CN108707582A - 一种体液来源的肿瘤细胞的高效培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体液来源的肿瘤细胞的培养方法和肿瘤培养基。所述方法为富集体液肿瘤细胞,与细胞外基质混合,在基本培养基的存在下,加入相应的胸水、腹水或脑脊液等进行3D细胞培养。此方法能高效获得病人来源的肿瘤类似物(Patient Derived Tumor analog,PDTA),为检测临床肿瘤病人对药物的敏感程度以及测定候选药物的体外代谢稳定性、代谢谱、毒性等提供一种新型的检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及体液来源的肿瘤细胞的培养领域,具体涉及多种胸水、腹水或脑脊液肿瘤细胞的培养方法、肿瘤细胞培养基及其应用。
背景技术
目前用于肿瘤学基础科学研究的模型主要有肿瘤细胞系和人源肿瘤异种移植模型。其中肿瘤细胞系具有培养周期短、易于操作、费用较低等优点,其缺点有:1)肿瘤细胞系是在2D条件下培养获得的,与体内环境相差较大;2)肿瘤细胞系的遗传背景和基因表达谱与临床患者肿瘤细胞有较大差异。因此,肿瘤细胞系通常只用作基础探索性研究工具。人源肿瘤异种移植模型(patient-derived xenograft model,PDX模型)是指将病人的肿瘤组织手术切下来后,接种在免疫缺陷的小鼠体内,在小鼠身上成瘤并进一步传代的肿瘤模型。PDX模型能够保留肿瘤患者的组织型和遗传学特征,并能维持肿瘤的异质性。其缺点有:1)培养周期长,从肿瘤组织获取到接种、传代、实验,通常需要数月时间;2)需要专门的免疫缺陷小鼠和动物培养场所,费用昂贵;3)实验动物对药物的反应性等与人类有较大差异。
近年来,随着干细胞技术的发展,Hans Clever等建立了一种体外3D培养干细胞获得组织类器官的方法。类器官是指将具有干细胞潜能的细胞进行3D培养,从而形成相应器官的类似组织,并具有自我更新和自我组织的能力,维持了其来源组织的生理结构和功能的特点,也被称作“瓶皿里的器官”。研究表明,类器官在传代的过程中显示出高度的遗传稳定性,如单个肝脏干细胞生成的肝类器官,经三个月的传代后,全基因组测序显示仅出现了一个同源碱基的替换。截止目前,正常组织类器官培养已用于肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺等组织,主要被用于器官发育生物学、细胞生物学、再生机制等领域的研究。CN102439135B公开了上皮正常组织快所含干细胞类器官培养和上皮腺瘤组织块来源的肿瘤细胞3D培养,但是对体液来源的,尤其是胸腹水肿瘤细胞分离,及3D肿瘤类似物的培养没有涉及。
胸水、腹水、脑脊液等体液的过多积聚是临床常见的病理现象,多由转移性恶性肿瘤形成。CN104962520 A公开了从从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法,但没有涉及胸腹水肿瘤细胞的培养方法;CN106190980 A公开了一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤细胞的方法及其专用培养基,其使用的仍然是普通体外培养基和人工加入的部分细胞因子,不能很好的体现体内环境,影响检测数据的准确性和真实性,对于达到临床治疗目的有一定的差距。综上,在现有技术中,尚缺乏从肿瘤病人的胸水、腹水、脑脊液等体液中分离肿瘤细胞,并在3D条件下,利用可模拟肿瘤细胞体内环境的培养基进行肿瘤类似物培养的方法。因此,改善肿瘤细胞体外培养技术,是现在亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足,提供一种从体液中提取肿瘤细胞体外培养肿瘤类似物的方法并提供培养基。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种肿瘤细胞的培养方法,所述方法包含:富集体液肿瘤细胞,与细胞外基质(如3D-基质胶)混合,在培养基的存在下,加入相应的体液上清液。
一种肿瘤类似物的培养方法,所述方法包含:富集体液肿瘤细胞,与细胞外基质(如3D-基质胶)混合,在培养基的存在下,加入相应的体液上清液。
