CN104988122A - 肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肾癌舒尼替尼耐药的细胞系及其构建方法与应用。本发明采用人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞与ACHN细胞为对象建立皮下荷瘤裸鼠模型，利用临床常规剂量的舒尼替尼治疗荷瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药物压力筛选，最后分离培养获得了在体内外均不受舒尼替尼抑制的肾癌耐药细胞系，命名为7SuR、ACSuR。本发明建立的肾癌舒尼替尼耐药的细胞系更能模拟临床药物耐药，为研究肾癌靶向药物耐药机制、逆转肾癌细胞耐药性以及开发和评价新的抗癌药物提供了重要的平台。

Description

肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

肾癌约占成人恶性肿瘤的3％，在中国的发病率位居泌尿系肿瘤第二位。其主要病理类型为透明细胞癌，大约30％的患者在诊断时即发现远处转移，术后远处转移的发生率也高达30％～40％。由于肾癌对传统的放、化疗不敏感，以白介素-2、干扰素-α等为基础的细胞因子治疗一度成为晚期肾癌的主要治疗手段，但也仅在不到20％的患者中起效，且有明显的副作用。

近年来出现的以舒尼替尼为代表的小分子靶向药物极大改善了晚期肾癌的治疗前景，其中位无进展生存期是接受细胞因子治疗患者的两倍，总缓解率相比也有显著的提高。舒尼替尼(Sunitinib，Sutent，索坦)是一种小分子多靶点受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，它能够抑制血管内皮生长因子受体-1/2(VEGFR-1/2)，血小板源性生长因子受体(PDGFR)、集落刺激因子受体-1(CSF-1R)、干细胞生长因子受体(c-KIT)、FMS样的酪氨酸激酶3(FLT3)，具有抗血管生成和抗肿瘤活性的双重作用，是肾癌治疗中最常用的小分子靶向药物。

尽管靶向药物能够显著缩减肿瘤体积并延长晚期肾细胞癌患者中位无进展生存期和总生存期，却不能保持持久疗效，多数患者会在治疗开始的5-10月出现耐药甚至进展，因此研究肾癌耐药机制以及防止或逆转肿瘤耐药的发生对于提高靶向治疗效果十分重要，但目前尚缺乏对舒尼替尼耐药的肾癌细胞系，肿瘤耐药细胞系的构建方法也亟待摸索和改进。

而肾癌耐药细胞系的建立对于研究肾癌细胞耐药机制、逆转肾癌细胞耐药性和指导病人用药方面都具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供肾癌舒尼替尼耐药细胞系，本发明的另一目的是提供该肾癌舒尼替尼耐药细胞系的构建方法以及应用。

本发明的主要技术方案是采用人肾癌细胞系786-O与ACHN细胞为对象建立皮下荷瘤裸鼠模型，利用临床常规剂量的舒尼替尼治疗荷瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药物压力筛选，最后分离培养获得了在体内外均不受舒尼替尼抑制的肾癌耐药细胞系7SuR、ACSuR。

本发明提供了一种肾癌舒尼替尼耐药细胞系，该肾癌舒尼替尼耐药细胞系的保藏编号为CCTCC C2014217或CCTCC C2014238。

本发明的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒尼替尼耐药株7SuR(肾癌耐药细胞系7SuR，简称7SuR)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCC C2014217。

本发明的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒尼替尼耐药株ACSuR(肾癌耐药细胞系ACSuR，简称ACSuR)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCC C2014238。

本发明提供了上述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系的构建方法，具体如下：

复苏人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞与ACHN细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO₂孵箱中培养；收集处于对数生长期的人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞与ACHN细胞，以3×10⁶/点，接种于裸鼠两侧肩胛部皮下，建立裸鼠肾癌模型；

待裸鼠移植瘤体积≥200mm³后，将裸鼠随机分为2组，分别为生理盐水组和舒尼替尼组(40mg/kg，灌胃，1次/天，4周)，停药2周后，从肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，为第1代；

将第1代肿瘤细胞3×10⁶/点，再次皮下接种裸鼠，重复前次处理，得到第2代，重复上述方法，最终从第3代移植瘤中分离出肾癌细胞系。

将靶向药物处理组与对照组的第3代肿瘤细胞进行体内外药敏实验，发现前者在靶向药物常规剂量下出现明显的耐药抵抗(在裸鼠体内生长不受舒尼替尼抑制，在体外培养耐受10uM药物浓度)，因此将舒尼替尼持续压力下获得的第3代及其之后代数的肿瘤细胞作为舒尼替尼耐药的肾癌细胞系。

