CN115747139A - 一种多突变的人原代肺癌细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多突变的人原代肺癌细胞株,来源于临床肺腺癌手术切除样本,所述人原代肺癌细胞株命名Lu‑01‑1534,保藏编号为CCTCC NO:C2022167,保藏日期为2022年8月25日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心。Lu‑01‑1534具有EGFR、L858R突变,RET扩增。本发明通过提供一株具有中国人基因特征的细胞株Lu‑01‑1534,可在培养基中进行体外培养,且体外培养生长快速稳定、能连续传代,进而方便建立人肺癌体内模型;免疫缺陷鼠皮下成瘤性好,为药物的体内试验提供了重要的保证,进而为制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种多突变的人原代肺癌细胞株及其应用。
背景技术
肺癌作为目前世界上最常见的癌症类型,是导致与癌症相关疾病死亡率升高的主要原因。严重威胁人类健康和生命。根据临床组织学类型,肺癌可被细分为鳞状上皮癌、腺癌、大细胞未分化癌和小细胞未分化癌这四种不同的类型,而在这四种不同的类型之中,小细胞肺癌无论是从疾病临床表现、中晚期转移程度还是临床治疗原则上,均与其他几种肿瘤类型有所区别,因此,我们将除小细胞肺癌外的这三种不同的肺癌类型总结起来归类统称为非小细胞肺癌。肺腺癌约占非小细胞肺癌的50%。患有肺腺癌的患者5年生存率非常低,大约有75%的患者在临床首次确诊为该疾病时肿瘤已经发展并进入了中晚期。
随着人们认识到肺癌不是突然的转变,而是遗传和遗传表观学逐渐变化的结果,对于肺腺癌相关基因,即驱动基因和抑癌基因的研究取得了一定的进展。比较重要的基因突变包括表皮生长因子(EGFR)基因突变、间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排、c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因重排和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(KRAS)突变,这些生物标志物也被认为是目前必须检测的基因。其中ALK基因重排被认为是肺腺癌患者对奥西替尼产生耐药的关键机制。肺腺癌一旦明确基因突变的类型,其临床鉴别、诊断和后续治疗的选择会变得相对容易。因此,用具有EGFR和ALK基因突变的临床肺腺癌患者的肿瘤组织分离培养人原代肺癌细胞系,对研究肺腺癌发生发展和耐药机制以及筛选治疗肺腺癌的候选药物具有重要作用。
而中国人的肺癌基因图谱和西方人存在明显不同:高的EGFR突变率,低的KRAS突变率,HBV的合并感染多等等。而当前用来进行肺癌研究的细胞均来自外国细胞库,这些细胞已经被研究人员广泛投入研究中,开发出了多种肺癌靶向疗法的药物。但是针对具有中国人基因特征突变的肺癌和耐药性肺癌的治疗亟需具有中国人基因特征的肺癌细胞株。因此,建立具有中国人特征性基因改变的肺癌细胞株对于研究中国人肺癌发生发展机理及筛选个性化的人原代肺癌的候选药物具有必不可少的重要作用,同时,具有中国人基因特征的肺癌细胞可以作为精准化医疗的工具,提高中国肺癌患者的生存期。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株具有中国人基因特征的细胞株Lu-01-1534,为研究病人体内肿瘤的发生、耐药机制及治疗提供良好的体内和体外模型,从而促进肺癌的基础研究、预防及临床治疗。
为解决上述技术问题,本发明提供一种多突变的人原代肺癌细胞株,来源于临床肺腺癌手术切除样本,所述人原代肺癌细胞株命名Lu-01-1534,保藏编号为CCTCC NO:C2022167,保藏日期为2022年8月25日,保藏单位地址为中国武汉武汉大学, 保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
具体的,所述Lu-01-1534具有EGFR、L858R突变,RET扩增。
具体的,所述Lu-01-1534具有RPS6KB2,MST1R,ARHGEF28,ALK,MAP3K14,GLI1,ERBB2,DOT1L,DNMT1,AURKA的原癌基因突变和FAT1,FANCA,TET,RECQL4,HNF1A,MAP3K1,ETAA1,BARD1,CIC,ANKRD11的抑癌基因突变。
本发明还提供了将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌动物模型中的应用。
本发明还提供了将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌微环境模型中的应用。
