CN112481193A - 三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法 - Google Patents

三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种或多种；试剂A包含N‑乙酰半胱氨酸、Y‑27632、A8301、重组人表皮细胞生长因子和胃泌素中的一种或多种；试剂B包含R‑spondin1、Noggin、烟酰胺和SB202190中的一种或多种；试剂C包含Wnt‑3A。本发明的培养基针对于肠组织中成体干细胞的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和，经过优化培养基中生长因子的配比，肠的成体干细胞和肠癌的细胞能够有效地在三维培养环境中分别形成肠的类器官和肠癌的类器官。

Description

三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法。
背景技术
类器官技术是近些年生物学领域一项重大的突破。通过类器官培养技术，科学家们建立起了全新的体外培养的模型，用来培养正常或者病变癌组织。正常类器官可以模拟正常组织的形态，结构和功能性特征；癌的类器官表现出在体癌肿的形态学特点，基因突变谱和表型特点。正常及癌类器官可以在体外长期稳定的培养，所以类器官培养技术可以将大部分活体的生物学过程在培养皿中进行，这一革命性的技术进步为癌症及人体生物学的研究建立一个全新的平台，肿瘤类器官更是为肿瘤患者的个性化治疗提供巨大的帮助。目前科学家们已经成功建立了人体主要器官及其肿瘤的类器官培养体系。
然而，作为一项新兴的技术，很多器官的类器官三维培养缺少标准化的培养基。尽管已有报道在不同三维培养条件下，可以成功培养出肠的类器官。但是，到目前为止，还没有一种标准化的培养基。这种现状制约了肠和肠癌类器官的在研究和临床治疗中的广泛的应用。
发明内容
为了解决肠组织体外类器官培养过程中缺少标准化培养基的问题，本发明的目的在于提供一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基及培养方法，本发明的培养基针对于肠组织中成体干细胞的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和，经过优化培养基中生长因子的配比，肠的成体干细胞和肠癌的细胞能够有效地在三维培养环境中分别形成肠的类器官和肠癌的类器官。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种或多种；
试剂A包含N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、A8301、重组人表皮细胞生长因子和胃泌素中的一种或多种；
试剂B包含R-spondin1、Noggin、烟酰胺和SB202190中的一种或多种；
试剂C包含Wnt-3A。
优选地，在试剂A中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1~10mM，Y-27632的浓度为0.5~50uM，A8301的浓度为50~5000nM，重组人表皮细胞生长因子的浓度为5~500ng/ml，胃泌素的浓度为1~100nM。
优选地，在试剂B中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，R-spondin1的浓度为10%，Noggin的浓度为10%，烟酰胺的浓度为1~100mM，SB202190的浓度为1~100uM。
优选地，在试剂C中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Wnt-3A的浓度为5%。
优选地，所述标准化培养基用于建立和扩增肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述标准化培养基用于分化培养肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述标准化培养基用于建立和扩增肠癌类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述基础培养基以Advanced F12/DMEM为溶剂，并包含以下成分：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、青霉素及链霉素。
优选地，在基础培养基中，以基础培养基的终体积为基准计算，N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸的浓度为10~1000mM，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为20~2000mM，青霉素的浓度为10000U/ml，链霉素的浓度为10000ug/ml。
优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，B27的浓度为2%。
优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Primocin的浓度为100ug/ml。
优选地，所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml
人胰岛素 15.6~1560μg/ml
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml
人转铁蛋白 25~2500μg/ml
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml
乙醇胺 0.1~10mg/ml
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml
腐胺 80.5~8050μg/ml
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml
皮质酮 0.1~10μg/ml
亚油酸 5~500μg/ml
加莫尼克酸 5~500μg/ml
黄体酮 31.5~3150μg/ml
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml
维它命E油 5~500μg/ml
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml
生物素 12.5~1250μg/ml
牛血清白蛋白 12.5%。
本发明还提供一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法，包括：
（1）建立和扩增肠类器官：
采用建立和扩增肠类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增肠类器官培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，两天后便可观察到类器官形成，6-7天传代一次；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
优选地，所述三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养方法还包括：
