CN110475860A - 使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养 - Google Patents

使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种细胞块的制作方法，其是基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，所述细胞块的制作方法以肿瘤组织作为起始材料在抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖的同时，具有以原代癌细胞为主成分的细胞块的、高增殖能力，且兼具处理的容易性、通用性、高通量性，本发明通过提供如下方法来解决课题，所述方法是基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，该方法包括：三维培养工序，其在实质上为低粘附性的细胞培养基材上在包含5v/v％以下的细胞外基质的培养基中培养由该肿瘤组织得到的细胞。

Description

使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养
技术领域
本发明涉及基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法、细胞块、筛选方法、判定方法、试剂盒。
背景技术
作为在活体外评价肿瘤的方法，以往就使用了株化的癌细胞(癌细胞株)。然而，癌细胞株由于是适应于活体外环境的大致均匀的细胞集团、通过得以长期维持而确认基因变异的蓄积等，因此被指出丧失大多作为基础的肿瘤性质。另外，还被指出：肿瘤明显由具有多样的遗传背景的癌细胞构成，从该不均匀性这一点来看，无法由有限数量的癌细胞株充分说明病理状况。为此，为了更准确地理解肿瘤，使用肿瘤的原代细胞的培养系受到注目。在肿瘤中，除由患者得到的肿瘤外，还使用将该肿瘤移植于免疫缺陷动物而制作的异种移植(Patient-Derived Xenograft、PDX)肿瘤。
肿瘤的原代细胞的培养的基本在于：将所摘出的肿瘤进行物理性或酶性的分散，将所得的分散细胞与培养基一起接种于培养容器中，使其在CO2培养箱内增殖(非专利文献1：第三版组织培养的技术-基础编-、株式会社朝仓书店、1996年)。为了使癌细胞良好地增殖或者为了抑制非癌细胞(尤其是成纤维细胞)的过量增殖，进行了基于密度梯度离心分离法的细胞的分离、基于培养容器的细胞外基质的包被、无血清培养基的使用、基于对胰蛋白酶或抗生素的敏感性的不同进行的细胞分离等。然而，即使耗费这样的工夫，也难以使癌细胞高概率地增殖，期望更可靠的培养法。
近年来，三维地培养细胞的方法作为原代癌细胞的培养方法受到注目。该第一个方法为Hubrecht Institute的Clevers等开发的类器官培养法(非专利文献2：Sato,Toshiro,et al."Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitrowithout a mesenchymal niche."Nature 459.7244(2009):262-265.、非专利文献3：Sato,Toshiro,et al."Long-term expansion of epithelial organoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett's epithelium."Gastroenterology 141.5(2011):1762-1772.)。类器官培养是利用成体干细胞的自组织化来形成细胞块(类器官)的培养法，具体而言，将成体干细胞包埋于细胞外基质的凝胶内，使用最佳培养基进行培养。通过将该方法应用于原代癌细胞，从而使他们确立大肠癌(非专利文献3)、前列腺癌(非专利文献4：Gao,Dong,et al."Organoid cultures derived from patients with advancedprostate cancer."Cell 159.1(2014):176-187.)及胰腺癌(非专利文献5：Boj,SylviaF.,et al."Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer."Cell160.1(2015):324-338.)的培养法。然而，该方法需要在低温下将细胞包埋于凝胶中，缺乏高通量性而使医药品开发等的通用性不充分。
第二个方法为Molecular Response公司等开发的3D-tumour growth assay(3D-TGA)法。在包埋于细胞外基质的凝胶内并且使用最佳培养基进行培养这一点上与第一个方法相同，在其前阶段在被细胞外基质包被的培养容器中进行前培养这一点和将作为可选物(option)而增殖的癌相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblast,CAF)或间叶系干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)与癌细胞一起包埋于细胞外基质的凝胶内这一点是不同的(非专利文献6：Saunders,John H.,et al."Individual patient oesophagealcancer 3D models for tailored treatment."Oncotarget(2016).)。本法也与第一个方法同样地需要在低温下将细胞包埋于凝胶中，缺乏高通量性。
第三个方法为成人病中心的井上等开发的、使用未单一分散的直径为40～100μm的细胞块(Cancer Tissue-Originated Spheroid,CTOS)的培养法(CTOS法)(非专利文献7：Kondo,Jumpei,et al."Retaining cell-cell contact enables preparation andculture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectalcancer."Proceedings of the National Academy of Sciences108.15(2011):6235-6240.)。具体而言，将所得的CTOS接种于非粘附性孔板，一边使用最佳培养基使其浮游，一边进行培养。CTOS即使不包埋于细胞外基质的凝胶内，癌细胞也会增殖，因此，与第一个方法和第二个方法相比，耗费在进行温度管理的操作的工夫更少。然而，在药剂敏感性试验中需要重新选择配置尺寸均匀的CTOS这样的繁琐工序，高通量性低，并且与包埋至细胞外基质中的方法相比，癌细胞的增殖性更低，因此实用性不充分。
第四个方法是国立癌研究中心的中面等开发的、使用单一分散的癌细胞和实施过抑制粘附性的处理的细胞培养孔板的培养法(专利文献1：WO2016/047801)。具体而言，是将单一分散的癌细胞与包含1体积％以上的血清的培养基一起接种至ORGANOGENIX公司制的三维培养孔板即NanoCulture Plate中来培养细胞块的方法，由ORGANOGENIX公司出售培养试剂盒(癌类器官培养试剂盒(Cancer Organoid Culture Kit))。该方法即使不包埋于细胞外基质的凝胶内，癌细胞也会增殖，因此与第一个方法和第二个方法相比，耗费在进行温度管理的操作的工夫更少。另外，由于使用单一分散的癌细胞，因此无需特别的操作就能均匀地接种细胞，与第三个方法相比，高通量性更高。然而，仅以人肺癌肿瘤和乳腺癌异种移植肿瘤(非专利文献8：Sakamoto,Ruriko,et al."Time-lapse imaging assay using theBioStation CT:A sensitive drug-screening method for three-dimensional cellculture."Cancer science 106.6(2015):757-765.)的报告，尤其在乳腺癌异种移植肿瘤中，无法确认细胞块有明显增殖，并且通用性的验证不充分，实用性上存在疑问。
正如这些方法所示，使用肿瘤组织的原代癌细胞的培养通过三维培养法而使培养性的可靠性增加，但是，任一方法均在癌细胞的增殖能力、处理的容易性、高通量性、通用性等的任一方面存在问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/047801
非专利文献
非专利文献1：第三版组织培养的技术-基础编-、株式会社朝仓书店、1996年
非专利文献2：Sato,Toshiro,et al."Single Lgr5 stem cells build cryptvillus structures in vitro without a mesenchymal niche."Nature 459.7244(2009):262-265.