保藏于CCTCC的为第4代细胞。

本发明还提供了两种根据上述构建方法获得的肾癌舒尼替尼耐药细胞系。

所述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，为舒尼替尼持续压力下获得的第3代及其之后代数的肿瘤细胞，为舒尼替尼耐药的肾癌细胞系7SuR、舒尼替尼耐药的肾癌细胞系ACSuR。

本发明所述的耐药细胞系是利用临床常规剂量的舒尼替尼治疗786-O与ACHN荷瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药物压力筛选，最后分离培养获得的。

本发明所述的耐药细胞系在裸鼠体内生长不受舒尼替尼抑制，在体外培养耐受10uM药物浓度。

本发明通过细胞形态学观察、生长曲线及IC50测定、细胞周期的测定、软琼脂克隆形成实验和裸鼠荷瘤实验等，检测肾癌耐药细胞系的生物学特性，从而确定肾癌耐药细胞系7SuR、ACSuR的成功建立。

本发明还提供了肾癌舒尼替尼耐药细胞系在研究肾癌细胞耐药机制中的应用，可通过药物敏感与耐药细胞之间的基因组、表达谱、信号通路活化情况等方面的对比分析，探寻可能导致药物耐药的罪魁祸首。

本发明还提供了肾癌舒尼替尼耐药细胞系在筛选和制备抗肾癌药物中的应用，可利用小分子化合物库，探寻能够逆转舒尼替尼耐药的小分子靶向药物，并在小鼠体内进行临床前期的联合应用治疗。

本发明可用于分析肾癌发生舒尼替尼耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究肿瘤对舒尼替尼耐药的分子机制和逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物、单克隆抗体药物等，具有较高的科研和生产应用价值。

附图说明

图1是建立舒尼替尼耐药小鼠肾癌模型示意图；

图2是光学显微镜下对照和耐药细胞的细胞形态；

图3是对照和耐药细胞的生长曲线图和药物浓度-抑制率曲线，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR；

图4是对照和耐药细胞周期图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR， B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR；

图5是对照和耐药细胞的平板克隆实验图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR；

图6是对照和耐药细胞的软琼脂克隆形成实验图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR；

图7是对照和耐药细胞在裸鼠体内的生长曲线图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR。

本发明的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒尼替尼耐药株7SuR，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCC NO：C2014217。

本发明的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒尼替尼耐药株ACSuR，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCC NO：C2014238。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，而且在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例所用的人肾癌细胞系786-O与ACHN均购自上海中科院；

实施例所用的舒尼替尼为市售的Selleck Chemicals公司的5mg规格的产品。

实施例1：人肾癌细胞系786-O与ACHN裸鼠荷瘤模型的建立

1)、复苏人肾癌细胞系786-O与ACHN细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天换液，细胞生长至密度80％左右时传代扩大培养。

2)、收集处于对数生长期的人肾癌细胞系786-O与ACHN细胞以3×10⁶/点，分别接种于8周龄裸鼠两侧肩胛部皮下，其中786-O接种于左侧肩胛部皮下，ACHN接种于右侧肩胛部皮下。

实施例2：人肾癌细胞系786-O与ACHN荷瘤裸鼠的舒尼替尼治疗和体内连续传代

1)、待裸鼠移植瘤体积达200mm³后，将裸鼠随机分为2组，每组5只荷瘤裸鼠，舒尼替尼组每天灌胃40mg/kg舒尼替尼，对照组每天灌胃等体积盐水，持续4周，停药2周。同时在指定的时间点用游标卡尺分别量取种植肿瘤的长短径。

2)、颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，酒精棉球全身消毒裸鼠，特别是肿瘤接种部位，使用眼科剪剪开裸鼠皮肤，无菌剥离肿瘤组织置于预冷盐水中，准备分离肿瘤细胞。

