CN111876385A - 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111876385A
CN111876385A CN202010770820.4A CN202010770820A CN111876385A CN 111876385 A CN111876385 A CN 111876385A CN 202010770820 A CN202010770820 A CN 202010770820A CN 111876385 A CN111876385 A CN 111876385A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lung cancer
cell model
kras
cell
mouse lung
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010770820.4A
Other languages
English (en)
Inventor
王书宗
董新龙
王晶晶
欧阳雪松
李其翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Crown Bioscience Inc Taicang
Original Assignee
Crown Bioscience Inc Taicang
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Crown Bioscience Inc Taicang filed Critical Crown Bioscience Inc Taicang
Priority to CN202010770820.4A priority Critical patent/CN111876385A/zh
Publication of CN111876385A publication Critical patent/CN111876385A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法及其应用；本发明首先通过特殊培养方法构建永生化小鼠肺癌mLU6054‑KRAS‑G12D细胞模型；然后在此基础上，使用CRISPR‑Cas9基因编辑方法将LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054‑KRAS‑G12D‑MLKBKO的特异型细胞模型；最后通过Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型，使之成为一个稳定可靠的模型，用于KRAS‑G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发。

Description

一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肺癌KRAS 突变细胞模型的构建方法及其应用。
技术背景
据2019年报告显示，2015年全国恶性肿瘤发病约392.9万人，较2014年的380.4万增加12.5万，增长率为3.2％。从发病人数看，肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位，发病人数为78.4万。
2015年全国恶性肿瘤死亡例数约为233.8万例，较2014年的229.6万4.2万，增长率为1.8％。肺癌位居我国恶性肿瘤死亡第1位， 2015年我国因肺癌死亡人数约为63.1万例，死亡率为45.87/10万。
肺癌研究表明，50％的非小细胞肺癌的发生是由于一系列的驱动基因，包括EGFR，KRAS,ALK,Akt,MEK,PI3K,BRAF等。其中最常见的为EGFR和KRAS突变。过去十年里，疾病驱动基因包括 EGFR、ALK、ROS-1和BRAF以及靶向药物研发的进步，非小细胞肺癌的治疗取得了巨大的进展。然而，一个主要驱动基因仍没有相应的靶向治疗药物，那就是KRAS。KRAS基因已证实在约25％的非小细胞肺癌(NSCLC)中扩增，但仍没有成功的靶向KRAS药物临床应用于临床。
而对EGFR的靶向药物治疗中，KRAS如果突变，也会导致耐药性。
所以KRAS的突变细胞模型对于药物研究和开发具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种构建肿瘤细胞模型mLU6054-KRAS-G12D-mLKB1KO工程细胞系的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
1)构建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D细胞模型；
2)使用CRISPR-Cas9基因编辑方法将步骤1中的细胞模型中的 LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特异型细胞模型。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤2 之后还包括步骤3：通过Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤1 具体包括以下详细步骤：
a)处死小鼠：将mLU6054鼠源肺癌移植瘤块的荷瘤小鼠脱颈处死，裸鼠浸泡入75％酒精消毒五分钟，非裸鼠浸泡10分钟；
b)剥取荷瘤：用眼科镊子和剪刀小心剥取瘤，迅速将瘤组织完全浸泡在带双抗的PBS中，并给瘤块编号，称重；
c)处理荷瘤：在6孔板中每孔加入2mL PBS，清洗并尽量剔去筋膜，弃去脓液、坏死及钙化组织，最后移至1.5mL灭菌离心管用剪刀剪碎成1mm3；将瘤块全部移至新的50mL离心管，加入10mL含胶原酶B(2.5mg/mL)和DNaseⅠ(1X)的消化液，37℃摇床50rpm 消化1h，使瘤块充分消化,将消化充分的瘤块和悬液移至70μm筛网上，滤入新的50mL离心管，PBS冲洗筛网并补至50mL，1500rpm 常温离心10min；红细胞较多时需裂红：移去上清，加入5-10mL ACKlysing buffer，常温裂解3-5min后，PBS补至50mL，1500rpm常温离心5min；弃上清，加入50mL PBS，1500rpm常温离心5min，清洗细胞沉淀1次；