进一步的,富集体液肿瘤细胞的方法为:取胸水、腹水或脑脊液样本,离心后得到细胞沉淀物,同时收集上清,过滤去除杂质,56℃水浴灭活20-40min,优选30min。体液上清液的浓度为0-50%。所述细胞外基质为3D-凝胶质。
所述基本培养基包含DMEM/F12、N-acetylcysteine、gastrin、egf、rspondin1、noggin、A83-01、normocin、nicotinamide、wnt3a、fgf10。
具体成分为:DMEM/F12 1:1,N-acetylcysteine 1mM、gastrin 1nM、egf 50ng/ml、rspondin1 500ng/ml、noggin 100ng/ml、A83-01 2uM、normocin 100ug/ml、nicotinamide10mM、wnt3a 100ng/ml、fgf10 10ng/ml。
其中,腹水、胸水、或脑脊液的来源为上皮来源的腺瘤病人或动物。
胸水样本的来源是以下病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌。
腹水样本的来源是以下病人或动物:胃癌、肠癌、肺癌、胆管癌、子宫内膜癌。
脑脊液样本的来源是以下病人或动物:胃癌。
上述培养方法的主要应用在于:a)检测病人肿瘤对药物的敏感程度,b)测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱;c)毒性测定。应用对象包含以下来源的病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌。
特别的,可以利用所述方法获得的肿瘤细胞或肿瘤类似物制备药物筛选模型,所述模型可以用来,a)检测病人肿瘤对药物的敏感程度,b)测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱;c)毒性测定,所述应用是针对包含以下来源的病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌。
另一方面,本发明还提供了一种肿瘤细胞培养基,其包含一定比例的肿瘤病患来源的体液处理后所得上清液和基础培养基。
其中所述上清为来自病患的体液,可以为胸水或腹水或脑脊液等,浓度可以为0-100%,优选浓度为0-50%;其中肿瘤来源包括肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌、胸腺癌。
另一方面,本发明还提供了上清液在肿瘤细胞培养或肿瘤泪苏伟培养中的应用,所述上清液为来自病患的体液,可以为胸水或腹水或脑脊液等,浓度可以为0-100%,优选浓度为0-50%;其中肿瘤来源包括肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌、胸腺癌。
本发明的有益效果:
1、成功从体液(如胸水、腹水、脑脊液)中提取出肿瘤细胞,并建立了一种体外高效培养肿瘤类似物的方法,并一定程度优化了肿瘤细胞培养基,尤其是利用体液本身离心后的上清液与基础培养基结合培养肿瘤细胞;
2、所获得肿瘤类似物能保持临床病人肿瘤组织的基因突变谱;
3、本发明所获得的肿瘤类似物可用于病人药物敏感性的检测,为病人个体化精准提供数据支持;
4、本发明所获得的肿瘤类似物可用于测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱以及毒性测定,为药物的体外筛选提供一种体外模型。
与现有技术相比,本发明具有以下优点
本发明充分考虑了肿瘤细胞自体环境因素,首次采用体液环境作为体外培养的培养基的一部分,从更加仿生的角度模拟肿瘤的培养环境,实现了对肿瘤细胞的体外类似物培养的较好效果。
附图说明
图1 胃癌病人腹水肿瘤细胞在基本培养基中的生长情况
图2 培养基中添加胃癌病人腹水上清时肿瘤细胞的生长。A 10% 腹水上清,B 25% 腹水上清,C 50% 腹水上清, D 100% 腹水上清。
图3添加不同浓度胃癌病人腹水上清时肿瘤细胞的形成的类似物的平均面积。
图4肠癌病人腹水肿瘤细胞在基本培养基和25%腹水上清中的生长情况。A基础培养基,B基础培养基加 25% 腹水上清。
图5添加不同浓度肠癌病人腹水上清时肿瘤细胞的形成的类似物的平均面积。
图6 肺癌病人胸水肿瘤细胞在基本培养基中的生长情况。
