CN113122500B - 一种转移性肠癌类器官的培养和应用 - Google Patents

一种转移性肠癌类器官的培养和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术，尤其涉及一种转移性肠癌类器官的培养和应用。本发明改良了基础培养基的组分和浓度，提高了转移性肠癌类器官培养的建立成功率、增加了转移性类器官的扩增效率，传代后增殖效率稳定，加快了药筛过程，降低了培养材料的成本。

Description

一种转移性肠癌类器官的培养和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地涉及一种转移性肠癌类器官的培养和应用。
背景技术
大肠癌是一种非常高发的消化道恶性肿瘤，在全世界肿瘤发病率中排第3，每年超过120万新发病例，死亡人数每年超60万。15％的大肠癌患者诊断时已是晚期转移(IV期)，没有很好的治疗方案和治疗药物，同时也丧失了手术机会；50％的大肠癌患者最终会进展到远处转移，包括肝，肺和骨。如何及时给予大肠癌IV期患者有效的治疗方案和治疗药物一直是临床医生孜孜追求的目标。
类器官是将具有干性潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的类似组织，类器官能最大程度地模拟体内组织结构及功能并能长期传代培养。肿瘤类器官的遗传背景与其来源肿瘤组织遗传背景又高度一致。2018年Science一项研究表明肿瘤类器官体外对药物的反应与转移性胃肠道肿瘤患者的临床预后高度一致，揭示了肿瘤类器官可以作为肿瘤病人特别是晚期肿瘤病人临床精准治疗的一种筛查工具。
大肠癌原发部位的手术样本或活检样本肿瘤类器官培养已有很高的成功率，但转移部位的穿刺样本因其样本微小，反复治疗后遗传特性改变，肿瘤微环境改变等，与原发未经治疗的样本相比，因不适应原位培养基，其肿瘤类器官培养难度较大，成功率较低。这个技术难题限制了肿瘤类器官在更需要精准治疗的晚期肿瘤病人中的临床应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了大肠癌转移部位穿刺样本的肿瘤类器官培养方法，培养基和类器官药物筛选方法。
1.一种改良的基础培养基，以Advance DMEM/F12和DMEM/F12培养基为基础，添加有抗坏血酸(Ascorbic acid)、转铁蛋白(优选地人源转铁蛋白(Holo-transferrin))、L-谷胱甘肽(L-Glutathine)、胰岛素(Insulin)、偏钒酸铵(Ammonium metavanadate)、四水氯化锰(Manganese chloride tetrahydrate)、亚硒酸钠(Sodium selenite)和乙醇胺盐酸盐(Ethanolamine hydrochloride)。
2.如项目1所述的改良的基础培养基，Advance DMEM/F12和DMEM/F12的体积比为(0.1-10):1，较佳地(0.5-2):1。
3.如项目1所述的改良的基础培养基，抗坏血酸的浓度为0.2-50mg/L，较佳地1-10mg/L；人源转铁蛋白的浓度为1-250mg/L，较佳地5-50mg/L；L-谷胱甘肽的浓度为0.2-50mg/L，较佳地1-10mg/L；胰岛素的浓度为0.2-100mg/L，较佳地1-20mg/L；偏钒酸铵的浓度为2×10-5-1×10-2mg/L，较佳地1×10-4-2×10-3mg/L；四水氯化锰的浓度为1×10-5-2.5×10-3mg/L，较佳地5×10-5-5×10-4mg/L；亚硒酸钠的浓度为0.0004-0.25mg/L，较佳地0.002-0.05mg/L；和/或乙醇胺盐酸盐的浓度为0.4-100mg/L，较佳地2-20mg/L，以改良的培养基总体积计。