d)重悬荷瘤细胞并传代培养：用5-10mL完全培养基重悬肿瘤细胞，并转移至细胞培养瓶进行培养，每隔3天换液，汇合度达到 80-100％时进行传代，传至>P10。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述所述步骤d的传代培养具体包括以下步骤：
每次传代记录代次，并冻存P0、P1、P2、P10细胞；P0冻存3-5 支于一级种子罐中；P1、P2各冻存10支于次级种子罐中；复苏与冻存顺序相反；P2用于将来扩增冻存工作库；冻存P0时瓶瓶取支原体样品，送检时取混合样，有问题时，再送单瓶样品；P0冻存后，若支原体阴性，则着手做SNP测试，以确定是目标鼠源肺癌细胞；鉴定成功后，永生化细胞模型命名为mLU6054-KRAS-G12D。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述mLU6054-KRAS-G12D用DMEM+10％FBS培养基培养。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤2 具体包括以下步骤：
a)设计并合成相应带GFP标记的gRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；
b)转染前准备:
转染前一天，细胞传代准备，用0.25％胰蛋白酶消化KRAS-G12D 细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度并计数后，按照每孔6～8×105cells接种到6孔板中，置于培养箱37℃5％CO2培养； 16h～24h后待细胞密度生长到90％～95％时即可用于转染；转染前0.5-1h，更换无双抗的培养基；
c)转染：转染时，取1.5ml灭菌EP管，按照一定比例取脂质体 Lipofectamine3000溶于200μl的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min；将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀，室温孵育10min后，向6孔板中逐滴缓慢加入DNA-脂质体复合物，置于37℃5％CO2孵箱中孵育过夜；
d)分选：第二天上午移去含DNA-脂质体复合物培养基，更换新的普通培养基培养48h，观察GFP信号并进行单细胞流式分选；
e)鉴定：分选所得单细胞扩大培养后进行Western blot检测目的蛋白表达情况，不表达目的蛋白的细胞株即为敲除成功的单克隆细胞系。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述步骤e 之后，还包括确认步骤：将敲除成功的单克隆细胞系提取DNA进行测序，比对基因组DNA序列突变情况，在DNA水平进一步确认敲除成功。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，所述DNA 测序中所用的引物分别为MKRASF3和MKRASR3；其序列分别为 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
上述一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法在 KRAS-G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发中的应用。
本发明有如下有益效果：
本发明首先通过特殊培养方法构建永生化小鼠肺癌 mLU6054-KRAS-G12D细胞模型。然后在此基础上，使用 CRISPR-Cas9基因编辑方法将LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特异型细胞模型。最后通过 Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型，使之成为一个稳定可靠的模型，用于KRAS-G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建永生化小鼠肺癌 mLU6054-KRAS-G12D细胞模型的流程图；
图2为本发明实施例2中设计并合成相应带GFP标记的用于敲除LKB1基因的gRNA的原理图；
图3为本发明实施例2Western blot检测目的蛋白表达情况；
图4为本发明实施例2中敲除成功的 mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO特异型细胞模型的DNA测序鉴定结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
实施例1
通过特定培养方法构建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D 细胞模型。实验流程见附图1所示：
a)处死小鼠：将mLU6054鼠源肺癌移植瘤块的荷瘤小鼠脱颈处死，裸鼠浸泡入75％酒精消毒五分钟；
b)剥取荷瘤：用眼科镊子和剪刀小心剥取瘤，迅速将瘤组织完全浸泡在带双抗的PBS中，并给瘤块编号，称重；
c)处理荷瘤：在6孔板中每孔加入2mL PBS，清洗并尽量剔去筋膜，弃去脓液、坏死及钙化组织，最后移至1.5mL灭菌离心管用剪刀剪碎成1mm3；将瘤块全部移至新的50mL离心管，加入10mL含胶原酶B(2.5mg/mL)和DNaseⅠ(1X)的消化液，37℃摇床50rpm 消化1h，使瘤块充分消化,将消化充分的瘤块和悬液移至70μm筛网上，滤入新的50mL离心管，PBS冲洗筛网并补至50mL，1500rpm 常温离心10min；红细胞较多时需裂红：移去上清，加入5-10mL ACKlysing buffer，常温裂解3-5min后，PBS补至50mL，1500rpm常温离心5min；弃上清，加入50mL PBS，1500rpm常温离心5min，清洗细胞沉淀1次；