3)、用无菌手术刀切开肿瘤组织，去除肿瘤包膜和内部的坏死组织，使用眼科剪将剩余组织剪碎，加入胰蛋白酶/II型胶原酶37℃消化30min后过200目细胞筛网，使用完全培养基中和后，900r/min离心3min，加入Tris-NH₄Cl裂解红细胞5min，再次900r/min离心3min，弃上清后加入舒尼替尼终浓度为4uM的DMEM完全培养基于于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天更换新鲜的含药培养基，细胞生长至密度80％左右时传代扩大培养。以此方法所获得的细胞分别为第一代耐受舒尼替尼治疗的肾癌细胞和第一代对照肾癌细胞。

4)、将第1代逃逸舒尼替尼治疗的肾癌细胞和第一代对照肾癌细胞按同样方法分别接种到裸鼠两侧肩胛部皮下，仍然是786-O接种于左侧肩胛部皮下，ACHN接种于右侧肩胛部皮下，成瘤后，重复前次处理。6周后使用同样方法得到第2代耐受舒尼替尼治疗的肾癌细胞和第2代对照肾癌细胞。

5)、以此方法反复在裸鼠皮下接种荷瘤，并进行耐药肿瘤细胞的筛选，经过3轮筛选后，持续使用舒尼替尼治疗的786-O与ACHN肾癌细胞表现出对舒尼替尼耐受的性状，其在裸鼠体内的生长曲线已接近未接受舒尼替尼治疗的肾癌细胞生长曲线(见图7)，并命名为7SuR和ACSuR。

6)、用无菌手术刀切开第3代肿瘤组织，去除肿瘤包膜和内部的坏死组织，使用眼科剪将剩余组织剪碎，加入胰蛋白酶/II型胶原酶37℃消化30min后过200目细胞筛网，使用完全培养基中和后，900r/min离心3min，加入Tris-NH₄Cl裂解红细胞5min，再次900r/min离心3min，弃上清后加 入舒尼替尼终浓度为4uM的DMEM完全培养基于于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天更换新鲜的含药培养基，细胞生长至密度80％左右时传代扩大培养。

最后，将细胞冻存于液氮中，此为建成的舒尼替尼耐药的肾癌7SuR和ACSuR细胞的原始细胞库。

实施例3:对照和耐药细胞的细胞形态学观察

倒置相差显微镜观察活细胞形态：分别取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞，换液后在倒置显微镜(×200倍)下观察活细胞形态并照相。通过光镜可以观察到7SuR较786-O呈明显梭形改变，体积增大；ACHN细胞呈上皮样，大小形态较规则，而ACSuR细胞稍大，形态不规则，呈长伪足的多角形，体积增大出现巨大细胞(如图2所示)。

实施例4：对照和耐药细胞生长曲线与药物浓度-抑制率曲线测定

1)、取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞，用0.5％胰酶消化并计数，按每孔3000个细胞的密度接种入96孔板并设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养0h,24h,48h,72h,96h；于各时间点吸弃培养基，每孔各加100μL CCK8工作液，在培养箱中孵育1小时后，放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，以时间为横坐标、某时间点OD平均值与0h时间点OD平均值的比值为纵坐标，绘制生长曲线。

2)、取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞，用0.5％胰酶消化并计数，按每孔5000个细胞的密度接种入96孔板，加入舒尼替尼至终浓度依次为0、0.01、0.1、1、10、100uM，每种药物浓度设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72h后吸弃培养基，每孔各加100μL CCK8工作液，在培养箱中孵育1小时后，放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，以药物浓度为横坐标、某浓度组OD平均值与0uM浓度组的OD平均值的比值为纵坐标，绘制药物浓度-抑制率曲线。

检测亲本和耐药细胞的生长状态后发现耐药细胞系7SuR和ACSuR表 现出较亲本细胞系786-O与ACHN的更高的耐药增殖能力，其耐药IC50可达亲本细胞的10倍(如图3所示)。

实施例5：对照和耐药细胞的细胞周期分析

1)、取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞分别种于6孔板中，不含血清的DMEM同步化12h后，换为10％FBSDMEM，在48h消化收集细胞，用70％的乙醇固定细胞，置4℃保存待测；

2)、流式细胞仪分析之前，1000×g离心10min去除固定液，并使用碘化丙啶(PI)染色，至流式细胞仪分析，细胞周期分析软件Modifit 2.0处理结果。

分析结果显示：耐药细胞较对照细胞周期分布发生明显改变，其主要改变表现为耐药细胞系7SuR和ACSuR的G0/G1期细胞明显增多，而S期明显减少(结果如图4所示，数据如表1所示)。

