CN102439139A

CN102439139A - 癌组织来源细胞块及其制备方法

Info

Publication number: CN102439139A
Application number: CN2010800099623A
Authority: CN
Inventors: 井上正宏; 大植雅之
Original assignee: OSAKA PREFECTURAL HOSPITAL ORG; REI Medical Co Ltd
Current assignee: Osaka Prefectural Hospital Org
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-01
Publication date: 2012-05-02
Also published as: WO2010101119A1; EP2412803A4; US20120164732A1; SG174224A1; US8841125B2; EP2412803B1; US20140227781A1; CA2753526C; EP2412803A1; SG2014012843A; CA2753526A1; JP2010227088A; JP5652809B2

Abstract

本发明目的在于提供一种新的癌组织来源细胞块及其制备方法，该细胞块能够准确反映出癌细胞在生物体内的行为。并且本发明制备一种癌组织来源细胞块，该细胞块是从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理而得到的分离物或其培养物，在体外能够保持增殖能力。这种癌组织来源细胞块例如可以采用包括以下工序的制备方法获得：对从生物体取出的癌组织碎片状物进行酶处理的工序、以及对该酶处理物中含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序。

Description

癌组织来源细胞块及其制备方法

技术领域

本发明涉及癌组织来源细胞块及其制备方法。更详细而言，本发明涉及可在体外重建癌且保持增殖能力的癌组织来源细胞块。

背景技术

近年来，为了攻克癌症人们反复进行了各种研究，因此早期癌症的治疗成果得到了飞跃性提高。但是，晚期癌症的治疗仍然是个难题，癌症一直占据着日本人死因的第一位。根据厚生劳动省于平成19年进行的人口动态统计，每年死于癌症的人数超过34万人。

迄今为止的癌症研究中，特别是在研究体外癌症行为时，主要是在最适合培养的条件下使用次代培养而建立的癌细胞株来进行实验。这种癌细胞株包括：人乳腺癌细胞株(MDF7、NCI/ADR HS578T、MDA-MB-22231/ATCC、MDA-MB-4335、MDA-N、BT-549、T-47D)、人宫颈癌细胞株(HeLa)、人肺癌细胞株(A549、EKVX，HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522)以及人大肠癌细胞株(Caco-2、COLO 205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT29、KM12、SW-620)、人前列腺癌细胞株(DU-145、PC-3、LNCaP)等，上述细胞株被广泛用于研究。

为了实现对癌症患者的个别诊断和治疗等，业界认为有望进行癌细胞的原代培养，因此一直在进行这方面的研究。例如，开发出了使用原代培养细胞的CD-DST法(胶滴肿瘤药敏试验，Collagen gel droplet embedded drugsensitivity test)等。这种体外实验法是一种将从患者分离的组织或细胞包埋在胶原凝胶小滴内，再结合三维培养技术和图像比色定量法来进行检验的药物敏感性试验(例如非专利文献1)。但是，对于原代培养细胞，还未建立培养方法且操作困难。

作为癌细胞的研究成果，相继出现了支持构成癌症的癌细胞可能是由多个亚群组成，并且存在被称为“肿瘤原始细胞”或者“肿瘤干细胞”的亚群的报告，上述亚群虽然为小群，但可进行自我复制且可通过分化而成为大多数癌细胞的来源(例如非专利文献2、3)。这种干细胞，例如可通过将从生物体取出的肿瘤分离至单个细胞后再进行分类来获取，其中一些干细胞显示出了体外增殖能力(非专利文献4)。但是，也有报告否定了用干细胞来这样解释癌症起源的说法(非专利文献5)，这些报告仍是一种假设。

虽然现在对癌症的研究很广泛，但是关于癌症还存在诸多未知。

非专利文献1：Takamura Y，et al.，(2002)Prediction of chemotherapeuticresponse by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test inhuman breast cancers.Int.J.Cancer，98，450-455

非专利文献2：Vermeulen L，et al.，(2008)Single-cell cloning of coloncancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.PNAS Vol.105No.3613427-13432

非专利文献3：Ricci-Vitiani L，et al.，(2007)Identification and expansionofhuman colon-cancer-initiating cells.Nature Vol.445111-115

非专利文献4：Todaro M，et al.，(2007)Colon cancer stem cells dictatetumor growth and resist cell death by production of interleukin-4.Cell Stem Cell1：389-402

非专利文献5：Shmelkov S V，et al.，(2008)CD133 expression is notrestricted to stem cells，and both CD133+and CD133-metastatic colon cancercells initiate tumors.The Journal of Clinical Investigation Vol.1182111-2120

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的癌组织来源细胞块，该癌组织来源细胞块能够在体外再现癌细胞在生物体内的行为，并能够通过药物敏感性试验或射线敏感性试验等准确验证在生物体内的效果，还可用来作为癌症分析和治疗研究的试样。

本发明的目的还在于提供一种新的癌组织来源细胞块，在向异种动物的移植中，少量的该细胞块即具有充分的固定性，可用于制作简便的癌动物模型，还可用来作为癌症分析和治疗研究的试样。

本发明人打算对各癌症患者进行治疗敏感性试验，考虑到作为癌研究的研究材料而使用的细胞株对患者的癌来说有可能是异物，为了解决上述课题，本发明人对作为研究材料的癌细胞的原代培养法进行了反复深入的研究，结果发现了新的癌组织来源细胞块及其制备方法，从而完成本发明。

即，本发明的目的在于提供一种在体外也能够准确反映出癌细胞在生物个体内的行为的新的癌组织来源细胞块及其制备方法。

本发明涉及一种癌组织来源细胞块，该细胞块是从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理得到的分离物或其培养物，并且在体外能够保持增殖能力。