图7 培养基中添加肺癌病人胸水上清时肿瘤细胞的生长。A 10% 腹水上清,B 25%腹水上清,C 50% 腹水上清, D 100% 腹水上清。
图8添加不同浓度肺癌病人胸水上清时肿瘤细胞的形成的类似物的平均面积。
图9培养基中添加胃癌病人脑脊液上清时肿瘤细胞的生长。A 0% 脑脊液上清,B10% 脑脊液上清,C 25% 脑脊液上清, D 50% 脑脊液上清。
图10图8添加不同浓度胃癌病人脑脊液上清时肿瘤细胞的形成的类似物的平均面积。
图11 癌症体细胞全景突变个性化展示图。图中最顶端柱形图展示每个样本的突变率 (Mutations /Mb) 下图热图展示高频突变基因及突变类型,横坐标为样本名称,纵坐标为高频突变基因,图谱中不同颜色代表不同的突变类型。热图左侧柱形图表示每个基因的突变数量,右侧展示高频突变基因的p value。
图12胃癌病人腹水PDTA的药物敏感性实验。 A胃癌病人腹水PDTA 对奥沙利铂的药物敏感性,B胃癌病人腹水PDTA 对伊立替康的药物敏感性。
图13 肠癌病人腹水PDTA的药物敏感性实验。A肠癌病人腹水PDTA 对多西他赛的药物敏感性,B肠癌病人腹水PDTA 对紫杉醇的药物敏感性。
具体实施方式
本发明中的部分重要试剂及其来源如下:
DMEM:是一种广泛用于哺乳动物细胞培养的培养基,购自Gibco公司。
DMEM/F12:是F12培养基和DMEM培养基按照1:1结合,称为DMEM/F12。购自Gibco公司。
Matrigel,从富含细胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出,其主要成分有层粘连蛋白,IV型胶原,硫酸肝素糖蛋白等,还包含生长因子和基质金属蛋白酶等,购自BD公司。
B27,即B27补充剂,可用于配制培养基,购自Life technologies公司。
N-acetylcysteine:N-乙酰半胱氨酸,购自Sigma公司。
EGF,表皮生长因子,购自R&D公司。
Noggin,细胞生长蛋白成分,购自Peprotech公司。
R-spondin1,人细胞生长编码蛋白,购自Peprotech公司。
Wnt3a,WNT激动剂,购自R&D公司。
Glutamax,细胞培养添加剂,购自Gibco公司。
N2,N2补充剂,购自Life technologies公司。
Gastrin,胃泌素,购自Sigma公司。
以下对本发明的实施方式做出详细说明,应当强调的是,以下说明仅仅是示例性的,而不是为了限制本发明的范围及其应用。
实施例一;胃癌病人腹水肿瘤细胞的培养
一、胃癌病人腹水肿瘤细胞的提取
1、收集IV期胃癌病人胸水样本(本发明样本取自第二军医大学附属长海医院),取20ul镜检观察肿瘤细胞或细胞团整体状况:形状,数量,大小。
2、1200转离心5分钟后,收集上清,并将上清用滤膜过滤除菌后分装,50-60℃水浴灭活30min。
3、用 PBS(磷酸缓冲盐溶液)轻轻将底部沉淀重悬,轻轻混匀后静置,观察沉淀沉降后,尽可能吸走上清。
4、用PBS重悬沉淀,轻轻混匀,静置或低速离心使肿瘤细胞团沉降。
5、弃上清,适量PBS轻轻重悬,计数并观察记录细胞活性。
6、根据需求,吸取一定数量的肿瘤细胞团补充PBS至7-12ml轻轻混匀,1200g离心5min,铺板用,铺板密度为100-300个/50ul基质胶,剩余细胞使用细胞冻存液冻存,留取样本。
二、胃癌病人腹水肿瘤细胞的培养
1、铺板细胞,37℃培养箱静置10-15min,取出加培养基500ul/孔。所用胃癌PDTA基础培养基的配方是:
试剂名称 | 终浓度 |
Wnt 3a | 100 ng/ml |
N-acetylcysteine | 1mM |
Gastrin | 1nM |
EGF | 50 ng/ml |
Rspondin1 | 500 ng/ml |
Noggin | 100 ng/ml |
FGF10 | 10 ng/ml |
A83-01 | 2uM |
Normocin | 100ug/ml |
Nicotinamide | 10mM |
DMEM/F12 | 1:1 |
2、根据需要,每隔2-4天更换培养基,培养11天后,观察所得病人来源的肿瘤类似物(Patient Derived Tumor Organoid, PDTA)的生长情况。胃癌腹水PDTA生长情况多样,从生长形状概括来说主要有:葡萄串状、桑椹状、圆饼状、不规则实体状及其他。其中获得的肿瘤类似物的形态如图1所示。