本发明还提供了将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建3D肿瘤培养体系和类器官体系模型中的应用。
本发明还提供了将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌微环境与肺腺癌进展关系模型中的应用。
本发明构建了一种多突变的人原代肺癌细胞株Lu-01-1534,该细胞系的供体为临床肺腺癌患者,且基因证实具有EGFR、L858R突变,RET扩增。人原代肺癌细胞株Lu-01-1534,可在培养基中进行体外培养,且体外培养生长快速稳定、能连续传代。该细胞系能够在免疫缺陷鼠皮下形成肿瘤,为研究体外和体内肺腺癌的发生、发展和耐药机制研究提供新的试验材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案,下面对本发明所需要使用的附图作简单的介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是显微镜下的人原代肺癌细胞株Lu-01-1534细胞形态图(10X);
图2是人原代肺癌细胞株Lu-01-1534体外生长曲线;
图3是人原代肺癌细胞株Lu-01-1534小鼠皮下肿瘤模型的生长曲线;
图4是人原代肺癌细胞株Lu-01-1534全外显子测序(WES)原癌基因突变Top10;
图5是人原代肺癌细胞株Lu-01-1534全外显子测序(WES)抑癌基因突变Top10;
图6是人原代肺癌细胞株Lu-01-1534基于转录组测序的活跃信号通路及基因集分析。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1.多突变的人原代肺腺癌细胞株Lu-01-1534的建立
1.取材
从湖南肿瘤医院获得新鲜的临床肺腺癌手术切除样本(女,71岁,肺腺癌肿瘤,临床分期IV期,基因诊断EGFR、L858R突变,RET重排(符合伦理学,以及经过患者同意)),立即在无菌条件下将肿瘤组织放入无菌,4℃预冷的组织保护液中,转移到预灭菌的生物安全柜中。
2.样本处理
从离心管中取出组织,快速转移至10cm的培养皿中,并用含双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的PBS清洗2遍,剔除坏死组织以及周围非肿瘤组织,尽可能确保坏死部分不被用于接种。
3.动物体内传代
1)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下,每块组织约30~50mm3,根据病人肿瘤组织的总体大小决定接种数量,每只小鼠接种1~4个点;
2)对于荷瘤小鼠,每周至少观察一次,将达到(400~1000mm3)及时传代并冻存;
3)传代4次~5次之后,选择肿瘤体积达到500~800mm3的小鼠,安乐死并剥取瘤块进行单细胞分离。
4.单细胞制备及传代
1)用含双抗的PBS清洗肿瘤组织,去除结缔组织和坏死组织,然后将组织转移至含有10mL不含胎牛血清的RPMI 1640培养基中,用无菌手术剪将肿瘤样本剪切成小块(1~2mm3大小);
2)将剪碎的组织转移到15mL accumax消化液中,在37℃水浴中孵育1小时,将孵育好的混合物用70μm的滤膜过滤,将滤液收集在50mL离心管中,用30mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基冲洗滤膜,将滤液用1300rpm离心5分钟,去掉上清;
3)用5mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞,并转移到25mm3的培养皿中,分离出的肿瘤细胞在37℃培养箱中培养;
4)当细胞密度达到80-90%时,吸弃培养基,0.5%胰酶消化细胞并接种于新的培养瓶中,进行细胞传代,传代至50代以上,细胞生长良好,形态较为均一;
5)将培养的细胞的培养瓶置于倒置显微镜下,在明视野下进行拍照,结果见图1(10X),可见Lu-01-1534细胞失去了接触抑制,呈恶性生长,具有上皮样细胞特点。
该人原代肺癌细胞株命名为Lu-01-1534,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号为CCTCC No:C2022167,保藏日期为2022年8月25日。
实施例2:人原代肺癌Lu-01-1534细胞株STR检测