（2）分化培养肠类器官：
采用分化肠类器官培养基作为标准化培养基，所述分化肠类器官培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基；
当传代培养的肠类器官在长到合适大小后，即在培养2-3天以后，将建立和扩增肠类器官培养基更换为此分化肠类器官培养基，隔天换液一次，4-5天后即可见分化好的肠类器官。
优选地，所述三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养方法还包括：
（3）建立和扩增肠癌类器官：
采用建立和扩增肠癌类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增肠癌类器官培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，2-3天后便可观察到肠癌类器官；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的培养基针对于肠组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成分按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子的含量适宜，肠组织细胞有效在3D环境中形成类器官；
（2）本发明的培养基营养成分适宜，肠组织及肠癌组织可以有效地维持组织细胞特异性、干细胞特性、形成遗传及结构等生物学特点稳定肠/肠癌组织类器官，满足科学研究需要。同时采用本发明的培养基可以完成肠/肠癌组织类器官的传代培养，达到大规模复制培养肠组织类器官的需求，控制培养得到的类器官具有高度的一致性。
附图说明
图1为本发明实施例2中的肠类器官在建立和扩增培养基中不同培养天数的形态对比图。
图2为本发明实施例3中的分化的人肠道类器官的显微结构图。
图3为本发明实施例4中的大肠癌类器官的显微结构图。
具体实施方式
为了让本发明的上述特征和优点更明显易懂，下面特举实施例，并配合附图，作详细说明如下。
实施例1：
一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种或多种；
试剂A包含N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine）、Y-27632、A8301、重组人表皮细胞生长因子（EGF）和胃泌素（Gastrin）中的一种或多种；
试剂B包含R-spondin1、Noggin、烟酰胺（Nicotinamide）和SB202190中的一种或多种；
试剂C包含Wnt-3A。
优选地，在试剂A中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1~10mM（如1mM），Y-27632的浓度为0.5~50uM（如5uM），A8301的浓度为50~5000nM（如500nM），重组人表皮细胞生长因子的浓度为5~500ng/ml（如50ng/ml），胃泌素的浓度为1~100nM（如10nM）。
优选地，在试剂B中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，R-spondin1的浓度为10%，Noggin的浓度为10%，烟酰胺的浓度为1~100mM（如10mM），SB202190的浓度为1~100uM（如10uM）。
优选地，在试剂C中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Wnt-3A的浓度为5%。
优选地，所述标准化培养基用于建立和扩增肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述标准化培养基用于分化培养肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述标准化培养基用于建立和扩增肠癌类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基。
优选地，所述基础培养基以Advanced F12/DMEM为溶剂，并包含以下成分：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine）、青霉素及链霉素（可以青链霉素双抗的形式存在）。
优选地，在基础培养基中，以基础培养基的终体积为基准计算，N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸的浓度为10~1000mM（如100mM），L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为20~2000mM（如200mM），青霉素的浓度为10000U/ml，链霉素的浓度为10000ug/ml。
优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，B27的浓度为2%。
优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Primocin的浓度为100ug/ml。
优选地，所述B27以神经干细胞培养基[Neurobasal medium (solute)]为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml（如125μg/ml）
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml（如50μg/ml）
人胰岛素 15.6~1560μg/ml（如156μg/ml）
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml（如375U/ml）
人转铁蛋白 25~2500μg/ml（如250μg/ml）
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml（如0.1μg/ml）
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml（如100μg/ml）
乙醇胺 0.1~10mg/ml（如1mg/ml）
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml（如750μg/ml）
腐胺 80.5~8050μg/ml（如805μg/ml）
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml（如625μg/ml）
皮质酮 0.1~10μg/ml（如1μg/ml）
亚油酸 5~500μg/ml（如50μg/ml）
加莫尼克酸 5~500μg/ml（如50μg/ml）
黄体酮 31.5~3150μg/ml（如315μg/ml）
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml（如5μg/ml）
维它命E油 5~500μg/ml（如50μg/ml）
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml（如50μg/ml）
生物素 12.5~1250μg/ml（如125μg/ml）
牛血清白蛋白 12.5%。