在另一优选例中，以Advance DMEM/F12和DMEM/F12培养基为基础，其中AdvanceDMEM/F12和DMEM/F12的体积比为(0.1-10):1，含有0.2-50mg/L抗坏血酸，1-250mg/L人源转铁蛋白，0.2-50mg/L L-谷胱甘肽，0.2-100mg/L胰岛素，2×10-5-1×10-2mg/L偏钒酸铵，1×10-5-2.5×10-3mg/L四水氯化锰，0.0004-0.25mg/L亚硒酸钠和0.4-100mg/L乙醇胺盐酸盐，以所述改良的培养基总体积计。
在另一优选例中，以Advance DMEM/F12和DMEM/F12培养基为基础，其中AdvanceDMEM/F12和DMEM/F12的体积比为(0.5-2):1，含有1-10mg/L抗坏血酸，5-50mg/L人源转铁蛋白，1-10mg/L L-谷胱甘肽，1-20mg/L胰岛素，1×10-4-2×10-3mg/L偏钒酸铵，5×10-5-5×10-4mg/L四水氯化锰，0.002-0.05mg/L亚硒酸钠和2-20mg/L乙醇胺盐酸盐，以所述改良的培养基总体积计。
4.项目1所述的改良的基础培养基在制备转移性肿瘤类器官培养基的用途，优选地，所述转移性肿瘤为肠癌转移位肿瘤、胃癌转移位肿瘤、胰腺癌转移位肿瘤、消化道肿瘤(如食管癌)转移位肿瘤、肺癌转移位肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述转移性肿瘤包括肠癌肝转移肿瘤、肠癌肺转移肿瘤、肠癌骨转移肿瘤、肠癌淋巴结转移肿瘤、胃癌肝转移、胰腺癌肝转移、消化道肿瘤肝转移(如食管癌肝转移)、肺癌肝转移、或其组合。
5.一种转移性肿瘤类器官培养基，所述转移性肿瘤类器官培养基包含项目1所述的改良的基础培养基和功能组分；
优选地，所述转移性肿瘤类器官培养基为肠癌转移位肿瘤类器官培养基、胃癌转移位肿瘤类器官培养基、胰腺癌转移位肿瘤类器官培养基、消化道肿瘤转移位肿瘤类器官培养基、肺癌转移位肿瘤类器官培养基；
优选地，所述功能组份选自下组中的一种或多种：R-spondin 1、Noggin、N2、B27、GlutaMAX Supplement、HEPES、烟酰胺、NormocinTM、N-乙酰半胱氨酸、A83-01、SB202190、Gastrin I、PGE2、EGF、HGF、FGF2、FGF7、FGF10、BMP2、BMP4、BMP7和Y27632；
优选地，各功能组份在所述类器官培养基的含量或重量比选自下组中的一种或多种：R-spondin 1:Noggin为(0.2-5):1；N2：B27为(0.1-2):1；R-spondin 1，50-1000ng/ml；N2，0.5X-3X；GlutaMAX Supplement，0.5X-2X；HEPES，0.5X-2X；烟酰胺，1-100mM；NormocinTM，0.5X-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.1-10mM；A83-01，0.1-20μM；SB202190，0.1-10μM；Gastrin I，0.1-20nM；PGE2，0.1-30μM；EGF，1-200ng/ml；HGF，5-500ng/ml；FGF2，1-100ng/ml；FGF7，1-200ng/ml；FGF10，50-500ng/ml；BMP2，1-200ng/ml；BMP4，1-200ng/ml；BMP7，10-500ng/ml；Y27632，1-200μM。
6.如项目5所述的转移性肿瘤类器官培养基，所述转移性肿瘤类器官培养基为肠癌肝转移位类器官培养基或肠癌淋巴结转移位类器官培养基，且包含以下一种或多种功能组份：R-spondin 1:Noggin，(0.2-5):1；N2：B27，(0.1-2):1；R-spondin 1，50-1000ng/ml；N2，0.5X-3X(优选0.5X-2X，更优选1X-2X)；GlutaMAX Supplement，0.5X-2X；HEPES，0.5X-2X；烟酰胺，1-100mM；NormocinTM，0.5X-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.1-10mM；A83-01，0.1-20μM；SB202190，0.1-10μM；Gastrin I，0.1-20nM；PGE2，0.1-30μM；EGF，1-200ng/ml；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；和HGF，5-500ng/ml；或