三、胃癌病人腹水肿瘤细胞培养方案的优化
在培养基中加入灭活的胃癌病人腹水样本的上清液进行优化培养,具体地,将上述类似物基础培养基与灭活的上清按比例混合,其中上清液的体积比为10%、25%、50%、100%(全部为上清液,不加肿瘤类似物基础培养基)。优化培养基从开始培养类似物时添加,并根据需要,每隔2-4天更换相应的培养基和上清的混合液。
添加含有不同体积比的腹水上清时,胃癌病人腹水肿瘤细胞培养11天后所得PDTA的形态如图2所示,平均面积的计算结果如图3所示,当基础培养基中加入的上清液的体积比0-50%时,随体积比升高,PDTA的面积逐渐升高,当基础培养基加体积比50%的相应上清液时,PDTA的面积最大,此时肿瘤细胞增殖分裂速度最快,即对肿瘤细胞的生长促进效果最明显;但全部使用上清进行培养时,细胞几乎不生长。此结果说明胃癌病人腹水上清液可以一定程度地模拟肿瘤细胞的体内环境,对肿瘤细胞的生长具有促进作用,且在一定范围内,上清浓度与肿瘤细胞的生长情况呈正相关。综上,本发明建立了一种高效培养胃癌病人腹水肿瘤细胞的方法。
实施例二;胃癌病人脑脊液肿瘤细胞的培养
一、胃癌病人脑脊液肿瘤细胞的提取
1、收集IV期胃癌病人脑脊液样本(本发明样本取自第二军医大学附属长海医院),取20ul镜检观察肿瘤细胞或细胞团整体状况:形状,数量,大小。
2、1200转离心5分钟后,收集上清,并将上清用滤膜过滤除菌后分装,50-60℃水浴灭活30min。
3、用 PBS(磷酸缓冲盐溶液)轻轻将底部沉淀重悬,轻轻混匀后静置,观察沉淀沉降后,尽可能吸走上清。
4、用PBS重悬沉淀,轻轻混匀,静置或低速离心使肿瘤细胞团沉降。
5、弃上清,适量PBS轻轻重悬,计数并观察记录细胞活性。
6、根据需求,吸取一定数量的肿瘤细胞团补充PBS至7-12ml轻轻混匀,1200g离心5min,铺板用,铺板密度为100-300个/50ul基质胶,剩余细胞使用细胞冻存液冻存,留取样本。
二、胃癌病人脑脊液肿瘤细胞的培养
1、铺板细胞,37℃培养箱静置10-15min,取出加培养基500ul/孔。所用胃癌PDTA基础培养基的配方是:
试剂名称 | 终浓度 |
Wnt 3a | 100 ng/ml |
N-acetylcysteine | 1mM |
Gastrin | 1nM |
EGF | 50 ng/ml |
Rspondin1 | 500 ng/ml |
Noggin | 100 ng/ml |
FGF10 | 10 ng/ml |
A83-01 | 2uM |
Normocin | 100ug/ml |
Nicotinamide | 10mM |
DMEM/F12 | 1:1 |
2、根据需要,每隔2-4天更换培养基,培养11天后,观察所得病人来源的肿瘤类似物(PDTA)的生长情况。胃癌脑脊液PDTA生长情况与胃癌腹水来源的PDTA类似,与从生长形状概括来说也主要有:葡萄串状、桑椹状、圆饼状、不规则实体状及其他。
三、胃癌病人脑脊液肿瘤细胞培养方案的优化
在培养基中加入灭活的胃癌病人脑脊液样本的上清液进行优化培养,具体地,将上述类似物基础培养基与灭活的上清按比例混合,其中上清液的体积比为0、10%、25%、50%。优化培养基从开始培养类似物时添加,并根据需要,每隔2-4天更换相应的培养基和上清的混合液。
添加含有不同体积比的腹水上清时,胃癌病人脑脊液肿瘤细胞培养11天后所得PDTA的形态如图4所示,平均面积的计算结果如图5所示,当基础培养基中加入的上清液的体积比0-50%时,随体积比升高,PDTA的面积逐渐升高,当基础培养基加体积比50%的相应上清液时,PDTA的面积最大,对肿瘤细胞的生长促进效果最明显。此结果说明胃癌病人脑脊液上清液可以一定程度地模拟肿瘤细胞的体内环境,对肿瘤细胞的生长具有促进作用。综上,本发明建立了一种高效培养胃癌病人脑脊液肿瘤细胞的方法。
实施例三;肠癌病人腹水肿瘤细胞的培养
一、肠癌病人腹水肿瘤细胞的提取
1、收集IV期肠癌病人腹水样本(本发明样本取自复旦大学附属肿瘤医院),取20ul镜检观察肿瘤细胞或细胞团整体状况:形状,数量,大小。
2、1200转离心5分钟后,收集上清,并将上清用滤膜过滤除菌后分装,50-60℃水浴灭活30 min。
