CN105695411B - 一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法 - Google Patents

一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从新生裸鼹鼠大脑皮层分离并纯化培养皮层神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠皮层神经元的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠皮层神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠皮层神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

Description

一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法。
背景技术：
神经元虽然不是是哺乳动物中枢神经系统中比例最高的，但却是功能最重要的一类细胞，神经元在突触形成、突触信号传递，以及突触可塑性中发挥着至关重要的作用。而大脑皮层神经元在机体诸多功能，包括视觉、听觉、嗅觉、语言、运动、体表感觉等方面发挥着控制中枢的作用。
裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持脑结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。裸鼹鼠常年生活与地下黑暗狭窄的洞穴中，裸鼹鼠视觉功能严重退化，只能感受到无定形的光线信号，但无法接收清晰的图像信号，视觉中枢萎缩，远不及其他视力正常的啮齿类动物(Mills SL,Catania KS(2004)Identification of retinal neurons in a regressive rodent eye(the naked mole-rat).Vis Neurosci 21:107-117.；Nikitina N,Maughan-Brown B,Riain MO,Kidson S(2004)Postnatal development of the eye in the naked mole rat(Heterocephalusglaber).Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 277:317-337.；Hetling JR,Baig-Silva MS,Comer CM,et al.(2005)Features of visual function in the naked mole-rat Heterocephalus glaber.J Comp Physiol ANeuroethol Sens Neural BehavPhysiol 191:317-330.)。听觉系统及听力也到了一定程度的削弱。首先外耳廓在进化过程中消失，在耳开口处只有由皮肤组成的环状结构。其次，其声源定位能力障碍，只能辨识以泥土为传播介质的低频声音(Heffner RS,Heffner HE(1993)Degenerate hearing andsound localization in naked mole-rats(Heterocephalus glaber)with an overviewof central auditory structures.J Comp Neurol331:418-433.)。另外其对空气中传播的气味分子的嗅觉能力严重受限。但是，裸鼹鼠其他功能则代偿性增强：其发达的终生保持增生能力且功能强大的切牙可以从事高强度的挖掘工作；在与其身体直径相当的洞穴中，裸鼹鼠主要依赖其体表数根触须发挥的触觉功能代偿其严重退化的视力和听力。这些生理功能的变化可能主要是其脑内对应脑区的形态结构和功能出现适应性的变化造成的(Catania KC,Remple MS(2002)Somatosensory cortex dominated by therepresentation of teeth in the naked mole-rat brain.Proc Natl Acad Sci U SA99:5692-5697.；Crish SD,Rice FL,Park TJ,Comer CM(2003)Somatosensoryorganization and behavior in naked mole-rats I:vibrissa-like body hairscomprise a sensory array that mediates orientation to tactile stimuli.BrainBehav Evol 62:141-151.；Park TJ,Comer C,Carol A,et al.(2003)Somatosensoryorganization and behavior in naked mole-rats:II.Peripheral structures,innervation,and selective lack of neuropeptides associated withthermoregulation and pain.J Comp Neurol 465:104-120.；Henry EC,Remple MS,O'Riain MJ,Catania KC(2006)Organization of somatosensory cortical areas in thenaked mole-rat(Heterocephalus glaber).J Comp Neurol 495:434-452.)。裸鼹鼠大脑皮层功能及其机制的阐明除了需要在体功能的研究，还需要对其特定大脑皮层神经元的研究，这就依赖于其大脑皮层纯化培养的神经元。
目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠皮层神经元的培养方法(Lin Gang,Yu-chen Yao,Ying-fu Liu,Yi-peng Li,Kai Yang,Lei Lu,Yuan-chi Cheng,Xu-yi Chen,andYue Tu.Co-culture of oligodendrocytes and neurons can be used to assess drugsfor axon regeneration in the central nervous system.Neural Regen Res.2015；10(10):1612–1616.)。
中国专利申请CN201110164446.4，申请公布号为CN102839151A，公开了一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法，所述的培养基为胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠无血清培养基，其中含有0.5g/L胰岛素、0.5g/L转铁蛋白和0.5mg/L亚硒酸钠。
中国专利申请CN201510072161.6，申请公布号为CN104611294A，公开了一种大鼠视皮层神经元体外培养方法，贴壁培养时先用接种培养基，18h后用维持培养基全换液；所述的接种培养基为DMEM/F12培养基中加入体积比为10％的马血清、2×105U/L的青链霉素和0.5mmol/L的L-谷氨酰氨；所述的维持培养基指Neurobasal Medium无血清培养基中加入体积比为2％的B27血清替代物和2×105U/L的青链霉素以及0.5mmol/L的L-谷氨酰氨。