所述转移性肿瘤类器官培养基为肠癌肺转移位类器官培养基，且包含以下一种或多种功能组份：R-spondin 1:Noggin，(0.2-5):1；N2：B27，(0.1-2):1；R-spondin 1，50-1000ng/ml；N2，0.5X-3X(优选0.5X-2X，更优选1X-2X)；GlutaMAX Supplement，0.5X-2X；HEPES，0.5X-2X；烟酰胺，1-100mM；NormocinTM，0.5X-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.1-10mM；A83-01，0.1-20μM；SB202190，0.1-10μM；Gastrin I，0.1-20nM；EGF，1-200ng/ml；PGE2，0.1-30μM；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；FGF7，1-200ng/ml；和FGF2，1-100ng/ml；或
所述转移性肿瘤类器官培养基为肠癌骨转移位类器官培养基，且包含以下一种或多种功能组份：R-spondin 1:Noggin，(0.2-5):1；N2：B27，(0.1-2):1；R-spondin 1，50-1000ng/ml；N2，0.5X-3X(优选0.5X-2X，更优选1X-2X)；GlutaMAX Supplement，0.5X-2X；HEPES，0.5X-2X；烟酰胺，1-100mM；NormocinTM，0.5X-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.1-10mM；A83-01，0.1-20μM；SB202190，0.1-10μM；Gastrin I，0.1-20nM；PGE2，0.1-30μM；EGF，1-200ng/ml；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；BMP2，1-200ng/ml；BMP4，1-200ng/ml；和BMP7，10-500ng/ml。
在另一优选例中，所述培养基中还包含抗生素，如青霉素、链霉素等。
7.项目1-3、5、6中任一所述的培养基在制备转移性肿瘤类器官中的应用和/或在制备转移性肿瘤类器官培养的试剂中的应用；优选地所述转移性肿瘤为肠癌转移位肿瘤、胃癌转移位肿瘤、胰腺癌转移位肿瘤、消化道肿瘤(如食管癌)转移位肿瘤、肺癌转移位肿瘤、或其组合。
8.一种培养转移位肿瘤类器官的方法，所述方法包括：将肿瘤转移部位细胞与项目5-6中任一所述的培养基和基质胶(Matrigel)混合，对肿瘤转移部位细胞进行培养，从而得到转移位肿瘤类器官；优选地，所述肿瘤转移部位细胞为肠癌转移部位细胞、胃癌转移部位细胞、胰腺癌转移部位细胞、消化道肿瘤(如食管癌)转移部位细胞、肺癌转移部位细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述培养为体外培养。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(i)获得肿瘤(如肠癌)转移部位细胞；优选地，所述肿瘤(如肠癌)转移部位细胞包括肠癌肝转移细胞、肠癌肺转移细胞、肠癌骨转移细胞和/或肠癌淋巴结转移细胞；
(ii)将肿瘤(如肠癌)转移部位细胞与基质胶重悬，接种于培养容器(如细胞培养板、细胞培养皿)；和