上述癌组织来源细胞块可以通过包括以下工序的方法获得，即，用含有胶原酶的酶对由上述个体得到的癌组织进行处理的工序。

作为这种酶，特别地，可以通过包括以下工序的方法获得，即，用含有蛋白酶和胶原酶的混合酶进行处理的工序，上述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种以上，上述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV中的1种以上。

上述混合酶可为LIBERASE BLENDZYME 1

本发明还涉及一种含有3个以上的癌细胞集合体且大致呈球形或椭球形的癌组织来源细胞块。

本发明还涉及一种癌组织来源细胞块，该细胞块含有3个以上的癌细胞集合体、以及存在于该癌细胞集合体外周面的基底膜状物，并大致呈球形或椭球形。

上述癌组织来源细胞块优选实质上不含有癌细胞以外的细胞。

上述基底膜状物可为层粘蛋白。

上述癌组织来源细胞块的直径可为40μm～250μm。

上述癌细胞可来源于上皮癌细胞。

上述癌细胞可来源于大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、咽喉癌、或胰腺癌。

本发明还涉及一种癌组织来源细胞块的制备方法，其包括：对从生物体取出的癌组织碎片状物进行酶处理的工序、以及对该酶处理物中含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序。

上述制备方法进一步包括对上述回收的成分进行3个小时以上的培养的工序。

上述选择回收可使用筛来进行回收。

上述对含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序，可以是对目径为40μm的筛的筛上成分且目径为250μm的筛的筛下成分进行回收的工序。

上述酶可含有胶原酶。上述酶可以是含有蛋白酶和胶原酶的混合酶，上述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种以上，上述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV中的1种以上。

上述混合酶可为LIBERASE BLENDZYME 1

本发明还涉及通过上述制备方法得到的癌组织来源细胞块。

本发明的癌组织来源细胞块，在体外能够显示出与生物体内相同的行为，并且能够对显示这种行为的细胞块进行重建，而且经过一定时间之后仍能保持增殖能力。这种癌组织来源细胞块，能够通过对癌细胞的培养而扩增使用，并且能够广泛且方便地用于体外药物敏感性试验或射线敏感性试验。由于对异种动物的肿瘤固定性优异，因此能够用于制作简易的肿瘤形成动物。

附图说明

图1是本发明的癌组织来源细胞块的形成过程的示意图。

图2是本发明的癌组织来源细胞块的一个实施方式中，细胞表达表面抗原CD133、CD44、CD166等的示意图。

图3是体外培养过程中显示本发明的癌组织来源细胞块的形状变化和增殖能力的图。

图4是使用本发明的癌组织来源细胞块，体外给予5-FU的药物敏感性试验的结果示意图。

图5是将本发明的癌组织来源细胞块移植到小鼠而得的肿瘤组织(右)、与从癌组织来源细胞块的来源的生物体内取出的肿瘤组织(左)进行比较的图。

图6是使用本发明的癌组织来源细胞块，进行体外射线敏感性试验的结果示意图。

图7是由各癌组织得到的本发明的癌组织来源细胞块的示意图，左起为大肠癌、胰腺癌、卵巢癌(上段)；咽喉癌、乳腺癌、肺癌(中段)；前列腺癌、肾癌、膀胱癌(下段)。

图8是表示使用乳腺癌组织来源细胞块，进行激素敏感性培养试验的结果图。

图9是由小鼠胰岛细胞瘤得到的本发明的癌组织来源细胞块的示意图。

图10是将本发明的癌组织来源细胞块进行冷冻保存的前后(冷冻保存前(左)以及溶解后24小时(右))状态的比较图。

具体实施方式

本发明的癌组织来源细胞块是从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理而得到的分离物或其培养物，并且在体外能够保持增殖能力。

在此，“从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理而得到的分离物”是指，对从生物体内生成的癌中得到的癌组织进行处理，从而得到含有3个以上、优选为8个以上癌细胞的分离物。这种分离物不含有已被分离成单个细胞的物质，并且不含有被分离成单个细胞后重建而成的重建物。但是，这种分离物不仅含有刚从生物体分离的物质，还含有例如在生理盐水中保持了一定时间的物质、经过冷冻或冷藏的物质。

从个体“得到的癌组织”是指，除了通过手术等取出而得的癌组织之外，还包括能够利用注射针或内窥镜在体外进行处理的用于组织检查而得的癌组织。

“从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理而得到的分离物的培养物”是指，通过对分离物进行体外培养而得到的培养物，上述分离物是指，对从生物体内产生的癌中获得的癌组织进行处理，再以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式，将得到的处理物进行分离处理而得到的分离物。对于培养时间没有特别限定，只要是能够在培养基中短时间存活的细胞块即可。在多数情况下，这种培养物经过一定时间的培养，优选为3小时以上，会大致呈球形或椭球形。这里的培养物包括：经过上述一定时间后大致呈球形或椭球形的培养物、以及一定时间后仍为不定形的培养物。并且，这里所说的培养物还包括：对上述大致呈球形或椭球形的培养物进行进一步分割而得到的不定形的培养物、以及通过进一步培养而得到的大致呈球形或椭球形的培养物。

本发明的癌组织来源细胞块在体外“能够保持增殖能力”是指，在37℃、5％CO₂的培养箱的细胞培养条件下，能够在至少10天以上、优选为13天以上、进一步优选为30天以上的期间保持增殖能力。

即使对这种癌组织来源细胞块保持原样持续培养，经过10天以上、优选为13天以上、进一步优选为30天以上的时间也仍然能够保持增殖能力，而通过进一步在培养过程中进行定期机械分割，能够保持实质上的无限增殖能力。

除了可以使用手术刀、刀、剪刀以外，还可使用眼科尖刀等进行机械分割。或者还可通过将注射针安装在注射器上，对培养液和癌组织来源细胞块反复吸入排出来进行分割。本发明优选使用例如1ml的注射器和27G的注射针，但并不受此限定。