但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的皮层神经元分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠皮层神经元分离纯化和培养方法的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化和培养方法，以便捷、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠皮层神经元，为体外建立裸鼹鼠皮层神经元提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠皮层神经元的活化、以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠皮层神经元低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
我们试用了目前小鼠、大鼠的皮层神经元分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠皮层神经元，而且裸鼹鼠皮层神经元增殖的数量也较少。
关于裸鼹鼠皮层神经元的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。4)裸鼹鼠妊娠周期长达两个月以上，而大鼠及小鼠仅需3周，因此在选择胎鼠进行实验的时间需要仔细摸索。
因此，裸鼹鼠皮层神经元的培养中最重要的摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的妊娠周期和培养基。
为达到此目的，本发明的裸鼹鼠皮层神经元的分离纯化方法包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠皮层混合神经细胞：
分离65-70天的胚胎裸鼹鼠大脑皮层组织，将大脑皮层组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于35-37℃消化15-30分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的24孔板中；
所述的组织消化液，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。优选的组织消化液：含有所述组织消化液为含有质量浓度0.25％的胰酶和终浓度为0.08mg/ml DNA酶的混合液。
所述的基质层，可以为常规的左旋多聚赖氨酸、右旋多聚赖氨酸等。优选的基质层为laminin。
B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养6-10个小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2-4天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2-4天，如此为一个循环，培养2-4个循环。
所述的混合神经细胞培养基可以为常规含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选为含有体积百分数为10％胎牛血清的低糖DMEM。
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积分数为2％的B27。
所述的神经元维持培养基为含有体积百分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF。
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
进一步，步骤A中，分离65-70天的胚胎裸鼹鼠大脑皮层组织的方法如下：取怀孕65-70天的雌性裸鼹鼠，将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。将胎鼠颅骨剪开，于体式显微镜下将左右大脑从正中线分成两半，然后小心剥离皮层，并剥除皮层表面的脑膜结构。
进一步，步骤A中，用显微剪将皮层组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化20min。
进一步，步骤B中，于三气培养箱中培养8小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2天，如此为一个循环，培养2个循环。
进一步，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
中国专利申请201410066546.7，申请公布号为103789266A中公开了一种大脑皮层神经元分离和原代培养方法，其中细胞维持液用于大鼠皮层神经元的培养。但是考虑到从皮层中获取的神经细胞包括皮层神经元和多种神经胶质细胞，其中皮层神经元在体外无法增殖，而胶质细胞则增殖能力较强，所以我们筛选了神经元纯化培养基和神经元维持培养基的不同组合方式，并统计皮层神经元的存活比例，结果如下表所示，我们发现将贴壁于混合神经细胞培养基中的细胞，先以神经元维持培养基培养2天，再以神经元纯化培养基培养2天，如此为一个循环，培养两个循环可以得到较高比例的皮层神经元。神经元纯化培养基和维持培养基的基础成分均为添加体积分数为2％B27的Neurobasal，区别在前者添加有终浓度为10μM 5-氟尿嘧啶用于具有增殖能力的胶质细胞，后者添加终浓度为100ng/ml NGF用于维持神经元活力。
中国专利申请201410066546.7，申请公布号为103789266A中公开了一种大脑皮层神经元分离和原代培养方法，其中细胞取自孕14-孕17天Wistar胎鼠。与大鼠相比，裸鼹鼠妊娠周期为70-80天，如何获得较高比例的皮层神经元，我们也进行了摸索，如下表所示，我们发现利用上述培养基和培养方式，取自孕65天-70天裸鼹鼠胎鼠的皮层神经元比例高于其他年龄段的胎鼠。
本发明的有益效果在于：①综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠大脑皮层分离并纯化培养皮层神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠皮层神经元的合理培养方法。我们发现5％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；②操作方法简单，具有较高的可重复性；③通过使用神经元纯化培养基，有效控制了皮层混合神经细胞中胶质细胞的生长，保证了皮层神经元的纯度能够达到98％以上(针对神经元特异性标记物Tuj1进行的免疫细胞化学染色结果)；④额外添加的生长因子种类少，只需要在神经元维持培养基中添加NGF以保证神经元较好的功能状态和活力。
综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠皮层神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠皮层特定区域神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
附图说明：
图1为体外培养的皮层神经元(普通光学显微镜下)；
图2为体外纯化培养的皮层神经元(免疫细胞化学染色)，其中A为Tuj1，B为Hoechst，C为Tuj1/Hoechst。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：裸鼹鼠皮层神经元分离纯化及培养
1、实验材料
孕65-70天的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。