本实施例还提供一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法，包括：
（1）建立和扩增肠类器官：
采用建立和扩增肠类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增肠类器官培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel（基质胶）后，加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，两天后便可观察到类器官形成，6-7天传代一次；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
优选地，所述三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法还包括：
（2）分化培养肠类器官：
采用分化肠类器官培养基作为标准化培养基，所述分化肠类器官培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基；
当传代培养的肠类器官在长到合适大小后，即在培养2-3天以后，将建立和扩增肠类器官培养基更换为此分化肠类器官培养基，隔天换液一次，4-5天后即可见分化好的肠类器官。
优选地，所述三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法还包括：
（3）建立和扩增肠癌类器官：
采用建立和扩增肠癌类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，2-3天后便可观察到肠癌类器官；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
实施例2：
本实施例提供了一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，所述标准化培养基用于建立和扩增人肠类器官，所述标准化培养基的配方如下：
试剂A：
以标准化培养基的终体积为基准来计算，包含以下成分：
N-乙酰半胱氨酸 0.1~10mM（具体如1mM）
Y-27632 0.5~50uM（具体如5uM）
A8301 50~5000nM（具体如500nM）
重组人表皮细胞生长因子 5~500ng/ml（具体如50ng/ml）
胃泌素 1~100nM（具体如10nM）；
试剂B：
以标准化培养基的终体积为基准来计算，包含以下成分：
R-spondin1 10%
Noggin 10%
烟酰胺 1~100mM（具体如10mM）
SB202190 1~100uM（具体如10uM）；
试剂C：
Wnt-3A 5%；
基础培养基：
以Advanced F12/DMEM为溶剂，并以基础培养基的终体积计算包含以下成分：
N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸 10~1000mM（具体如100mM）
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 20~2000mM（具体如200mM）
青霉素 10000U/ml
链霉素 10000ug/ml；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
B27 2%；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
Primocin 100ug/ml。
在本实施例中，所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
人胰岛素 15.6~1560μg/ml（具体如156μg/ml）
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml（具体如375U/ml）
人转铁蛋白 25~2500μg/ml（具体如250μg/ml）
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml（具体如0.1μg/ml）
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml（具体如100μg/ml）
乙醇胺 0.1~10mg/ml（具体如1mg/ml）
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml（具体如750μg/ml）
腐胺 80.5~8050μg/ml（具体如805μg/ml）
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml（具体如625μg/ml）
皮质酮 0.1~10μg/ml（具体如1μg/ml）
亚油酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
加莫尼克酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
黄体酮 31.5~3150μg/ml（具体如315μg/ml）
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml（具体如5μg/ml）
维它命E油 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
生物素 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
牛血清白蛋白 12.5%。
在本实施例中，所述标准化培养基的配置过程如下：在Advanced F12/DMEM中加入上述浓度的N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、青霉素及链霉素（可以青链霉素双抗的形式加入），然后按上述浓度加入试剂A、试剂B和试剂C，最后加入B27及Primocin。
本实施例还提供了一种人肠/肠癌类器官建立的标准方法：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，加入此标准化培养基，隔天换液一次。两天后便可以观察到类器官形成，6-7天传代一次。图1展示了肠类器官在建立和扩增肠类器官培养基（取上述的具体值时）中不同的形态，光镜图片（放大倍数40）顶端显示在培养基中培养的天数。
本实施例还提供了一种人肠/肠癌类器官扩增及传代培养的标准方法：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此标准化培养基，隔天换液一次，每一周传代一次，可实现近一年持续培养及传代。
实施例3：
本实施例提供了一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，所述标准化培养基用于分化培养人肠道类器官，所述标准化培养基的配方如下：
试剂A：
以标准化培养基的终体积为基准来计算，包含以下成分：
N-乙酰半胱氨酸 0.1~10mM（具体如1mM）
Y-27632 0.5~50uM（具体如5uM）
A8301 50~5000nM（具体如500nM）
重组人表皮细胞生长因子 5~500ng/ml（具体如50ng/ml）
胃泌素 1~100nM（具体如10nM）；
基础培养基：
以Advanced F12/DMEM为溶剂，并以基础培养基的终体积计算包含以下成分：