(iii)向培养容器中加入项目5-6中相应转移性肿瘤类器官培养基(如肠癌肝转移位类器官培养基、肠癌肺转移位类器官培养基、肠癌骨转移位类器官培养基或肠癌淋巴结转移位类器官培养基)，培养至得到肿瘤(如肠癌)转移位肿瘤类器官。
在另一优选例中，所述步骤(i)包括将肠癌转移部位(如肝，肺，骨)样本经胶原酶解得到肠癌转移部位细胞。
在另一优选例中，所述步骤(i)中还包括用PBS溶液清洗肠癌转移部位细胞。
9.利用项目8所述的方法制备得到的转移位肿瘤类器官。
10.项目9所述的转移位肿瘤类器官在药物开发、药物筛选、食品补充剂的毒性测定和作为药物评价模型中的应用；优选地，所述药物评价为抗肿瘤药物评价；优选地，在转移位肿瘤类器官(如肠癌转移位肿瘤类器官)靶向药物的体外高通量筛选和抗肿瘤药物敏感性评价中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物的体外评价方法，包括如下步骤：
(1)利用项目8所述的方法得到转移位肿瘤类器官；
(2)使用转移位肿瘤类器官进行抗肿瘤药物敏感性评价。
本发明还提供了一种试剂盒，其含有项目1-3中任一所述的改良的基础培养基，或者项目5或6所述的转移性肿瘤类器官培养基，或者可以制备得到项目1-3中任一所述的改良的基础培养基，或者项目5或6所述的转移性肿瘤类器官培养基的试剂组合；优选地，所述试剂盒中还含有基质胶。
本发明还提供了一种制备项目1所述的改良的基础培养基的方法，包括将AdvanceDMEM/F12和DMEM/F12培养基与抗坏血酸、转铁蛋白(优选地人源转铁蛋白(Holo-transferrin))、L-谷胱甘肽、胰岛素、偏钒酸铵、四水氯化锰、亚硒酸钠和乙醇胺盐酸盐混合，从而得到所述的改良的基础培养基。
本发明还提供了一种制备转移性肿瘤类器官培养基的方法，包括将项目1所述的改良的基础培养基与功能组分混合，从而得到所述的转移性肿瘤类器官培养基；优选地，所述功能组份选自下组中的一种或多种：R-spondin 1、Noggin、N2、B27、GlutaMAXSupplement、HEPES、烟酰胺、NormocinTM、N-乙酰半胱氨酸、A83-01、SB202190、Gastrin I、PGE2、EGF、HGF、FGF2、FGF7、FGF10、BMP2、BMP4、BMP7和Y27632。
本发明的改良的基础培养基的有益效果在于：
本发明改良的培养基提高了肠癌转移位肿瘤类器官培养成功率，增加了转移位肿瘤类器官的扩增效率(培养时间变短)，传代后增殖效率稳定，因而，在面向体外药筛时，加快了药筛过程，降低了培养材料的成本。同时为临床上晚期转移肿瘤病人的治疗提供了新的药物可能和选择机会，尽可能避免晚期肿瘤病人无药可选的局面。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为肠癌肝转移样本用原位培养基和改良培养基培养12天的结果。
图2为改良培养基和原位培养基对肠癌转移位样本进行类器官培养的结果。
图3为肠癌肺转移样本用原位培养基和改良培养基培养9天的结果。
图4为肠癌骨转移样本用原位培养基和改良培养基培养15天的结果。
图5为肠癌肝转移样本用原位培养基和改良培养基培养15天的结果。
图6为肠癌肺转移样本用原位培养基和改良培养基培养15天的结果。
图7为利用肠癌骨转移后的样本培养得到的类器官对原有化疗药物5-FU，CPT11，Oxaliplatin已不敏感，但对Gemctitabine和Epirubicin依然敏感。其中红色显示存活类器官。
图8为利用肠癌肺转移后的样本培养得到的类器官对原有化疗药物5-FU，CPT11，Oxaliplatin已不敏感，但对Vinorelbine和Epirubicin依然敏感。其中红色显示存活类器官。
图9为利用肠癌肝转移后的样本培养得到的类器官对原有化疗药物5-FU，CPT11，Oxaliplatin已不敏感，但对Epirubicin依然敏感。其中红色显示存活类器官。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