非专利文献3：Sato,Toshiro,et al."Long-term expansion of epithelialorganoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett's epithelium."Gastroenterology 141.5(2011):1762-1772.
非专利文献4：Gao,Dong,et al."Organoid cultures derived from patientswith advanced prostate cancer."Cell 159.1(2014):176-187.
非专利文献5：Boj,Sylvia F.,et al."Organoid models of human and mouseductal pancreatic cancer."Cell 160.1(2015):324-338.
非专利文献6：Saunders,John H.,et al."Individual patient oesophagealcancer 3D models for tailored treatment."Oncotarget(2016).
非专利文献7：Kondo,Jumpei,et al."Retaining cell-cell contact enablespreparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cellsfrom colorectal cancer."Proceedings of the National Academy of Sciences108.15(2011):6235-6240.
非专利文献8：Sakamoto,Ruriko,et al."Time-lapse imaging assay using theBioStation CT:Asensitive drug-screening method for three-dimensional cellculture."Cancer science 106.6(2015):757-765.)
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述的问题而完成的发明，发明者人等的目的在于，提供一种细胞块的制作方法，其是基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方，该方法以肿瘤组织作为起始材料在抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖的同时，具有以原代癌细胞为主成分的细胞块的、高增殖能力，且兼具处理的容易性、通用性、高通量性。
用于解决课题的手段
为了解决上述的课题，本发明人等进行了深入研究。其结果发现：以患者异种移植(以下有时简称为PDX)肿瘤作为起始材料，使用单一分散的细胞，利用最佳的培养基材和三维培养培养基的组合，在浮游状态下进行培养，由此能够制作具有可用于各种试验的癌细胞的、高增殖能力并且兼具处理的容易性、通用性、高通量性的、基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块，由此完成本发明。
即，本发明可以进行如以下所示的例示。
[1]一种方法，其是基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，
该方法包括三维培养工序，该工序在实质上低粘附性的细胞培养基材上在包含5v/v％以下的细胞外基质的培养基中培养由肿瘤组织得到的细胞。
[2]根据[1]所述的方法，其中，肿瘤组织为异种移植肿瘤。
[3]一种原代癌细胞的细胞块，其是利用[1]或[2]所述的细胞块的制作方法制作的、由肿瘤组织得到的原代癌细胞的细胞块。
[4]一种对细胞块有作用的物质的筛选方法，其包括：
利用[1]或[2]所述的细胞块的制作方法制作原代癌细胞的细胞块的工序；
对该细胞块给予受试物质的工序；以及
评价该受试物质对该细胞块的作用的工序。
[5]一种判定物质对该细胞块的效果的判定方法，其包括：
利用[1]或[2]所述的细胞块的制作方法制作原代癌细胞的细胞块的工序；
对该细胞块给予受试物质的工序；以及
评价该受试物质对该细胞块的效果的工序。
[6]一种试剂盒，其是用于制作基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的试剂盒，
该试剂盒具备：
实质上低粘附性的细胞培养基材；以及
包含5v/v％以下的细胞外基质的三维培养工序用的培养基。
发明效果
根据本发明，可以提供一种细胞块的制作方法，其是基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，所述细胞块以肿瘤组织作为起始材料，在抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖的同时，具有以原代癌细胞为主成分的细胞块的、高增殖能力，且兼具处理的容易性、通用性、高通量性。
附图说明
图1是表示实施例2的培养结果的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。培养培养基使用在StemPro hESC SFM中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶(CorningMatrigel)GFR而成的培养基。※2：当在孔板底面确认到纺锤形状的细胞的情况下，判断为具有成纤维细胞的粘附。
图2是表示实施例3的培养结果的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。使用PrimeSurface。※2：在利用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，细胞或细胞块也一起吸取的情况设为不能。
图3-1是表示实施例4的培养结果(康宁基质胶)的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。使用PrimeSurface。※2：在利用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，细胞或细胞块也一起吸取的情况设为不能。
图3-2是表示实施例4的培养结果(Cultrex BME)的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。使用PrimeSurface。※2：在利用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，细胞或细胞块也一起吸取的情况设为不能。