N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸 10~1000mM（具体如100mM）
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 20~2000mM（具体如200mM）
青霉素 10000U/ml
链霉素 10000ug/ml；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
B27 2%；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
Primocin 100ug/ml。
在本实施例中，所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
人胰岛素 15.6~1560μg/ml（具体如156μg/ml）
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml（具体如375U/ml）
人转铁蛋白 25~2500μg/ml（具体如250μg/ml）
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml（具体如0.1μg/ml）
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml（具体如100μg/ml）
乙醇胺 0.1~10mg/ml（具体如1mg/ml）
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml（具体如750μg/ml）
腐胺 80.5~8050μg/ml（具体如805μg/ml）
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml（具体如625μg/ml）
皮质酮 0.1~10μg/ml（具体如1μg/ml）
亚油酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
加莫尼克酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
黄体酮 31.5~3150μg/ml（具体如315μg/ml）
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml（具体如5μg/ml）
维它命E油 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
生物素 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
牛血清白蛋白 12.5%。
在本实施例中，所述标准化培养基的配置过程如下：在Advanced F12/DMEM中加入上述浓度的N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、青霉素及链霉素（可以青链霉素双抗的形式加入），然后按上述浓度加入试剂A、试剂B和试剂C，最后加入B27及Primocin。
当实施例2传代培养的人肠类器官在长到合适大小后（一般是在培养2-3天以后），将人肠类器官扩增用的培养基更换为此标准化培养基，隔天换液一次，4-5天后即可见分化好的人肠道类器官。图2展示了通过分化肠类器官培养基（取上述的具体值时）分化得到的人肠道类器官显微结构，免疫荧光染色：紫色，肌动蛋白；蓝色，细胞核；标尺：10微米。
实施例4：
本实施例提供了一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，所述标准化培养基用于建立和扩增人肠癌类器官，所述标准化培养基的配方如下：
试剂A：
N-乙酰半胱氨酸 0.1~10mM（具体如1mM）
Y-27632 0.5~50uM（具体如5uM）
A8301 50~5000nM（具体如500nM）
重组人表皮细胞生长因子 5~500ng/ml（具体如50ng/ml）
胃泌素 1~100nM（具体如10nM）；
试剂B：
R-spondin1 10%
Noggin 10%
烟酰胺 1~100mM（具体如10mM）
SB202190 1~100uM（具体如10uM）；
基础培养基：
以Advanced F12/DMEM为溶剂，并以基础培养基的终体积计算包含以下成分：
N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸 10~1000mM（具体如100mM）
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 20~2000mM（具体如200mM）
青霉素 10000U/ml
链霉素 10000ug/ml；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
B27 2%；
以标准化培养基的终体积为基准来计算：
Primocin 100ug/ml。
在本实施例中，所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
人胰岛素 15.6~1560μg/ml（具体如156μg/ml）
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml（具体如375U/ml）
人转铁蛋白 25~2500μg/ml（具体如250μg/ml）
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml（具体如0.1μg/ml）
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml（具体如100μg/ml）
乙醇胺 0.1~10mg/ml（具体如1mg/ml）
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml（具体如750μg/ml）
腐胺 80.5~8050μg/ml（具体如805μg/ml）
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml（具体如625μg/ml）
皮质酮 0.1~10μg/ml（具体如1μg/ml）
亚油酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
加莫尼克酸 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
黄体酮 31.5~3150μg/ml（具体如315μg/ml）
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml（具体如5μg/ml）
维它命E油 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml（具体如50μg/ml）
生物素 12.5~1250μg/ml（具体如125μg/ml）
牛血清白蛋白 12.5%。
本实施例还提供了一种人肠/肠癌类器官建立的标准方法：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，Matrigel凝固后加入此标准化培养基，2-3天后便可以观察到人肠癌类器官。图3展示了通过建立和扩增肠癌类器官培养基（取上述的具体值时）建立得到的大肠癌类器官的光镜显微结构，图片顶端数字为放大倍数。