3、用 PBS(磷酸缓冲盐溶液)轻轻将底部沉淀重悬,轻轻混匀后静置,观察沉淀沉降后,尽可能吸走上清。
4、用PBS重悬沉淀,轻轻混匀,静置或低速离心使肿瘤细胞团沉降。
5、弃上清,适量PBS轻轻重悬,计数并观察记录细胞活性。
6、根据需求,吸取一定数量的肿瘤细胞团补充PBS至7-12ml轻轻混匀,1200g离心5min,铺板用,铺板密度为100-300个/50ul基质胶,剩余细胞使用细胞冻存液冻存,留取样本。
二、肠癌病人腹水肿瘤细胞的培养
1、铺板细胞,37℃培养箱静置10-15min,取出加培养基500ul/孔。所用肠癌PDTA基础培养基的配方是:
试剂名称 | 终浓度 |
N-acetylcysteine | 1mM |
Gastrin | 1nM |
EGF | 50ng/ml |
Rspondin1 | 500ng/ml |
Noggin | 100ng/ml |
A83-01 | 2uM |
Normocin | 100ug/ml |
Nicotinamide | 10mM |
DMEM/F12 | 1:1 |
2、根据需要,每隔2-4天更换培养基,培养11天后,观察所得病人来源的肿瘤类似物(PDTA)的生长情况。肠癌腹水PDTA生长情况多样,主要包括:葡萄串状、桑椹状、圆饼状、不规则实体状等。
三、肠癌病人腹水肿瘤细胞培养方案的优化
在培养基中加入灭活的肠癌病人腹水样本的上清液进行优化培养,具体地,将上述类似物基础培养基与灭活的上清按比例混合,其中上清液的体积比为25%。优化培养基从开始培养PDTA时添加,并根据需要,每隔2-4天更换相应的培养基和上清的混合液。
添加25%体积比的腹水上清时,肠癌病人腹水肿瘤细胞培养11天后所得PDTA的形态如图6所示,PDTA的平均面积的计算结果如图7所示。结果表明,添加腹水上清至肿瘤细胞基础培养基中,上清体积比在25%时,对肿瘤细胞的生长促进作用最大,说明胃癌病人腹水上清液可以一定程度地模拟肿瘤细胞的体内环境,对肿瘤细胞的生长具有促进作用。
实施例四;肺癌病人胸水肿瘤细胞的培养
一、肺癌病人胸水肿瘤细胞的提取
1、收集IV期肺癌病人胸水样本(本发明样本取自第二军医大学附属长海医院),取20ul镜检观察肿瘤细胞或细胞团整体状况:形状,数量,大小。
2、1200转离心5分钟后,收集上清,并将上清用滤膜过滤除菌后分装,50-60℃水浴灭活20-40 min。
3、用 PBS(磷酸缓冲盐溶液)轻轻将底部沉淀重悬,轻轻混匀后静置,观察沉淀沉降后,尽可能吸走上清。
4、用PBS重悬沉淀,轻轻混匀,静置或低速离心使肿瘤细胞团沉降。
5、弃上清,适量PBS轻轻重悬,计数并观察记录细胞活性。
6、根据需求,吸取一定数量的肿瘤细胞团补充PBS至7-12ml轻轻混匀,1200g离心5min,铺板用,铺板密度为100-300个/50ul基质胶,剩余细胞使用细胞冻存液冻存,留取样本。
二、肺癌病人胸水肿瘤细胞的培养
1、铺板细胞,37℃培养箱静置10-15min,取出加培养基500ul/孔。所用肠癌PDTA基础培养基的配方是:
试剂名称 | 终浓度 |
Wnt3a | 100 ng/ml |
N-acetylcysteine | 1mM |
B27 | 1x |
EGF | 50 ng/ml |
Rspondin1 | 500 ng/ml |
Noggin | 100 ng/ml |
FGF10 | 200 ng/ml |
N2 | 1X |
Glutamax | 1X |
Normocin | 100ug/ml |
Nicotinamide | 10mM |
DMEM/F12 | 1:1 |
2、根据需要,每隔2-4天更换培养基,培养11天后,观察所得病人来源的肿瘤类似物(PDTA)的生长情况。肺癌胸水PDTA生长情况多样,有:葡萄串状、桑椹状、不规则实体状及其他。其中一例病人的PDTA的形态如图8所示。
三、肺癌病人胸水肿瘤细胞培养方案的优化
在培养基中加入灭活的肺癌病人胸水样本的上清液进行优化培养,具体地,将上述类似物基础培养基与灭活的上清按比例混合,其中上清液的体积比为10%、25%、50%、100%(全部为上清液,不加类似物基础培养基)。优化培养基从开始培养PDTA时添加,并根据需要,每隔2-4天更换相应的培养基和上清的混合液。