图3-3是表示实施例4的培养结果(Cultrex RGF BME)的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。使用PrimeSurface。※2：在利用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，细胞或细胞块也一起吸取的情况设为不能。
图3-4是表示实施例4的培养结果(Cellmatrix Type I-A)的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。使用PrimeSurface。※2：Day 14的2v/v％的孔由于在显微镜下未对焦，因此以肉眼进行观察。※3：在利用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，细胞或细胞块也一起吸取的情况设为不能。
图4是表示实施例5的培养结果的图(照片)。※1：使用胰腺癌(1)PDX肿瘤。培养培养基使用在基础培养基中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR而成的培养基。培养孔板使用PrimeSurface。
图5是表示实施例6的培养结果的图(照片)。※1：培养培养基使用在StemPro hESCSFM中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR而成的培养基。培养孔板使用PrimeSurface。
图6是表示实施例7的培养结果的图(照片)。※1：培养培养基使用在StemPro hESCSFM中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR而成的培养基。培养孔板使用PrimeSurface。使用Day 14的细胞块。
图7是表示实施例8的培养结果的图(照片)。※1：培养培养基使用在StemPro hESCSFM中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR而成的培养基。培养孔板使用PrimeSurface。
图8是表示实施例9的培养结果的图(照片)。※1：培养培养基使用在StemPro hESCSFM中以使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR而成的培养基。培养孔板使用PrimeSurface。在Day 7用添加了吉西他滨(Gemcitabine)的培养培养基进行半量培养基更换。在Day 10及12以不改变最终浓度的方式用调整浓度后的添加吉西他滨的培养培养基进行半量培养基更换。在Day 14进行ATP分析，算出将吉西他滨浓度为0μmol/L的结果设为细胞存活率100％时的各吉西他滨浓度组的结果之比，制作细胞存活率曲线。
图9是表示实施例10的培养结果的图(照片)。
图10-1是表示实施例11的培养结果(新鲜肿瘤)的图(照片)。
图10-2是表示实施例11的培养结果(冻结肿瘤)的图(照片)。
具体实施方式
本发明的基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，其特征在于，作为三维培养工序，在实质上低粘附性的细胞培养基材上在包含5v/v％以下的细胞外基质的培养基中培养由该肿瘤组织得到的原代癌细胞。
一般而言，认为：当在浮游状态下三维培养该原代癌细胞时，若使用特殊的方法，则难以形成细胞块。另外，认为：在使用包含细胞外基质的培养基的情况下，通过在凝胶状的培养基中以固定状态进行培养，从而得到具有高增殖能力的细胞块。但是，如后述的实施例记载那样，通过在实质上低粘附性的细胞培养基材上在包含溶胶状的细胞外基质的培养基中以浮游状态培养原代癌细胞，从而得出在抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖的同时能够使该原代癌细胞具有高增殖能力而进行三维培养这样的意外效果。
由此，具有可用于各种试验的癌细胞的高增殖能力，并且尤其是在浮游状态下进行培养，因此能够基于使用兼具有处理容易性、通用性、高通量性的肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法制作细胞块。浮游状态并非粘附于细胞培养基材或在凝胶状培养液中不移动的状态，而是指例如用移液等操作容易移动的状态。用本发明的方法制作的细胞块的尺寸并无特别限制，例如为平均直径100μm以上，优选为平均直径100μm～300μm。
以下，以使用本发明的培养法的基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作法的一个方式作为基础进行说明。
作为本发明中可使用的实质上低粘附性的细胞培养基材，可列举能够进行细胞的浮游三维培养的低粘附性培养基材。实质上低粘附性的细胞培养基材，只要是为了用于三维培养法而使整体具有低粘附性的细胞培养基材即可，可列举具有亲水性表面的细胞培养基材、表面被亲水性化合物处理后的培养基材等，具体而言，可列举例如PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)、Corning ULA Round-bottom(康宁公司)、Corning ULA Flat-bottom(康宁公司)、Elplasia(可乐丽公司)等。另外，也可以对具有粘附性的细胞培养基材进行抑制粘附性的处理而制成低粘附性培养基材。作为该抑制粘附性的处理，可以使用公知的亲水处理法、疏水处理等。另外，是否为低粘附性可以通过进行使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养、并对在基材上的细胞块以外的场所成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞未伸展增殖(進展増殖)进行确认来判断。另外，只要是实质上低粘附性的细胞培养基材，则基材的形状、加工、原材料等并无限定。
