CN102389412B - 一种治疗白内障的滴眼液 - Google Patents
一种治疗白内障的滴眼液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102389412B CN102389412B CN2011103414058A CN201110341405A CN102389412B CN 102389412 B CN102389412 B CN 102389412B CN 2011103414058 A CN2011103414058 A CN 2011103414058A CN 201110341405 A CN201110341405 A CN 201110341405A CN 102389412 B CN102389412 B CN 102389412B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dendrophnol
- group
- syringic acid
- dimethoxy
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及含有机有效成分的医药配制品,具体涉及一种治疗白内障的滴眼液,该滴眼液为水溶液,其特征在于,其中具有浓度为2.25g/1000ml~3g/1000ml的有效成分,该有效成分由3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸组成,二者的质量配比为3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄∶3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸=1∶0.2~5。本发明所述的治疗白内障的滴眼液的治疗效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及含有机有效成分的医药配制品,具体涉及含有酚类机有效成分的医药配制品。
背景技术
白内障是一种发病率、致盲率均居当今世界眼病之首的眼病。有关白内障的致病机理目前还没有统一认识,但人们认为白内障与晶状体蛋白变性有密切关系。对于白内障的治疗有药物治疗和手术治疗。手术治疗存在一定的风险,一是手术后的创伤修复,残留在晶状体上皮细胞(LEC)反弹性增殖、移行,会再次形成白内障即“二次白内障”,越来越多的白内障病人属于早期发展或等待手术或手术不成功的范畴;二是一些老年患者常伴有其他疾病如糖尿病、高血压、心脏病等,不愿意手术治疗,希望通过药物防治来提高生存质量;三是手术费用相对较贵,难以解决低收入患者、偏远地区患者的需求。
药物治疗分为西药和中药。目前,西医白内障治疗的药物一般有以下几类:①辅助营养类药如利眼明、Colin-rosol等;②与醌类学说有关的药物如卡他林、法克林、白内停、治障宁等;③抗氧化损伤药物如谷光甘肽、硫拉、SOD等;④其他类如腮腺素、仙诺特、视明露等。我国传统中药治疗则通过全身辨证施治,早期白内障,对肝肾两亏者予补益肝肾,方选杞菊地黄丸或石斛夜光丸;脾虚气弱者予补脾益气,方选补中益气汤;肝热上扰者予清热平肝,方选石决明散;阴虚挟湿热者予滋阴清热,宽中利湿法,方选甘露饮。但是上述治疗药物只能延缓病情的发生、发展,效果仍不理想。因此,研制疗效确切、安全高效的治疗白内障药物十分必要。
上述石斛夜光丸中的石斛为名贵中药材,我国传统医学认为它具有明目等功效,《秘传眼科七十二症全书》记载“石斛,味辛,性寒,明盲目”,《本经》记载石斛具有“补五脏虚劳嬴瘦,强阴……”,《本草纲目拾遗》中记载“除虚热,生津……,滋阴褪障……”。现代研究表明,石斛含多种酚类化合物,如下式(I)所示的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄(即石斛酚)如下式(II)所示的3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸是其中两种。公开号为CN102058567A的发明专利申请公开了3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄治疗白内障的用途;环球中医药2010年5月第3卷第3期第187-189和197页发表了一篇题为《石斛提取的丁香酸对氧化条件下人类晶状体上皮细胞增殖的影响》的文章,该文证实了丁香酸,即3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸对人类晶状体上皮细胞具有良好的保护作用,可用于治疗白内障。但是,本发明人分别对上述(I)式和(II)式化合物的深入研究发现,二者单独使用的效果均不十分理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种治疗白内障的滴眼液,该滴眼液的有效成分具有显著的协同增效作用。
本发明解决上述问题的技术方案为:
一种治疗白内障的滴眼液,该滴眼液为水溶液,其特征在于,其中具有浓度为2.25g/1000ml~3g/1000ml的有效成分,该有效成分由3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸组成,二者的质量配比为3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄∶3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸=1∶0.2~5。
本发明所述的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸可以采用常规的方法从中药石斛或其它植物中提取得到,也可以由合成或其他方法制得。
本发明所述的滴眼液,由于所述的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸的苯环与AR形成π-π共轭键,比公知的AR抑制剂与AR结合形成的氢键更稳定;抑制AR的性能更强;其次,所述的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄与3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸和AR的氨基酸残基之间形成广泛的范德华力,增强两者与AR的结合能力,从而增强抑制性能;再者,所述的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄与3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸抑制AR时形成共同的药效团,3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸的3位苯环的甲氧基中的氧和3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄右苯环5′位上甲氧基中的氧形成氢键受体,氢键供体为3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸连接3位苯环的甲氧基中的氢,3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸、3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄上的苯环共同形成疏水力,同样增强两者与AR的结合能力,从而提高抑制AR的性能。