这里，对于本发明的癌组织来源细胞块培养用培养基没有特别限定，但优选使用动物细胞培养用培养基。特别优选使用干细胞培养用的无血清培养基。这种无血清培养基只要是用于培养干细胞的无血清培养基，则没有特别限定。无血清培养基是指不含有没有提炼或未纯化的血清的培养基，可以添加纯化了的血液来源成分或动物组织来源成分(例如增殖因子)而使用。

可以将用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基来制备本发明的无血清培养基。作为基础培养基，例如可列举BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基，以及它们的组合。

可以在这种无血清培养基中添加血清替代物来培养本发明的癌组织来源细胞块。血清替代物可适当添加例如白蛋白、氨基酸(例如非必需氨基酸)、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’-硫醇甘油(3’-thiolglycerol)，或者它们的同等物等。

本发明的培养方法可使用市售的血清替代物。作为这种市售的血清替代物，例如可列举Knockout血清替代品(KSR)、Chemically-defined Lipidconcentrated脂肪酸浓缩液(Gibco社制)、Glutamax(Gibco社制)。用来培养本发明的癌组织来源细胞块的培养基还可含有维生素、增殖因子、细胞因子、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

可使用任意的无血清培养基，特别优选使用含有EGF和bFGF的无血清培养基、含有例如Knockout血清替代物(KSR，インビトロジエン社制)等血清替代物和bFGF的无血清培养基等。血清替代物或EGF等的含量优选为培养基整体的10～30％w/v。

作为这种培养基没有限定，作为市售品可列举STEMPRO人ES细胞用无血清培养基(Gibco)。

用于培养癌组织来源细胞块的培养器只要是通常能够进行动物细胞培养的培养器，则没有特别限定，例如可列举培养瓶、组织培养瓶、培养皿、有盖培养皿、组织培养皿、复合皿(multi dish)、微量板、微孔板、复合板(multiplate)、多孔板、腔室培养玻片、培养皿(schale)、培养管、培养托盘、培养袋、培养转瓶。

优选地，培养器无细胞粘附性，并且在培养基中与细胞外基质(ECM)等细胞支持用基质共存，进行三维培养。细胞支持用基质可以用于粘附癌组织来源细胞块粘附。作为这种细胞支持用基质，可列举使用了细胞外基质的基质胶，例如：胶原凝胶、明胶、多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、层粘蛋白、纤维连接蛋白。在想使本发明的癌组织来源细胞块增殖的情况下，特别适合使用以上条件。

可以适当设定其它培养条件，例如培养温度虽没有特别限定，但优选约为30～40℃。最优选为37℃。CO₂浓度例如约1～10％、优选约为2～5％。

本发明的癌组织来源细胞块能够在上述培养基及培养条件下进行培养。并且，培养癌组织来源细胞块时，根据其个别的性质，有时可优选与其它细胞共同培养，或者有时有必要添加例如激素等追加的特殊补充物。

具体地，可与饲养细胞一起进行共同培养。作为饲养细胞，可使用胚胎成纤维细胞等的基质细胞等。虽然没有具体限定，但优选NIH3T3等。或者，对于特定种类的乳腺癌、子宫癌、前列腺癌，优选在存在激素的条件下进行培养。具体而言，对于乳腺癌为雌激素、对于子宫癌为黄体酮、对于前列腺癌为睾酮等，但不受此限定，可添加各种激素并调整最适培养条件。此外，由于存在上述激素，通过研究癌组织来源细胞块在培养后的行为是如何变化的，从而有可能能够了解来源于患者的癌的激素依赖性，并能够预测抗激素药物治疗的有效性。

本发明的癌组织来源细胞块还可以采用悬浮培养进行培养。采用悬浮培养，在对培养器无粘附性的条件下，在培养基中培养癌组织来源细胞块。作为这种悬浮培养，例如可列举胚状体培养法(Keller et al.，Curr.Opin.CellBiol.7，862-869(1995))、SFEB法(例如Watanabe et al.，Nature Neuroscience 8，288-296(2005)；参照国际公开第2005/123902号)。虽然没有特别限定，但例如可用于形成或维持大致呈球形且有时具有基底膜的稳定的癌组织来源细胞块。

本发明的癌组织来源细胞块中，含有刚从个体的癌组织来源细胞块中进行了分离处理的物质，还含有经过冷藏或冷冻保存后的物质，并且还含有它们的培养物。培养时间可优选为3小时以上、更优选为10小时以上36小时、进一步优选为24小时～36小时以上。

构成癌组织来源细胞块的癌细胞至少为3个以上、优选为8个以上、更优选为10个以上、进一步优选为20个以上、最优选为50个以上。在本发明的癌组织来源细胞块为分离物的情况下，优选为1000个以下、更优选为500个以下左右。如果是培养分离物后的培养物，则可通过培养来增加该数量。但是，培养物优选为1万个以下、更优选为5000个以下。

本发明中提到“癌细胞”时，是指其常用的涵义，即，生物体内的正常细胞中所见的秩序已经紊乱的细胞，该细胞可无限制地分裂增殖并逃脱了细胞凋亡。更详细而言，是指细胞增殖调控机能丧失或严重减弱的细胞，典型是指以下细胞：以80％以上的高频率获得无限增殖能力，并且在多数情况下大部分还具有浸润转移能力，导致人特别是哺乳动物死亡的且被认为是恶性新生物的细胞。

在本发明中，癌组织来源的种类并没有特别限制，可以是在哺乳类等动物体内生成的淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经细胞瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤、白血病、恶性淋巴瘤等，特别优选在哺乳类的上皮细胞内生成的肿瘤。这种在上皮细胞内生成的肿瘤包括非小细胞肺癌、肝细胞癌、胆管癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、咽喉癌、乳腺癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、阴唇癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌。以哺乳类为代表的动物并没有特别限定，例如可列举猴和人等灵长目动物、小鼠和松鼠以及大鼠等啮齿目动物、兔形目动物、狗和猫等食肉目动物。