本实施例还提供了一种人肠/肠癌类器官扩增及传代培养的标准方法：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此标准化培养基，隔天换液一次，每一周传代一次，可实现近一年持续培养及传代。
本发明的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基包括了多种针对于肠组织及肠癌组织细胞培养所需要的细胞因子，各种细胞因子相互之间密切影响、协调配合，使得肠组织细胞在培养的过程中能够更好地表现出其固有的活性特征，实现高度近似于活体肠组织的综合特性。
特别需要说明的是，所有标准化培养基的终体积均根据实际培养对象的大小来确定。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做任何简单的修改、均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种或多种；
试剂A包含N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、A8301、重组人表皮细胞生长因子和胃泌素中的一种或多种；
试剂B包含R-spondin1、Noggin、烟酰胺和SB202190中的一种或多种；
试剂C包含Wnt-3A。
2.根据权利要求1所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：
在试剂A中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.1~10mM，Y-27632的浓度为0.5~50uM，A8301的浓度为50~5000nM，重组人表皮细胞生长因子的浓度为5~500ng/ml，胃泌素的浓度为1~100nM；
在试剂B中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，R-spondin1的浓度为10%，Noggin的浓度为10%，烟酰胺的浓度为1~100mM，SB202190的浓度为1~100uM；
在试剂C中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Wnt-3A的浓度为5%。
3.根据权利要求1所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：
所述标准化培养基用于建立和扩增肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基；
所述标准化培养基用于分化培养肠类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基；
所述标准化培养基用于建立和扩增肠癌类器官时，所述标准化培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基。
4.根据权利要求3所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：所述基础培养基以Advanced F12/DMEM为溶剂，并包含以下成分：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、青霉素及链霉素。
5.根据权利要求4所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：在基础培养基中，以基础培养基的终体积为基准计算，N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸的浓度为10~1000mM，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为20~2000mM，青霉素的浓度为10000U/ml，链霉素的浓度为10000ug/ml。
6.根据权利要求3所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：以标准化培养基的终体积为基准来计算，B27的浓度为2%；以标准化培养基的终体积为基准来计算，Primocin的浓度为100ug/ml。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：
过氧化氢酶 12.5~1250μg/ml
谷胱甘肽（还原型） 5~500μg/ml
人胰岛素 15.6~1560μg/ml
超氧化物歧化酶 37.5~3750U/ml
人转铁蛋白 25~2500μg/ml
T3 (triodo-I-thyronine) 0.01~1μg/ml
露卡西左旋肉碱 10~1000μg/ml
乙醇胺 0.1~10mg/ml
D-(+)-吡喃葡萄糖 75~7500μg/ml
腐胺 80.5~8050μg/ml
亚硒酸钠 62.5~6250μg/ml
皮质酮 0.1~10μg/ml
亚油酸 5~500μg/ml
加莫尼克酸 5~500μg/ml
黄体酮 31.5~3150μg/ml
维生素A醋酸酯 0.5~50μg/ml
维它命E油 5~500μg/ml
DL-α-生育酚乙酸酯 5~500μg/ml
生物素 12.5~1250μg/ml
牛血清白蛋白 12.5%。
8.一种三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法，其特征在于，包括：
（1）建立和扩增肠类器官：
采用建立和扩增肠类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增肠类器官培养基包括试剂A、试剂B、试剂C、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，两天后便可观察到类器官形成，6-7天传代一次；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
9.根据权利要求8所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法，其特征在于，还包括：
（2）分化培养肠类器官：
采用分化肠类器官培养基作为标准化培养基，所述分化肠类器官培养基包括试剂A、B27、Primocin和基础培养基；
当传代培养的肠类器官在长到合适大小后，即在培养2-3天以后，将建立和扩增肠类器官培养基更换为此分化肠类器官培养基，隔天换液一次，4-5天后即可见分化好的肠类器官。
10.根据权利要求8或9所述的三维培养肠及肠癌组织类器官的标准化培养方法，其特征在于，还包括：
（3）建立和扩增肠癌类器官：
采用建立和扩增肠癌类器官培养基作为标准化培养基，所述建立和扩增肠癌类器官培养基包括试剂A、试剂B、B27、Primocin和基础培养基；
建立：将组织消化为单细胞并包埋在Matrigel后，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，2-3天后便可观察到肠癌类器官；
扩增：将吹打成碎片的类器官包埋在Matrigel，Matrigel凝固后加入此建立和扩增肠癌类器官培养基，隔天换液一次，每一周传代一次。
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