CN106520697B - 一种裸鼹鼠drg神经元培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法。本发明综合使用多种培养基从胚胎期裸鼹鼠脊髓分离并纯化培养DRG神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠DRG神经元的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠DRG神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠DRG神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

Description

一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说，是一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠DRG神经元的分离纯化和培养方法。
背景技术
慢性疼痛严重影响着人类的生活质量，亟待有效的治疗措施。DRG神经元作为体内重要的感觉神经元，在疼痛的发生发展过程中发挥主要作用(Vallejo R,Tilley DM,
Figure BDA0001136045570000011
DL,Kelley CA,DeMaegd M,Benyamin R.Genomics of the Effect of SpinalCord Stimulation on an Animal Model of NeuropathicPain.Neuromodulation.2016Jul 8.doi:10.1111/ner.12465.)。因此，深入揭示DRG神经元生理学功能及特点将有利于阐明DRG神经元的功能以及其在神经系统疾病发生发展中的作用。
裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度仅有6％左右的不通风洞穴中能够保持神经系统结构和功能的完整无损并进行正常的生命活动。而DRG作为一种以DRG神经元成分为主的结构，无论在个体清醒还是在睡眠过程中都时刻保持着高度活力，参与机体痛觉等多种感觉信息的输入以及整合，对氧及其他营养物质需求量巨大，而其本身并没有储存能量的机制，只能及时从周围环境中摄取氧及其他养分以保证其正常生命活动(Theorganization and neural substrates of human memory.Squire LR Int JNeurol.1987-1988；21-22:218-22.；Cohen N J.,Eichenbaum H.Memory,Amnesia,and theHippocampal System.Cambridge,Mass,USA:MIT Press；1993)。此外，裸鼹鼠对炎性疼痛具有较强的耐受能力(Park TJ,Lu Y,Jüttner R,Smith ES,Hu J,Brand A,Wetzel C,Milenkovic N,Erdmann B,Heppenstall PA,Laurito CE,Wilson SP,Lewin GR.PLoSBiol.2008Jan；6(1):e13.Selective inflammatory pain insensitivity in theAfrican naked mole-rat(Heterocephalus glaber).)，其中涉及到的DRG神经元功能上的机制尚不明了，但是其中的机制一旦阐明将对人类疼痛相关医学难题的攻克具有重要的意义。因此，揭示裸鼹鼠DRG神经元低氧条件下存活及其特殊的低氧耐受机制以及疼痛耐受机制将为解决缺血缺氧或者低氧环境给人类带来的病理性伤害的防御以及疼痛机制的阐明提供一定的策略，因此我们需要建立离体的裸鼹鼠DRG神经元模型用于开展相关研究。
目前，研究人员已经建立出大鼠及小鼠DRG神经元的培养方法(Anand U,SinisiM,Fox M,MacQuillan A,Quick T,Korchev Y,Bountra C,McCarthy T,AnandP.Mycolactone-mediated neurite degeneration and functional effects incultured human and rat DRG neurons:Mechanisms underlying hypoalgesia inBuruli ulcer.Mol Pain.2016Jun 20；12.pii:1744806916654144.doi:10.1177/1744806916654144.)。但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的DRG神经元分离纯化和培养方法均不适用于裸鼹鼠，目前国内外文献尚无有关裸鼹鼠DRG神经元分离纯化和培养方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠DRG神经元的分离纯化和培养方法，以便捷、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠DRG神经元，为体外建立裸鼹鼠DRG神经元提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠DRG神经元的活化、以及低氧耐受能力、以及裸鼹鼠DRG神经元低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
我们试用了目前小鼠、大鼠的DRG神经元分离纯化和培养方法，结果发现均无法培养获得纯度高、状态好的裸鼹鼠DRG神经元，而且裸鼹鼠DRG神经元增殖的数量也较少。
关于裸鼹鼠DRG神经元的培养尚没有建立出可行的实验方法，我们分析其原因，主要是：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。4)裸鼹鼠妊娠周期长达两个月以上，而大鼠及小鼠仅需3周，因此在选择胎鼠进行实验的时间需要仔细摸索。
因此，裸鼹鼠DRG神经元的培养中最重要的是摸索到合适的温度、湿度和氧气浓度，以及摸索到适合的妊娠周期和培养基。
为了实现上述目的，本发明提供一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠DRG混合神经细胞：
分离胚胎期55-60天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I混匀之后消化，再用组织消化液II消化；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中(较优的选择24孔板)；
所述的组织消化液I，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如I型、II型胶原酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连引起的细胞聚集。优选的组织消化液I为含有0.1％胶原酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液。
所述的组织消化液II，可以为常规的蛋白水解酶类消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，辅以DNA酶I以解除DNA片段粘连所致的细胞聚集。优选的组织消化液II为含有0.125％胰酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液。