其中，在本发明的癌组织来源细胞块，特别优选来源于大肠癌组织、卵巢癌组织、乳腺癌组织、肺癌组织、前列腺癌组织、肾癌组织、膀胱癌组织、咽喉癌组织或者胰腺癌，但不受此限定。

如果是来源于大肠癌组织的癌组织来源细胞块，则所含有的癌细胞没有特别限定，但有时可发现CD133。

对从在生物体内生成的癌中获得的癌组织进行分离处理时，虽然没有任何限定，但包含对从个体所获得的癌组织进行的酶处理。

可使用胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、透明质酸酶、溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种，或者它们的2种以上的组合来进行酶处理。酶处理条件可以使用生理学上可接受的pH，例如约6～8、优选为约7.2～7.6的缓冲等渗盐溶液，例如在PBS或Hank’s缓冲盐溶液中，例如在约20～40℃、优选为约25～39℃下，用于分解结缔组织的充分时间，例如约1～180分钟、优选为30～150分钟；用于分解结缔组织的充分浓度，例如约0.0001～5％w/v、优选为约0.001％～0.5％w/v。

虽然没有限定，但该酶处理的条件包括用含有胶原酶的混合酶进行处理的工序。例如包括了用含有蛋白酶和胶原酶的混合酶进行处理的工序，上述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种以上，上述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV中的1种以上。

对于这种混合酶没有限定，但含有LIBERASE BLENDZYME 1

等。

本发明癌组织来源细胞块可含有3个以上的癌细胞集合体且大致呈球形或椭球形。

虽没有限定，但可含有存在于该癌细胞集合体外周面的基底膜状物。

这里虽没有特别限定，但在多数情况下，形成集合体的癌细胞的细胞表面含有选自CD133、CD44、CD166、CD117、CD24和ESA中的1种以上的表面抗原。CD133、CD44、CD166、CD117、CD24和ESA一般为在淋巴细胞等白血细胞、纤维原细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等细胞中表达的表面抗原。这些表面抗原除具有细胞-细胞间、细胞-基质间的粘附功能以外，还与各种信号传导相关，是各种干细胞的表面标记。

本发明中提到细胞群“表达”CD133等表面抗原时是指，在细胞群中存在的80％以上、优选为90％以上、更优选实质上为全部的细胞显示表面抗原的状态。

本说明书中，虽没有限定“基底膜状物”，但优选为含有胶原蛋白、层粘蛋白、巢蛋白、硫酸类肝素蛋白多糖等蛋白聚糖，以及纤维连接蛋白等糖蛋白中的至少1种的物质。本发明中，优选含有层粘蛋白的基底膜状物。

层粘蛋白是构成基底膜的高分子糖蛋白。层粘蛋白的功能复杂，例如该功能与以下细胞功能相关：细胞粘附、细胞间信息传导、正常细胞和癌细胞的增殖等。层粘蛋白具有3个不同的亚单位分别通过双硫键连接的结构，因各亚单位的种类不同，而出现了11种层粘蛋白。

它们之中，层粘蛋白5通常只产生于上皮细胞，并作为具有促进与上皮细胞基底膜的粘附和促进运动功能的活性的成分而被人所知。这种层粘蛋白5具有以下结构：由α3链、β3链、γ2链各1条形成的复合体，特别地，认为γ2链是LN5固有的，其它的LN分子种类中不含有。

本发明的癌组织来源细胞块可具有以下结构：癌细胞集合体的整个外周被形成有这种基底膜状物的膜包围。这种形态可以通过以下方法解析，即，用电子显微镜对癌组织来源细胞块进行观察，或者对基底膜构成要素进行免疫染色，或结合上述两种方法。

例如，可以使识别层粘蛋白的抗体(例如，シグマ-アルドリツチ社的小鼠层粘蛋白来源兔抗体)与癌组织来源细胞块接触来测定抗体抗原反应，由此检测层粘蛋白的存在。

并且，也可以使用识别特定种类层粘蛋白的特异性抗体。例如，可使用例如，特别地，使对上述固有的γ2链或其断片具有反应性的抗体与癌组织来源细胞块接触来测定抗体反应，由此检测层粘蛋白的存在。

在本发明的癌组织来源细胞块中，根据细胞块的大小，可形成数μm左右、优选为40～120nm左右的薄膜状基底膜状物，但不受上述限定。

本发明癌组织来源细胞块的尺寸没有限定，既包括粒径或体积平均粒径为8μm～10μm左右的不定形细胞块，还包括经过培养而长大的1mm粒径以上的细胞块。优选直径为40μm～1000μm、更优选为40μm～250μm、进一步优选为80μm～200μm。

在多数情况下，本发明的癌组织来源细胞块具有选自棚状排列、片状排列、重层排列以及合胞体状排列中的1种以上的排列，但没有特别限定。

本发明的癌组织来源细胞块可通过包括以下典型工序的方法来制备，即，对从生物体取出的癌组织的碎片状物进行酶处理的工序、以及对酶处理物中含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序。

并且，虽然没有限定，但可通过包括以下工序的制造方法制备本发明癌组织来源细胞块，即，对上述回收成分进行3个小时以上培养的工序。

可以首先将从生物体取出的癌组织保持原样进行碎片化，此外，还可以在碎片化前先将其放置动物细胞培养用培养基内。虽然没有限定，但这种动物细胞培养用培养基中含有Dulbecco’s MEM(DMEM F12等)、Eagle’sMEM、RPMI、Ham’s F12、alpha MEM、Iscove’s改良的Dulbecco’s MEM等。此时，优选在无细胞粘附性的培养器中进行悬浮培养。