添加含有不同体积比的胸水上清时,肺癌病人胸水肿瘤细胞培养11天后所得PDTA的形态如图9所示,基础培养基中加入不同体积比的上清液均对PDTA的生长有促进作用。PDTA的平均面积的计算结果图10显示,基础培养基中加入25%的相应上清液时PDTA的平均表面积最大,即该条件为肺癌病人胸水肿瘤细胞的最佳培养体系。通过图9和图10可知,在肺癌肿瘤细胞基础培养基中,添加肺癌病人胸水上清液可以一定程度地模拟肿瘤细胞的体内环境,对肿瘤细胞的生长具有促进作用。综上,本发明建立了一种高效培养肺癌病人胸水肿瘤细胞的方法。
实施例五;PDTA性质鉴定
下面以胃癌病人腹水肿瘤细胞培养得到的PDTA为例,比较了体外培养的PDTA与病人肿瘤组织的基因突变情况。
将体外培养并传代3-4次的胃癌病人腹水肿瘤细胞PDTA和胃癌病人直接来源的腹水肿瘤细胞进行全外显子测序,并对测序结果进行高频突变基因分析。高频突变基因(SMG,Significantly mutated genes) 综合考虑了体细胞SNP和INDEL等变异,是指突变频率显著高于背景突变频率 (BMR,background mutation rate) 的基因。肿瘤高频突变分析使用MuSic软件,MuSiC以所有肿瘤样本的体细胞突变为背景,对基因上的各个突变类型进行统计检验,检测出显著高于背景突变率的基因。所得结果如图11所示,YDY069-OA是对培养3-4代的胃癌病人腹水肿瘤细胞PDTA的分析,YDY069-PC是对同一例胃癌病人直接来源的腹水肿瘤细胞的分析,结果显示二者的高频突变图谱完全一致,即本发明的体外PDTA培养体系能够保持病人的基因突变等特性,可用于体外研究病人的发病机制,药物敏感性等研究,是一种新型的有效的疾病研究模型。
此处所述的方法不仅可用于胃癌病人腹水肿瘤细胞PDTA的性质鉴定,也可用于其他来源的PDTA的性质鉴定,如肠癌病人腹水肿瘤细胞PDTA、肺癌病人胸水肿瘤细胞PDTA、各种肿瘤病人手术或穿刺肿瘤细胞来源的PDTA等,结果表明,胸/腹水肿瘤细胞PDTA与病人直接来源的胸/腹水肿瘤细胞的高频突变图谱完全一致,即本发明成功的建立了一种体外PDTA培养体系,该培养体系能够保持病人的基因突变等特性。
实施例六;胃癌病人腹水PDTA药物敏感性实验
下面以胃癌病人腹水肿瘤细胞培养得到的PDTA为例,说明由体液来源的肿瘤细胞培养得到的PDTA可以用于检测病人肿瘤细胞的药物敏感性。本方法可用于但不限于胃癌病人腹水肿瘤细胞的药物敏感性检测,也可用于其他来源的PDTA的药物敏感性检测。
一、PDTA的传代及铺板:将通过实施例一得到的PDTA进行消化,得到均匀大小的PDTA,重新铺于96孔板中。
二、药物梯度实验:
1、采用梯度稀释的方法:分别吸取10μL、5μL、2.5μL、2μL、1μL的原浓度或稀释后的药物,加入到含1mL的胃癌病人腹水PDTA的优化培养基的离心管中,再从上述离心管中吸取0.5mL到第二个已装有0.5mL完全培养基的离心管中,即按照1:1稀释药品。重复以上方法,依次稀释,最后得到加药所需的5种浓度。
2、对照组吸取1μL的DMSO或DMF,加入到1mL的胃癌病人腹水PDTA的优化培养基中,一种浓度的药物和实验对照组都各设2-3个复孔,另外设置3个复孔加胃癌病人腹水PDTA的优化培养基、DMSO对照和DMF对照。每孔加入药品体积为140μL。
3、换液及第二次加药:第一次加药为第0天,第3天时换液及第二次加药。加药浓度与第一次相同。
4、CCK-8细胞活性检测:第5天,用CCK8检测试剂检测加药培养后细胞的OD值,OD值的大小反映出细胞活性以及药物对类似物的作用,每孔加入配置好的CCK8检测液,混匀后放置37℃孵育3~4h后,酶标仪在450nm和650nm处检测吸光值。计算公式如下:
ODDelta = ODBlank450 - ODBlank650
5、所得结果如图12所示:以胃癌病人腹水PDTA为例,检测其对化疗药物的敏感性。图12A显示了该病人对伊立替康的药物敏感性,结果显示,高浓度的伊立替康对PDTA的杀伤力高于低浓度药物,其中半数致死剂量为2.04 μM。图12B显示了该病人对奥沙利铂的药物敏感性,结果显示,高浓度的紫杉醇对PDTA的杀伤力高于低浓度药物,其中半数致死剂量为9.2 μM。即同一病人对不同药物具有不同的敏感性,该病人对伊立替康的敏感性高于奥沙利铂。