DNA酶购自Solarbio生物科技有限公司，NGF、5-氟尿嘧啶、胰蛋白酶、左旋多聚赖氨酸、青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清、Neurobasal培养基、B27无血清添加因子等购自Thermo Fisher Scientific公司，培养皿、T25和T75培养瓶购自Corning公司。
混合神经细胞培养基成分为低糖DMEM培养基含有体积分数为10％的胎牛血清。
皮层神经元纯化培养基为Neurobasal+体积分数2％B27+终浓度10μM5-氟尿嘧啶。
皮层神经元维持培养基为含有体积分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF。
2、裸鼹鼠皮层神经元分离纯化及培养方法
①收集裸鼹鼠皮层混合神经细胞：
孕65-70天的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，并用青霉素100U/ml和0.1mg/ml链霉素混合液擦拭裸鼹鼠腹部皮肤，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。将台数颅骨剪开，于体式显微镜下将左右大脑从正中线分成两半，然后小心剥离皮层，并剥除皮层表面的脑膜结构。
用显微剪将皮层组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化15min。然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液。随后将单细胞悬液种于无菌的且预先包被有基质层的24孔板中。
②裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将①中得到的细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中培养8小时，待其完全贴壁之后，换为神经元纯化培养基继续培养2天，然后将培养基更换为神经元维持培养基2天，如此为一个周期，培养一周。
所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
实施例2：裸鼹鼠皮层神经元的鉴定
采用实施例1所得的裸鼹鼠皮层神经元的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于无血清培养基中的皮层神经元进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。
1、细胞形态学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Xuejun Chai,Shanting Zhao,Li Fan,Wei Zhang,XiLu,Hong Shao,Shaobo Wang,Lingzhen Song,Antonio Virgilio Failla,Bernd Zobiak,Hans G.Mannherz,Michael Frotscher，Reelin and cofilin cooperate during themigration of cortical neurons:a quantitative morphological analysis，Development，2016，143:1029-1040)结果如图1所示，光镜下裸鼹鼠皮层神经元胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突。
2、免疫细胞化学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Xuejun Chai,Shanting Zhao,Li Fan,Wei Zhang,XiLu,Hong Shao,Shaobo Wang,Lingzhen Song,Antonio Virgilio Failla,Bernd Zobiak,Hans G.Mannherz,Michael Frotscher，Reelin and cofilin cooperate during themigration of cortical neurons:a quantitative morphological analysis，Development，2016，143:1029-1040)。
结果如图2所示，将皮层神经元进行爬片实验，在无血清培养基中培养24小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用神经元表面特异抗原Tuj1的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在无血清培养基中，细胞能够保持Tuj1阳性(红色荧光)。
根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠皮层神经元具备典型的皮层神经元形态，胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突，免疫细胞化学染色显示其呈Tuj1阳性。并在无血清培养基中能够保持良好的增殖状态。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠皮层混合神经细胞：
分离65-70天的胚胎裸鼹鼠大脑皮层组织，将大脑皮层组织剪碎，加入组织消化液混匀之后，于35-37℃消化15-30分钟；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；
B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养6-10个小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2-4天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2-4天，如此为一个循环，培养2-4个循环；
所述的混合神经细胞培养基为含有体积百分数为10％胎牛血清的低糖DMEM；
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积分数为2％的B27；
所述的神经元维持培养基为含有体积百分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加100ng/ml NGF；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％。
2.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，所述的组织消化液为含有质量浓度0.25％的胰酶和终浓度为0.08mg/ml DNA酶的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，所述的基质层为laminin聚合物。
4.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用显微剪将海马组织剪碎至1mm3，加入组织消化液混匀之后，于37℃消化20min。
5.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养8小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，然后将培养基更换为神经元维持培养基继续培养2天，如此为一个循环，培养2个循环。
6.根据权利要求1所述的一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
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