CN105412059A - 没食子酸乙酯在治疗骨肉瘤方面的新用途 - Google Patents

Abstract

尽管没食子酸乙酯的作用陆续被研究学者发现，但其在治疗骨肉瘤，特别是U2-OS型骨肉瘤方面的研究仍未见报道。本发明公开了一种没食子酸乙酯的新用途，尤其是在治疗U2-OS型骨肉瘤作用的用途没食子酸乙酯在应用到治疗骨肉瘤方面，没食子酸乙酯在高、中、低剂量下对骨肉瘤均有不同程度的抑制作用，且随着时间的推移，高浓度时治疗效果优于现在市场上的药物5-氟尿嘧啶（二者相同浓度），具备成为替换5-氟尿嘧啶治疗骨肉瘤的可能。

Description

没食子酸乙酯在治疗骨肉瘤方面的新用途

技术领域

本发明涉及一种没食子酸乙酯的药物应用，尤其是在治疗U2-OS型骨肉瘤作用的药物的用途。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的恶性肿瘤，其发病率在原发性骨恶性肿瘤中占居首位。骨肉瘤患者中75%为青少年,男性患者是女性患者的1.5倍，其恶性程度甚高,容易发生早期肺转移,预后极差,既往一经发现多采取截肢手术治疗,即便如此,患者术后5年存活率也仅为5-20%,这为患者及其家庭带来极大的精神伤害,也为社会乃至国家都带来沉重的经济负担。目前保肢手术辅以大剂量化疗逐步成为骨肉瘤的首选治疗方案,但仍有20-40%患者死于转移。

在前期研究中，我们从二色补血草中分离得到了没食子酸乙酯，其又称3,4,5-三羟基苯甲酸乙酯，英文名称是Ethylgallate，除了存在于二色补血草中，很多植物如狼毒大戟，赤芍，翻白草，亮叶围涎树，美丽芍药，南天竹种子，芡实，中华补血草，泽漆，窄叶芍药以及鸡尾木等植物中也发现了其的存在。它不仅以天然产物形式存在于多种植物中，也可以方便的被合成。

没食子酸乙酯除了用作油脂的抗氧化剂、食品添加剂及某些药品的中间体，还发现对小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12有一定的抑制作用，对结肠癌LOVO细胞、肺癌A549细胞、口腔鳞癌CAL-27细胞的生长均具有一定的抑制作用，体外可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、运动以及黏附能力，对过氧化氢造模的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的氧化损伤模型，具有一定的保护作用。

尽管没食子酸乙酯的作用陆续被研究学者发现，但其在治疗骨肉瘤，特别是U2-OS型骨肉瘤方面的研究仍未见报道。

发明内容

本发明旨在提供一种没食子酸乙酯的新的药物应用用途，尤其是在治疗U2-OS型骨肉瘤作用的药物的用途。

本发明中所用PBS缓冲液配制方法如下：8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO4，0.20gKH₂PO4，加超纯水至1000mL，调节PH7.2-7.4，高压高温（121℃）灭菌20min，4℃冷藏备用。

本发明中所用胰酶配制方法如下：称取胰蛋白酶粉0.50g和EDTA1g，溶于200mLPBS缓冲液中。低温下搅拌4h，充分溶解后，调整PH7.2-7.4。0.22μm滤膜过滤除菌，用15mL试管分装，-20℃冻存备用。

本发明中所用RPMI1640培养基配制方法如下：将RPMIMedium1640固体粉末培养基6.75g溶于500mL超纯水中，加入32.5mg青霉素、50mg链霉素、1gNaHCO₃，充分溶解；0.22μm滤膜过滤除菌，在超净工作台内向100mL瓶分装，每瓶85mL，4℃冷藏备用。使用时每瓶加入10mL马血清、5mL胎牛血清，配置成15%培养基。

本发明中所用MTT配制方法如下：称取20mgMTT于5mL试管中，加入4mLPBS缓冲液，使用涡旋仪使其完全溶解，即成5mg/mLMTT液；用0.22μm微孔滤器除菌后-20℃冷冻保存。