由上面的分析可见,本发明所述的3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸具有显著的协同增效作用。另外,本发明所述有效成分除直接抑制AR、iNOS的活性外,还可抑制晶状体上皮细胞(LEC)AR和iNOS的基因表达,减少LEC中AR和iNOS量,间接降低渗透压和减轻氧化损伤,从而增强治疗白内障的效果。
附图说明
图1为石斛酚与丁香酸联合组、石斛酚组、丁香酸组对HLEC增殖影响显微图片(×25),其中,A图为正常对照组,B图为模型组,C图为石斛酚组D图为石斛酚与丁香酸联合组,E图为丁香酸组。
图2为石斛酚与丁香酸联合组、石斛酚、丁香酸对离体培养的大鼠晶状体干预24h后浑浊度比较的显微图片(×25)。
图3为大鼠晶状体iNOS mRNA表达的凝胶电泳图,其中,泳道A为正常对照组,泳道B为模型对照组,泳道C为石斛酚组,泳道D为丁香酸组,泳道E为石斛酚与丁香酸联合组。
图4为大鼠晶状体AR mRNA表达的凝胶电泳图,泳道A为正常对照组,泳道B为模型对照组,泳道C为石斛酚组,泳道D为丁香酸组,泳道E为石斛酚与丁香酸联合组。
具体实施方式
为了便于描述以下将,化合物3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄简称为石斛酚,化合物3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸简称为丁香酸。
例1(石斛酚的制备)
石斛酚提取方法为现有技术,本发明人参照文献(张朝凤,邵莉,王磊,等.兜唇石斛酚类化学成分研究[J].中国中药杂志,2008,33(24):2922~2925。杨莉,谷丽华,王峥涛,等.叠鞘石斛中联苄类成分的定性定量分析[J].中国药学杂志,2007,42(21):1620~1623.)的报导制备石斛酚,具体实施过程如下:
干燥叠鞘石斛切碎打成粗粉,用95%乙醇加热回流提取2~3次,每次加乙醇量为12000ml/kg药材,回流约2小时,合并药液后抽滤,将滤液浓缩至无乙醇味,得浸膏,加水混悬后,用等体积乙酸乙酯萃取3次,回收溶剂得乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱,用石油醚-乙酸乙酯(石油醚∶乙酸乙酯的配比分别为100∶0,100∶1,50∶1,100∶3,25∶1,20∶1,15∶1,12∶1,10∶1,9∶1,8∶1,6∶1)溶剂系统进行梯度洗脱,收集石油醚-乙酸乙酯(9∶1)洗脱部分;该部分经过反复硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯洗脱冲掉其他物质后,用氯仿-甲醇梯度洗脱分离纯化得到淡黄色油状物。所得到的淡黄色油状物TLC喷洒2%硫酸香草醛试剂显红色。
淡黄色油状物化合物鉴定为石斛酚:紫外有吸收有四个吸收峰,分别在206nm,224nm,274nm和300nm有最大吸收,其中300为肩峰;在IR中有5个主要的吸收峰,分别在3500(OH),2900,1600,1520(C-H)和1220cm-1(C-O-C)。在1HNMR有两个甲氧基信号分别在δ3.77和δ3.85,一个等位苯甲基质子信号在δ2.83,及六个芳香族信号δ6.81(1H,d,J=9Hz,3”-H)、δ6.77(1H,dd,J=2 and 9Hz,2”-H)、δ6.65(1H,d,J=2Hz,6”-H)和δ6.29(3H,brs,A-ring protons);两个羟基信号在δ5.57和由D2O转换确定。且在质谱中有一个离子峰[M]+在m/z274(C16H18O4)和一个基峰在m/z 137。经与文献数据对照(Juneja R.K.,Sharma S.C.,Tandon J.S.A substituted 1,2-diarylethane from Cymbidium giganteum[J].Phytochemistry,1985,24(2):321~324.),化合物鉴定为3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄(石斛酚)。
下述实施例3~5所述的滴眼液使用本例所制得的石斛酚。
例2(丁香酸的制备)
丁香酸提取方法也为现有技术,本发明人参照文献[张雪,高昊,王乃利,等。金钗石斛中的酚性成分[J].中草药,2006,37(5):652-655。张雪1,续洁琨,王乃利,等。金钗石斛中联苄类和酚酸类成分的抗氧化活性研究[J].中国药学杂志,2008,43(11):829-832.邵莉,黄卫华,张朝凤,等.兜唇石斛的化学成分研究.中国中药杂志,33(14):1693-1695.]的报道制备丁香酸。具体实施过程如下:
金钗石斛的干燥茎5kg,用10倍量体积分数60%乙醇加热回流2次,每次2h,合并提取液,减压回收溶剂,浓缩后得到浸膏。将浸膏混悬于10倍量水中,用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次,减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。对乙酸乙酯萃取物运用硅胶柱色谱,用石油醚-乙酸乙酯(石油醚∶乙酸乙酯的配比分别为100∶0,100∶1,50∶1,100∶3,25∶1,20∶1,15∶1,12∶1,10∶1,9∶1,8∶1,6∶1)溶剂系统进行梯度洗脱,收集石油醚-乙酸乙酯(15∶1)洗脱部分;该部分经过反复硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯洗脱冲掉其他物质后,用甲醇梯度洗脱分离纯化得到无色针晶。鉴定为丁香酸。
下述实施例3~5所述的滴眼液均使用本例所制得的丁香酸。
例3(本发明所述滴眼液)
(1)处方:
石斛酚1.00g,丁香酸1.25g,羧甲纤维素钠2.1g,对羟基苯甲酸乙酯0.31g,氯化钠9.8g。
(2)制备方法:
取羧甲纤维素钠溶于适量的注射用水中,过夜使其溶解,用布氏漏斗垫200目尼龙布过滤,备用;将对羟基苯甲酸乙酯加入少量注射用水中,加热使溶解,备用;将氯化钠加入适量注射用水中,加热溶解,备用;