实施例七;肠癌病人腹水PDTA药物敏感性实验
下面以肠癌病人腹水肿瘤细胞培养得到的PDTA为例,说明由体液来源的肿瘤细胞培养得到的PDTA可以用于检测肿瘤细胞的药物敏感性。本方法可用于但不限于肠癌病人腹水肿瘤细胞的药物敏感性检测,也可用于其他来源的PDTA的药物敏感性检测。
一、PDTA的传代及铺板:将通过实施例三得到的PDTA进行消化,得到均匀大小的PDTA,重新铺于96孔板中。
二、药物梯度实验:
1、采用梯度稀释的方法:分别吸取10μL、5μL、2.5μL、2μL、1μL的原浓度或稀释后的药物,加入到含1mL的肠癌病人腹水PDTA的优化培养基的离心管中,再从上述离心管中吸取0.5mL到第二个已装有0.5mL完全培养基的离心管中,即按照1:1稀释药品。重复以上方法,依次稀释,最后得到加药所需的5种浓度。
2、对照组吸取1μL的DMSO或DMF,加入到1mL的肠癌病人腹水PDTA的优化培养基中,一种浓度的药物和实验对照组都各设2-3个复孔,另外设置3个复孔加肠癌病人腹水PDTA的优化培养基、DMSO对照和DMF对照。每孔加入药品体积为140μL。
3、换液及第二次加药:第一次加药为第0天,第3天时换液及第二次加药。加药浓度与第一次相同。
4、CCK-8细胞活性检测:第5天,用CCK8检测试剂检测加药培养后细胞的OD值,OD值的大小反映出细胞活性以及药物对类似物的作用,每孔加入配置好的CCK8检测液,混匀后放置37℃孵育3~4h后,酶标仪在450nm和650nm处检测吸光值。计算公式如下:
ODDelta = ODBlank450 - ODBlank650
5、所得结果如图13所示:以YDY-45和YDY-81两例肠癌病人腹水PDTA为例,检测其对化疗药物的敏感性。图13A显示了两例肠癌病人腹水肿瘤细胞对多西他塞的药物敏感性,结果显示,高浓度的多西他塞对PDTA的杀伤力高于低浓度药物,且YDY-81病人对多西他塞的药物敏感性高于YDY-45病人,多西他塞对二者的半数致死剂量分别为12.48 μM和1.225 μM。图13B显示了两例肠癌病人腹水肿瘤细胞对紫杉醇的药物敏感性,结果显示,高浓度的紫杉醇对PDTA的杀伤力高于低浓度药物,且YDY-81病人对紫杉醇的药物敏感性高于YDY-45病人,紫杉醇对二者的半数致死剂量分别为20.69 μM和4.677 μM。
综上,实施例六和实施例七成功建立了检测PDTA药物敏感性的方法,同时也为体外检测候选药物的疗效、代谢、毒性等提供了一种快速有效的体外模型和检测方法。上述药物敏感性检测方法不仅可用于胃癌病人和肠癌病人腹水肿瘤细胞来源PDTA的药物敏感性检测,也可用于其他来源的PDTA的药物敏感性检测,如胃癌病人脑脊液肿瘤细胞PDTA、肺癌病人胸水肿瘤细胞PDTA、各种肿瘤病人手术或穿刺肿瘤细胞来源的PDTA等,在此不一一赘述。
本发明建立了从晚期胃癌病人的腹水、胃癌病人的脑脊液、肠癌病人的腹水、肺癌病人的胸水等肿瘤病人体液中提取并培养肿瘤细胞的方法。上述从恶性肿瘤病人的胸水、腹水、脑脊液类体液中提取肿瘤细胞的方法基本一致,因此也可以用于其他肿瘤病人来源的体液中提取肿瘤细胞。本发明建立的体液肿瘤细胞的培养方法主要是在肿瘤细胞的基础培养基中加入不同体积比的相应体液的上清液,不同类型肿瘤及不同体液来源的肿瘤细胞的最佳培养体系中所需的上清液的体积比略有不同,但都可以通过本发明的方法而获得。本发明所述从体液中分离并培养肿瘤细胞的方法不仅限于上述肠癌病人腹水肿瘤细胞、胃癌病人腹水肿瘤细胞、胃癌病人脑脊液肿瘤细胞、肺癌病人胸水肿瘤细胞的提取和培养,也可用于取自其他类型肿瘤病人的体液肿瘤细胞的提取和培养。本发明获得的肿瘤类似物能够保持病人的基因突变等特性,即本发明建立了一种新型的高效的能维持肿瘤细胞特性的体外培养体系,为肿瘤的机制、药物敏感性等研究,以及新型药物体外筛选提供了一种新型的体外模型。
同时,本发明建立了检测胃癌病人腹水肿瘤细胞来源的PDTA对伊立替康和奥沙利铂的药物敏感性,肠癌腹水肿瘤细胞来源的PDTA对多西他赛和紫杉醇的药物敏感性的方法。检测不同来源的PDTA对不同药物的敏感性的方法基本一致,仅有药物浓度需要改变,因此,本发明检测药物敏感性的方法也适用于其他来源的PDTA对其他药物的反应情况。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型,而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种肿瘤细胞或类似物的培养方法,所述方法包含:富集体液肿瘤细胞,与细胞外基质混合,在培养基的存在下,加入相应的体液上清液,优选的,体液选自胸水、腹水或脑脊液,加入的体液上清液的浓度优选为0-50%。