作为可以用于本发明的该肿瘤组织，只要是包含公知的癌细胞的组织片即可，可列举例如淋巴瘤、骨髓瘤、脑瘤、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、阑尾癌、大肠癌、肝细胞癌、胆嚢癌、胆管癌、胰腺癌、肾上腺癌、消化道间质瘤、间皮瘤、喉癌、口腔癌、牙龈癌、舌癌、颊粘膜癌、唾液腺癌、鼻窦癌、上颌窦癌、额窦癌、筛窦癌、蝶窦癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、骨肉瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、肾细胞癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、肛门癌、其他各种癌细胞、各种干细胞、各种前体细胞、间叶系前体细胞(閏葉系前駆細胞)、及ES细胞、iPS细胞等。予以说明，细胞不限于单一的细胞，也可以为多种细胞种的集合体。作为肿瘤组织的来源，并无特别限定，可列举：包含人、猴等在内的属于灵长类的动物；小鼠、大鼠等属于啮齿目的动物；属于兔科的动物；属于狗、猫等猫科、猪等偶蹄目、牛、马等奇蹄目的动物。另外，除如上述那样由患者得到的肿瘤组织以外，也可以使用将该肿瘤组织移植于免疫缺陷动物而制作的异种移植(Patient-Derived Xenograft、PDX)肿瘤。该患者源性异种移植肿瘤可以利用公知的方法来制作(非专利文献9：Cho,Sung-Yup,et al."Anintegrative approach to precision cancer medicine using patient-derivedxenografts."Molecules and cells 39.2(2016):77.)。
根据本发明，即使是PDX肿瘤，也能进行基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作，所述细胞块具有能够用于各种试验的癌细胞的高增殖能力，并且兼具处理容易性、通用性和高通量性，因此特别优选以PDX肿瘤为对象。就PDX肿瘤而言，能够进行使用患者源性肿瘤的临床预测性高的抗癌剂的开发，还能广泛地用于治疗效果的判定，因此特别优选以PDX肿瘤为对象。
另外，作为本发明中能够使用的肿瘤组织，可以使用进行外科摘出而浸渍于组织保存液(生理食盐水、HBSS等)的新鲜肿瘤，也可以使用将新鲜肿瘤浸渍于冻结保存液(CELLBANKER 1等)而将细胞以存活状态冻结后的冻结肿瘤。就保存方法而言，只要是本领域技术人员，就能从公知的方法中适当选择使用。
作为本发明中能够使用的三维培养法，只要没有特别说明，则可以使用公知的方法，并且只要是本领域技术人员，就能适当选择使用。
作为基于使用本发明中能够使用的肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法中的、原代癌细胞的准备工序，可以使用公知的方法。可列举例如从包含癌细胞的组织片中分取细胞的方法、将该组织片直接使用的方法，但从处理的容易性、试验的再现性等出发，优选分取细胞的方法。
作为从上述包含癌细胞的组织片中分取细胞的方法，可列举例如将从活体摘出的肿瘤组织片根据需要利用酶处理、密度梯度离心分离处理、过滤器处理、磁珠、流式细胞仪等处理进行分离纯化的方法。酶处理由于处理方法简便并能够容易地得到分散为单细胞的癌细胞，因此是优选的。予以说明，这些细胞群可以是来自相同组织且分化阶段不同的细胞的集合体。
作为本发明中能够使用的三维培养法，可列举在上述实质上低粘附性的细胞培养基材上在包含5v/v％以下的细胞外基质的培养基中培养由肿瘤组织得到的原代癌细胞的方法。该细胞外基质、该培养基及该原代癌细胞可以以任意的顺序进行混合，可列举如下方法：制备以溶胶状态包含该5v/v％以下的细胞外基质的培养基，向其中混合该原代癌细胞后，将其接种于该实质上低粘附性的培养孔板上。只要细胞外基质为5v/v％以下，则该原代癌细胞能够在浮游状态下进行培养。
由于能够在浮游状态下进行培养，因而处理变得容易，容易使用于各种试验中，并且能够进行机械性的操作，因此还容易使用于高通量的试验中，因此是优选的。
作为在本发明中能够使用的细胞外基质，可列举能够在公知的三维培养法中使用的的细胞外基质。可列举例如：胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、明胶、弹性蛋白、蛋白多糖、葡糖胺聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素、基质胶(Matrigel)(商标：康宁公司)、基质胶GFR(Matrigel GFR)(商标：康宁公司)、Cultrex BME(商标：TREVIGEN公司)、Cultrex RGF BME(商标：TREVIGEN公司)、Cellmatrix Type I-A(商标：新田明胶公司)、生长因子(Basic FGF、EGF、IGF-1、PDGF、NGF、TGF Beta等)。
作为本发明中能够使用的细胞外基质的浓度，只要是由肿瘤组织得到的原代癌细胞能够以浮游状态进行三维培养的浓度即可，可列举5v/v％以下，也可以为2.5v/v％以下，下限并无特别限制，优选列举0.1v/v％以上，进一步优选0.2v/v％以上，特别优选列举0.5v/v％以上，只要是本领域技术人员，就能根据该原代癌细胞的种类等进行适当设定。
本发明中能够使用的进行接种的细胞密度，只要能够以由肿瘤组织得到的原代癌细胞利用三维培养法制作成的细胞块的形式正常地生存即可。关于该原代癌细胞的细胞密度，通常可以以3×103～7×104cells/cm2的密度进行接种，但是可以结合培养条件、所使用的培养器具等适当设定优选的细胞密度。另外，作为培养条件，可以使用公知的条件，例如，培养温度优选为20～45℃，更优选为30～42℃，特别优选为35～39℃，培养液的pH优选为pH7～8。另外，作为培养期限，可以根据目标试验法进行适当设定，可列举2天以上且30天以下，更优选列举7天以上且14天以下，尤其即便在长时间(约10天以上)内也能够稳定地维持在高状态，因此利用价值高。
作为本发明中能够使用的培养基，可以使用任意的细胞培养基础培养基、分化培养基、原代培养专用培养基等。可列举例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Glasgow MEM(GMEM)、RPMI1640、Ham F12、无血清培养基(MCDB培养基等)等。进而，还可以使用在这些培养基中添加血清、各种增殖因子(胰岛素·转铁蛋白·硒盐、地塞米松)、分化诱导因子后的培养基。
本发明的能够利用使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养方法制作的细胞块并不受以下的限定，可以利用于各种试验法、例如对该细胞块有作用的物质的筛选方法、判定物质对该细胞块的效果的判定方法等。该细胞块具有如下优点：具有能够利用于各种试验法的高细胞增殖能力、且以浮游状态存在，并且具有处理的容易性、通用性、高通量性，因此容易利用于各种试验法中。
作为对本发明的该细胞块有作用的物质的筛选方法，只要是本领域技术人员，就能适当变更公知的方法再实施。可列举例如包括如下工序的对该细胞块有作用的物质的筛选方法，即，按照本发明而利用使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养方法制作细胞块的工序；对该细胞块给予受试物质的工序；以及评价该受试物质对该细胞块的作用的工序。作为有上述作用的物质，可列举直接或间接作用于该细胞块的物质、或者直接及间接发挥作用的物质、例如抗癌剂、各种化合物、抗体、抗体药物复合体、核酸、肽、病毒、细胞(NK细胞、TCR-T细胞、CAR-T细胞等)等。例如由于可以筛选能够抑制该细胞块的增殖的物质，因此可以用于抗癌剂的开发。