取羧甲纤维素钠置于水浴上加热煮沸,在搅拌下加入石斛酚和丁香酸,搅拌均匀后加入所制备的对羟基苯甲酸乙酯溶液、氯化钠溶液,加注射水至1000ml,充分搅拌均匀;用200目尼龙布垫于布氏漏斗上减压过滤,灌装于容器中,密封,用流通蒸汽100℃灭菌30min,分装于洗净灭菌的滴眼瓶中,严封即得。
(3)用法和用量:
滴眼,每天3次,每次1~2滴,一疗程30天。
例4(本发明所述滴眼液)
(1)处方:
石斛酚0.5g,丁香酸2.5,硼砂0.100g,硼酸19.500g,依地酸二钠0.10g,羟苯甲脂0.25g,羟苯丙脂0.16g,PVP-K30 20.00g。
(2)制备方法:
取羟苯甲脂、羟苯丙脂加入适量注射用水中,加热、搅拌使溶解,备用;取硼酸、硼砂加入少量注射用水中,加热使溶解,然后依次加入依地酸二钠、石斛酚、丁香酸并溶解,将此溶液加入到所制备的羟苯甲脂与羟苯丙脂混合溶液中,加入PVP-K30并溶解,加注射水至1000ml,充分搅拌均匀,灌于容器内密封,以100℃流通蒸汽灭均30min,分装于洗净灭菌的滴眼瓶中,严封即得。
(3)用法和用量:
滴眼,每天2-3次,每次1-2滴,一疗程30天。
例5(本发明所述滴眼液)
(1)处方:
石斛酚2.50g,丁香酸0.5,硼砂6.12g,硼酸7.33g,对羟基苯甲酸乙酯0.23g,氯化钠7.22g。
(2)制备方法:取硼酸、硼砂加入适量注射用水中,加热使溶解,加入石斛酚、丁香酸、氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯搅拌溶解,煮沸15min,搅拌,混合均匀、放冷;用硼砂水溶液(1∶20)调节pH至6.0~7.0,氯化钠调成等渗后,过滤灭菌,补充水量至1000ml,充分搅拌均匀,分装于洗净灭菌的滴眼瓶中,严封即得。
(3)用法和用量:
滴眼,每天2-3次,每次1-2滴,一疗程30天。
例6(药理、药效实验)
实验一石斛酚联合丁香酸对人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用
实验目的:探讨石斛提取的石斛酚和丁香酸对氧化条件下人晶状体上皮细胞(HLEC)的形态及生长的影响,并与单用石斛酚或丁香酸的药效比较。
1.实验材料
1.1细胞株人晶状体上皮细胞株SRA01/04(HLEC)。
1.2实验组及其对应的受试药物
石斛酚组对应的受试药物为石斛酚滴眼液,该滴眼液的制备方法如下:取硼酸7.98g、硼砂5.72g加入适量注射用水中,加热使溶解,加入上述实施例1所制得的石斛酚3.00g、氯化钠7.35g、对羟基苯甲酸乙酯0.26g搅拌溶解,煮沸15min,搅拌,混合均匀、放冷;调节pH至6.0~7.0,调节渗透压至等渗后,过滤灭菌,补充水量至1000ml,充分搅拌均匀即可。
丁香酸组对应的受试药物为丁香酸滴眼液,该滴眼液的制备方法如下:取硼酸5.62g、硼砂4.75g加入适量注射用水中,加热使溶解,加入上述实施例2所制得的丁香酸3.75g、氯化钠6.89g、对羟基苯甲酸乙酯0.31g搅拌溶解,煮沸15min,搅拌,混合均匀、放冷;调节pH至6.0~7.0,调节渗透压至等渗后,过滤灭菌,补充水量至1000ml,充分搅拌均匀即可。
石斛酚与丁香酸联合组为本发明实施例3所述的滴眼液。
1.3试剂和仪器新生小牛血清及DMEM培养基(Gibco公司);DMSO(广州市康洋化工有限公司)M193863MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(北京中西远大科技有限公司);胰蛋白酶(美国DIFCO公司;上海生工生物工程公司代理)。Olympus PM-6倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);BioTek Elx800酶标仪(美国BioTek公司);E-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-D(III)循环水式真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂);BP221S电子分析天平(上海精密仪器表有限公司)。
2.方法
2.1HLEC的培养
取出保存冻存HLEC的冻存管立即置于37℃水中,将细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释,离心,除去上清,反复洗涤3次,以5×108个/L接种于培养瓶中,37℃、50mL/L、5%CO2培养箱内培养,细胞形态呈多角形或不规则形,3~4d可融合。融合成片的细胞,中央部分细胞呈六边形,大小较一致。细胞生长接近融合时及时传代或冻存,按1∶3或1∶4分瓶传代培养。
2.2分组与给药及HLEC形态观察
实验分为5组,取对数生长的HLEC,采用含10%的胎牛血清的DMEM培养基进行培养,正常对照组:正常HLEC+DMEM;模型组:正常对照组+500μmol/L H2O2(双氧水);石斛酚组:模型组+石斛酚滴眼液;丁香酸组:模型组+丁香酸滴眼液;石斛酚与丁香酸联合组:模型组+实施例3所述的滴眼液。在倒置显微镜下观察HLEC的形态及特征并及时照相记录。
2.3MMT法检测HLEC生长情况
消化并收集生长良好、呈对数生长期的HLEC,以含有10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液。接种于96孔板培养板中,每孔200μL,细胞浓度为8×103个/mL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,弃去培养液,加入无血清的DMEM液,继续培养24h,使细胞同步化,24h后按照上述实验分组,分别加入各药物,继续培养24h后,弃去培养液,在各组培养板分别加入200μL的MTT试剂(至终浓度为0.5g/L),继续培养4h终止培养,吸去MTT溶液,加入150μLDMSO溶液,室温下轻轻振荡10min后,于全自动酶标仪上490nm波长测各组的吸光值(A)以观察石斛酚、丁香酸及石斛酚和丁香酸的组合对HLEC生长情况的影响,并计算细胞存活率和细胞抑制率(细胞存活率%=药物组平均吸光度值/正常对照组平均值吸光值×100%),细胞抑制率=100%-细胞存活率)。以上实验在同样条件下重复3次,取平均值。
3.结果
3.1石斛酚与丁香酸联合对氧化条件下HLEC形态的影响
图1结果显示,正常对照组HLEC为克隆性贴附生长,细胞形态为扁平的多角形或星形。其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接,呈“铺路石”状连接成片。细胞多为单层,一般互不重叠,细胞透亮,胞浆丰富,胞膜清晰,且具有接触抑制和密度抑制现象,形成内密外疏的细胞群落(图1-A),增殖明显且部分呈现跳跃式生长,与文献报道一致。
