞为颗粒细胞。
原代培养的鹅颗粒细胞DAPI核染。
DAPI核染后在荧光显微镜下观察，能清晰的看见细胞核。
原代培养的鹅卵巢卵泡颗粒细胞免疫荧光鉴定。
颗粒细胞中能够表达FSHR受体，并能与Rabbit Anti-Goose FSHR Antibody特异性结合，二抗孵育后镜检可以观测到FITC荧光，且荧光在细胞核周围。FSHR受体为细胞膜受体，所以荧光在细胞核染所发出的荧光周围。免疫荧光鉴定结果表明，分离培养的细胞为颗粒细胞。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞培养的方法，其特征在于，其操作步骤为：
(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢卵泡，再用PBS冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中，迅速转移至细胞培养室中；
(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污后，置于含有PBS的培养皿中；
(3)将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄成分，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中；
(4)将初次分离的颗粒细胞置于37℃预热的PBS培养皿中清洗5次，洗净卵黄；
(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中并加入2mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织，机械分离持续5min，再将其封口后，置于37℃水浴消化4min；
(6)向消化完全的颗粒细胞中加入适量胎牛血清，终止消化；
(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rpm离心10min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次；
(8)加入含有胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞使细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×106个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2mL；
(9)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5％的CO2；
上述步骤中所述PBS缓冲液是：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，121℃，100kpa灭菌30min；
上述步骤中所述的含有胎牛血清的DMEM培养液是含3％胎牛血清的DMEM；
上述步骤中所述的胶原蛋白酶是100mg的胶原蛋白酶稀释于100mL的水中，其终浓度为1mg/mL。
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