CN100446051C - 一种胚胎体外着床模型的建立方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚胎体外着床模型的建立方法及用途，它包括选取子宫内膜、人子宫内膜基质细胞的分离培养及蜕膜化的诱导、胚胎培养、人胚胎与蜕膜化的子宫内膜基质细胞共培养等过程，由于本发明建立了使用蜕膜化的人子宫内膜基质细胞和人胚泡在体外进行共培养模型，并且观察到了人胚胎黏附、外延生长及侵入整个着床过程。该模型更接近于人类在体胚胎着床环境，利用该模型可进行一系列与胚胎着床有关影响因素的研究，使在体外观察人胚胎着床成为现实并为深入研究人胚胎着床机理提供了条件。能提高不育症治疗技术水平及辅助生殖技术水平，改善育龄人群的生育质量、生活质量和生命质量，具有重大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
发明涉及生殖医学领域，具体涉及一种人类胚胎体外着床模型的建立方法及其用途。
背景技术
目前随着不育症治疗技术的提高，尤其是辅助生殖技术的开展，成熟卵母细胞的获得率、体外受精的成功率及胚胎的植入率均明显提高，但妊娠率却很低，究其原因在于胚胎着床失败。胚胎着床是指胚泡逐渐埋入子宫内膜的过程，可分为定位/黏附、突破和侵入三个阶段，该过程复杂而精细。以往由于临床观察手段有限及妊娠后子宫内膜取材困难，因而无法直接观察到人胚胎着床过程，着床机理也不十分清楚。为揭示着床机制的奥秘和克服在体研究中难以精确观察到胚泡着床各阶段的变化及各种有关因素间的协调作用，人们不断探索并建立了多种动物着床模型。其中与人体内环境较接近的模型有以下两类：一类模型是用囊胚与子宫单层上皮细胞体外共培养。利用该模型，已发现了大量与胚胎着床有关的上皮细胞分泌的因子，如整合素、瘦素、IL-1等，观察了17-B雌二醇(E2)对胚胎发育的促进作用及其粘附和扩展作用。但是该模型中的囊胚仅仅定位黏附在上皮细胞层上并不能侵入上皮细胞中，利用该模型仅能进行胚胎着床第一阶段的研究；另一种着床模型是胚泡与子宫上皮细胞和基质细胞共培养，在这个着床模型中，子宫上皮细胞与基质细胞通过一个人工的基底膜分开，胚泡被种植在上皮细胞层上。光镜及电镜观察到囊胚黏附并侵入到上皮细胞层中，但是未穿透基底膜到达基质细胞层。因此该模型也只能观察到胚胎着床第二阶段的过程。另外，用人子宫蜕膜细胞与小鼠胚泡共培养建立的着床模型，也只能观察到小鼠胚泡在人蜕膜上能够孵出、黏附、铺展，同样无法进行人类胚胎着床第三阶段即囊胚侵入子宫内膜基质细胞阶段的观察及研究。
发明目的
本发明旨在用人胚胎和人子宫内膜蜕膜化的基质细胞为材料，建立一个更为接近人在体着床过程的体外模型，对囊胚侵入子宫内膜基质细胞过程进行观察和研究，深入了解人胚胎着床机制，进而提高不育症治疗技术水平及辅助生殖技术水平。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于它包括下列步骤：
a.无菌收集因妇科良性疾病行子宫切除术或清宫术的育龄妇女子宫内膜组织。
b.将无菌收集的子宫内膜组织用培养液充分洗涤后制成颗粒，加入10～20ml的消化酶恒温震荡消化50～120分钟，然后用250μm的细胞筛过滤细胞悬液除去未消化的组织碎片，再用细胞筛过滤除去上皮细胞和腺体成分；
c.将上述过滤后的细胞悬液梯度离心25～35分钟，静置后取梯度离心液交界面中的细胞，将其悬浮在缓冲液中，然后进行活细胞染色并计数；
d.将上述细胞种植在组织培养瓶中，使细胞密度为1×106～1×105/ml，加入含10％～15％胎牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium为美国Sigma公司产品)后，于培养箱中培养并传代；
e.传代后2～8代基质细胞被种植在培养板的单孔底部盖玻片上，待细胞贴壁汇合成层后，加入含0.5mM 8-溴-环磷酸腺苷的F12培养液继续培养，培养3天后部分细胞蜕膜化；
f.胚胎培养：受精后2天的胚胎在BlastAsist System培养液中培养5～6天，直至进入孵化阶段；
g.将孵化的胚胎种植在预先准备好的蜕膜化的子宫内膜基质细胞上，在培养箱中培养48小时以上。
所述颗粒体积为0.5～1.5mm3。
所述消化酶采用胶原酶I或胶原酶I与DNA酶I组成的混合酶。