本发明中所用酸液配制方法如下：称取120g重铬酸钾加入1000mL超纯水中，加热辅助使其完全溶解；将该溶解液缓慢加入200mL浓硫酸中，并不断搅拌，至其冷却。

本发明的步骤如下：

1、细胞株复苏：在敞口瓶中加入蒸馏水，放入38℃恒温水槽中，待其温度恒定后将冻存于-198℃液氮中的细胞取出，快速放入敞口瓶中，晃动，使冻存管内液体于1-2min内溶化。用酒精棉擦拭冻存管，放入工作台内，将细胞液吸入15mL试管内，同时加入10mL该细胞株的新鲜培养基，1000rpm离心4min。弃去上清液，移液枪注入1mL新鲜培养基吹打分散后，注入已装有7mL新鲜培养基的培养瓶内，轻旋盖子，于CO₂培养箱内培养。

2、细胞换液：将细胞培养瓶拧紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用移液枪吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取8mL新鲜培养基注入培养瓶内，盖上盖子，观察细胞状态。酒精擦拭瓶身及瓶口后放入培养箱内。

3、细胞消化：将细胞培养瓶拧紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将该消化后液体移入10mL试管中，旋紧盖子，1000rpm离心4min，弃去上清液。用移液枪吸取2mLPBS注入试管中，1000rpm离心4min，弃去上清液。

4、细胞传代：将消化好的细胞用移液枪注入2mL新鲜培养基，并吹打分散后，分别吸取1mL液体移入已装有7mL新鲜培养基的培养瓶中，旋紧盖子，放入CO₂培养箱中培养。

5、细胞计数：将上述消化好的细胞，用移液枪注入4mL新鲜培养基，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。

计数原则：以细胞格线为准。记上不记下，计左不计右。

计算公式：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×10⁴个。

6、MTT测定法：实验前先将96孔板于超净工作台中，紫外灯照射3h。将上述已经细胞计数的细胞悬液，加入一定的培养基稀释，调整细胞浓度为5000个/100μL。用移液枪吸取200μL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。

培养12h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200μL移液枪将孔内的培养基吸出，加入不同浓度的含药物的培养基培养，每孔200μL。盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。

培养24、48h、60或72小时后于超净工作台中每孔加入10μLMTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570nm下读数。

7、计算公式：肿瘤细胞生长抑制率%=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%

8、实验模型设置:实验组：将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组：只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组：含有一定浓度阳性药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组：含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步进行描述，但其不代表为本发明的唯一实施方式。

实施例1：经过复苏的U2-OS型骨肉瘤细胞株，在培养过程中，根据需要进行细胞换液，在细胞贴壁生长面积达到细胞瓶底部的80%后，倒掉培养基，用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将该消化后液体移入10mL试管中，旋紧盖子，1000rpm离心4min，弃去上清液。用移液枪吸取2mLPBS注入试管中，1000rpm离心4min，弃去上清液，进行细胞传代，将消化好的细胞用移液枪注入2mL新鲜培养基，并吹打分散后，分别吸取1mL液体移入已装有7mL新鲜培养基的培养瓶中，旋紧盖子，放入CO₂培养箱中培养。经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100μL。用移液枪吸取200μL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200μL移液枪将孔内的培养基吸出，加入100μg﹒mL^-1、20μg﹒mL^-1、4μg﹒mL^-1的含药物的培养基培养，每孔200μL。盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养24h后于超净工作台中每孔加入10μLMTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570nm下读数。计算公式：肿瘤细胞生长抑制率%=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%，实验模型设置:实验组：将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组：只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组：含有100μg﹒mL^-1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组：含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示：阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100μg﹒mL^-1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为35.1%，没食子酸乙酯在100μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为22.5%，在20μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为18.4%，在4μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为10.3%。