d)重悬荷瘤细胞并传代培养：用5-10mL完全培养基重悬肿瘤细胞，并转移至细胞培养瓶进行培养，每隔3天换液，汇合度达到 80-100％时进行传代，传至>P10。
每次传代记录代次，并冻存P0、P1、P2、P10细胞。P0冻存3-5 支于一级种子罐中。P1、P2各冻存10支于次级种子罐中。复苏与冻存顺序相反。P2用于将来扩增冻存工作库。冻存P0时瓶瓶取支原体样品，送检时取混合样，有问题时，再送单瓶样品。P0冻存后，若支原体阴性，则着手做SNP测试，以确定是目标鼠源肺癌细胞。鉴定成功后，该株细胞建系成功了。
建系成功的永生化细胞系命名为mLU6054-KRAS-G12D，可换用普通DMEM+10％FBS培养基培养。
实施例2
使用CRISPR-Cas9基因编辑方法将步骤1中的细胞模型中的 LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特异型细胞模型。
a)设计并合成相应带GFP标记的用于敲除LKB1基因的gRNA，设计方法为CRISPR-Cas9基因编辑，原理如图2所示，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1＝5’TGTGGACGTGCTGTACAATG3’；
b)转染前准备:
转染前一天，细胞传代准备，用0.25％胰蛋白酶消化KRAS-G12D 细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度并计数后，按照每孔6～8×105cells接种到6孔板中，置于培养箱37℃5％CO2培养； 16h～24h后待细胞密度生长到90％～95％时即可用于转染；转染前0.5-1h，更换无双抗的培养基；
c)转染：转染时，取1.5ml灭菌EP管，按照一定比例取脂质体Lipofectamine3000溶于200μl的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min；将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀，室温孵育10min后，向6孔板中逐滴缓慢加入DNA-脂质体复合物，置于37℃5％CO2孵箱中孵育过夜；所述脂质体的使用比例参考下表1。
表1脂质体使用比例。
Figure RE-GDA0002665606570000081
Figure RE-GDA0002665606570000091
d)分选：第二天上午移去含DNA-脂质体复合物培养基，更换新的普通培养基培养48h，观察GFP信号并进行单细胞流式分选；
e)鉴定：分选所得单细胞扩大培养后进行Western blot检测目的蛋白表达情况，不表达目的蛋白的细胞株即为敲除成功的单克隆细胞系。所述鉴定结果见图3所示，证明LKB1基因成功敲除。
f)进一步确认：将敲除成功的单克隆细胞系提取DNA进行测序，比对基因组DNA序列突变情况，在DNA水平进一步确认敲除成功。所述DNA测序中所用的引物分别为MKRASF3和MKRASR3；其序列分别为SEQ ID NO：2＝5’CAGTCTCAGGGCTGACCTTC 3’和SEQ ID NO：3＝5’ACGTAGGCTGTGCAACCTCT 3’；所述鉴定结果见图 4所示，证明LKB1基因成功敲除。
以上结果说明本发明所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法稳定可靠可以验证，可以用于KRAS-G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中美冠科生物技术(太仓)有限公司
<120> 一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法及其应用
<130> 20200730
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gRNA
<400> 1
tgtggacgtg ctgtacaatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MKRASF3
<400> 2
cagtctcagg gctgaccttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MKRASR3
<400> 3
acgtaggctg tgcaacctct 20

Claims (9)

1.一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D细胞模型；
2）使用CRISPR-Cas9基因编辑方法将步骤1中的细胞模型中的LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特异型细胞模型。
2.根据权利要求1中所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2之后还包括步骤3：通过Western Blot和Sanger测序法鉴定得到细胞模型。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1具体包括以下详细步骤：
a）处死小鼠：将mLU6054鼠源肺癌移植瘤块的荷瘤小鼠脱颈处死，裸鼠浸泡入75%酒精消毒五分钟，非裸鼠浸泡10分钟；
b）剥取荷瘤：用眼科镊子和剪刀小心剥取瘤，迅速将瘤组织完全浸泡在带双抗的PBS中，并给瘤块编号，称重；