所述梯度离心液其浓度为25％和65％。
所述缓冲液为含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
所述活细胞染色所用染色剂为含0.4％台盼兰的染液。
该着床模型用于体外人胚胎着床过程的观察。
将孵化的胚胎与预先准备好的蜕膜化的子宫内膜基质细胞共培养5～10小时后，胚胎黏附在子宫内膜基质细胞层上；共培养24～36小时后，可观察到滋养层细胞逐渐从囊胚的两个极端开始外延生长，随着囊胚的铺展及滋养细胞的外延生长，囊胚也渐渐变大；最终侵入蜕膜化的基质细胞中。至此，体外着床模型已经建立，利用该模型可进行一系列胚胎体外着床机理的研究。
本发明取得的技术进步：
本发明建立了使用蜕膜化的人子宫内膜基质细胞和人胚泡在体外进行共培养模型，并且观察到了人胚胎黏附、外延生长及侵入整个着床过程。该模型更接近于人类在体胚胎着床环境，利用该模型可进行一系列与胚胎着床有关影响因素的研究，使在体外观察人胚胎着床成为现实并为深入研究人胚胎着床机理提供了条件。而胚泡着床是生殖的关键环节，是在激素的调节下有多种因子参与的复杂过程。对着床机理的探讨，是生命科学的重要基础理论研究。通过对着床过程的控制可避免人口过度增长、促进牲畜的繁衍以及提高基因动物与克隆动物的成功率。此外还能提高不育症治疗技术水平及辅助生殖技术水平，改善育龄人群的生育质量、生活质量和生命质量，因此具有重大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
一、选取实验材料：子宫内膜取自年龄在29-40岁因妇科良性疾病行子宫切除术或清宫术的妇女。上述病人月经周期应规则，且近三个月内未服用任何激素类药物。胚胎由行IVF治疗的病人捐赠。
二、人子宫内膜基质细胞的分离培养及蜕膜化的诱导：
①.清洗：将无菌收集的子宫内膜组织用DMEM培养液洗涤3～5次，以去掉血及其黏液。
②.制备颗粒：将上述收集的子宫内膜组织剪切成1mm3大小的颗粒，以利于消化。
③.消化：将上述子宫内膜组织颗粒放入一个体积为30ml的带盖离心管内，加入10～20ml浓度为330IU/ml的胶原酶I，该酶采用美国Wathington生化公司产品，于37℃恒温水浴箱中震荡消化60分钟，当组织颗粒消失变为圆形单个细胞时，结束消化。整个消化过程要随时在倒置显微镜下观察，以免消化过度损伤细胞或消化程度不够。当使用一种消化酶消化一个小时，细胞依然呈现团状聚集时，应再加入DNA酶I继续消化，该酶采用美国Wathington生化公司产品。
④.细胞分离：用250μm的细胞筛过滤上述消化后的细胞悬液，以除去未消化的组织碎片，然后用含0.1％BSA的PBS清洗1遍；再用40μm的细胞筛过滤除去上皮细胞和腺体成分，再用含0.1％BSA的PBS清洗2遍。该BSA即牛血清白蛋白为美国Sigma公司产品，PBS即磷酸盐缓冲液，为美国Sigma公司产品；250um和40um的细胞筛为英国Lockertex公司产品。
⑤.梯度离心：将上述过滤后的细胞悬液在25％和60％的梯度离心液中于12℃以1800转/分钟速度离心30分钟，静置后取25％和60％Percoll交界面中的细胞，然后将其悬浮在含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中。上述梯度离心液为美国Sigma公司产品。
⑥.细胞计数：用0.4％的台盼兰染色，用白细胞计数板在显微镜下进行活细胞计数，该台盼兰染液为美国Sigma公司产品。
⑦.种植：将上述细胞种植在75cm2组织培养瓶中(细胞密度1×106/ml)，加入含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液15ml，于37℃、5％CO2的培养箱中培养并传代，人子宫内膜基质细胞纯度检测大于95％。胎牛血清为美国Sigma公司产品。二氧化碳水套式培养箱(型号：3110)为美国Forma Scientific公司产品。