各药物处理组HLEC培育24h后,模型组在H2O2的作用下,细胞形态表现多样,不规则细胞增多,逐渐变得肿胀,出现空泡和颗粒,逐渐死亡,细胞变得稀疏(图1-B);在各组石斛酚、丁香酸及石斛酚与丁香酸联合的干预下,HLEC较好地保持了原有细胞形态,细胞之间紧密相靠,互相衔接,排列规则,较少出现肿胀,空泡和颗粒等,细胞未见稀疏(图1-C~E)。从细胞形态上来看,石斛酚与丁香酸联合组能更好地抑制H2O2对晶状体上皮细胞的氧化损伤。
3.2石斛酚与丁香酸联合干预对HLEC生长的影响
结果见表1。表1显示,各组HLEC培育24h后,加入MTT,再培养4h,模型组HLEC的增殖被H2O2抑制增殖,抑制率为52.99%,与其他各组比较差异显著(p<0.05);石斛酚与丁香酸联合组的存活率达到79.97%,与石斛酚组、丁香酸组比较差异显著(p<0.05),说明石斛酚与丁香酸联合能较好地防止HLEC凋亡,有利于白内障的防治。
表1石斛酚与丁香酸联合对HLEC的增殖情况
统计方法:t检验;①p<0.05,与药物各组及正常对照组比较;②P<0.05,与石斛酚组、丁香酸组之间比较
4.讨论
晶状体上皮细胞(LEC)是白内障损伤的主要靶位,氧化应激是其发病的重要机制之一;白内障病人和模型动物在晶状体出现混浊之前,LEC先出现凋亡;H2O2白内障患者房水和晶状体内升高,干扰细胞结构蛋白质和高活性酶的DNA功能,致LEC的细胞核和线粒体结构和功能损伤,从而出发凋亡机制,细胞出现明显的凋亡现象。本试验通过体外培养的人晶状体上皮细胞,利用H2O2模拟机体氧化损伤病理生理特点,造成模型组,24h HLEC出现形态和数量的异常改变,生长受到抑制,细胞形态逐渐丧失原有特征,变得不规则、不均一、肿胀直至死亡,生长受到抑制,传代后容易老化,说明体外H2O2培养的晶状体上皮细胞具有类似于白内障的晶状体细胞改变。
石斛酚和丁香酸均为石斛酚性成分之一。石斛酚和丁香酸干预氧化条件的人晶状体上皮细胞,保持了上皮细胞的形态特征,特别是两者的组合,细胞之间紧密相靠,排列规则,呈“铺路石”状连接成片,细胞死亡率明显下降,传代未见老化,从而证明其对晶状体上皮细胞具有良好的保护作用,其机制与石斛酚和丁香酸的酚性羟基协同抗氧化有关。
实验二石斛酚与丁香酸联合对离体培养的晶状体的保护作用
实验目的:研究石斛酚与丁香酸组合对体外培养的氧化损伤晶状体的保护作用。
1.实验材料
1.1实验动物
动物4~5周龄的Wistar大鼠20只,体重80~120g,雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:粤临证字2007A025。
1.2实验组及其对应的受试药物
本实验中,石斛酚组、丁香酸组和石斛酚与丁香酸联合组所对应的受试药物分别与上述实验一相同。
1.3试剂
DMEM低糖培养基(杭州吉诺生物医药技术有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,福州迈新生物技术开发公司);30%过氧化氢(H2O2,浙江临安化工二厂);吡诺克辛钠滴眼液即白内停;Bradford蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。
1.4仪器
E-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-DIII型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);BS110S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)旋转蒸发仪,超净工作台,全自动酶标仪,裂隙灯显微镜、可见分光光度计等;HI-98128型pH计(北京HANNA);SW-CJ-IF型超净台(苏州净化设备厂);Galaxy-s型CO2培养箱(美国RS Biotech):ST-PT型解剖显微镜(日本OLYMPUS);5810-R型低温高速离心机(德国Eppendorf);7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。
2.方法
2.1体外大鼠晶状体的培养及分组
颈椎脱臼处死大鼠,用眼科剪镊迅速摘取双眼眼球,以含800U/ml青霉素、800g/ml链霉素的冷PBS液漂洗眼球后,投入含相同浓度双抗的PBS液中浸泡,转入超净台。约10min后将大鼠眼球转移至含500U/ml青霉素、500g/ml链霉素的DMEM培养液中,小心从眼球后极部剪开巩膜,取出晶状体,去除晶状体表面的虹膜和玻璃体,晶状体经PBS液漂洗2遍后,再用DMEM液漂洗1遍,然后再放人已预热的24孔组织培养板中培养,每孔1ml DMEM培养基(含20%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素),预培养5h(37℃,5%CO2,)后,剔除受损伤或已混浊的晶状体。将40只未受损伤、透明的晶状体按照随机原则分4个组培养,每组10只:①正常对照组:DMEM培养基+10%胎牛血清+100ug/ml青霉素及100μg/ml链霉素;②模型对照组:正常组培养基+2mmol/l 30%半乳糖;③阳性对照组:正常组培养基+2mmol/l 30%半乳糖+10%吡诺克辛钠滴眼液(白内停,1-羟-5-氧-5H-吡啶并-[3,2-a]-吩恶嗪-3-羧酸钠-水合物);④石斛酚组:模型组培养基+石斛酚滴眼液;⑤丁香酸组:模型组培养基+丁香酸滴眼液;⑥石斛酚与丁香酸联合组:模型组培养基+实施例3所述的滴眼液。
2.2观察并照相记录晶状体混浊度
加药培养后,每6h更换1次培养液以保持H2O2浓度不变。观察记录各组晶状体混浊度。晶状体混浊度的分级方法分为四级:在黑色背景下设计1mm×1mm的黑色方格图,将被检晶状体置于“+”字交叉的黑色线条之上,在解剖显微镜下观察晶状体,按透过晶状体所能看到的线条清晰度进行分级。“一”表示线条清晰可见,为完全透明,即0级;晶状体“+”混浊:线条模糊,但轮廓尚可辨,即I级;“++”混浊:线条轮廓不清,仅中央部隐约可见,即II级;“+++”混浊:线条完全不见,晶状体全部混浊,即III级。最后以各组晶状体混浊度,即“+”出现量的多少进行统计学处理。培养后24h,拍照。
2.3统计学方法应用统计软件SPSS 16.0进行统计处理分析。
3.结果
3.1石斛酚与丁香酸联合对晶状体混浊度的影响
晶状体分组培养后6h,模型组晶状体均出现“+”度浑浊,其他各组均透明;继续培养6h,可见正常组晶状体均保持透明,模型组晶状体为“++”至“+++”度混浊,其余各组晶状体混浊度在“+”至“++”度不等;培养后24h,正常组晶状体均保持透明,模型组晶状体均为“+++”度混浊,肉眼观为乳白色,且晶状体体积明显缩小,其他各组晶状体混浊度表现为“+”至“+++”不等。各个药物添加组中,阳性对照组、石斛酚组、丁香酸组及石斛酚与丁香酸联合组晶状体混浊度比模型组明显减轻(表2,图2,P<0.05);其中石斛酚与丁香酸联合组与石斛酚组、丁香酸组、阳性对照组相比具有显著学意义(P<0.01)。