作为本发明的判定物质对该细胞块的效果的判定方法，只要是本领域技术人员，就能够适当变更公知的方法再实施。可列举例如包括如下工序的判定物质对该细胞块的效果的判定方法，即，按照本发明而利用使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养方法制作细胞块的工序；对该细胞块给予受试物质的工序；以及评价由该受试物质带来的效果的工序。作为用于判定上述效果的受试物质，可列举例如抗癌剂、各种化合物、抗体、抗体药物复合体、核酸、肽、病毒、细胞(NK细胞、TCR-T细胞、CAR-T细胞等)等。例如通过从各种抗癌剂中判定能够抑制该细胞块的增殖的抗癌剂，并对该细胞块源性患者给予该抗癌剂，从而可以提高治疗效果等，能够辅助治疗法的选择。予以说明，对于该细胞块和其源性患者的组合并无限定，也可以用于与该细胞块为相同种类的细胞的源性患者。
作为抗癌剂，可以使用公知的抗癌剂，可列举例如放线菌素D、美法仑、白消安、卡铂、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、奥沙利铂、丙卡巴肼、替莫唑胺、异环磷酰胺、多柔比星脂质体、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、博来霉素、米托蒽醌、克拉屈滨、氟脲嘧啶、巯嘌呤、培美曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、奈拉滨、卡培他滨、氟达拉滨、吉西他滨、喷司他丁、长春新碱(ピンクリスチン)、艾日布林、紫杉醇、长春碱、伊立替康、多西紫杉醇、依托泊苷、长春瑞滨、拓普替康(Nogitecan)、紫杉醇、维A酸、贝伐单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、西妥昔单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、单抗奥佐米星、依维莫司、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、伊马替尼、达沙替尼、舒尼替尼、索拉非尼、硼替佐米、他米巴罗汀、尼莫司汀、雷莫司汀、依诺他滨、卡莫氟、阿糖胞嘧啶、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美嘧啶-奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、索布佐生、长春地辛、阿柔比星、氨柔比星、净司他丁斯酯、吡柔比星、培洛霉素、奈达铂等。
另外，该细胞块可以在利用上述三维培养方法培养结束后直接在该培养液中用于各种试验，也可以移至别的容器再用于各种试验。在移至别的容器的情况下，其回收方法可以以公知的方法进行。只要是本领域技术人员，就能适当选择这些方法再实施。另外，该细胞块由于以浮游状态进行培养，也因此具有容易回收的优点。
作为各种试验法，可列举公知的试验法，可列举例如细胞增殖试验(MTT分析、ATP分析等)、生死细胞染色解析、表现型筛选(细胞形态变化的检查等、例如上皮间叶转换的解析)、病理组织学的解析(HE染色、免疫组化染色等)、生化学的解析(基因变异解析、mRNA表达解析、蛋白质表达解析、外来体解析等)等。只要是本领域技术人员，就可以根据上述物质的筛选方法、上述物质的效果的判定方法等的目的适当设定试验法再使用。
根据本发明，各种试验法能够使用一般的自动分注装置来实施，在96孔或384孔的孔板中的细胞的接种、培养基更换、药液添加、分析试剂添加、之后的使用发光或荧光测定装置的电子数据的取得、或使用自动图像解析装置的图像解析电子数据的取得等中，能够容易或高通量地进行。
只要是本领域技术人员，使用公知的方法就能容易地确认利用使用本发明的肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法制作的细胞块能够抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖、并且具有以原代癌细胞为主成分的细胞块的高增殖能力、反映活体而用于各种用途中。例如通过在视觉上确认细胞块的形成、评价细胞的增殖性、利用已知的物质评价对细胞块的效果、或将由动物得到的细胞块再次移植到动物中而评价是否具有致肿瘤性，从而能够确认是否具有与活体中的肿瘤同样的功能。
作为本发明的试剂盒，可列举具备实质上低粘附性的细胞培养基材和包含5v/v％以下的细胞外基质的三维培养工序用的培养基的、用于基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法制作细胞块的试剂盒。该包含5v/v％以下的细胞外基质的三维培养工序用的培养基，可以为了在试剂盒的使用前开始制备而分开具备细胞外基质和培养基，也可以将细胞外基质和培养基混合而具备。另外，还包括在说明书等中为了试剂盒的使用者能够获得而记载在本发明的细胞块的制作方法中能够使用的、实质上低粘附性的细胞培养基材、细胞外基质、培养基。另外，细胞培养基材、培养基、细胞外基质等材料或试剂盒的使用方法等可列举在上述的本发明的细胞块的制作方法中能够使用的材料或试剂盒的使用方法。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明并不受这些实施例的限制。
＜实施例1：肿瘤组织的采集及癌细胞的分散处理＞
按照常规方法在安全柜内无菌地摘出在免疫缺陷小鼠[Super SCID小鼠(系统名：C3H/HeJ/NOs-scid；LPS-nonresponder)]的皮下增大的人癌患者源性的Patient-DerivedXenograft(以下称作“PDX”)肿瘤，用外科用剪刀除去肿瘤的坏死区域。将肿瘤快速地浸入日本药局方生理食盐液中，在冰上进行保存。接着，从肿瘤中除去日本药局方生理食盐液，用标本处理液(癌类器官培养试剂盒附带品、ORGANOGENIX公司)对肿瘤反复清洗3次。
作为用于三维培养的准备工序，按照以下方式进行癌细胞的分散处理。采取清洗后的肿瘤于冰上的10cm培养皿中，用外科用剪刀切成约1mm见方后，将其回收于50mL管中。向管内添加分散溶液(癌类器官培养试剂盒附属品、ORGANOGENIX公司)，一边使其在水浴中振荡，一边以37℃、60min对肿瘤片进行酶处理。添加反应液的2倍量的标本处理液，减弱反应，通过100μm的细胞筛网，除去未分散的残渣。用适量的标本处理液冲洗管及细胞筛网，回收细胞，进行300×g、5min离心分离。除去上清后，对细胞团添加标本处理液，进行再悬浮，进行300×g、5min离心分离。之后，对细胞团用适量的标本处理液进行再悬浮，进行细胞数的计数。确认变成单细胞，用于以下的实验。