所述的基质层，可以为常规的左旋多聚赖氨酸、右旋多聚赖氨酸、胶原蛋白、laminin等。优选的基质层为右旋多聚赖氨酸基质层并覆盖以胶原蛋白基质层。
B、裸鼹鼠DRG混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的DRG混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养10-15小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养1-3天，然后再更换为神经元维持培养基培养1-3天，如此为一个循环，培养3-5个循环。
所述的混合神经细胞培养基可以为常规的含血清混合神经细胞培养液，例如低糖DMEM等。优选为含有体积百分数为10％进口胎牛血清的低糖DMEM。
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积百分数为2％的B27。
所述的神经元维持培养基为含有体积分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加120ng/ml NGF。
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5±0.5％，湿度为96±2％。
优选的，步骤A中，分离胚胎期55-60天的裸鼹鼠大脑中的DGR组织的方法如下：取怀孕55-60天的雌性裸鼹鼠，将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。沿胎鼠背部脊柱走向将其剪开，于体式显微镜下暴露椎管和椎间孔，用显微镊逐个摘除两侧椎体的外侧隐窝中圆形透亮的脊神经节，尽量剥除神经节表面的筋膜。
优选的，步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm3，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化15min。然后用3ml混合神经细胞培养基终止消化。
优选的，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养3个循环。
优选的，所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
中国专利文献CN105274055A中公开了一种哺乳动物原代DRG神经元的培养方法，其中密度梯度离心和差速贴壁法用于DRG神经元的纯化过程。但是考虑到从脊神经节中获取的神经细胞包括DRG神经元和多种胶质细胞、成纤维细胞等，其中DRG神经元体外无法增殖，而胶质细胞和成纤维细胞则增殖能力较强，所以我们摸索了神经元营养培养基中NGF的浓度梯度，并统计DRG神经元的存活比例，结果如图1所示，我们发现将贴壁于混合神经细胞培养基中的细胞，先以神经元纯化培养基培养2天，再以神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，进行3个循环的处理，其中神经元营养培养基中NGF浓度为120ng/ml时，DRG神经元存活比例较高，可以得到较高比例的DRG神经元。神经元纯化培养基和维持培养基的基础成分均为添加体积分数为2％B27的Neurobasal，区别在前者添加有终浓度为10μM 5-氟尿嘧啶用于抑制胶质细胞及成纤维细胞增殖，后者添加终浓度为一定浓度的NGF用于维持神经元活力。
中国专利文献CN105754943A公开了一种裸鼹鼠海马神经元培养方法，中国专利文献CN105695411A公开了一种裸鼹鼠皮层神经元培养方法，但是海马神经元、皮层神经元取材自不含结缔组织的脑组织，而DRG神经元取自两侧椎体的外侧隐窝，每个DRG神经节直径不超过1mm，并由一层结缔组织膜包裹，这层结缔组织膜无法利用机械的方法剥除，在分离消化方法上有别于脑组织来源的神经元。因此，在对DRG神经节进行消化时，需要首先利用含有0.1％胶原酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液，即消化液I对DRG神经节表面的结缔组织进行消化。然后，再利用消化液II对DRG神经节内部进行消化，这样能够将DRG神经节进行有效的消化从而提高所获细胞的量。另外，由于DRG神经元属于感觉神经元的痛觉神经元，对环境中的氧浓度及营养需求较高，因此需要较高的氧浓度(15％)，以及较高的NGF水平(120ng/ml)才能够维持结构和功能与在体情况基本一致，具体参见表1和表2。
表1.不同氧浓度对裸鼹鼠DRG神经元存活的影响
Figure BDA0001136045570000051
注：**，P＜0.01，与5％O2浓度相比；##，P＜0.01，与20％O2浓度相比。
表2.不同NGF浓度对裸鼹鼠DRG神经元存活的影响
Figure BDA0001136045570000052
注：**，P＜0.01，与NGF浓度100ng/ml相比。
本发明的有益效果在于：
①综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠脊髓DRG神经节分离并纯化培养DRG神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠DRG神经元的合理培养方法。我们发现15％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；②操作方法简单，具有较高的可重复性；③通过使用DRG神经元纯化培养基，有效控制了DRG神经节中混合神经细胞中胶质细胞和成纤维细胞的生长，保证了DRG神经元的纯度能够达到90％以上(针对神经元特异性标记物Tuj1进行的免疫细胞化学染色结果)；④额外添加的生长因子种类少，只需要在神经元维持培养基中添加NGF以保证神经元较好的功能状态和活力。
综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠DRG神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠DRG神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
附图说明
图1为体外培养的DRG神经元(普通光学显微镜，40倍放大)；
图2为体外培养的DRG神经元(普通光学显微镜，200倍放大)；
图3为体外培养的DRG神经元(免疫细胞化学鉴定)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：裸鼹鼠DRG神经元分离纯化及培养
1、实验材料
孕55-60天的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。
DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，NGF、5-氟尿嘧啶、胰蛋白酶、右旋多聚赖氨酸、胶原蛋白青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲来源胎牛血清、Neurobasal培养基、B27无血清添加因子等购自Thermo Fisher Scientific公司，24孔培养板购自Corning公司。
混合神经细胞培养基成分为低糖DMEM培养基含有体积分数为10％的胎牛血清，DRG神经元纯化培养基为Neurobasal+体积分数2％B27+终浓度10μM 5-氟尿嘧啶。DRG神经元维持培养基为含有体积分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加终浓度为120ng/ml的NGF。
2、裸鼹鼠DRG神经元分离纯化及培养方法