氧化损伤是诱发白内障的主要机制之一。本实验采用体外构建氧化损伤晶状体的方法制成白内障模型,探讨石斛酚与丁香酸联合抗白内障功效。结果显示,石斛酚与丁香酸协同抗白内障功效优于单用石斛酚和丁香酸及阳性对照药物白内停。
表2不同时段各组晶状体混浊度量化比较:(“+”/晶状体数)
统计方法:t检验:①P<0.05,与正常组比较;②P<0.05,与阳性对照组、石斛酚组、丁香酸组比较。
实验三不同配比的石斛酚与丁香酸联合组滴眼液对在体动物(大鼠)白内障的治疗作用
实验目的:研究比较石斛酚与丁香酸不同配比制备的滴眼液(例3~例5)在整体动物水平上对白内障治疗作用,并与市场上应用较广泛的抗白内障药物白内停进行药效比较。
1 材料
1.1动物
Wistar大鼠160只(由广州中医药大学实验动物中心提供;实验动物生产许可证号:scxk(粤)2003-0001粤临证字2007A025)雌雄各半,5~6周龄,体重80~120g。
1.2实验试剂及实验组及其对应的受试药物
试剂:D-半乳糖(AMRESCO产品,纯度>99%),复方托吡卡胺眼药水(北京双鹤现代医药技术有限责任公司,批号:060902),其他试剂均为国产分析纯。
实验组及其对应的受试药物:本实验中,石斛酚组和丁香酸组对应的受试药物均与实验一相同;石斛酚和丁香酸联合组1对应的受试药物为实施例3所述的滴眼液;石斛酚和丁香酸联合组2对应的受试药物为实施例4所述的滴眼液;石斛酚和丁香酸联合组3对应的受试药物为实施例5所述的滴眼液。
1.3仪器设备
玻璃匀桨器(陕西化学玻璃器械有限公司);TGL-16G-A高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);YZ-5E型裂隙灯显微系统(苏州医疗器械厂)。电热恒温水浴锅(北京化玻联医疗仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,型号:E-52AA);循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂,型号:SHZ-DIII);电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司,型号:BS110S);pH计(北京HANNA,型号:HI-98128);解剖显微镜(日本OLYMPUS,型号:ST-PT);低温高速离心机(德国eppendorf,型号:5810-R);分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司,型号:7200型),UV-1600紫外可见光光度计(上海安亭科学仪器厂),Real time PCR仪(Bio-Rad),DYY-10型电泳仪(北京六一仪器厂),A30型荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)等。
2.方法
2.1分组与模型制备
实验前,用复方托吡卡胺眼药水滴大鼠双眼,用裂隙灯显微镜检查晶状体透明的160只投入实验,适应性喂养一周后,按体重、性别随机分为以下8组(每组20只):正常对照组、模型组、石斛酚组、丁香酸组、白内停阳性对照组及石斛酚与丁香酸联合组1~3(即本发明所述滴眼液例3~5),其中,正常对照组,每天予以10ml/kg生理盐水腹腔注射并给饮用水;其余大鼠用于制造白内障模型,造模方法为:自由饮用10%(w/v)D-半乳糖溶液,并予以腹腔注射50%(w/v)D-半乳糖溶液10mL/kg(即5g/kg),2次/日(10g/kg·d D-半乳糖),晶状体混浊度的分级方法参照文献,待模型组晶状体发混浊度达到I~II级时,30天时,再将半乳糖处理的模型大鼠随机分成7组:模型组,每天予以10mL/kg生理盐水腹腔注射并给饮用水;石斛酚组、丁香酸组及石斛酚与丁香酸联合组1~3,按照前述用法用量给药;白内停阳性对照组,每次滴一滴白内停,3次/日;药物处理10天后用裂隙灯观察记录大鼠晶状体浑浊度。
2.2晶状体混浊度在体观察
注射半乳糖后,每天观察记录大鼠体重、精神、食欲、毛色、反应、运动、尿量等,每天用裂隙灯显微镜观察各组大鼠晶状体:先用复方托吡卡胺眼药水滴大鼠双眼,约5min后,用裂隙灯显微镜观察各组大鼠晶状体,将晶状体混浊程度按下列标准分级,0级:无混浊,晶状体透明清亮;I级:轻度混浊,仅赤道部有空泡,以一个“+”表示;II级:明显混浊,空泡扩展到中央,用两个“++”表示;III级:核混浊,晶状体中央呈现核性白内障,以三个“+++”表示;IV级:整个晶状体呈完全混浊,以四个“++++”表示。最后以各组晶状体混浊度,即“+”出现量的多少进行统计学处理。运用SPSS 16.0进行统计处理。
3.结果
结果如表3。模型组的大鼠注射D-半乳糖23天后开始形成白内障,即晶状体周边出现散在点状混浊,随着时间的延长,混浊度持续加重,成为II级~IV混浊;正常组大鼠晶状体始终保持透明;30天后,模型组停止腹腔注射和饮用D-半乳糖,白内障继续严重,与其他各组比较差异显著(P<0.01);各药物组干预10天后,晶状体浑浊开始发生逆转,46天后大都转变为I级混浊或0级透明清晰,发现石斛酚与丁香酸的配比从0.2∶1到5∶1都是有效的,但石斛酚与丁香酸联合组1(石斛酚与丁香酸的配比1∶1.25)药效最高,大部分晶状体保持清亮透明,其疗效明显优于白内障停组、石斛酚组及丁香酸组及另外两组石斛酚与丁香酸的联合组(P<0.05),
表3给药后不同时段各组大鼠晶状体混浊度量化比较
统计方法:t检验;①P<0.01,与正常对照组及其它各药物组比较;②P<0.05,与白内停组、石斛酚组、丁香酸组、石斛酚与丁香酸联合组1、石斛酚与丁香酸联合组2、石斛酚与丁香酸联合组3。
实验四石斛酚与丁香酸组合对AR、iNOS基因表达的影响
实验目的:考察石斛酚与丁香酸组合对AR、iNOS基因表达的抑制性能,探索石斛酚与丁香酸组合抗白内障协同增效机制。
1.试剂、受试药物和仪器设备
DEPC(Sigma公司),Tris平衡酚(中国医学科学院生物工程医学研究所),盐酸胍(Solarbio公司),聚乙烯吡咯烷酮K30(Amresco公司)等,其他试剂均为国产分析纯。玻璃匀桨器(陕西化学玻璃器械有限公司);TGL-16G-A高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);YZ-5E型裂隙灯显微系统(苏州医疗器械厂)。电热恒温水浴锅(北京化玻联医疗仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,型号:E-52AA);循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂,型号:SHZ-DIII);电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司,型号:BS110S);pH计(北京HANNA,型号:HI-98128);分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司,型号:7200型),UV-1600紫外可见光光度计(上海按亭科学仪器厂),Real time PCR仪(Bio-Rad),DYY-10型电泳仪(北京六一仪器厂),A30型荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)等。
