CN104042620A - 罗汉果醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及罗汉果醇（Mogrol）在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是Mogrol在制备抗肿瘤药物耐药逆转剂中的应用。Mogrol是天然产物，具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用，可以作为肿瘤多药耐药的逆转剂；Mogrol也具有增加肿瘤多药耐药细胞对抗肿瘤药物敏感性的作用，可以作为化疗增敏剂使用。本发明还提供了抗肿瘤药物和Mogrol联合使用的药物组合物抑制肿瘤多药耐药细胞增殖的用药方法。本发明中的小分子化合物Mogrol作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

罗汉果醇在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途

技术领域

本发明属于逆转肿瘤多药耐药和增敏抗肿瘤药物的医药学领域，具体涉及罗汉果皂苷元——罗汉果醇（Mogrol）的新用途，即Mogrol在制备肿瘤多药逆转剂和抗肿瘤药物增敏剂中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类的生命健康，已成为当今疾病致死亡的主要原因之一。目前恶性肿瘤的主要治疗手段有手术治疗、放疗和化疗等。对于被诊断为晚期肿瘤的患者和已经发生转移的患者来说，化疗是一个较好的选择。临床医生通过调节用药剂量可以优化得到最大的疗效和最小的毒性，帮助患者延长生存时间和提高预后生活质量。然而，肿瘤细胞的耐药性的产生导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降，大大限制了化疗的治疗的效果[1]。肿瘤细胞对某种药物产生耐药性之后，会对从未接触过的、结构不同、作用机制各异的多种化疗药物产生交叉耐药，这种现象称为肿瘤的多药耐药性（Multiple Drug Resistance,MDR）。多药耐药的产生是当前肿瘤治疗的所面临的重大难题之一[2-4]。MDR一旦产生，通过加大药物剂量是无效的，会产生更强的毒性和进一步诱导耐药的产生[5-8]。多数与MDR有关的药物都是疏水性或者两亲性的天然产物，如紫杉烷类、蒽环类抗生素、长春花生物碱类等[7,9-11]。MDR的产生具有多种机制，包括细胞对一些水溶性药物摄取的减少，细胞周期的改变，DNA修复功能的增强，抑制细胞的凋亡，药物在细胞内的代谢过程的改变，对疏水性药物和易于进入细胞的一些药物外排的增加等[12]。肿瘤MDR的形成过程复杂，这些耐药机制常同时存在，但以一种机制为主，不同机制之间互相影响，可能单独或联合起作用[13]。

为了克服肿瘤细胞对化疗药物的MDR特性，研究者们一直在寻找有效的ABC转运蛋白的抑制剂，这些化合物又被称为MDR的抑制剂、调节剂、逆转剂或者化疗增敏剂，它们通常能够调节多个ABC转运蛋白的功能[7,8]。1981年，Tsuruo首次报道了钙通道阻滞剂异搏定（Verapamil）和钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪（TFP）在体外和体内实验中均能增强耐药小鼠白血病P388/VCR细胞对长春新碱（vincristine，VCR）的敏感性[14]。在随后30年的研究中，新的MDR逆转剂的不断被发现和研究，但较高的细胞毒性一直是困扰MDR抑制剂研究开发的一大问题。因此，开发毒性较小、逆转作用更强的MDR抑制剂或逆转剂仍然是肿瘤药物研究的热点之一。

在新一代MDR抑制剂的研究过程中，从天然产物中筛选高效低毒的MDR逆转剂日益被医学界所重视并逐渐成为研究的热点。多种天然产物被发现具有逆转肿瘤细胞MDR的作用。罗汉果（Siraitia grosvenorii Swingle）是葫芦科多年生草本植物，是我国特有的植物，主要产于广西永福、临桂和龙胜等地。罗汉果的果实可以食用，也可以入药，在广西民间的药用历史已有300多年。罗汉果性凉，味甘，有清热润肺，滑肠通便的功效[15]。罗汉果因其甜度高、热量低而被作为甜味剂广泛使用，常作为肥胖者和糖尿病患者的代用糖。罗汉果的主要化学成分之一是罗汉果皂苷，该类化学成分具有镇咳、祛痰、平喘、调节免疫、降低血糖、抗病毒和抑制肿瘤细胞增殖等药理作用[16]。罗汉果醇为罗汉果皂苷IA1、IE1、IIE、III、IV、IVE、V和赛门苷I等的苷元，英文名为Mogrol，分子式为C₃₀H₅₂O₄，分子量461.4，CAS号为88930-15-8，其化学结构如图1所示。目前关于罗汉果皂苷和罗汉果醇Mogrol对肿瘤细胞耐药性的调节尚未见报道。

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发明内容

本发明的目的是提供一种小分子化合物罗汉果醇，即Mogrol在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。