实施例2：经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100μL。用移液枪吸取200μL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200μL移液枪将孔内的培养基吸出，加入100μg﹒mL^-1、20μg﹒mL^-1、4μg﹒mL^-1的含药物的培养基培养，每孔200μL。盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养48h后于超净工作台中每孔加入10μLMTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570nm下读数。计算公式：肿瘤细胞生长抑制率%=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%，实验模型设置:实验组：将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组：只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组：含有100μg﹒mL^-1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组：含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示：阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100μg﹒mL^-1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为66.6%，没食子酸乙酯在100μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为53.8%，在20μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为24.9%，在4μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为13.7%。

实施例3：经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100μL。用移液枪吸取200μL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200μL移液枪将孔内的培养基吸出，加入100μg﹒mL^-1、20μg﹒mL^-1、4μg﹒mL^-1的含药物的培养基培养，每孔200μL。盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养60h后于超净工作台中每孔加入10μLMTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570nm下读数。计算公式：肿瘤细胞生长抑制率%=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%，实验模型设置:实验组：将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组：只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组：含有100μg﹒mL^-1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组：含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示：阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100μg﹒mL^-1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为68.0%，没食子酸乙酯在100μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为73.8%，在20μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为30.6%，在4μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为23.5%。

实施例4：经传代后的细胞，倒掉培养基，用加样器吸取2mLPBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将上述消化好的细胞，用新鲜培养基稀释，并吹打分散，吸取细胞悬液少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。静置几分钟后，于倒置显微镜下观察，计数细胞板中四个大格细胞总数。调整细胞浓度为5000个/100μL。用移液枪吸取200μL的细胞悬液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中间的6行10列，共60个孔。96孔板的四周加入PBS缓冲液，防止边缘效应。盖上盖子，并记录日期和时间，酒精喷板后，放入培养箱中培养。培养12h后于倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，酒精喷板，放入超净工作台中，用200μL移液枪将孔内的培养基吸出，加入100μg﹒mL^-1、20μg﹒mL^-1、4μg﹒mL^-1的含药物的培养基培养，每孔200μL。盖上盖子，于倒置显微镜下观察，酒精喷板，放入培养箱中。培养72h后于超净工作台中每孔加入10μLMTT，盖上盖子，酒精喷板后放入培养箱中培养。4h后用移液枪吸出孔内液体，每孔加入150μLDMSO，振摇均匀后，放入酶标仪中，570nm下读数。计算公式：肿瘤细胞生长抑制率%=（OD对照-OD样品）/OD对照×100%，实验模型设置:实验组：将试验药物用DMSO溶解，然后用培养基稀释使DMSO最终浓度为0.5%。每个单体化合物设三个剂量组，每个计量样品做3个孔的平行实验。空白实验组：只含有培养基，每块96孔板中留有3个孔的平行实验。阳性对照组：含有100μg﹒mL^-1浓度阳性药物5-氟尿嘧啶（5-FU）的培养基，每块96孔板中有3个孔的平行实验。阴性对照组：含有0.5%DMSO的培养基，每个样品做3个孔的平行实验。结果显示：阴性对照对U2-OS骨肉瘤细胞没有任何抑制作用，阳性对照100μg﹒mL^-1浓度的5-氟尿嘧啶对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为70.0%，没食子酸乙酯在100μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为83.8%，在20μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为40.6%，在4μg﹒mL^-1时对U2-OS骨肉瘤细胞的抑制率为33.5%。

首次将没食子酸乙酯应用到治疗骨肉瘤方面，没食子酸乙酯在高、中、低剂量下对骨肉瘤均有不同程度的抑制作用，且随着时间的推移，高浓度时治疗效果优于现在市场上的药物5-氟尿嘧啶（二者相同浓度），具备成为替换5-氟尿嘧啶治疗骨肉瘤的可能。

Claims (3)

1.没食子酸乙酯在治疗骨肉瘤方面的新用途，其特征在于：骨肉瘤为人U2-OS型。

2.根据权利要求1所述的没食子酸乙酯，其特性在于：没食子酸乙酯单体化合物及其一切制剂类型。

3.根据权利要求2所述的一切制剂类型，其特征在于：以没食子酸乙酯为原料，以国家批准的可用作制剂的材料为辅料，以不同配比制成的液体剂型、固体剂型、半固体剂型、气体剂型。