本实验中,石斛酚组、丁香酸组和石斛酚与丁香酸联合组所对应的受试药物分别与上述实验一相同。
2.方法
2.1晶状体总RNA的提取分离与检测
取上述实验三中的正常组、模型组、石斛酚与丁香酸联合组1的大鼠晶状体置于研钵中,冰浴研磨,充分匀桨,在冰浴中用Trizol裂解,分别提取总RNA,采用紫外吸收法检测RNA纯度;1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
2.2引物设计与合成及cDNA
根据Reno等报道,分别设计AR、iNOS基因引物序列。AR的PCR上游引物P1:5’-AGC GGTTTA GGT ACC ATG GGT TTT-3’;下游引物P2:5’-AGG GTA AGC TTC GAA TTC TCA GGC GCGGAT TTG TTG TGA-3’;iNOS的PCR上游引物P1:5`-CGCCCTTCCGCAGTTCT-3`;下游引物P2:5`-GCGGGGGCATCGGAACCCAGCC-3`;片段长度为262bp;β-actin引物P1:5`GAGACCTTCAACACCCAGCC-3`,P2:5`-GCGGGGCATCGGAACCGTCA-3`,片段长度为420bp,由上海博亚生物技术公司合成。
2.3常规逆转录PCR按照Promega公司Improm-II TM Reverse Transcription System试剂盒说明将RNA反转录合成cDNA,逆转录体系20μL中含有200μmol/L dNTP 0.5μL,引物各10pmol,RNA摸板5μL,逆转录酶2μL,5×RT buffer 4μL,DEPC水7.7μL,置于37℃水浴60min,95℃水浴3min,合成mRNA的cDNA。
2.4荧光定量PCR采用TaK aRa ExTaq H s酶(TaK aRa公司),SYBR Green I嵌合荧光染料、AB I PR ISM 7000实时定量PCR扩增仪,PCR反应体系25μL(含Taq酶12.5μL,引物各0.5μL,荧光探针0.5μL,cDNA模板2.0μL,DEPC水9.0μL),按下列条件扩增:95℃10s预变性,然后按90℃5s,60℃31s,共40个循环。记录40个周期中的C(t)值(循环阈值),以同一样品的α-actin作内对照,计算目的基因mRNA拷贝数的相对含量,对比各组样品结果,确定基因表达水平的变化。
3 结果
3.1石斛酚和丁香酸组合对晶状体AR、iNOS基因的表达的影响
结果见表5、6及图3、4,可以看出,正常对照组AR mRNA和iNOS mRNA的表达较弱,模型组大鼠晶状体均检测到较强的AR mRNA和iNOS mRNA的信号表达。由相对Ct值可以看出AR mRNA和iNOS mRNA在模型组大鼠晶状体中有强表达。在模型组中AR mRNA和iNOS mRNAO-Ct为别为0.72、0.68;而正常对照组大鼠晶状体的AR mRNA和iNOS mRNA的O-Ct分别为0.95、0.99;石斛酚和丁香酸联合组干预组的AR mRNA和iNOS mRNAO-Ct为0.94、0.93;石斛酚和丁香酸联合组与石斛酚组、丁香酸组相比差异显著(P<0.05),说明石斛酚和丁香酸联合组1使得ARmRNA和iNOS mRNA的表达均显著下调,达到增效作用。
表4各组大鼠晶状体AR mRNA实时荧光PCR检测Ct值及相对Ct值
组别 | AR Ct | B-Actin Ct | O-Ct | P |
正常对照组 | 26.66 | 26.93 | 0.95 | 1.46 |
模型对照组 | 17.47① | 25.69① | 0.72① | 1.00① |
石斛酚组 | 25.37 | 26.52 | 0.91 | 1.37 |
丁香酸组 | 24.11 | 26.73 | 0.88 | 1.33 |
石斛酚与丁香酸组 | 26.15② | 26.55② | 0.94② | 1.41② |
统计方法:t检验;①P<0.01,与正常对照组及其它各药物组比较;②P<0.05,与丁香酸组、石斛酚组比较。
表5各组大鼠晶状体iNOS mRNA实时荧光PCR检测Ct值及相对Ct值
组别 | iNOS Ct | B-Actin Ct | O-Ct | P |
正常对照组 | 25.74 | 26.16 | 0.99 | 1.49 |
模型对照组 | 18.32 | 25.33 | 0.68 | 1.00 |
石斛酚组 | 24.51 | 25.97 | 0.90 | 1.43 |
丁香酸组 | 21.98 | 25.74 | 0.89 | 1.39 |
石斛酚与丁香酸组 | 25.13② | 26.02② | 0.93② | 1.45② |
统计方法:t检验;①P<0.01,与正常对照组及其它各药物组比较;②P<0.05,与丁香酸组、石斛酚组比较。
实验五石斛酚与丁香酸组合对AR的抑制作用及其机制研究
实验目的:比较石斛酚与丁香酸不同配比对AR的抑制性能,探索石斛酚与丁香酸组合增效作用机理。用分子对接法探索石斛酚与丁香酸联合应用时对AR的协同机制。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器石斛酚与丁香酸按例1与例2制备制备。醛糖还原酶(AR),批号809AKR1B101,购自PROSPEC-TANY TECHNOGENE LTD;DL-甘油醛,批号140593023908264,为美国Sigma公司产品;NADPH(还原型),批号10041939,为意大利Roth公司产品;DMSO(广州市康洋化工有限公司);磷酸盐缓冲液,批号20100203,(广州威佳科技有限公司);全波长酶标仪,BioTek(power wave XS2);涡旋器(VORTEX-T GENIE2产品);离心机,(Thermolectron CORPORATION PICO17)。应用软件版本:Sybyl7.3,Gaussian03W(中山大学药学院)。
1.2石斛酚与丁香酸联合对AR抑制活性的测定