优选在碎片化前洗涤癌组织。虽然没有特别限定，但可以使用以下溶液进行这种洗涤：醋酸缓冲溶液(醋酸+醋酸钠)、磷酸缓冲溶液(磷酸+磷酸钠)、柠檬酸缓冲溶液(柠檬酸+柠檬酸钠)、硼酸缓冲溶液、酒石酸缓冲溶液、Tris缓冲溶液、磷酸缓冲生理盐水等缓冲溶液等。本发明中特别优选能够在HBSS中进行组织洗涤。适当的洗涤次数为1次至3次。

可使用刀、剪刀、切割器(手动、自动)等将洗涤后的组织分割来进行碎片化。碎片化后的尺寸和形状没有特别限定，可以随意分割，但优选为1mm³～5mm³、更优选为1mm³～2mm³的均匀尺寸。

接着，将由此得到的碎片状物进行酶处理。这种酶处理可通过胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、透明质酸酶、溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、以及分散酶中的1种、或者2种以上这些酶的组合来进行处理。酶处理条件可以使用生理学上可接受的pH，例如约6～8、优选为约7.2～7.6的缓冲等渗盐溶液，例如在PBS或Hank’s缓冲盐溶液中，例如在约20～40℃、优选为约25～39℃下，用于分解结缔组织的充分时间，例如约1～180分钟、优选为30～150分钟；用于分解结缔组织的充分浓度，例如约0.0001～5％w/v、优选为约0.001％～0.5％w/v。

虽没有限定，但该酶处理的条件，例如可以用含有胶原酶的混合酶进行处理。更优选为用含有蛋白酶和胶原酶的混合酶进行处理，上述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、以及分散酶中的1种以上；上述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II、以及胶原酶IV中的1种以上。上述混合酶没有限定，但含有LIBERASE BLENDZYME1

等。

接着，优选对由上述方法得到的酶处理物中含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收。选择回收的方法没有特别限定，可使用本领域技术人员公知的任何方法进行尺寸分类。

作为尺寸的分类方法，简便的方法有采用目视或相差显微镜进行区分、或者利用筛子，但只要是本领域技术人员能够利用的粒径区分法，则没有特别限定。使用筛子时，优选回收能通过筛目径20μm且不能通过500μm的成分。更优选回收能通过筛目径40μm且不能通过250μm的成分。其中，作为选择对象的含有3个以上癌细胞的细胞块是本发明癌组织来源细胞块，具有一定范围的尺寸。一定范围的尺寸也包括体积平均粒径为8μm～10μm左右的小尺寸，但接近球形时，指直径为20μm以上500μm以下、优选为30μm以上400μm以下、更优选为40μm以上250μm以下；为椭圆形时，指长径为20μm以上500μm以下、优选为30μm以上400μm以下、更优选为40μm以上250μm以下；为不定形时，指体积平均粒径为20μm以上500μm以下、优选为30μm以上400μm以下、更优选为40μm以上250μm以下。可以使用安装有CCD相机的相差显微镜(IX70；オリンパス社制)根据对粒度分布及粒子形状的评价，来测定体积平均粒径。

由此得到的作为选择回收成分的分离处理物或其培养物均为本发明的癌组织来源细胞块。培养物可以是在培养基中短时间存活的选择回收成分的分离物，也可以是经过例如至少3小时以上、优选为10小时～36小时、更优选为24小时～36小时以上的培养时间，形成大致球形或者大致椭球形的形状的培养物。培养时间可以超过36小时、数日、或者经过10天以上、13天以上、或者30天以上。

可以在培养基中长期保持原样进行培养，优选为，通过在培养中途进行定期机械分割，从而保持实质上的无限增殖能力。

由此得到的本发明的癌组织来源细胞块在体外显示了与生物体内癌组织相同的行为，能够稳定地进行培养，并且能够保持增殖能力。因此，能够有效用于例如对得到的癌组织来源的肿瘤具有敏感性的现有药物种类的选定、或者针对每个患者是否对放射线敏感的个别确认。药物或者放射线敏感性可使用公知的所有方法，没有特别限定。药物敏感性可通过对体外癌组织来源细胞块的增殖率进行测定而得。该增殖率的测定例如包括：对添加被检药物后、数小时后、或数日后的存活细胞数与对照例一起进行目视观察；在CCD相机照相后进行图像解析；或者对各细胞所含的由蛋白结合性色素(例如，硫氰酸盐B)染色的蛋白量进行比色测定等。

并且，这种癌组织来源细胞块也可用作筛选未知药物。关于该未知药物的敏感性，也可通过进行体外癌组织来源细胞块的增殖率测定、或者进行细胞存活判定来得到。增殖率的测定例如包括：对添加被检药物后、数小时后、或数日后的存活细胞数与对照例一起进行目视观察；在CCD相机照相后进行图像解析；或者对各细胞所含的由蛋白结合性色素硫氰酸盐B染色的蛋白量进行比色测定；对SD(Succinyl dehidrogenase)活性进行测定等。

对所有人培养细胞的被检化合物敏感性测定数据，即，抑制细胞增殖50％的浓度(GI₅₀)、外观上抑制细胞增殖的浓度(TGI)以及细胞数减少了播种时50％的浓度(LC₅₀)等，能够进行计算、信息处理。GI₅₀、TGI、LC₅₀值分别由被测试的癌组织来源细胞块的固有数值而得。求出其整体平均GI₅₀、TGI、LC₅₀值，再求出该平均值与每个细胞的Log GI₅₀值之差，以平均LogGI₅₀值为基准，将该差值的绝对值以正负表示。可以判断正值越大是敏感性越高的药物。

作为使用本发明癌组织来源细胞块的射线敏感性试验，包括以下公知试验：单独使用X射线、以钴的放射性同位素为放射源的γ射线、用直线加速器将电子束加速的粒子线、由回旋加速器取出的α射线等重粒子线等，或者与放射增敏剂并用。