短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)又称为微卫星DNA,一般由一个长2~6bp的核心序列经多次串联重复排列而成,重复次数大多在10~60次之间,个体间核心序列的重复次数呈高度变异性,因而一组STR序列的重复次数在不同的个体中几乎是唯一的,是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。收集新鲜培养的人原代肺癌细胞Lu-01-1534细胞,提取细胞的基因组的DNA,用5’端标记的STR引物进行PCR扩增,对所得产物进行测序。其中STR位点的引物序列及拷贝数如表1所示,上述序列和ATCC、DSMZ等细胞库的数据库进行比对,未发现相同STR检测结果,由此可证明其是唯一的,且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。
表1.STR位点拷贝数
实施例3.人原代肺癌细胞株Lu-01-1534细胞体外生长动力学
将Lu-01-1534细胞以6000/孔的密度接种在96孔板中,进行培养,分别在6小时,24小时,48小时,72小时,96小时和120小时使用CellTiter Glo试剂盒测定每孔中的活细胞数,结果见图2。结果显示:细胞扩增速度良好。
实施例4.人原代肺癌细胞株Lu-01-1534细胞体内模型建立
体外培养Lu-01-1534细胞,取对数生长期内的细胞,计数并制备悬液,在NOD SCID小鼠右侧颈背部皮下接种Lu-01-1534细胞,接种体积为0.2mL,接种细胞量为10x106,细胞悬液为PBS加基质胶(体积比为1:1),建立Lu-01-1534皮下异种移植模型,每周2至3次测量并测量小鼠的体重及肿瘤的长(L)和宽(D),根据肿瘤体积计算公式(TV=0.5*L*D*D)来计算肿瘤体积,按照肿瘤体积-时间绘制肿瘤生长曲线,结果如图3所示。
实施例5.人原代肺癌细胞株Lu-01-1534特征基因分析
收取Lu-01-1534细胞,将细胞的基因组DNA进行超声打碎100~200bp,构建DNA文库,进行全外显子测序(WES),检测基因的突变情况;收取细胞裂解收集全部转录的RNA进行mRNA富集,然后反转录为cDNA后进行转录组(RNAseq)测序,分析基因的突变和表达情况。
基于WES测序数据分析,对样本中原癌基因和抑癌基因的突变情况进行统计,原癌基因和抑癌基因引自ONCOKB数据库。原癌基因的突变Top 10结果如图4所示,从结果可以看出,Lu-01-1534具有RPS6KB2,MST1 R,ARHGEF28,ALK,MAP3K14,GLI1,ERBB2,DOT1 L,DNMT1,AURKA原癌基因的突变位点,其中ALK是极具潜力的癌症治疗靶点。
抑癌基因的突变Top 10如图5所示,抑癌基因FAT1,FANCA,TET,RECQL4,HNF1A,MAP3K1,ETAA1,BARD1,CIC,ANKRD11具有多位点的突变。
基于转录组测序得到的基因表达数据,对样本进行基因集变异分析(GSVA分析),寻找特异的信号通路或基因集。分值越高,通路/基因集的活动越活跃。结果如图6所示,从结果可以看出,在TGF-b通路中小细胞肺癌和非小细胞肺癌基因集的活动比较活跃,在EGFR和MET通路活跃度次之。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (7)
1.一种多突变的人原代肺癌细胞株,其特征在于,来源于临床肺腺癌手术切除样本,所述人原代肺癌细胞株命名Lu-01-1534,保藏编号为CCTCC NO:C2022167,保藏日期为2022年8月25日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的人原代肺癌细胞株,其特征在于,所述Lu-01-1534具有EGFR、L858R突变,RET扩增。
3.根据权利要求1所述的人原代肺癌细胞株,其特征在于,所述Lu-01-1534具有RPS6KB2,MST1R,ARHGEF28,ALK,MAP3K14,GLI1,ERBB2,DOT1L,DNMT1,AURKA的原癌基因突变和FAT1,FANCA,TET,RECQL4,HNF1A,MAP3K1,ETAA1,BARD1,CIC,ANKRD11的抑癌基因突变。
4.将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌动物模型中的应用。
5.将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌微环境模型中的应用。
6.将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建3D肿瘤培养体系和类器官体系模型中的应用。
7.将权利要求1所述人原代肺癌细胞株Lu-01-1534在构建肺腺癌微环境与肺腺癌进展关系模型中的应用。
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