酶活力用试验条件下单位时间转化NADPH为NADP+的量来计算,1单位酶活力(U)定义为在试验条件下,酶催化氧化1μmol NADPH为NADP+。参照Prasanta Kumar Sahoo[81]的方法,测定温度为25℃,酶反应总体积为200μL,包括:酶液20μL,0.104mmoL/LNADPH 50μL,10mmoL/L DL-甘油醛50μL,0.1moL/L磷酸盐缓冲液(pH 6.2)以及不同浓度的石斛酚/丁香酸溶液(浓度设定通过测定抑制率在0~100%范围内,抑制率为50%左右的石斛酚/丁香酸浓度)。加入底物DL-甘油醛开始反应,以340nm处每分钟NADPH吸光值的下降来表示AR的活性,每10s测定1次,反应时间记录10min。石斛酚/丁香酸用DMSO溶解,涡旋,DMSO在测试的反应体积中不能超过1%,石斛酚浓度、丁香酸浓度及石斛酚与丁香酸的组合配比(见表6~8)。AR先离心后,用PBS稀释100倍。取不同浓度石斛酚和丁香酸作为样品组,其他试剂加入顺序方法同空白组。每个样品进行3个复孔检测。样品对AR的抑制率计算如下:抑制率(%)=[1-(A2-A0)/(A1-A0)]×100%,式中A0表示未加酶、底物和样品,即每分钟NADPH自然氧化吸光值的下降;A1表示未加样品每分钟NADPH吸光值的下降;A2表示加样品后每分钟NADPH吸光值的下降。
1.3石斛酚与丁香酸组合与AR对接
分子对接采用Sybyl中的FlexX模块进行,FlexX是一种柔性对接方法,它首先在配体分子中选取一个核心部分,将其对接到受体的活性部位,然后再通过树搜寻方法连接其余的片段;配体和受体之间结合情况的评价采用了类似BShm提出的半经验的自由能得分方程。化合物模板见图1,2。靶酶结构来源于PDB数据库(PDB编号:1USO)。把晶体结构中配体所在位置周围范围定义为活性口袋。
1USO晶体结构的准备:对接中采用晶体结构中的配体结构作为参考;保留辅酶的存在;氨基酸侧链各氨基酸的角度按默认的值进行计算;删除水分子;最后计算配体表面。
石斛酚和丁香酸配体的准备:建立石斛酚的配体文件(.sdf);然后用MOE(MolecularOperating Environment)药物设计软件的Wash及Energy Minimize模块处理石斛酚;用Gaussian03W进行最低能量优化,基本设置B3LYP/6-31+G(d),得到最佳能量构象(如图4,5),最后运行FlexX模块进行对接。
1.4统计学处理采用SPSS 16.0数据统计软件进行数据处理。
2结果与分析
2.1石斛酚与丁香酸组合对AR的抑制活性
不同浓度的石斛酚、丁香酸及石斛酚与丁香酸组合对AR的抑制作用见表6、7、8。可以看出,石斛酚、丁香酸及石斛酚与石斛酚与丁香酸组合对AR的抑制作用与其浓度存在明显的剂量一效应关系。由表8对照表6、7,可以看出石斛酚与丁香酸组合对AR的抑制活性显著高于单一成分——石斛酚和丁香酸的药效的叠加,呈现良好的协同效果。
2.2石斛酚与丁香酸组合与AR的分子对接
分子保留10个对接构象,用于对接结果的分析。选取对接结果RMSD最小,打分最高的进行分析,得出二者联合应用时的分子对接图。由于石斛酚与丁香酸连接后形成的结构式较长,故在二维图中可看到口袋周围氨基酸残基较多,二者联合时,AR的Asn160与石斛酚和丁香酸的苯环形成π-π共轭键,π-π共轭较单纯形成的氢键更稳定,抑制性能更加强烈,另一方面,石斛酚与丁香酸和AR的氨基酸残基之间形成广泛的范德华力。由此可见,石斛酚与丁香酸芳香环与AR活性口袋的残基侧链形成的范德华力,是石斛酚、丁香酸二者对AR协同抑制的主要驱动力。
同时,丁香酸与石斛酚协同抑制AR时形成共同的药效团,其氢键受体为丁香酸的3位苯环的甲氧基中的氧和石斛酚右苯环5′位上甲氧基中的氧,氢键供体为丁香酸连接3位苯环的甲氧基中的氢,丁香酸、石斛酚上的苯环均为疏水芳香环,形成疏水力。
表6石斛酚滴眼液对AR的抑制作用
石斛酚浓度(g/L) | 抑制率(%) |
0.5 | 21.25±7.216878 |
1 | 23.125±7.216878 |
2.5 | 30.5±12.500000 |
5 | 51.25±19.094070 |
注:本表中的不同浓度的石斛酚滴眼液均采用实施例1所制得的石斛酚按实验一所述石斛酚滴眼液相同的方法制得。
表7丁香酸滴眼液对AR的抑制作用
丁香酸浓度(g/L) | 抑制率(%) |
0.5 | 12.5±7.216878 |
1.25 | 31.625±9.09407 |
2.5 | 47±5.216878 |
5 | 50.625±3.216878 |
注:本表中的不同浓度的丁香酸滴眼液均采用实施例2所制得的丁香酸按实验一所述丁香酸滴眼液相同的方法制得。
表8本发明所述的滴眼液对AR的抑制作用
滴眼液 | 石斛酚+丁香酸((g/L)) | 抑制率(%) |
实施例4的滴眼液 | 0.5+2.5(0.2∶1) | 79.125±7.116873 |
实施例5的滴眼液 | 2.5+0.5(5∶1) | 67.342±4.511311 |
实施例3的滴眼液 | 1+1.25(1∶1.25) | 93.5±3.500066 |
3.结论
本发明人研究发现从石斛中提取的化学单体——石斛酚和丁香酸分别对AR具有较好的抑制作用,本实验研究表明石斛酚和丁香酸联用具有更好的抗白内障作用,对AR表现更好的抑制活性,呈现良好的协同性。
采用分子对接探测石斛酚与丁香酸联合与AR协同作用模式,得到的复合物结构表明二者和AR之间的主要结合方式是范德华力,并形成共同的药效团。通过查阅文献归纳得知,AR抑制剂的热点残基为Trp111,His110,Tyr48。本实验得到的复合物结构表明二者和AR之间的主要结合热点残基包含Asn160,并且形成π-π共轭,比公知的AR抑制剂与AR结合形成的氢键更稳定。
Claims (2)
1.一种治疗白内障的滴眼液,该滴眼液为水溶液,其特征在于,其中具有浓度为2.25g/1000ml~3g/1000ml的有效成分,该有效成分由3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄和3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸组成,二者的质量配比为3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄∶3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸=1∶1.25。