在本发明的一个具体实施方式中，改良的基础培养基和转移位肠癌培养基的成分、配比及浓度如下：
1.改良的基础培养基成分：Advance DMEM/F12(12634028，Gibco)，DMEM/F12(L310KJ，源培)，抗坏血酸(A103539，Aladdin)，人源转铁蛋白(T0665，Sigma)，L-谷胱甘肽(G6013，Sigma)，胰岛素(91077C，Sigma)，偏钒酸铵(A111829，Aladdin)，四水氯化锰(M112543，Aladdin)，亚硒酸钠(S5261，Sigma)，乙醇胺盐酸盐(E120635，Aladdin)。
配比和浓度：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(0.5-2)，抗坏血酸(1-10mg/L)，人源转铁蛋白(5-50mg/L)，L-谷胱甘肽(1-10mg/L)，胰岛素(1-20mg/L)，偏钒酸铵(1x10-4-20x10- 4mg/L)，四水氯化锰(5x10-5-50x10-5mg/L)，亚硒酸钠(0.002-0.05mg/L)，乙醇胺盐酸盐(2-20mg/L)。
2.转移位肠癌培养基成分：改良的基础培养基(上1)，R-spondin 1(SinoBiological)，Noggin(SinoBiological)，N2(Gibco)，B27(Gibco)，GlutaMAXSupplement(Gibco)，HEPES(Gibco)，Nicotinamide(Sigma)，NormocinTM(Invivogen)，N-Acetylcystine(Sigma)，A83-01(Tocris)，SB202190(Sigma)，Gastrin I(Sigma)，PGE2(Sigma)，EGF(Prerotech)，HGF(Prerotech)，FGF2(Prerotech)，FGF7(Prerotech)，FGF10(Prerotech)，BMP2(SinoBiological)，BMP4(SinoBiological)，BMP7(SinoBiological)，Y27632(Sigma)。
配比和浓度：R-spondin 1:Noggin(0.2-5)，N2：B27(0.1-2)，R-spondin1(100-500ng/ml)，Noggin(100-500ng/ml)，N2(1X-2X)，B27(1X-2X)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(1-100mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(0.1-10mM)，A83-01(0.1-20μM)，SB202190(0.1-10μM)，Gastrin I(0.1-20nM)，PGE2(0.1-30μM)，EGF(1-200ng/ml)，HGF(5-500ng/ml)，FGF2(1-100ng/ml)，FGF7(1-200ng/ml)，FGF10(50-500ng/ml)，BMP2(1-200ng/ml)，BMP4(1-200ng/ml)，BMP7(10-500ng/ml)，Y27632(1-200μM)。
实验结果显示(图2)，对29例肠癌转移位样本进行类器官培养，改良培养基对肠癌转移位肿瘤类器官培养成功率显著提高，培养时间缩短。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用方法
本发明提取肠癌转移部位细胞和培养方法如下：
1.大肠癌转移部位(肝，肺，骨)样本保存于4℃保存液中，24小时内低温转移至操作室；
2.样本冰PBS清洗5次，每次5min；
3.样本低温切成1mm碎片入37℃预热胶原酶消化液中，消化时间30-60min.