本发明的另一目的在于提供包含Mogrol和VCR及ADR等抗肿瘤药物的抗肿瘤药物组合物在制备治疗多药耐药肿瘤的药物中的应用。

Mogrol的细胞毒作用较小，对多种肿瘤细胞的IC₅₀均大于40μM，具有良好的安全性。本发明通过随机筛选，发现该天然产物具有逆转MDR的作用。鉴于其低毒高效的特点，具有良好的应用前景。实验表明，Mogrol能够增强化疗药物对肿瘤多药耐药细胞株增殖的抑制效果，逆转多药耐药的作用。例如实施例中显示的，Mogrol能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，增强KB/VCR细胞对化疗药物VCR的敏感性，促进VCR对KB/VCR细胞的凋亡的诱导作用。Mogrol能够显著克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，能够通过影响P-gp糖蛋白的功能，逆转肿瘤细胞的多药耐药特性，增强化疗药物对肿瘤多药耐药肿瘤细胞的治疗效果。

本发明提供了Mogrol在制备肿瘤多药耐药逆转剂（Reversal agent）中的应用。

所述的肿瘤可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌或者宫颈癌的肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。Mogrol对于由于药物外排增加导致的耐药性有显著效果，尤其适用于通过P-gp糖蛋白等ABC转运蛋白进行药物运输的肿瘤细胞。

所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物、抗口腔癌药物或者抗肺腺癌药物，可以是细胞周期特异性药物(CCSA)，如长春新碱、紫杉醇等，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。

所述的抗肿瘤药物耐药逆转剂可以被制成任何一种药学上可接受的剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等。

本发明还提供了Mogrol在制备抗肿瘤药物的增敏剂（sensitizer）中的应用。

Mogrol能够克服肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增加肿瘤耐药细胞对药物的敏感性，增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用和ADR所引起的多药耐药细胞的G2/M期阻滞。Mogrol可以增加罗丹明123在KB/VCR和MCF-7/ADR细胞内的蓄积，调节P-gp蛋白的ATP酶活性和转运功能。

本发明中所述的抗肿瘤药物的耐药逆转剂或增敏剂的活性成分是罗汉果醇（Mogrol）。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物包括Mogrol和抗肿瘤药物。所述的抗肿瘤药物可以是长春新碱、紫杉醇等细胞周期特异性药物(CCSA)，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。Mogrol也可以与外科手术联合使用，与一种或多种西药联合使用，与中草药联合使用，与放射性治疗联合使用。

本发明的一个实施例中，Mogrol能够增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用,能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，使VCR重新发挥促凋亡作用。由于VCR本身是一个微管抑制剂，可以引起微管的解聚，引起细胞发生凋亡，使处于sub-G1期的细胞增多。为此，本发明应用流式细胞术检测了Mogrol对VCR诱导的耐药细胞的凋亡的影响。如图3所示，KB/VCR细胞在80nM VCR单独处理的情况下，约有6.2%左右的细胞发生凋亡，当10μM或者20μM的Mogrol与80nM的VCR共同处理后，KB/VCR细胞的凋亡比例上升到14.4%和26.9%，是80nM VCR单独处理时的2.3倍和4.3倍，而10μM或者20μM的Mogrol单独处理对KB/VCR细胞的凋亡并无影响。因此，Mogrol可以显著促进VCR对肿瘤多药耐药细胞KB/VCR的凋亡诱导作用，这种作用随着Mogrol浓度的增加而增强。在对KB细胞的试验中，未发现相似的现象。

另一方面，本发明提供了一种增加体外培养的多药耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感性的方法，即在多药耐药肿瘤细胞的培养基中加入Mogrol。

所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或胰腺癌。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。

对肿瘤细胞加药后，培养基中Mogrol的浓度可以大于20μM，甚至大于50μM。但是，即使培养基中Mogrol的浓度较低，例如5-20μM，甚至接近于但不包含0μM的时候，Mogrol依然能够起到肿瘤多药耐药逆转剂或者化疗增敏剂的作用。

本发明的小分子化合物Mogrol可以采用各种常规的制备方法制备。例如，可从植物（例如，罗汉果）中分离纯化或者人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Mogrol发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。

以本发明的Mogrol为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的Mogrol可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的Mogrol还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的Mogrol被用作药物时，可将治疗有效剂量的Mogrol施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地剂量是约10微克/千克体重～1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了Mogrol在制备抗肿瘤药物中的应用。Mogrol是天然产物，在高剂量时能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。实验表明，Mogrol能够明显克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，能够通过影响P-gp糖蛋白的功能，逆转肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的治疗效果。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

附图说明

图1：罗汉果醇Mogrol的化学结构。

图2：罗汉果醇对多药耐药细胞的逆转作用。

(A)和(B)显示的是罗汉果醇对KB/VCR细胞的逆转作用。(C)和(D)显示的是罗汉果醇对MCF-7/ADR细胞耐药性的逆转。图中横坐标为对应化合物浓度的对数（以浓度标出），纵坐标为细胞的相对增殖率，实验重复3次。