2.如权利要求1或2所述的培养方法,所述富集体液肿瘤细胞的方法为:取体液样本,离心后得到细胞沉淀物;所述相应的体液上清液的制备方法为:取体液样本,离心后收集上清,过滤去除杂质,灭活。
3.如权利要求1-2所述的培养方法,所述基本培养基包含DMEM/F12 1:1、N-acetylcysteine 1mM、gastrin 1nM、egf 50ng/ml、rspondin1 500ng/ml、noggin 100ng/ml、A83-01 2uM、normocin 100ug/ml、nicotinamide 10mM。
4.权利要求3所述的培养方法,培养基中还进一步含有wnt3a 100ng/ml、fgf10 10ng/ml。
5.如权利要求1-4所述的培养方法,所述胸水样本的来源是以下病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌;所述腹水样本的来源是以下病人或动物:胃癌、肠癌、肺癌、胆管癌、子宫内膜癌。
6.权利要求1-5所述培养方法获得的肿瘤细胞/或肿瘤类似物。
7.权利要求1-5所述培养方法的应用,所述应用包含:a)检测病人肿瘤对药物的敏感程度,b)测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱;c)毒性测定,所述应用对象包含以下来源的病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌。
8.权利要求1-5所述培养方法获得的肿瘤细胞/或肿瘤类似物在制备药物筛选模型中的应用,所述药物筛选模型包括,a)检测病人肿瘤对药物的敏感程度,b)测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱;c)毒性测定,所述应用是针对包含以下来源的病人或动物:肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌。
9.一种肿瘤细胞培养基,其特征在于,包含一定比例的肿瘤病患来源的体液处理后所得上清液和基础培养基,优选的,体液选自胸水、腹水或脑脊液,所述体液上清液浓度优选为0-50%。
10.如权利要求9所述的培养基,其中肿瘤来源包括肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌、胸腺癌。
11.如权利要求9-10所述的培养基,其中基础培养基成分为DMEM/F12 1:1、N-acetylcysteine 1mM、gastrin 1nM、egf 50ng/ml、rspondin1 500ng/ml、noggin 100ng/ml、A83-01 2uM、normocin 100ug/ml、nicotinamide 10mM、wnt3a 100ng/ml、fgf10 10ng/ml。
12.权利要求9-11所述肿瘤细胞培养基在肿瘤细胞或肿瘤类似物培养中的应用。
13.体液来源的肿瘤细胞上清液在类似物培养中的应用,其特征在于,上清液与基础培养基共同培养肿瘤细胞,优选的,体液为胸水、腹水或脑脊液,优选的,胸水或腹水上清液的浓度为0-50%。
14.权利要求13所述的应用,其特征在于,肿瘤来源包括肺癌、胃癌、胸腺癌、肠癌、胆管癌、子宫内膜癌、胸腺癌。
15.权利要求13-14所述的应用,其特征在于,所述上清液与基础培养基共同培养肿瘤细胞,所述基础培养基成分为DMEM/F12 1:1、N-acetylcysteine 1mM、gastrin 1nM、egf50ng/ml、rspondin1 500ng/ml、noggin 100ng/ml、A83-01 2uM、normocin 100ug/ml、nicotinamide 10mM、wnt3a 100ng/ml、fgf10 10ng/ml。
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