4.样本消化完全后，添加与消化液同体积的冰PBS，反复吹打直至不见碎片组织；
5. 100g低温离心5-10min，去除上清，冰PBS重悬；
6. 70g低温离心5-10min，去除上清，冰PBS重悬，此过程重复3-5次；
7. 200g低温离心10min，去除上清，依据获得细胞情况，1-5ml冰PBS重悬后显微镜下计数细胞；
8. 300g低温离心10min，去除上清，依据细胞计数加入适量冰Matrigel重悬接种于24孔板，加入相应转移位肠癌培养液(即改良培养基)或原位培养基，每3天更换一次相应培养液；
9.肿瘤类器官培养12天后，每孔添加1ml冰PBS，反复吹打，移入15ml离心管；
10. 300g低温离心10min，去上清，冰PBS重悬，此步骤重复3-5次，直至Matrigel全部清除
11.离心结束后，冰Matrigel重悬，1：3接种扩增；
12.待肿瘤类器官稳定传代后，重复步骤10，一半类器官做药物敏感性实验，一半类器官用细胞冻存液冻存建细胞系。
实施例1肠癌肝转移类器官培养及肠癌淋巴结转移类器官培养
获得肠癌肝转移穿刺样本(1mmx1.5cm)，提取肠癌转移部位细胞和培养方法的实验步骤如上述通用方法，添加肠癌肝转移位培养基(改良培养基)的组分及浓度如下：改良的基础培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(100ng/ml)(2:1)，N2(1X)：B27(2X)(1：2)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(3μM)，SB202190(5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(1μM)，EGF(100ng/ml)，FGF10(250ng/ml)，Y27632(30μM)，HGF(100ng/ml)。其中改良的基础培养基的组分及浓度如下：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(1:2)，抗坏血酸(1mg/L)，人源转铁蛋白(20mg/L)，L-谷胱甘肽(1mg/L)，胰岛素(5mg/L)，偏钒酸铵(3x10-4mg/L)，四水氯化锰(15x10-5mg/L)，亚硒酸钠(0.01mg/L)，乙醇胺盐酸盐(5mg/L)。
结果如图1所示，肠癌肝转移样本培养12天，与原位培养基(Advance DMEM/F12培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(100ng/ml)(2:1)，N2(1X)：B27(2X)(1：2)，GlutaMAXSupplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(3μM)，SB202190(5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(1μM)，EGF(100ng/ml)，FGF10(250ng/ml)，Y27632(30μM)，HGF(100ng/ml))相比，改良培养基形成类器官数量多，生长快速。本实施例用肠癌肝转移位培养基(改良培养基)共培养样本12例，成功11例；而用原位培养基共培养样本12例，仅成功3例(图2)。另有2例淋巴结转移用此改良培养基也成功建立，而用原位培养基培养样本2例均失败。
实施例2
获得肠癌肺转移穿刺样本(1mmx1.5cm)，提取肠癌转移部位细胞和培养方法的实验步骤如上述通用方法，添加肠癌肺转移位培养基(改良培养基)的组分及浓度如下：改良基础培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(200ng/ml)(1:1)，N2(1X)：B27(1X)(1:1)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(5μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(10nM)，EGF(100ng/ml)，PGE2(1μM)，FGF10(50ng/ml)，Y27632(30μM)，FGF7(50ng/ml)，FGF2(10ng/ml)。其中改良的基础培养基的组分及浓度如下：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(1:1)，抗坏血酸(1mg/L)，人源转铁蛋白(30mg/L)，L-谷胱甘肽(5mg/L)，胰岛素(10mg/L)，偏钒酸铵(3x10-4mg/L)，四水氯化锰(15x10-5mg/L)，亚硒酸钠(0.01mg/L)，乙醇胺盐酸盐(5mg/L)。