⑧.诱导人子宫基质细胞蜕膜化：，将传代后2～8代基质细胞种植在4孔培养板上，使细胞密度为1×106/ml。此时细胞呈圆形，加入含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。培养4～5天后细胞变成梭形并汇合成层时，换成含0.5mM 8-溴-环磷酸腺苷的F12培养液继续培养，8-溴-环磷酸腺苷为美国Sigma公司产品，可诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化，培养3天后基质细胞由梭形变成多边形的蜕膜细胞，此时的子宫内膜细胞更接近于在体人胚胎着床时的内膜细胞。F12培养液为美国Sigma公司产品。
三、胚胎培养：受精后2天的胚胎在BlastAsistSystem培养液中培养5～6天，直至透明带脱落进入孵化阶段。用德国ZEISS公司生产的倒置显微镜(型号：Axiovert 135)密切观察整个培养过程。BlastAsist System培养液为丹麦Medi Cult公司产品。
四、人胚胎与蜕膜化的子宫内膜基质细胞共培养：将孵化的胚胎种植在预先准备好的蜕膜化的子宫内膜基质细胞层上，每孔加入500ml DMEM培养液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，分别在5、24、48、72、96小时时用倒置显微镜观察并记录胚胎黏附、外延生长及侵入情况。透明带脱落为孵出；轻轻摇晃培养板胚泡不随液体飘动者为黏附；在显微镜下见滋养细胞从附着处向外生长定为铺展及外延生长；光镜下观察有滋养细胞侵入母体的细胞或细胞外基质为侵入。共培养5～10小时后，胚胎黏附在子宫内膜基质细胞层上；共培养24～36小时后，滋养层细胞逐渐从囊胚的两个极端开始外延生长，随着囊胚的铺展及滋养细胞的外延生长，囊胚也渐渐变大；最终侵入蜕膜化的基质细胞中。至此，体外着床模型已经被建立。
Claims (7)
1.一种胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于它包括下列步骤：
a.无菌收集因妇科良性疾病行子宫切除术或清宫术的育龄妇女子宫内膜组织；
b.将无菌收集的子宫内膜组织用培养液充分洗涤后制成颗粒，加入10～20ml的消化酶恒温震荡消化50～120分钟，然后用250μm的细胞筛过滤细胞悬液除去未消化的组织碎片，再用35～42μm细胞筛过滤除去上皮细胞和腺体成分；
c.将上述过滤后的细胞悬液梯度离心25～35分钟，静置后取梯度离心液交界面中的细胞，将其悬浮在缓冲液中，然后进行活细胞染色并计数；
d.将步骤c梯度离心液交界面中的细胞种植在组织培养瓶中，使细胞密度为1×106～1×105/ml，加入含10％～15％胎牛血清、100I U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液后，于培养箱中培养并传代；
e.传代后2～8代基质细胞被种植在培养板上，待细胞贴壁汇合成层后，加入含0.5mM 8-溴-环磷酸腺苷的F12培养液继续培养，培养3天后部分细胞蜕膜化；
f.胚胎培养：受精后2天的胚胎在BlastAsist System培养液中培养5～6天，直至进入孵化阶段；
g.将孵化的胚胎种植在预先准备好的蜕膜化的子宫内膜基质细胞上，在培养箱中培养48小时以上。
2.根据权利要求1所述的胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于所述颗粒体积为0.5～1.5mm3。
3.根据权利要求1所述的胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于所述消化酶采用胶原酶I或胶原酶I与DNA酶I组成的混合酶。
4.根据权利要求1所述的胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于所述梯度离心液其浓度为25％和65％。
5.根据权利要求1所述的胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于所述缓冲液为含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的胚胎体外着床模型的建立方法，其特征在于所述活细胞染色所用染色剂为含0.4％台盼兰的染液。
7.一种如权利要求1所述的胚胎体外着床模型的用途，其特征在于该着床模型用于体外人胚胎着床过程的观察。
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