＜实施例2：细胞在三维培养孔板中的接种及培养＞
首先，使用最初被记载为能够进行原代癌细胞的三维培养的、癌类器官培养试剂盒(Cancer Organoid Culture Kit)(ORGANOGENIX公司)，对是否能够进行使用PDX肿瘤的三维培养进行了研究。癌类器官培养试剂盒是为了形成癌细胞的细胞块而用使低粘附孔板具有凹凸的脚手架结构的孔板和包含1体积％以上的血清的培养基进行培养的方法。
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量后置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，用NanoCulture Medium P type(癌类器官培养试剂盒附属品、ORGANOGENIX公司)以使细胞数为1×105cells/mL的方式制备细胞悬浮液。向作为三维培养孔板的NanoCulturePlate(癌类器官培养试剂盒附属品、ORGANOGENIX公司)中添加150μL的NanoCultureMedium P type，进行700×g、5min离心分离后，进行37℃、10min静置，进行预湿。向孔板中添加细胞悬浮液100μL，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/250μL/well，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并适当地进行。其结果判明：未形成明显的细胞块，确认到纺锤形状的成纤维细胞粘附于孔板底面，因此难以对胰腺癌(1)PDX肿瘤直接应用ORGANOGENIX公司的癌类器官培养试剂盒。
为了达成以浮游状态进行培养，通常按照在溶胶状的条件下包含于培养基的方式来制备以凝胶状使用的细胞外基质，成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞无伸展增殖，对原代癌细胞能否形成细胞块进行了研究。
与上述同样地将计数后的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照使最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照使细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于作为一般的低粘附孔板的三维培养孔板的PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)、Corning ULA Round-bottom(康宁公司)、Corning ULA Flat-bottom(康宁公司)、Elplasia(可乐丽公司)或作为一般的粘附性的平面(二维)培养孔板的96孔微孔板(康宁公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。同样地在NanoCulture Plate中按照1×105cells/mL制备细胞悬浮液，向用150μL的培养基预湿的孔板中添加细胞悬浮液100μL，进行接种，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内中开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well(NanoCulture Plate以外)或1×104cells/250μL/well(NanoCulture Plate)，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并且适当地进行。
将结果示于图1中。用相位差显微镜确认形态，并且由其形态确认是否为细胞块，并且在孔板底面确认到纺锤形状的细胞的情况下，判定为有成纤维细胞的粘附。其结果，在作为一般的低粘附性孔板的三维培养孔板的PrimeSurface、Corning ULA Round-bottom、Corning ULA Flat-bottom、Elplasia中均未确认到成纤维细胞在孔板底面上的粘附，确认到能够形成100μm以上的大小的原代癌细胞的细胞块。另一方面，对于在作为一般的粘附性的平面培养孔板的96孔微孔板或低粘附性孔板中具有成为形成细胞块的脚手架的凹凸结构的NanoCulture Plate而言，虽然确认到细胞块的形成，但是确认到成纤维细胞在孔板底面上的粘附。由以上的结果显示：通过用低粘附性的培养孔板和包含溶胶状的细胞外基质的培养基进行培养，从而即使是浮游培养，也无成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的伸展增殖，能够形成充分大的原代癌细胞的细胞块。
＜实施例3：在培养基中添加的细胞外基质的浓度的研究＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为0、0.5、1、2、5、10、20或50v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于PrimeSurface(SumitomoBakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。未实施培养基更换，并且在Day 14评价半量培养基更换的实施可能性。将结果示于图2中。用相位差显微镜确认形态，在康宁基质胶GFR浓度为0.5v/v％以上且5v/v％以下时，即使是浮游状态，也无成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的伸展增殖，确认到充分大的细胞块的形成。另外，当在用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，并非充分的溶胶状态且与细胞或细胞块一起进行吸取的情况下，设为不能半量培养基更换。可知：在2v/v％以下的情况下，半量培养基更换能够实施，容易进行细胞块的处理，容易用于各种试验。
