CN114717190A

CN114717190A - 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系bpt0713及其应用

Info

Publication number: CN114717190A
Application number: CN202210416101.1A
Authority: CN
Inventors: 龚畅; 林群
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN114717190B

Abstract

本发明公开了一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT0713及其应用，本发明中的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系是从中国人来源建立的，建系时间短，生物遗传性稳定，且目前市面上缺乏人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系，以该人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系作为研究模型，对于了解乳腺叶状肿瘤病人的发病机制、信号通路以及肿瘤的发生、发展或转移有很大的帮助，还可以用于抗乳腺叶状肿瘤的药物的筛选和评估，以及用于制备肿瘤诊断产品。具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。

Description

一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT0713及其应用

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT0713及其应用。

背景技术

乳腺叶状肿瘤是由乳腺间质和上皮组织两种成分组成的纤维上皮性肿瘤，约占乳腺肿瘤的0.3％～1％。根据叶状肿瘤的临床病理特征，WHO将其分为良性、交界性和恶性叶状肿瘤3类。其中，恶性叶状肿瘤较交界性、良性叶状肿瘤生长速度快，侵袭性强。病理检查提示恶性叶状肿瘤血供丰富、肿瘤呈浸润性生长、细胞核异型性明显、核分裂活跃并伴有间质明显过度生长。

目前，在乳腺叶状肿瘤的临床诊断中，空心针穿刺活检阳性率可达83％～93％。然而，化疗、内分泌治疗、靶向治疗、免疫治疗等对乳腺叶状肿瘤的治疗效果均不佳，其主要治疗方式仍为手术治疗。因此，进一步提高乳腺叶状肿瘤术前诊断准确率对后续手术治疗方案的选择显得尤为重要。除此之外，精准化、个体化医疗的不断推广也使得科研工作者不得不探索效率更高、创伤更小、靶点更精准的乳腺叶状肿瘤相关治疗方案。

人乳腺叶状肿瘤的发生、发展机制的研究以及相关临床诊治方案的探索和改进一直都是热点问题，而建立良好的细胞实验模型是开展相关研究的基础之一。提供理想的细胞模型是人乳腺叶状肿瘤相关研究及探索道路中亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一例人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株，以填补目前国内外人群来源的叶状肿瘤细胞系的空缺，本发明的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株能用于研究乳腺叶状肿瘤发生发展机理及相关药物。本发明中的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713，己保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年8月31日；保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:C202182。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株，命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年8月31日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:C202182。

本发明的第二方面，提供如本发明第一方面所述的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的子代细胞。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在建立肿瘤动物或细胞模型中的应用。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在研究肿瘤致病机制、相关信号通路、肿瘤发生、发展或转移中的应用。

本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在制备肿瘤诊断产品中的应用。

本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在开发检测肿瘤相关生物工程产品中的应用。

本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在开发肿瘤药物靶点中的应用。

本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在制备、筛选或评估抗肿瘤药物/试剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤为恶性肿瘤。

在本发明的一些优选实施方式中，所述恶性肿瘤为乳腺恶性叶状肿瘤。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述乳腺恶性叶状肿瘤为人乳腺恶性叶状肿瘤。

本发明的第九方面，提供一种细胞模型，所述细胞模型为本发明第一方面所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株的细胞系。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株，命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713。本发明中的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系是从中国人来源建立的，建系时间短，生物遗传性稳定，且目前市面上缺乏人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系，以该人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系作为研究模型，对于了解乳腺叶状肿瘤病人的发病机制、信号通路以及肿瘤的发生、发展或转移有很大的帮助，还可以用于抗乳腺叶状肿瘤的药物的筛选和评估，以及用于制备肿瘤诊断产品。具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。

附图说明

图1是本发明人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713的形态学观察示意图。

图2是本发明人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713的STR检测结果观察示意图。

图3是本发明人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713的成瘤实验。

图4是BPT-1218与BPT-0713细胞株的体外增殖差异检测。

图5是BPT-1218与BPT-0713细胞株的成瘤差异检测。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的筛选

一、原代组织的制备与检测

1、病人信息概述

该患者，女，诊断为恶性叶状肿瘤，术后病理报告显示临床诊断：(右乳肿物)乳腺叶状肿瘤(复发)，肿瘤边界不清，广泛浸润周围纤维脂肪组织，间质细胞明显过度生长，大部分细胞轻度异型，部分区域细胞增生密集，中度异型，核分裂象约18个/10HPF，考虑为恶性叶状肿瘤。免疫组化结果：间质成分P53约60％中等(+)、CD117部分弱(+)、ER(-)、PR(-)、Her-2(0)、Ki67热点区约30％(+)、CK5/6(-)、P63(-)，上皮成分CK5/6部分(+)、P63肌上皮(+)、ER约95％(+)、PR约95％(+)、Her-2(2+)、Ki67约5％(+)。

2、获得原代细胞的具体步骤

(1)获得新鲜的上述病例的临床手术切除的恶性叶状肿瘤标本，取材严格保证无菌。用组织块放置于10ml玻璃培养皿中，用含10％胎牛血DMEM F12双抗培养液漂洗，去除多余血液及周边结缔组织，用眼科剪将组织剪切成小块(每块约1mm³大小)。