此外，本发明的癌组织来源细胞块，例如即使直径100μm的癌组织来源细胞块为10个以下(相当于1000个以下细胞)，向异种动物移植的固定度也很高。因此，本发明的癌组织来源细胞块能够有效用于简易制作小鼠等癌模型动物，并且能够对更严谨的癌组织检验、药物敏感性评价、或者放射治疗等治疗状态进行评价。

本发明的癌组织来源细胞块能够进行冷冻保存，在通常的保存状态下能够保持其增殖能力。

[产业上的可利用性]

本发明的癌组织来源细胞块，能够在体外以可培养状态进行冻结保存，用途广泛。并且，能够通过培养使其增殖，从而使来源于微量样品的癌细胞增殖成为可能。此外，本发明的癌组织来源细胞块，能够广泛用于药物敏感性试验或者射线敏感性试验，并且能够用于制作简易的肿瘤形成动物。因此，本发明的癌组织来源细胞块，能够为现在常用于试错法或者联合疗法的抗癌药或放射治疗带来飞跃改善。即，在进行上述疗法之前，能够用分别从患者得到的癌组织来源细胞块，预先对药物或放射治疗的效果进行预测，从而可以仅给予患者有效的药物。并且，由于本发明的癌组织来源细胞块仅具有用注射针能够采集的大小即可，因此可以从进行手术前的患者上得到，从而能够在减轻患者负担的状态下对抗癌药和放射治疗的效果进行预测。

[实施例]

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例的限定。应予说明，各实施例中份和％均以重量为基准。以下如没有特别规定的培养条件则均为在37℃、5％CO₂培养箱条件下。离心分离的条件如无特别说明，则为4℃、1000rpm、5分钟。

(实施例1)

(来源于小鼠大肠癌移植肿瘤的癌组织来源细胞块的制备)

采用如下所述异种移植法制备小鼠大肠癌移植肿瘤。

首先，无菌操作下，将手术取出的人肿瘤(大肠癌)标本切细至约2mm³。接着，在重症免疫不全小鼠(裸鼠、优选NOD/SCID小鼠)的背部切开约5mm的小切口，剥离皮下组织。将预先准备的肿瘤片插入皮下后，用皮肤缝合夹进行缝合。约14天后至3个月后将一部分移植肿瘤作为皮下肿瘤进行观察。

将得到的大肠癌小鼠在SPF(specific pathogen free)饲养条件下进行饲养，在肿瘤为1cm大小的时间点，取出肿瘤，回收至添加有20ml的DMEM(Gibco；11965-092)+1％Pen Strep(Gibco；15140-022)(终浓度均为100units/ml盘尼西林，100μg/ml)的50ml离心管(IWAKI；2345-050)中。

接着，加入20ml HBSS(Gibco；14025-092)，通过翻转混合对肿瘤进行洗涤。再加入20ml新的HBSS，将该操作重复2次，将肿瘤组织转移至10cm组织培养皿(组织培养皿)(IWAKI；3020-100)中。在该培养皿上，用手术刀除去坏死组织。

将除去了坏死组织的肿瘤片，转移至添加有HBSS 30ml的新的10cm培养皿中。然后用手术刀将肿瘤片切成约2mm³的碎片。

将HBSS和肿瘤碎片一起转移至新的50ml离心管后，进行离心分离，弃上清，用20ml HBSS通过翻转混合进行洗涤。

反复进行离心分离及洗涤。然后，加入20ml的DMEM+1％Pen Strep+0.28U/ml(终浓度)Blendzyme 1(Roche；11988417001)并混合。将其转移至100ml的锥形瓶中，在37℃恒温槽内，一边低速旋转搅拌器一边用LIBERASE BLENDZYME 1(ロツシユダイアグノステイツクス社制)进行2小时的处理。

接着，将酶处理物回收至50ml离心管中，进行离心分离，弃上清，加入20ml HBSS并混合。将通过不锈钢筛(500μm)并通过了滤器的成分回收至50ml离心管中，再进行离心分离操作。弃上清，加入1mg/ml DNaseI溶液(Roche；1284932)(10mg/ml stock 100μl+PBS 900μl)并混合，在4℃下静置5分钟，再加入20mlHBSS混合后，进行离心分离，弃去上清液。与20ml HBSS混合后，以500-250-100μm阶段性过筛，然后通过40μm细胞过滤网(BD；352340)。在添加有HBSS 30ml的10cm组织培养皿(组织培养皿)中浸入细胞过滤网，轻微摇动以除去单细胞、40μm以下的小细胞块、以及碎屑。将细胞过滤网转移至添加有HBSS 30ml的其它的10cm组织培养皿(组织培养皿)中，通过移液器(pipetting)对捕获在细胞过滤网上的细胞块进行回收。

然后，进行数次与上述同样的离心分离操作，在得到的成分中加入4mlStemPro hESC SFM(Gibco；A10007-01)+8ng/ml bFGF(Invitrogen；13256-029)+0.1mM 2-巯基乙醇(Wako；137-06862)+1％PenStrep+25μg/ml两性霉素B(Wako；541-01961)，混合后转移至6cm未经处理的皿(EIKENCHEMICAL；AG2000)中。

将其在37℃下5％CO₂培养箱(サンヨ一社制MCO-17AIC)中培养36小时。

其结果如图1所示，随着时间的流逝，由不定形向完整的球形变化，在至少3～6小时后为大致球形，在24小时后得到完全完整的球形癌组织来源细胞块。

(实施例2)

(来源于人大肠癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用大肠癌手术样品以外，采用与实施例1相同的方法获取癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例3)

(来源于人卵巢癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用卵巢癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例4)

(来源于人胰腺癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用胰腺癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例5)