结果如图3所示，肠癌肺转移样本培养9天，与原位培养基(Advance DMEM/F12培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(200ng/ml)(1:1)，N2(1X)：B27(1X)(1:1)，GlutaMAXSupplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(5μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(10nM)，EGF(100ng/ml)，PGE2(1μM)，FGF10(50ng/ml)，Y27632(30μM)，FGF7(50ng/ml)，FGF2(10ng/ml))相比，改良培养基形成类器官数量多，生长快速。本实施例用肠癌肺转移位培养基(改良培养基)共培养样本10例，成功8例。而用原位培养基共培养样本10例，仅成功2例(图2)。
实施例3
获得肠癌骨转移手术样本(0.5cmx0.5cm)，提取肠癌转移部位细胞和培养方法的实验步骤如上述通用方法，添加肠癌骨转移位培养基(改良培养基)的组分及浓度如下：改良的基础培养基，R-spondin 1(400ng/ml):Noggin(100ng/ml)(4:1)，N2(2X)：B27(1X)(2:1)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(1μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(0.5μM)，EGF(10ng/ml)，FGF10(100ng/ml)，Y27632(50μM)，BMP2(50ng/ml)，BMP4(50ng/ml)，BMP7(100ng/ml)。其中改良的基础培养基的组分及浓度如下：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(1:2)，抗坏血酸(1mg/L)，人源转铁蛋白(20mg/L)，L-谷胱甘肽(1mg/L)，胰岛素(5mg/L)，偏钒酸铵(3x10-4mg/L)，四水氯化锰(15x10-5mg/L)，亚硒酸钠(0.01mg/L)，乙醇胺盐酸盐(5mg/L)。
结果如图4所示，肠癌骨转移样本培养15天，与原位培养基(Advance DMEM/F12培养基，R-spondin 1(400ng/ml):Noggin(100ng/ml)(4:1)，N2(2X)：B27(1X)(2:1)，GlutaMAXSupplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(1μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(0.5μM)，EGF(10ng/ml)，FGF10(100ng/ml)，Y27632(50μM)，BMP2(50ng/ml)，BMP4(50ng/ml)，BMP7(100ng/ml))相比，改良培养基形成类器官且能存活传代，形成类器官数量多，生长快速。本实施例用肠癌骨转移位培养基(改良培养基)共培养样本5例，成功3例。而用原位培养基共培养样本5例，仅成功1例(图2)。
实施例4
获得肠癌肝转移穿刺样本(1mmx1.5cm)，提取肠癌转移部位细胞和培养方法的实验步骤如上述通用方法，添加肠癌肝转移位培养基(改良培养基)的组分及浓度如下：改良的基础培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(100ng/ml)(2:1)，N2(1X)：B27(2X)(1：2)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(3μM)，SB202190(5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(1μM)，EGF(100ng/ml)，FGF10(250ng/ml)，Y27632(30μM)，HGF(100ng/ml)。其中改良的基础培养基的组分及浓度如下：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(1:1)，抗坏血酸(5mg/L)，人源转铁蛋白(10mg/L)，L-谷胱甘肽(10mg/L)，胰岛素(20mg/L)，偏钒酸铵(1x10-3mg/L)，四水氯化锰(1x10-3mg/L)，亚硒酸钠(0.05mg/L)，乙醇胺盐酸盐(10mg/L)。
结果如图5所示，肠癌肝转移样本培养15天，与原位培养基(Advance DMEM/F12培养基，R-spondin 1(200ng/ml):Noggin(100ng/ml)(2:1)，N2(1X)：B27(2X)(1：2)，GlutaMAXSupplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(3μM)，SB202190(5μM)，Gastrin I(5nM)，PGE2(1μM)，EGF(100ng/ml)，FGF10(250ng/ml)，Y27632(30μM)，HGF(100ng/ml))相比，改良培养基形成类器官且能存活传代，形成类器官数量多，生长快速。
实施例5