(2)用5mL含10％胎牛血DMEM F12双抗培养液均匀润湿组织小块后，将组织小块用眼科剪剪碎后置于50mL离心管中，加入含1.5mg/mL胶原酶I、1.5mg/mL胶原酶II、6％胰酶的10％胎牛血DMEM F12双抗培养液，置于37℃温箱消化1.5h。

(3)将消化后的细胞悬液用100μM滤网过滤后离心，离心速度1000rpm，8min，升速9，降速9。

(4)离心后弃去上清，用含20％胎牛血DMEM F12双抗培养液重悬后接种于25cm培养瓶中。加入含20％胎牛血DMEM F12双抗培养液后将培养瓶瓶底朝上放置于37℃，5.0％CO₂温箱内静置培养。待细胞贴壁生长，密切观察细胞生长状况，换液。

二、人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的建立

(1)传代

传代培养的具体步骤如下：

用0.25％胰酶消化原代细胞，待细胞变圆终止消化，1000rpm离心3min后，用含20％胎牛血清重完全培养基悬后放入培养瓶中，放置于37℃，5.0％CO₂温箱内静置培养。初期换液采用半换液方法培养，待细胞传代20代之后，采取全换液方法培养，密切观察细胞生长状况。

(2)筛选

待步骤(1)中的细胞生长稳定后，采用反复贴壁法并使用含20％胎牛血DMEM F12双抗培养液进行培养，其目的是为了促进上皮和间质细胞生长，抑制其中纤维细胞生长。之后经反复冻存，以稳定传代100代以上。稳定后用新鲜含20％胎牛血DMEM F12双抗培养液培养。稳定后接种10⁴细胞于12孔板中，贴壁12h后进行慢病毒转染。每孔加入500μl的完全培养基(20％FBS+DMEM/F12)，每孔加入8μl的polybrene(10mg/ml),再加入15μl的TERT病毒(MOI＝30)和15μl的SV40病毒(MOI＝30)，4h后，每孔加入500μl的完全培养基(20％FBS+DMEM/F12)，24小时后，换液，用PBS清洗一遍，加入2ml的完全培养基(20％FBS+DMEM/F12)。培养3天后，换液，每孔加入1ml的完全培养基(20％FBS+DMEM/F12)，每孔加入2μl的Puromycin(10mg/ml)进行筛选。筛选成功后用完全培养基(20％FBS+DMEM/F12+1％的双抗)进行传代培养。得到一株人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株。命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713，己保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年8月31日：保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:C202182。

实施例2人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的鉴定

对实施例1得到的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株进行鉴定，具体包括以下几种方法：

1.人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株细胞形态学鉴定，结果如图1所示，细胞表现为小巢状，或形成富于细胞的片状结构。细胞密度显著增加，细胞出现显著非典型(如细胞核多形性、深染，染色质粗糙，核型不规则)，梭形细胞出现显著核分裂，出现细胞核异型性。

2.人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株STR鉴定，结果如图2、表1和表2所示：

表1STR鉴定结果

表2STR鉴定结果

实施例3人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株成瘤能力实验

1、实验材料和方法

(1)小鼠皮下植瘤：

动物模型种类：BALB/C-nu/nu；

动物实验数量：3只；

饲养环境：SPF级实验室；

注射细胞量：10⁶个BPT0713细胞；

注射方式：皮下注射；

注射部位：右侧第三对脂肪垫。

2、实验结果

细胞成瘤能力动物实验结果为图3：横坐标表示饲养天数，纵坐标表示动物皮下肿物体积。该图3曲线表示在BALB/C-nu/nu小鼠右侧第四对脂肪垫注射10⁶个BPT-0713细胞后，皮下肿瘤随着时间的增长而变大，在肿物直径达到15mm前结束实验。

申请人以专利CN 113293133 A中公开的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株BPT-1218为对比例，检测BPT-1218与BPT-0713的体外增殖差异，结果为图4。分别在96孔板中铺10⁵个BPT-0713细胞、10⁵个BPT-1218细胞，细胞贴壁后每24小时通过CCK8检测并记录。BPT-0713较BPT-1218增殖较快。

申请人以专利CN 113293133 A中公开的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株BPT-1218为对比例，检测BPT-1218与BPT-0713的成瘤差异，结果为图5。分别在BALB/C-nu/nu小鼠右侧第四对脂肪垫处注射10⁶个BPT-0713、10⁶个BPT-1218，每三天测量一次肿瘤大小并记录，皮下肿瘤随着时间的增长而变大，在肿物直径达到15mm前结束实验。BPT-0713较BPT-1218成瘤速度更快，体积更大。BPT-0713较BPT-1218成瘤能力更强。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株，命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系BPT-0713，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年8月31日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:C202182。

2.如权利要求1所述的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的子代细胞。

3.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在建立肿瘤动物或细胞模型中的应用。

4.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在研究肿瘤致病机制、相关信号通路、肿瘤发生、发展或转移中的应用。

5.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在制备肿瘤诊断产品中的应用。

6.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在开发检测肿瘤相关生物工程产品中的应用。

7.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在开发肿瘤药物靶点中的应用。

8.权利要求1所述的人乳腺癌恶性叶状肿瘤细胞株在制备、筛选或评估抗肿瘤药物试剂中的应用。

9.根据权利要求3～8任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤；优选地，所述恶性肿瘤为乳腺恶性叶状肿瘤；更优选地，所述乳腺恶性叶状肿瘤为人乳腺恶性叶状肿瘤。

10.一种细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为权利要求1所述的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株的细胞系。