2.根据权利要求1所述的一种治疗白内障的滴眼液,其特征在于,每升滴眼液中具有以下重量配比的原料:3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄1.00g,3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸1.25g,羧甲纤维素钠2.1g,对羟基苯甲酸乙酯0.31g,氯化钠9.8g。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103414058A CN102389412B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 一种治疗白内障的滴眼液 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103414058A CN102389412B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 一种治疗白内障的滴眼液 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102389412A CN102389412A (zh) | 2012-03-28 |
CN102389412B true CN102389412B (zh) | 2012-11-21 |
Family
ID=45856879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011103414058A Expired - Fee Related CN102389412B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 一种治疗白内障的滴眼液 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102389412B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104069365A (zh) * | 2013-03-28 | 2014-10-01 | 东海大学 | 石斛多酚于保肝、治疗/预防糖尿病的用途 |
CN111000976A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-04-14 | 佛山科学技术学院 | 一种预防白内障胶囊及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102058567B (zh) * | 2011-01-18 | 2012-02-22 | 广州中医药大学 | 3′, 4-二羟基-3, 5′-二甲氧基联苄在制备治疗白内障的药物中的应用 |
-
2011
- 2011-11-02 CN CN2011103414058A patent/CN102389412B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102389412A (zh) | 2012-03-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103735728B (zh) | 地骨皮醇提物、地骨皮甲素及乙素在制备具有神经保护作用的药物中的用途 | |
Pitchaipillai et al. | In vitro antidiabetic activity of ethanolic leaf extract of bruguiera Cylindrica L.–glucose uptake by yeast cells method | |
CN105193876A (zh) | 一种马齿苋提取物及其制备方法 | |
WO2015190872A1 (ko) | 스피루리나 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
CN102058567B (zh) | 3′, 4-二羟基-3, 5′-二甲氧基联苄在制备治疗白内障的药物中的应用 | |
CN102755343A (zh) | 胡萝卜苷在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用 | |
CN102389412B (zh) | 一种治疗白内障的滴眼液 | |
CN109939120A (zh) | 含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷的组合物及其应用 | |
TWI820342B (zh) | 台灣藜萃取物用於製備抵抗自然衰老、促進脂肪分解及減少脂肪堆積的組合物之用途以及減脂組合物 | |
KR101491771B1 (ko) | 흰점박이꽃무지 현탁액의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물 | |
JI et al. | Antihepatocarcinoma effect of solanine and its mechanisms | |
CN104042620A (zh) | 罗汉果醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途 | |
CN100594913C (zh) | 治疗糖尿病及其并发症的药物组合物及其制备方法和用途 | |
CN103638052A (zh) | 双齿多刺蚁提取物及其制备和医药用途 | |
CN103285082B (zh) | 一种用于治疗妇科炎症的药物组合物 | |
CN105533745A (zh) | 人参金银花片及其生产方法 | |
CN106177035B (zh) | 具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用 | |
CN105503800A (zh) | 一种新的佛木内酯类化合物及其制备方法和医药用途 | |
Wang | Effects of fresh royal jelly on the proliferation of human hepatoma cell line SMMC-7721 | |
CN103638055A (zh) | 拟黑多刺蚁提取物及其和抗真菌医药用途 | |
KR102691530B1 (ko) | 꾸지뽕나무 열매에서 항비만 성분을 증진시키는 방법 및 증진된 항비만 성분을 포함하는 비만 개선 및 예방용 조성물 | |
CN106860781A (zh) | 一种米根霉固态发酵提取物、制备方法及其抗癌功效的应用 | |
CN107412241A (zh) | 一种紫丁香苷药物组合物及其在治疗宫颈炎中的应用 | |
CN103768139B (zh) | 一种提高男性精子数量和活力的药物及其制剂、应用和制备方法 | |
CN107080761B (zh) | 腊梅属植物抗伪狂犬病毒的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121121 Termination date: 20181102 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |