CN102994452A - 一种高效分离和培养神经元的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效分离和培养神经元的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后胰酶消化、筛网过滤离心、细胞原代培养等4个实验步骤。此外还可包含神经元鉴定的步骤。本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养神经元的方法，使之简单易行，培养获得的神经元生长良好，纯度高，产量大，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。

Description

一种高效分离和培养神经元的方法

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种神经元体外分离和培养方法。

研究背景

神经元，又称神经细胞，是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4～120微米。核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质（旧称尼尔小体），还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。

在神经系统发育过程中，中枢神经系统经历了细胞数量和体积的增长及细胞连接形成改变过程。分化的神经元一经产生，便不可能再进行分裂，神经元的正常分化过程一旦受损， 即有可能影响突触联系的正常建立等一系列过程。对神经元损伤的机制及其防治，一直是人们感兴趣的问题。随着对神经元功能的了解，它已逐渐成为神经生物学领域研究的热点。但由于在体内神经元与其它神经细胞以及其他组织细胞混杂存在，妨碍了其生物学功能的研究及应用。因此需要对神经元进行体外培养并纯化，才能深入了解其形态结构和生物学功能。

由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂增殖，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长，其胞体伸出许多又长又细的突起，在取材过程中容易损伤其突起。在胚胎发育过程中，神经系统发育较早。出生后，神经系统发育基本完成，很多神经元此时已经长出突起，取材于该时期的脑组织对神经元的损伤较大。胚胎时期的神经元分化程度较低，体外生存能力强，该时期神经元之间的联系较少，取材过程中造成的不可逆伤害较小，易于成功培养。

体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。目前神经元的培养分为有血清培养和无血清培养，有血清培养提供细胞培养所必须的营养成分，促进细胞增殖和DNA 的合成，但也为神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等其它神经细胞提供了丰富的营养，但也使得培养的神经元很难分离开。无血清培养技术不利于有丝分裂细胞的生长，可防止非神经元过度增殖，可提高培养的神经元纯度。采用无血清培养能通过添加某些成分，而且可选择性地促进和控制神经元的生长。

目前尚未见有关神经元体外分离或培养方法的专利文献公开，虽然神经元采用常规细胞培养技术，能够在一定程度上达到培养的目的，但存在着与神经胶质细胞，成纤维细胞等其它杂细胞很难分离以及体外培养存活困难等问题，不能满足细胞实验的要求。本室参照国内外培养分离神经元的方法。根据多年的实验研究，改进了大脑皮质神经元的体外培养方法，建立了一种稳定、可靠的获得神经元的方法，为了解神经元的结构与功能，阐明其在脑血管疾病、神经系统疾病中的作用研究提供成功的实验模型。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前体外分离和培养神经元的方法，使之简单易行，培养获得的神经元生长良好，纯度高，产量大，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。

采用以下方案来实现本发明的目的。一种体外分离和培养神经元的方法，含有大脑皮质组织分离、组织细胞捣碎后胰酶消化、筛网过滤离心、细胞原代培养等4个实验步骤。此外还可包含神经元鉴定的步骤。

大脑皮质组织分离

孕鼠颈椎脱臼致死，无菌条件下取出胚胎，然后在无菌条件下取胎鼠两侧大脑半球放入培养皿中，剥离并去除皮层血管组织和软脑膜。

优选方案为：孕15-17天的大鼠颈椎脱臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪开腹部至两侧，无菌条件下取出串珠状胚胎，放入盛有1×PBS的培养皿中，然后在无菌超净台内冰床上取胎鼠两侧大脑半球放入盛有1×PBS的培养皿中，用眼科镊夹取动物双侧大脑皮质置于盛有1×PBS的培养皿内，仔细剥离并去除皮层血管组织和软脑膜，再将大脑皮质移至另一个盛有1×PBS的培养皿内。

需要注意的是解剖过程一定要全程在冰上进行。目的在于从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度，有助于提高神经元的存活率。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高神经元细胞的存活率。在解剖大脑时候，有人用hank’s液，在其中解剖。但即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hank’s液的无糖环境很不利。建议使用DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题， 就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。

组织细胞捣碎后胰酶消化

无菌条件下，捣碎脑组织呈糜状，然后加入低浓度的胰酶，置37℃培养箱消化5-30分钟。然后用神经元培养首液终止消化，并继续加入首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。

优选方案为：无菌条件下，用眼科镊夹碎脑组织呈糜状，加入浓度0.1-0.125%胰酶2ml，37℃培养箱消化10分钟。用神经元培养首液终止消化后，继续加入神经元培养首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。

需要注意的是除了采用胰酶以外，还可以采用木瓜酶联合DNA酶的方法进行消化。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶。木瓜酶配成1-3mg/ml浓度进行消化，同时加入浓度为1-3mg/ml的DNA酶，加入量各1-2ml，消化时间为20-30分钟。DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。木瓜酶和DNA酶在使用时需要现配现用。

本方案提到的神经元培养首液配方为：

胎牛血清	10%
		200uM L-谷氨酰胺	1%
双抗	1%
		Neurobasal	88%

本方案提到的神经元培养首液具体应用时可配制成50ml的溶液，其配方为：

胎牛血清	5.0ml
		200uM L-谷氨酰胺	0.5ml
双抗	0.5ml
		Neurobasal	44ml

本方案提到的神经元培养维持液配方为：

200uM L-谷氨酰胺	1%
		双抗	1%
B27	2%
		Neurobasal	96%

本方案提到的神经元培养维持液具体应用时可配制成50ml的溶液，其配方为：

200uM L-谷氨酰胺	0.5ml
		双抗	0.5ml
B27	1.0ml
		Neurobasal	48ml

该配方中所提到的Neurobasal，是一种商品化的培养基，又名Neurobasal无血清培养基，是专为满足神经细胞培养的特殊要求而研制的基础培养基，在常规试剂公司均可购得。本方案使用的是（1×）浓度的Neurobasal商品试剂。该培养基可长期维持神经细胞的正常表型和生长，不需星形细胞滋养层也能维持高纯度的神经细胞群体。Neurobasal培养基适用于胎儿海马神经元及其他多种中枢神经元的长期培养。Neurobasal-A 培养基适用于新生和成年大鼠中枢神经系统内海马和皮质神经元的长期培养和活力维持。

该配方中所提到的B27，也是一种商品化的神经细胞生长添加剂，又名B27 Neuro Mix。含有神经细胞所需的不同生长因子、特定的抗氧化剂和神经元所需的特定脂肪酸。是培养神经细胞的重要的生长添加剂，以及血清替代物。在常规试剂公司均可购得。本方案中加入的是（50×）浓度的B27商品试剂。该配方中的双抗浓度为链霉素100U/ml，青霉素100 U/ml。

筛网过滤并离心

将细胞悬液用微孔滤网过滤后，转入离心管中，离心分离。

优选方案为：将细胞悬液用200目微孔滤网过滤后，转入15ml离心管中，离心，1000转/分钟，5分钟。实践表明200目微孔滤网能有效将神经元细胞与其他杂质细胞分离开来，起到初步分离的目的，而其他规格孔径的滤网很难达到其效果。

原代培养

将已离心的上清液弃去，用神经元培养首液重悬离心沉淀后，接种于多孔培养板内，置培养箱中进行培养。6-24小时后换液改用神经元培养维持液，以后每1-4天换维持液1次，每次半量或全量换液，细胞生长3-10天可进行鉴定，4-10天后用于实验。

优选方案为：将已离心的上清液弃去，用2ml神经元培养首液重悬放入培养皿中，调整细胞密度为5×10⁵个/ml，接种于预先用多聚赖氨酸（PDL）包被的24孔、96孔培养板内，置入37℃、5%CO₂二氧化碳培养箱中进行培养。12小时后均改用含有B27的神经元培养维持液，首次全量换液即24孔板每次500μl/孔，96孔板100μl/孔，以后每2天换维持液1次，每次半量换液，细胞生长5天可进行鉴定，6天后用于实验。

另外我们研究发现采用的多孔培养板以6孔板为最佳，即常见的孔板孔直径6cm的6孔板最佳。神经元培养让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和其密度密切相关。大于6cm的孔会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以经摸索表明6孔板是最佳选择，采用6孔板接种细胞可以不用调节细胞密度。此外神经原代培养用的孔板一定要预先包被，常用用多聚赖氨酸或者胶原。否则细胞无法贴壁。

神经元鉴定

采用Tuj1抗体进行免疫荧光实验（或免疫细胞化学实验）和采用DAPI荧光染色技术鉴定培养细胞中的神经元。

细胞骨架包括微丝，中间丝，微管三种细胞内纤维。微管是存在所有真核细胞中的非模型结构，它是由微管蛋白组装成管状的细胞结构。采用Tuj1抗体进行免疫荧光实验（或免疫细胞化学实验）和DAPI荧光技术，可见明显的特异的神经元网络结构，如图3所示。证明该方案切实可行。

Tuj1抗体又名Neuronal Class III β-Tubulin（神经元III类β微管蛋白）抗体，是用大鼠脑中提取的微管蛋白作为抗原，最后筛选、纯化得到的单克隆抗体。Tuj1抗体已经被广泛证实仅识别神经细胞的Neuronal Class III β-Tubulin，而不识别胶质细胞的β-Tubulin（β微管）。Tuj1抗体用于神经元的免疫染色观察细胞的微管结构，染微管结构呈绿色如图1；

　DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色其灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。染细胞核呈蓝色如图2；图3是图1和图2合并而成，可见明显的特异的神经元网络结构。

本发明较现有技术具有以下特点和优势：1)细胞分离时采用短时间、低浓度的胰酶消化，减少了胰酶消化过度对细胞的损伤；2)筛网过滤，将细胞团分散成单个细胞；3）用含Neurobasal和B27的特殊培养基培养神经元，既能提供充足的营养成分，又可选择性促进神经元生长以及促进神经组织中少许神经干细胞分化发育形成神经元, 且能有效抑制非神经元细胞尤其是神经胶质细胞的生长； 4）由于出生后神经系统发育基本完成，很多神经元此时已经长出突起，取材于该时期的脑组织对神经元的损伤较大，因此实验用孕15-17天的胎鼠脑组织，取材时对神经元的损伤较小；5)制作细胞爬片的盖玻片一定要用多聚赖氨酸包被，否则神经细胞不易贴壁，染色过程中也会掉片；6）取材大脑皮质体外培养神经元时，尽量剥除脑膜脑血管，以提高神经细胞纯度，同时，整个操作在冰床上进行，过程越快越好，利于保持细胞的活力；7）神经元培养首液和维持液现配现用；8）原代培养神经元到第6天就可以开始用于实验；9) 在抑制胶质细胞过度增殖方面，本研究用无血清培养的方法，未使用细胞分裂抑制剂阿糖胞苷，其本身对神经元的生长也有不同程度的抑制作用，也因加入阿糖胞苷的时间点以及其作用时间长短的选择把握不准确而可能造成的神经元损伤。

这种改进的神经元培养方法及实验参数是根据多年的实验研究摸索获得，采用该方法获得的神经元经免疫组化染色鉴定其纯度达90%以上，完全符合实验要求。此外，在神经元培养过程中，需要加入一定量的有丝分裂抑制剂阿糖胞苷，阿糖胞苷能较好地抑制成纤维细胞和神经胶质细胞的增殖，但对神经元的生长有不同程度的抑制作用。阿糖胞苷加入过早可引起大量神经细胞凋亡或坏死，神经元产率较低；若阿糖胞苷使用过迟，已有大量的非神经元细胞增殖，使神经元所占比例降低；我们在实验中采用了添加有B27 的Neurobasal无血清的神经元培养维持液，选择性地促进神经元生长。无血清培养液不利于有丝分裂细胞的生长，防止非神经元细胞过度增殖，培养的神经元完全符合实验要求，其科学性和实验结果的可靠性属国内领先水平，为神经学科研究提供了基本的实验模型，为神经细胞再生功能研究以及缺氧、药物等因素对神经元影响的研究提供了基本的实验模型。我室以前采用该法培养的神经元，对其功能研究发现了许多已知和未知基因在应激过程中表达出现明显变化。

实验证明本方法可用于胎鼠、新生（出生1天）大鼠、小鼠、豚鼠等相对脆弱的组织，大脑皮质神经元等的培养，实验方案一致。但对于成年人类来说，由于大脑皮层组织比较坚韧，用此法难以达到目的。但实验表明取材引产胎儿的大脑皮层组织，采用本方法也能达到相同的效果，以胎龄4个月最为合适。

实验中应注意以下操作：（1）取材的脑组织用胰酶消化时，要把握消化的程度，既不能消化过度，又不能消化不完全，一般小于10分钟，应立即用神经元培养首液终止消化，避免消化过度而影响神经元活力，而消化不完全时致细胞数量不足；（2）吹打动作要轻柔，用毛细吸管吹打较口径粗的吸管吹打效果较佳，吹打次数以20 次左右适宜，否则会导致神经元大量死亡。（3）换液时要沿壁缓慢取液、加液，并根据细胞生长状态和细胞数量更换培养液的量。

附图说明

图1是激光共聚焦显微镜放大630倍观察神经元培养细胞的免疫组化染色鉴定（微管结构呈绿色）

图2是激光共聚焦显微镜放大630倍观察神经元培养细胞的免疫组化染色鉴定（染细胞核呈蓝色）

图3是激光共聚焦显微镜放大630倍观察神经元培养细胞的免疫组化染色鉴定（由图1、2合并而成）

具体实施方式

以下内容是本发明一种神经元培养方法的具体实施例，以使得本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。但需要说明的是，本发明方法绝不局限于所举的实施例。

实施例一：大鼠神经元的培养

（1）实验动物：孕15～17天的SD孕鼠1只(中南大学湘雅医学院实验动物中心提供)。

（2）主要试剂及仪器：Neurobasal(invitrogen公司)，胰蛋白酶(AMERESCO公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，神经元培养首液（FBS、L-谷氨酰胺、双抗、Neurobasal按照一定比例配制，现配现用），神经元培养维持液（L-谷氨酰胺、双抗、B27、Neurobasal按照一定比例配制，现配现用），Tuj1单克隆抗体(Sigma公司)，DAPI(Sigma公司)，FITC 标记的兔抗鼠IgG( Vector公司)，PBS液(按配方自制)，L-谷氨酰胺（gibco公司），多聚赖氨酸(碧云天)，CO₂培养箱(FormaScientific公司)，倒置显微镜(Olympus公司)，激光共聚焦显微镜 （LEICA公司）。

（3）原代培养：取孕15～17天的SD孕鼠，颈椎脱臼致死。用75％乙醇消毒孕鼠腹部，剪刀剪开腹部至两侧，取出串珠状胚胎5个，放入盛有1×PBS液的培养皿中，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨后，再用眼科镊取出双侧大脑皮质置于盛有1×PBS液的另外一个培养皿内，小心剥离脑膜和血管组织，再将大脑皮质移至另一个盛有适量1×PBS液的培养皿内，尽量吸去液体，用眼科镊夹碎大脑皮质呈糜状，加入0.125%胰酶2ml，37℃培养箱消化10分钟。用2ml神经元培养首液终止消化后，继续加入神经元培养首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。用200目微孔滤网过滤后，转入15ml离心管中，离心，1000转/分钟，5分钟。弃上清，用2ml神经元培养首液重悬细胞放入培养皿中，调整细胞密度为5×10⁵个/ml) 接种于预先用PDL包被的24孔、96孔培养板内，置入CO₂培养箱中进行培养。10小时后均改用含有B27的神经元培养维持液，首次全量换液即24孔板每次500μl/孔，96孔板100μl/孔，以后每2天换神经元培养维持液1次，每次半量换液，细胞生长5天可进行鉴定，6天后用于实验。

（4）神经元的鉴定：Tuj1抗体已经被广泛证实仅识别神经元的Neuronal Class III β-Tubulin，而不识别胶质细胞的β-Tubulin。Tuj1抗体用于神经元的免疫染色观察细胞的微管结构，染微管结构呈绿色；DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以透过完整的细胞膜，染细胞核呈蓝色。将原代神经元按5.0×10⁵个/ml的密度种植在24孔培养板内，孔内预先放置包被PDL的盖玻片，37℃、5％CO₂培养箱孵育，按上述不同时间换液，5天后，进行免疫荧光组织化学染色鉴定，荧光显微镜下观察染色情况，激光共聚焦显微镜下拍照。

（5）结果：

原代培养结果：初接种时，细胞呈圆形，无突起，胞体透明。培养12h，细胞基本贴壁，胞体呈圆形或椭圆形，体积小，胞体发亮，周边可见明显的光晕，立体感强，细胞伸出短小突起。培养1天，细胞突起增长，其长度约为胞体的1~2 倍。培养3天，胞体明显增大，呈圆形、椭圆形或多边形，饱满，折光性与立体感强，突起明显增长，形态多样，可见单级、双极、多极突起，较多突起相互连接。培养5天时，神经细胞胞体开始聚集，突起相连呈网络样生长。培养6天，胞体聚集更明显。随着培养时间的延长，神经细胞突起纵横交错，难以辨认突起的起源。

神经元的鉴定：细胞骨架包括微丝，中间丝，微管三种细胞内纤维。微管是存在所有真核细胞中的非模型结构，它是由微管蛋白组装成管状的细胞结构。Tuj1抗体已经被广泛证实仅识别神经细胞的Neuronal Class III β-Tubulin，而不识别胶质细胞的β-Tubulin。Tuj1抗体用于神经细胞的免疫染色观察细胞的微管结构，染微管结构呈绿色如图1；DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以透过完整的细胞膜，染细胞核呈蓝色如图2；在图3可见明显的特异的神经元网络结构。由于培养6天以后的神经细胞，神经元阳性率增高，但其胞体开始聚集，甚至突起互相交错、难以辨认突起的起源，染色阳性的神经元形态不典型，故取培养5天的细胞进行染色，发现神经元的形态比较典型，阳性率也较高。用免疫组化染色鉴定神经元纯度达90％以上，可满足神经生物学实验的要求，故认为按该方法体外培养大鼠皮层神经元是可行的。（在原代培养中采用木瓜酶联合DNA酶进行消化以代替胰酶消化，也可以达到相同的效果。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶。木瓜酶配成2.5mg/ml浓度进行消化，同时加入浓度为2mg/ml 的DNA酶，消化时间为20-30分钟。）

 实施例二：其他动物神经元培养

实验证明本方法可用于胎鼠、新生（出生1天）大鼠、小鼠、豚鼠等相对脆弱的组织，大脑皮质神经元等的培养，实验方案同上。但对于成年人类来说，由于大脑皮层组织比较坚韧，用此法难以达到目的。但实验表明取材引产胎儿的大脑皮层组织，采用本方法也能达到相同的效果，以中期引产胎龄4个月最为合适，胎龄过小或过大均影响实验结果。采用本方法分离培养的神经元纯度达90％以上。 

Claims (6)

1.一种神经元分离和培养方法，其包括以下步骤：大脑皮质组织分离；组织细胞捣碎后酶消化；筛网过滤并离心的步骤；以及细胞原代培养；其特征在于：在细胞原代培养步骤中采用6孔板接种细胞。

2.根据权利要求1所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于：所述的6孔板孔直径为6cm。

3.根据权利要求1-2所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于：所述大脑皮质组织分离步骤为：

将孕15-17天的大鼠颈椎脱臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪开腹部至两侧，无菌条件下取出串珠状胚胎，放入盛有1×PBS的培养皿中，然后在无菌超净台内冰床上取胎鼠两侧大脑半球放入盛有1×PBS的培养皿中，用眼科镊夹取动物双侧大脑皮质置于盛有1×PBS的培养皿内，仔细剥离并去除皮层血管组织和软脑膜，再将大脑皮质移至另一个盛有1×PBS的培养皿内。

4.根据权利要求1-2所述的一种神经元分离和培养方法，其特征在于：所述组织细胞捣碎后酶消化步骤为：

无菌条件下，用眼科镊夹碎脑组织呈糜状，加入浓度0.1-0.125%胰酶2ml，37℃培养箱消化10分钟；用神经元培养首液终止消化后，继续加入神经元培养首液轻轻吹打，直至将组织全部吹散，形成细胞悬液。

5.一种用于权利要求1所述的一种神经元分离和培养方法的神经元培养首液，其特征在于其配方为：胎牛血清10%，200μM L-谷氨酰胺 1%，双抗1%，Neurobasal 88%。

6.一种用于权利要求1所述的一种神经元分离和培养方法的神经元培养维持液，其特征在于其配方为：200μM L-谷氨酰胺1%，双抗1%，B27 2%，Neurobasal 96%。

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