获得肠癌肺转移穿刺样本(1mmx1.5cm)，提取肠癌转移部位细胞和培养方法的实验步骤如上述通用方法，添加肠癌肺转移位培养基(改良培养基)的组分及浓度如下：改良基础培养基，R-spondin 1(100ng/ml):Noggin(500ng/ml)(1:5)，N2(1X)：B27(1X)(1:1)，GlutaMAX Supplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(5μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(10nM)，EGF(100ng/ml)，PGE2(1μM)，FGF10(50ng/ml)，Y27632(30μM)，FGF7(50ng/ml)，FGF2(10ng/ml)。其中改良的基础培养基的组分及浓度如下：Advance DMEM/F12：DMEM/F12(2:1)，抗坏血酸(10mg/L)，人源转铁蛋白(5mg/L)，L-谷胱甘肽(1mg/L)，胰岛素(10mg/L)，偏钒酸铵(1x10-4mg/L)，四水氯化锰(5x10-5mg/L)，亚硒酸钠(0.0005mg/L)，乙醇胺盐酸盐(2mg/L)。
结果如图6所示，肠癌肺转移样本培养15天，与原位培养基(Advance DMEM/F12培养基，R-spondin 1(100ng/ml):Noggin(500ng/ml)(1:5)，N2(1X)：B27(1X)(1:1)，GlutaMAXSupplement(1X)，HEPES(1X)，Nicotinamide(20mM)，NormocinTM(1X)，N-Acetylcystine(5mM)，A83-01(5μM)，SB202190(0.5μM)，Gastrin I(10nM)，EGF(100ng/ml)，PGE2(1μM)，FGF10(50ng/ml)，Y27632(30μM)，FGF7(50ng/ml)，FGF2(10ng/ml))相比，改良培养基形成类器官且能存活传代，形成类器官数量多，生长快速。
实施例6
肿瘤类器官筛药：肠癌转移病人往往没有合适的药物可用，成功培养的转移位类器官非常适合进行体外筛药，可以为无药可用患者提供用药参考。
1.转移位肠癌类器官扩增后接种于96孔板，50-100个/孔，200μl培养基培养3天；
2.类器官培养3天后更换含化疗药物培养基，药物浓度分别为0μM，0.1μM，1μM，10μM和100μM；
3.药物作用6-12天后，CTG方法和拍照展示肿瘤类器官活性和存活情况。
结果如图7-9所示。结果表明，利用本发明的改良培养基培养得到的类器官非常适合进行体外筛药，能够有效快速地筛选出合适的治疗药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种改良的基础培养基，其特征在于，Advance DMEM/F12和DMEM/F12的体积比为(0.5-2):1，抗坏血酸的浓度为1-10mg/L；转铁蛋白的浓度为5-50mg/L；L-谷胱甘肽的浓度为1-10mg/L；胰岛素的浓度为1-20mg/L；偏钒酸铵的浓度为1×10-4-2×10-3mg/L；四水氯化锰的浓度为5×10-5-5×10-4mg/L；亚硒酸钠的浓度为0.002-0.05mg/L；和乙醇胺盐酸盐的浓度为2-20mg/L。
2.权利要求1所述的改良的基础培养基在制备肠癌转移位肿瘤类器官培养基的用途。
3.一种肠癌转移位肿瘤类器官培养基，其特征在于，所述转移性肿瘤类器官培养基包含权利要求1所述的改良的基础培养基和下述两种功能组分，其中，第一种功能组份为：R-spondin 1:Noggin为(0.2-5):1；N2：B27为(0.1-2):1；R-spondin 1，50-1000ng/ml；N2，0.5X-3X；GlutaMAX Supplement，0.5X-2X；HEPES，0.5X-2X；烟酰胺，1-100mM；NormocinTM，0.5X-2X；N-乙酰半胱氨酸，0.1-10mM；A83-01，0.1-20μM；SB202190，0.1-10μM；Gastrin I，0.1-20nM；第二种功能组分为PGE2，0.1-30μM；EGF，1-200ng/ml；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；和HGF，5-500ng/ml；或EGF，1-200ng/ml；PGE2，0.1-30μM；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；FGF7，1-200ng/ml；和FGF2，1-100ng/ml；或PGE2，0.1-30μM；EGF，1-200ng/ml；FGF10，50-500ng/ml；Y27632，1-200μM；BMP2，1-200ng/ml；BMP4，1-200ng/ml；和BMP7，10-500ng/ml。
4.权利要求1-3中任一所述的培养基在培养肠癌转移位肿瘤类器官中的应用。
5.权利要求1-3中任一所述的培养基在制备肠癌转移位肿瘤类器官培养的试剂中的应用。
6.一种培养肠癌转移位肿瘤类器官的方法，其特征在于，所述方法包括：将肠癌肿瘤转移部位细胞与权利要求4所述的培养基和基质胶(Matrigel)混合，对肠癌转移部位细胞进行培养。
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