(来源于人小细胞癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用作为肺癌之一的小细胞癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例6)

(来源于人肾癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用肾癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例7)

(来源于人膀胱癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用膀胱癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例8)

(来源于人乳腺癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用乳腺癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例9)

(来源于人前列腺癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除了使用前列腺癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得组织来源的细胞块。在培养基中添加10^-8摩尔/L浓度的双氢睾酮(DHT)，进行与实施例1相同的培养。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例10)

(来源于人咽喉癌手术样品的癌组织来源细胞块的制备)

除使用咽喉癌手术样品以外，采用与实施例2相同的方法获得癌组织来源细胞块。其结果如图7所示，在至少12小时后得到了与图1相同的大致球形的癌组织来源细胞块。

(实施例11)

(来源于乳腺癌的癌组织来源细胞块的激素敏感性试验)

在与实施例8相同的培养基条件下，通过雌二醇的有无，来对从多名患者得到的乳腺癌组织来源细胞块的状态有怎样的不同进行调查。其结果如图8所示，存在因添加雌二醇而促进增殖的病例、以及对雌二醇无反应的病例。并且可知在进行来源于患者的激素疗法时可被用来进行敏感性试验。

(实施例12)

(来源于小鼠胰岛细胞瘤的癌组织来源细胞块的制备)

RipTag是在大鼠胰岛素启动子的控制下，强制性表达SV40-T抗原的转基因小鼠的胰岛中产生的肿瘤。除了使用RipTag小鼠的胰岛细胞瘤以外，采用与实施例2相同的方法获取癌组织来源细胞块。其结果为，在至少12小时后，得到与图1同样的大致球形的癌组织来源细胞块(图9)。

(实施例13)

将实施例2得到的如图7所示的培养中的癌组织来源细胞块，在培养后24小时，与培养基一起取出5ml，在1000rpm、4℃下进行离心分离，弃去上清液。将回收的癌组织来源细胞块悬浮于细胞保存液(CellBanker)(BLC-1、三菱化学メデイスン社制)中，再加入10μM的Y27632(和光纯药工业社制)，移入冷冻保存管(Cryogenic vials 2.0ml、Nalge Nunc社制)中，在-80℃低温冰箱中保存。

保存后经过7天后，在37℃水浴中迅速复温。将其悬浮于PBS中，在1000rpm、4℃下进行离心分离，弃去上清液。将得到的沉淀物悬浮于StemPro(インビトロ社制)中，进行培养。如图10所示，溶解后24小时的细胞状态良好。

并且，通过将含有约1000个细胞的细胞块植入NOD-SCID小鼠中，来确认存活的得到的癌组织来源细胞块。

(比较例1)

使用人大肠癌手术样品，按照文献记载的方法(Todaro M et al.，(2007)Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by productionofinterleukin-4.Cell Stem Cell 1：389-402)，处理成单细胞，制备试样。但是，进行了单细胞处理并挑选后的CD133阳性细胞，未发现在体外的增殖。

按照下述方法对实施例等中的评价项目进行测定。

<表面抗原的识别>

将实施例1得到的癌组织来源细胞块用胰蛋白酶·EDTA分散成单细胞。将这些细胞与用荧光标记的表面抗原特异性抗体反应后，用流式细胞仪法进行解析。如图2所示，结果发现存在同时均匀表达表面抗原的细胞。

<基底膜状物的确认>

将实施例1得到的癌组织来源细胞块，在温度37℃、5％CO₂培养箱的培养条件下，用STEMPRO人ES细胞用无血清培养基(Gibco)1cc进行3天培养。将其用福尔马林固定后包埋石蜡，切成薄片，按照制造商的说明书进行抗层粘蛋白抗体染色(シグマ-アルドリツチ社制、小鼠层粘蛋白来源的兔抗体)后，对在癌组织来源细胞块的外周以及靠近外周的细胞的细胞质内的层粘蛋白的抗原性进行观察。由此发现本发明的癌组织来源细胞块，在癌细胞集合体的周边包围有层粘蛋白。另一方面，手术样品处理后24小时无法确认层粘蛋白的表达。

<低氧的检测>

使用哌莫硝唑进行低氧检测的例子

硝基咪唑类化合物哌莫硝唑，具有在无氧条件下形成蛋白或核酸与Adduct的特性。低氧下，可以使用特异识别哌莫硝唑的抗体，对经哌莫硝唑处理的组织的低氧区域进行识别。癌组织中离开血管约100μm时，则出现低氧区域，在距离实施例1中得到的癌组织来源细胞块外缘约100μm的范围内，在其内部的低氧区域也观察到了大面积的细胞死亡。

<对体外增殖能力的评价>

体外癌组织来源细胞块的增殖能力，通过下述方法进行验证。将每10个从实施例1得到的癌组织来源细胞块包埋于胶原凝胶(CellMatrixtypeIA(Nitta Gelatin)：5x DMEM(Gibco；12100-038)：凝胶重建用缓冲溶液(50mM NaOH，260mM NaHCO₃，200mM HEPES)＝7∶2∶1)中，在温度37℃、5％CO₂培养箱的培养条件下，在STEMPRO人ES细胞用无血清培养基(Gibco)1cc中进行培养。定期对细胞状态进行观察，用安装有CCD相机的相差显微镜(倍率40倍)测定其大小。结果如图3所示，没有机械分割能够保持至少13天的增殖能力。并且确认，在第13天进行机械分割后，还能够保持至少13天的增殖能力。应予说明，机械分割是使用眼科尖刀将直径500μm的癌组织来源细胞块分成4份。