取怀孕55-60天的雌性裸鼹鼠，将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。沿胎鼠背部脊柱走向将其剪开，于体式显微镜下暴露椎管和椎间孔，用显微镊逐个摘除两侧椎体的外侧隐窝中圆形透亮的脊神经节，尽量剥除神经节表面的筋膜。
步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm3，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化15min。然后用3ml混合神经细胞培养基终止消化。
步骤B中，用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养3个循环。
所述三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
①收集裸鼹鼠DRG神经节的混合神经细胞：将其在CO2中作窒息处理后立即将其浸泡于75％的乙醇中进行消毒，然后将其置于无菌玻璃平皿中，并用青霉素100U/ml和0.1mg/ml链霉素混合液擦拭裸鼹鼠腹部皮肤，小心剖腹并将其含有胎鼠的子宫完整取出，剪开子宫膜并小心取出胎鼠。沿胎鼠背部脊柱走向将其剪开，于体式显微镜下暴露椎管和椎间孔，用显微镊逐个摘除两侧椎体的外侧隐窝中圆形透亮的脊神经节，尽量剥除神经节表面的筋膜。在显微剪将DRG神经节组织剪碎至1mm3，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化15min。然后用3ml混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在神经细胞混合培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液。随后将单细胞悬液种于无菌的且预先包被有基质层的24孔板中。
②裸鼹鼠大脑混合神经细胞的培养：将①用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养3个循环共计12天。
三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
实施例2：裸鼹鼠DRG神经元的鉴定
采用实施例1所得的裸鼹鼠DRG神经元的鉴定：利用4％多聚甲醛对处于无血清培养基中的DRG神经元进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。
1、细胞形态学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Yang Y,Huang J,Mis MA,Estacion M,Macala L,ShahP,Schulman BR,Horton DB,Dib-Hajj SD,Waxman SG.Nav1.7-A1632G Mutation from aFamily with Inherited Erythromelalgia:Enhanced Firing of Dorsal Root GangliaNeurons Evoked by Thermal Stimuli.J Neurosci.2016Jul 13；36(28):7511-22.)。
结果如图1(低倍镜)和图2(高倍镜)所示，光镜下，裸鼹鼠DRG神经元胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突。
2、免疫细胞化学鉴定：
鉴定方法参考文献中所述(Lei Xianga,Yanping Ren,Xun Li,Wen Zhao,YijunSong.MicroRNA-204suppresses epileptiform discharges through regulating TrkB-ERK1/2-CREB signaling in cultured hippocampal neurons.Brain Res.2016,pii:S0006-8993(16)30104-4.)。结果如图3所示，将DRG神经元进行爬片实验，在增殖培养基中培养24小时后，利用4％多聚甲醛将细胞固定，然后利用神经元表面特异抗原Tuj1的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，在无血清培养基中，细胞能够保持Tuj1阳性(红色荧光)。
根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠DRG神经元具备典型的DRG神经元形态，胞体较大，具有1个或数个较短的树突，另一端具有一个细长的轴突，免疫细胞化学染色显示其呈Tuj1阳性，并在无血清培养基中能够保持良好的增殖状态。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (4)

1.一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、收集裸鼹鼠DRG混合神经细胞：
分离胚胎期55-60天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化15min；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；
所述的组织消化液I为含有0.1％胶原酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液；
所述的组织消化液II为含有0.125％胰蛋白酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液
所述的基质层为右旋多聚赖氨酸基质层并覆盖以胶原蛋白基质层；
B、裸鼹鼠DRG混合神经细胞的培养：
将步骤A得到的DRG混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，然后再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养3个循环；
所述的混合神经细胞培养基为含有体积百分数为10％进口胎牛血清的低糖DMEM；
所述的神经元纯化培养基为含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积百分数为2％的B27；
所述的神经元维持培养基为含有体积分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加120ng/ml NGF；
所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5±0.5％，湿度为96±2％。
2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm3。
3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用3ml混合神经细胞培养基终止消化。
4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤B中所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。
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The Molecular Basis of Acid Insensitivity in the African Naked Mole-Rat;Ewan等;《science》;20111231;1557-1560 *

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