＜实施例4：在培养基中添加的细胞外基质的种类的研究＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为0、0.5、1、2、5、10或20v/v％的方式添加康宁基质胶(康宁公司)、Cultrex BME(TREVIGEN公司)、Cultrex RGF BME(TREVIGEN公司)或Cellmatrix Type I-A(新田明胶公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。未实施培养基更换，并且在Day 14评价半量培养基更换的实施可能性。将结果示于图3中。用相位差显微镜或肉眼确认形态，在康宁基质胶、Cultrex BME、Cultrex RGF BME或Cellmatrix Type I-A的任一者细胞外基质中，均是在浓度为0.5v/v％以上且5v/v％以下时，即使是浮游状态，也无成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的伸展增殖，确认到充分大的细胞块的形成。另外，当在用移液方式吸取孔内的半量的培养基时，并非充分的溶胶状态并与细胞或细胞块一起吸取的情况下，设为不能半量培养基更换。可知：半量培养基更换根据细胞外基质的种类不同而不同，在2～5v/v％以下的情况下，能够实施。
＜实施例5：基础培养基的种类的研究＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在作为基础培养基的StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)或StemFit AK02N(Takara-Bio公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并且适当地进行。将结果示于图4中。用相位差显微镜确认形态，在StemProhESC SFM或StemFit AK02N的任一基础培养基中，即使是浮游状态，也无成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的伸展增殖，确认到充分大的细胞块的形成。
＜实施例6：PDX肿瘤的种类的研究＞
按照实施例1，使用各种PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。作为各种PDX肿瘤，使用胰腺癌(1)、胰腺癌(2)、肺扁平上皮癌(1)、肺扁平上皮癌(2)、肺扁平上皮癌(3)、胃癌(1)及大肠癌(1)。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo FisherScientific公司)按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并且适当地进行。将结果示于图5中。用相位差显微镜确认形态，在来自任一癌症或来自任一患者的PDX肿瘤中，均无成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的伸展增殖，即使是浮游状态，也确认到充分大的细胞块的形成。
＜实施例7：病理组织学的解析＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并且适当地进行。在Day 14将细胞块回收于1.5mL管中，使用iPGell(GENOSTAFF公司)凝固为果冻状，用10％中性缓冲福尔马林液固定处理一夜。按照常规方法，使用福尔马林固定后的细胞块制作石蜡包埋标本，进行HE染色及抗人HLA免疫组化染色。作为比较对照，制作胰腺癌(1)PDX肿瘤的福尔马林固定石蜡包埋标本，同样地进行HE染色及抗人HLA免疫组化染色。将结果示于图6中。由染色结果确认到由胰腺癌(1)PDX肿瘤制作的细胞块由人癌细胞构成。另外，确认到胰腺癌(1)PDX肿瘤和由其制作的细胞块具有同样的结构。
＜实施例8：细胞增殖的研究＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL以N＝4(相同条件各4个部位)接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。培养基更换设为在半量下实施，并且在Day 1、7、10及12进行。在Day 1、3、7、10及14进行使用CellTiter-Glo 3D CellViability Assay(Promega公司)的ATP分析，算出各测定日的结果相对于Day 1的结果之比，制作增殖曲线。将结果示于图7中。由胰腺癌(1)PDX肿瘤制作的细胞块的活细胞数发生时间依赖性的增加，与Day 1相比，在Day 7线性增加至约4倍，在Day 14线性增加至7倍以上。由此显示具有高增殖能力。
＜实施例9：抗癌剂敏感性试验＞
按照实施例1，使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)制备原代癌细胞。体内(in vivo)抗癌剂敏感性试验参照公知的方法按照以下的步骤来实施。在安全柜内无菌地摘出在免疫缺陷小鼠[Super SCID小鼠(系统名：C3H/HeJ/NOs-scid；LPS-nonresponder)]的皮下增大的胰腺癌(1)PDX肿瘤，用外科用剪刀除去肿瘤的坏死区域。之后，制作约2～3mm见方的移植肿瘤片，对12只以上的免疫缺陷小鼠进行皮下移植。在平均肿瘤体积达到约200mm3的时间点，基于肿瘤体积进行分组，分成对照组及吉西他滨给予组(N＝6：相同条件各6只)。在4周内以每周2次的频率给予吉西他滨(60mg/kg/time)。以每周2次的频率测定肿瘤直径，求出肿瘤体积，制作肿瘤增殖曲线。将结果示于图8左图中。
体外(in vitro)抗癌剂敏感性试验按照以下的步骤来实施。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemProhESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL以N＝4(相同条件各4个部位)接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。在Day 1进行半量培养基更换。在Day 7使用按照吉西他滨的最终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1或10μmol/L的方式添加吉西他滨后的培养基，实施半量培养基更换。在Day 10及12使用按照使吉西他滨的最终浓度不变的方式调制浓度后的培养基，实施半量培养基更换。在Day 14使用CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay(Promega公司)进行ATP分析，算出将吉西他滨浓度为0μmol/L的结果设为细胞存活率100％时的各吉西他滨浓度组的结果之比，制作细胞存活率曲线。将结果示于图8右图中。
吉西他滨在in vivo及in vitro的任一敏感性试验中均抑制了胰腺癌(1)PDX肿瘤的增殖。
＜实施例10：使用冻结肿瘤组织的研究＞