<细胞数的确认>

采用与实施例1相同的方法，将100～250μm的癌组织来源细胞块用胰蛋白酶0.25％、EDTA2.6mM处理3分钟，通过约30次的移液(pipetting)进行机械分解。以每孔一个细胞的比例，将上述处理液稀释分注在96孔培养板中。对于未单细胞化的细胞块，对构成的细胞数进行计数并记录。然后，进行培养(在与上述相同的条件下)，记录各孔增加的细胞数，进行30天的培养观察。其结果确认，如果有3个细胞则能够成长成细胞块。

<药物敏感性试验>

使用5-FU对实施例2的试样进行药物敏感性试验，已知该5-FU会与作为DNA合成所必须的代谢过程中的胸苷酸合酶结合，来阻碍DNA合成。试验方法如下：将每10个癌组织来源细胞块包埋于胶原凝胶(CellMatrixtypeIA(Nitta Gelatin)：5x DMEM(Gibco；12100-038)：凝胶重建用缓冲溶液(50mM NaOH，260mM NaHCO₃，200mM HEPES)＝7∶2∶1)中，在温度37℃、5％CO₂培养箱的培养条件下，在STEMPRO人ES细胞用无血清培养基(Gibco)1cc中进行培养。然后，使用0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml浓度的5-FU，分别对培养第0天和第8天的状态进行比较评价。其结果如图4所示。关于癌组织来源细胞块的面积的增大率，是将未使用药物培养下的面积的增大率作为1，而进行相对表示的。图4中证实，5-FU能够浓度依赖性地抑制培养第8天的癌细胞增殖，从而证明本发明的癌组织来源细胞块在药物敏感性试验中有效。

<移植到异种动物的试验>

将10个实施例2得到的本发明培养了3天的直径约100μm的癌组织来源细胞块悬浮于基质胶(BD社)中，并移植到NOD-SCID小鼠的背部皮下。通过对肿瘤尺寸进行经时测定，来评价肿瘤的形成。结果发现，在移植有本发明实施例2的癌组织来源细胞块的小鼠个体中有明显肿瘤形成，从而能够确认本发明的癌组织来源细胞块具有很高的肿瘤形成能力。对该组织进行解析，则可知移植到小鼠所形成的肿瘤与生物体内存在的肿瘤具有相似的组织类型(图5)。

<放射线照射试验>

将实施例2得到的本发明所使用的直径约100μm的癌组织来源细胞块包埋到胶原凝胶(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin)：5x DMEM(Gibco；12100-038)：凝胶重建用缓冲溶液(50mM NaOH，260mMNaHCO₃，200mM HEPES)＝7∶2∶1)中，在温度37℃、5％CO₂培养箱的培养条件下，接种10个到STEMPRO人ES细胞用无血清培养基(Gibco)1cc中，进行培养。向其照射以钴的放射性同位素为放射源的γ射线，确认细胞块的状况。其结果如图6所示。图6证实，至培养第8天，可照射量依赖性地抑制癌细胞增殖，从而证明本发明的癌组织来源细胞块在放射线照射试验中有效。

Claims

1.一种癌组织来源细胞块，其是从个体得到的癌组织中以含有3个以上癌细胞的细胞块的形式经分离处理而得到的分离物或其培养物，其中，所述细胞块在体外能够保持增殖能力。

2.如权利要求1所述的癌组织来源细胞块，该细胞块通过包括以下工序的方法获得，即，用含有胶原酶的酶对由个体得到的癌组织进行处理的工序。

3.如权利要求2所述的癌组织来源细胞块，该细胞块通过包括以下工序的方法获得，即，用含有蛋白酶和胶原酶的混合酶对由个体得到的癌组织进行处理的工序，所述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种以上，所述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV中的1种以上。

4.如权利要求3所述的癌组织来源细胞块，其中，所述混合酶为LIBERASE BLENDZYME 1

5.一种癌组织来源细胞块，其含有3个以上的癌细胞集合体且大致呈球形或椭球形。

6.一种癌组织来源细胞块，其含有3个以上的癌细胞集合体、以及存在于该癌细胞集合体外周面的基底膜状物，并大致呈球形或椭球形。

7.如权利要求1至6中任一项所述的癌组织来源细胞块，其实质上不含有癌细胞以外的细胞。

8.如权利要求6或7所述的癌组织来源细胞块，其中，所述基底膜状物为层粘蛋白。

9.如权利要求1至8中任一项所述的癌组织来源细胞块，其直径为40μm～250μm。

10.如权利要求1至9中任一项所述的癌组织来源细胞块，其中所述癌细胞来源于上皮癌细胞。

11.如权利要求10所述的癌组织来源细胞块，其中，所述癌细胞来源于大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、咽喉癌、胰腺癌。

12.一种癌组织来源细胞块的制备方法，其包括：

对从生物体取出的癌组织碎片状物进行酶处理的工序、以及

对该酶处理物中含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序。

13.如权利要求12所述的癌组织来源细胞块的制备方法，该制备方法进一步包括对所述回收的成分进行3个小时以上的培养的工序。

14.如权利要求12或13所述的癌组织来源细胞块的制备方法，其中，所述选择回收是使用筛来进行回收的。

15.如权利要求12至14任一项所述的癌组织来源细胞块的制备方法，其中，所述对含有3个以上癌细胞的细胞块进行选择回收的工序，是对目径为40μm的筛的筛上成分且目径为250μm的筛的筛下成分进行回收的工序。

16.如权利要求12所述的制备方法，其中，所述酶是含有胶原酶的酶。

17.如权利要求16所述的癌组织来源细胞块的制备方法，其中，所述酶为含有蛋白酶和胶原酶的混合酶，所述蛋白酶选自溶组织梭菌中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和分散酶中的1种以上，所述胶原酶选自胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV中的1种以上。

18.如权利要求17所述的癌组织来源细胞块的制备方法，其中，所述混合酶为LIBERASE BLENDZYME 1

19.一种癌组织来源细胞块，其通过权利要求12至18任一项所述的制备方法而得。