表1：786-O，ACHN细胞和相应耐药细胞7SuR，ACSuR的细胞周期分析

实施例6：对照和耐药细胞的平板克隆实验图

1)、取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞，用0.5％胰酶消化吹打成单细胞并计数，按每孔3000个细胞的密度接种入6孔板并设2个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养7-10天；

2)、当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清，用盐水小心清洗2次，加4％多聚甲醛固定细胞15-30分钟。弃去固定液，盐水洗1次后加适量0.1％结晶紫染色液染10～15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥后拍照记录。

结果如图5所示，与对照细胞相比较，耐药细胞在相同浓度舒尼替尼处理下克隆或集落形成能力明显提高。

实施例7：对照和耐药细胞的软琼脂克隆形成实验图；

1)、将1.3％低熔点琼脂糖与2×DMEM以1:1的体积比混合制备0.65％的底层琼脂，12孔板中每个孔1ml室温凝固后4℃备用；

2)、取对数生长期的786-O与ACHN对照细胞和7SuR和ACSuR耐药细胞，用0.5％胰酶消化吹打成单细胞并计数，将0.8％低熔点琼脂糖与含有细胞和不同浓度舒尼替尼的2×DMEM以1:1的体积比混合，制备0.4％的上层琼脂，每孔加1ml室温凝固；

3)、每3天1次在上次琼脂上添加含10％FBS的DMEM，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2-4周，当琼脂中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；

4)、弃去上清，用含醋酸的双蒸水浸泡5分钟，待琼脂微黄用盐水清洗后加适量中性红染色液染45分钟，弃去染色液后拍照记录；

结果如图6所示，与对照细胞相比较，耐药细胞在相同浓度舒尼替尼处理下仍具有较强克隆形成能力，显示耐药细胞体现了更高的恶性程度。

实施例8：对照和耐药细胞在裸鼠体内的生长曲线图

1)、取对数生长期的786-O对照细胞和7SuR耐药细胞，3×10⁶/点，分别接种于8周龄裸鼠两侧肩胛部皮下(786-O左侧7SuR右侧)。

2)、待裸鼠移植瘤体积达200mm³后，将裸鼠随机分为2组，每组4只荷瘤裸鼠，每天灌胃40mg/kg舒尼替尼或溶剂，持续4周，停药2周。同时在指定的时间点用游标卡尺分别量取移植瘤的长短径。7周后颈椎脱臼处死小鼠，拍照，并取相应肿瘤标本保存。

3)、ACHN对照细胞和ACSuR耐药细胞同时进行上述相同实验。

结果如图7所示，与对照细胞形成的移植瘤相比，耐药细胞形成的移植瘤的生长不受舒尼替尼的抑制，进一步证明了耐药细胞在体内对舒尼替尼的抵抗特性。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.肾癌舒尼替尼耐药细胞系，其保藏编号为CCTCC C2014217或CCTCC C2014238。

2.根据权利要求1所述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，该耐药细胞系在裸鼠体内生长不受舒尼替尼抑制，在体外培养耐受10uM舒尼替尼浓度。

3.如权利要求1或2所述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A)复苏人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞或ACHN细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO₂孵箱中培养；收集处于对数生长期的人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞或ACHN细胞，以3×10⁶/点，接种于裸鼠两侧肩胛部皮下，建立裸鼠肾癌模型；

B)待裸鼠移植瘤体积≥200mm³后，给予裸鼠舒尼替尼40mg/kg，灌胃，1次/天，4周；停药2周后，从肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，为第1代肿瘤细胞；

C)将第1代肿瘤细胞3×10⁶/点，接种于裸鼠两侧肩胛部皮下，重复步骤B的方法，得到第2代肿瘤细胞、第3代肿瘤细胞；从第3代及其之后代数的移植瘤中分离出肾癌舒尼替尼耐药细胞系。

4.如权利要求1或2所述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系在研究肾癌细胞耐药机制中的应用。

5.如权利要求1或2所述的肾癌舒尼替尼耐药细胞系在筛选或制备抗肾癌药物中的应用。