按照实施例1，摘出胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)。将肿瘤浸渍于CELLBANKER 1(Takara-Bio公司)，用程序控制深冷器(NepaGene公司)进行冻结，制备冻结肿瘤。将冻结肿瘤在37℃的温浴中熔解，用HBSS(Thermo Fisher Scientific公司)清洗后，按照实施例1，制备原代癌细胞。将分散处理后计数的细胞分取所需量并置于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo FisherScientific公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL的方式制备细胞悬浮液。将其200μL以N＝4(相同条件各4个部位)接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well，将接种日设为Day 0。在Day3对按照吉西他滨的最终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1或10μmol/L的方式添加吉西他滨后的培养基各添加50μL(250μL/well)。在Day 0、3及7使用CellTiter-Glo 3D Cell ViabilityAssay(Promega公司)进行ATP分析，算出各测定日的结果相对于Day 0的结果之比，制作增殖曲线。算出将吉西他滨浓度为0μmol/L的结果设为细胞存活率100％时的各吉西他滨浓度组的结果之比，制作细胞存活率曲线。将它们的结果示于图9中。
由暂时冻结的胰腺癌(1)PDX肿瘤制作的细胞块的活细胞数发生时间依赖性的增加，与Day 0相比，在Day 7增加至约4倍。即使使用暂时冻结的肿瘤组织，吉西他滨也与实施例9同样地抑制来自胰腺癌(1)PDX肿瘤的细胞块的增殖。
＜实施例11：继代培养的研究＞
使用胰腺癌(1)PDX肿瘤(从医药基盘研究所获得)，按照实施例1，得到来自新鲜肿瘤的细胞块，按照实施例10，得到来自冻结肿瘤的细胞块。将细胞块分别回收于50mL管，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，悬浮于TrypLE(Thermo Fisher Scientific公司)中，在37℃的温浴中对细胞块进行酶处理。添加反应液的10倍量的HBSS(Thermo FisherScientific公司)，减弱反应，通过100μm的细胞筛网，除去未分散的残渣。用适量的HBSS冲洗管及细胞筛网，回收细胞，进行300×g、5min离心分离。除去上清后，对细胞团添加HBSS，进行再悬浮，进行300×g、5min离心分离。之后，对细胞团用适量的HBSS进行再悬浮，进行细胞数的计数。确认变为单细胞，用于以下的实验。
分取所需量的细胞于15mL管中，进行300×g、5min离心分离，除去上清后，使用在StemPro hESC SFM(Thermo Fisher Scientific公司)中按照最终浓度为2v/v％的方式添加康宁基质胶GFR(康宁公司)后的培养基，按照细胞数为5×104cells/mL(来自新鲜肿瘤)或2×104cells/mL(来自冻结肿瘤)的方式制备细胞悬浮液。将其200μL以N＝4(相同条件各4个部位)接种于PrimeSurface(Sumitomo Bakelite公司)，在设定为37℃、5％CO2的CO2培养箱内开始静置培养。接种细胞数为1×104cells/200μL/well(来自新鲜肿瘤)或4×103cells/200μL/well(来自冻结肿瘤)，将接种日设为Day 0。在Day 3对按照吉西他滨的最终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1或10μmol/L的方式添加吉西他滨后的培养基各添加50μL(250μL/well)。在Day 0、3及7使用CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay(Promega公司)进行ATP分析，算出各测定日的结果相对于Day 0的结果之比，制作增殖曲线。算出将吉西他滨浓度为0μmol/L的结果设为细胞存活率100％时的各吉西他滨浓度组的结果之比，制作细胞存活率曲线。将它们的结果示于图10中。
由来自胰腺癌(1)PDX肿瘤的细胞块的细胞再制作的细胞块(也称作继代培养)，不论来自新鲜肿瘤还是来自冻结肿瘤，活细胞数均发生时间依赖性的增加，与Day 0相比，在Day 7增加至约2倍。与实施例9及实施例10一样，吉西他滨抑制来自胰腺癌(1)PDX肿瘤的再制作的细胞块的增殖。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种细胞块的制作方法，其是基于原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，所述细胞块以人肿瘤组织作为起始材料在抑制成纤维细胞等除癌细胞以外的细胞的增殖的同时，具有以原代癌细胞为主成分的细胞块的高增殖能力，且兼具处理的容易性、通用性、高通量性。因此，能够简便且廉价地在活体内组织中制作细胞块，有助于药剂筛选、药剂的药效评价、药品的安全性评价、再生医疗等。

Claims (6)

1.一种方法，其特征在于，是基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的制作方法，
该方法包括三维培养工序，该工序在实质上低粘附性的细胞培养基材上在包含5v/v％以下的细胞外基质的培养基中培养由该肿瘤组织得到的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，肿瘤组织为异种移植肿瘤。
3.一种原代癌细胞的细胞块，其特征在于，是利用权利要求1或2所述的细胞块的制作方法制作的、由肿瘤组织得到的原代癌细胞的细胞块。
4.一种对细胞块有作用的物质的筛选方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1或2所述的细胞块的制作方法制作原代癌细胞的细胞块的工序；
对该细胞块给予受试物质的工序；以及
评价该受试物质对该细胞块的作用的工序。
5.一种判定物质对细胞块的效果的判定方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1或2所述的细胞块的制作方法制作原代癌细胞的细胞块的工序；
对该细胞块给予受试物质的工序；以及
评价该受试物质对该细胞块的效果的工序。
6.一种试剂盒，其特征在于，是用于制作基于使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养法的细胞块的试剂盒，具备：
实质上低粘附性的细胞培养基材；以及
包含5v/v％以下的细胞外基质的三维培养工序用的培养基。
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