c) 处理荷瘤：在6孔板中每孔加入2mL PBS，清洗并尽量剔去筋膜，弃去脓液、坏死及钙化组织，最后移至1.5mL灭菌离心管用剪刀剪碎成1mm3;将瘤块全部移至新的50mL离心管，加入10mL含胶原酶B（2.5mg/ mL）和DNaseⅠ（1X）的消化液， 37℃摇床50 rpm消化1h，使瘤块充分消化,将消化充分的瘤块和悬液移至70μm筛网上，滤入新的50mL 离心管，PBS冲洗筛网并补至50mL，1500rpm常温离心10min;红细胞较多时需裂红：移去上清，加入5-10mL ACKlysing buffer，常温裂解3-5min后，PBS补至50mL，1500rpm 常温离心5min;弃上清，加入50mL PBS ，1500rpm 常温离心5min，清洗细胞沉淀1次；
d)重悬荷瘤细胞并传代培养： 用5-10mL完全培养基重悬肿瘤细胞，并转移至细胞培养瓶进行培养，每隔3天换液，汇合度达到80-100%时进行传代，传至>P10。
4.根据权利要求3所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤d的传代培养具体包括以下步骤：
每次传代记录代次，并冻存P0、P1、P2、P10细胞；P0冻存3-5支于一级种子罐中；P1、P2各冻存10支于次级种子罐中；复苏与冻存顺序相反；P2用于将来扩增冻存工作库；冻存P0时瓶瓶取支原体样品，送检时取混合样，有问题时，再送单瓶样品；P0冻存后，若支原体阴性，则着手做SNP测试，以确定是目标鼠源肺癌细胞；鉴定成功后，永生化细胞模型命名为mLU6054-KRAS-G12D。
5.根据权利要求4所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述mLU6054-KRAS-G12D用DMEM+10%FBS培养基培养。
6.根据权利要求1所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体包括以下步骤：
a）设计并合成相应带GFP标记的gRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO ：1；
b) 转染前准备:
转染前一天，细胞传代准备，用0.25%胰蛋白酶消化KRAS-G12D 细胞，以含10%血清的DMEM培养基调整细胞密度并计数后，按照每孔6～8×105 cells接种到6孔板中，置于培养箱37℃， 5%CO2培养；16h～24h后待细胞密度生长到90%～95%时即可用于转染；转染前0.5-1h，更换无双抗的培养基；
c）转染：转染时，取1.5ml灭菌EP管，按照一定比例取脂质体Lipofectamine3000溶于200μl的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min；将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀，室温孵育10min后，向6 孔板中逐滴缓慢加入DNA-脂质体复合物，置于37℃， 5%CO2孵箱中孵育过夜；
d) 分选：第二天上午移去含DNA-脂质体复合物培养基，更换新的普通培养基培养48h，观察GFP信号并进行单细胞流式分选；
e）鉴定：分选所得单细胞扩大培养后进行Western blot检测目的蛋白表达情况，不表达目的蛋白的细胞株即为敲除成功的单克隆细胞系。
7.根据权利要求6所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤e之后，还包括确认步骤：将敲除成功的单克隆细胞系提取DNA进行测序，比对基因组DNA序列突变情况，在DNA水平进一步确认敲除成功。
8.根据权利要求7所述的一种小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法，其特征在于，所述DNA测序中所用的引物分别为MKRASF3和MKRASR3；其序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3。
9.如权利要求1-8任一项所述的小鼠肺癌KRAS突变细胞模型的构建方法在KRAS-G12D突变引起的肺癌靶向药物的临床前研究和开发中的应用。
CN202010770820.4A 2020-07-30 2020-07-30 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用 Pending CN111876385A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010770820.4A CN111876385A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010770820.4A CN111876385A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111876385A true CN111876385A (zh) 2020-11-03

Family

ID=73210685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010770820.4A Pending CN111876385A (zh) 2020-07-30 2020-07-30 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111876385A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410685A (zh) * 2021-10-20 2022-04-29 浙江大学 Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130338040A1 (en) * 2012-04-16 2013-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill LKB1 Levels and Brain Metastasis from Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC)
US20140134158A1 (en) * 2012-05-22 2014-05-15 Alberto Bardelli Kras mutations and resistance to anti-egfr treatment
CN104988122A (zh) * 2015-01-13 2015-10-21 中国人民解放军第二军医大学 肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130338040A1 (en) * 2012-04-16 2013-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill LKB1 Levels and Brain Metastasis from Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC)
US20140134158A1 (en) * 2012-05-22 2014-05-15 Alberto Bardelli Kras mutations and resistance to anti-egfr treatment
CN104988122A (zh) * 2015-01-13 2015-10-21 中国人民解放军第二军医大学 肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁赛丹: "《实验动物模型制备手册》", 31 March 2019, 上海交通大学出版社 *
常思宇: "KRAS突变型细胞株的构建与鉴定", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》 *
李福明等: "LKB1在非小细胞肺癌可塑性及耐药反应中的重要作用及机制", 《中国细胞生物学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410685A (zh) * 2021-10-20 2022-04-29 浙江大学 Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624561B (zh) 原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用
EP3702458A1 (en) Method for increasing fetal hemoglobin expression level
CN108342480A (zh) 一种基因变异检测质控物及其制备方法
CN104894068A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
CN106566838A (zh) 一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒及其应用
CN107949641A (zh) 用于基因组编辑的crispr/cas9复合物
CN105586320A (zh) 一种重组腺相关病毒及其构建方法和应用
CN114450440A (zh) 用于人类癌症综合功能分析的遗传药典
Owen et al. Novel method of cell line establishment utilizing fluorescence‐activated cell sorting resulting in 6 new head and neck squamous cell carcinoma lines
CN110106150B (zh) 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用
CN107541494B (zh) 一种人胆管癌细胞系及其应用
CN112899233B (zh) 一种急性淋巴细胞性白血病小鼠模型的构建方法
CN111876385A (zh) 一种小鼠肺癌kras突变细胞模型的构建方法及其应用
Wang et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening and identification of potential genes promoting prostate cancer growth and metastasis
CN111235218B (zh) 第三代egfr-tki耐药细胞株及其应用
CN111635912A (zh) 一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用
CN110317878B (zh) 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用
CN106244679A (zh) miR‑100抑制剂在降低癌症转移中的用途
CN113226336A (zh) 一种在细胞中递送基因的方法
CN111876383B (zh) 一种类器官肺癌pdxo模型以及egfr工程化修饰及其在肿瘤药物药效学研究中的应用
CN113234678B (zh) 一种对依托泊苷与卡铂联合耐药的人小细胞肺癌细胞株及其建立方法和应用
CN113549597B (zh) 一种人原发性骨髓纤维化细胞株及其应用
CN113234679B (zh) 一种克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞株及其制备和应用
CN110624115B (zh) 钙网蛋白calr在猪抗病中的应用
CN108707625A (zh) mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201103

RJ01 Rejection of invention patent application after publication