图3：罗汉果醇促进VCR诱导的KB/VCR细胞的凋亡。

KB/VCR细胞经过48h相应的药物处理后，胰酶消化收集细胞，用含50μg/ml PI的0.03%的Triton X-100避光染色15min，流式细胞仪检测Sub-G1期细胞的数目，每次检测10000个细胞，VPL为阳性对照。(A)Mogrol单独处理对KB/VCR凋亡的影响；（B）80nM的VCR和不同浓度的Mogrol联合处理KB/VCR细胞的凋亡情况；(C)阳性对照VPL对VCR诱导的KB/VCR细胞凋亡的影响；(D)是对(A)、（B）和(C)图中凋亡细胞所占比例的统计结果，统计方法应用双样本等方差T检验假设比较不同处理组之间的差异。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图4：罗汉果醇增加罗丹明123（Rho123）在KB/VCR和MCF-7/ADR细胞内的聚集。

KB/VCR或者MCF-7/ADR细胞接种于12孔板中，24h后加入10μM或20μM浓度的罗汉果醇，37℃处理3h后，加入5μM Rho123，继续孵育30min，弃去培养液，PBS清洗细胞，胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞内的荧光。检测激发光波长为488nm，Rho123发射光波长为530nm（FL1）。A,B和E为KB和KB/VCR细胞内Rho123的聚集情况；C,D和F为MCF-7和MCF-7/ADR细胞内Rho123的聚集情况。A、B图中蓝色、粉色、红色和绿色峰分别表示DMSO,10μΜ和20μΜMogrol以及10μΜVPL处理的KB和KB/VCR细胞；C、D图中蓝色、橙色、红色和绿色峰分别表示DMSO,10μΜ和20μΜMogrol以及10μΜVPL处理的MCF-7和MCF-7/ADR细胞。应用双样本等方差T检验假设比较不同处理组之间的差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图5：罗汉果醇Mogrol对CFDA和Mitoxantone在细胞内聚集的影响。

KB/VCR和MCF-7/ADR细胞接种于12孔板，24h后加入相应浓度的Mogrol，37℃处理3h后，分别加入2μM CFDA或者3μM的MX，继续孵育45min，PBS清洗细胞，胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞内的荧光。激发光波长为488nm，CFDA发射光波长为530nm（FL1），MX发射光波长为630nm(FL3)。A,B和C为KB/VCR细胞内CFDA和MX的聚集情况；D为CFDA和MX在MCF-7/ADR细胞内的聚集情况。A、B图中蓝色，绿色和红色峰分别表示DMSO,10μΜ和20μΜMogrol处理的KB/VCR细胞，绿色峰表示KB细胞。

图6：罗汉果醇对P-gp糖蛋白ATP酶活性的影响。

RLU：Relative Light Units，相对光子数。ΔRLU表示罗汉果醇处理组的相对冷光值与对照组的相对冷光值之间的差值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

实施1：CCK-8试剂盒检测耐药细胞株对Mogrol的耐药倍数

实验材料：

Mogrol提取自植物罗汉果（有生产厂商及其货号吗），纯度不低于95%。人口腔癌细胞株KB及其耐药细胞株KB/VCR由中科院药物所提供，人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR及其耐药细胞株MCF-7/ADR，人结肠癌HCT-8及其耐药细胞株HCT-8/VCR均购自南京凯基生物公司。维拉帕米（VPL）、长春新碱(VCR)和阿霉素(ADR)购自罗氏化学公司，纯度都大于99%。CCK-8试剂盒购自同仁公司。

实验方法：

细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。

细胞传代培养

人口腔癌细胞株KB及其耐药细胞株KB/VCR培养于含有10%胎牛血清和1mM丙酮酸钠的α-MEM培养基中，人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR及其耐药细胞株MCF-7/ADR培养于含10%胎牛血清的1640培养基中。

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中生长至约90%汇合度（贴壁细胞）时，按照1:3到1:5的比例传代，约每隔2～4天传代一次。方法如下：

1)用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入1～2ml0.25%胰蛋白酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10%Gibco胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10%DMSO，40%DMEM和50%Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒中置于-80℃，5小时后移入液氮罐中保存。

CCK-8实验

KB和KB/VCR细胞以及MCF-7和MCF-7/ADR细胞都按照3500/孔的密度接种到96孔板中，24h后不同浓度的ADR，VCR，MOGROL以及VCR和MOGROL一起用含10%胎牛血清的α-MEM配好后被加到各个孔中。培养48h后，弃去培养液，每孔加入90μL不含血清的培养基和10μL CCK-8试剂。37℃反应2h后，酶标仪读取450nm波长的吸光值（OD450）。通过计算得到用药组相对于对照组的细胞增殖比率。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与药物同体积的DMSO，细胞存活率=（实验组OD450-空白组OD450）/（对照组OD450-空白组OD450）。通过IC₅₀值再计算耐药倍数（Resistance Fold，RF）。

RF=耐药细胞株的IC₅₀值/亲本细胞株的IC₅₀值。每个浓度设3个重复孔，实验重复3次。

表1Mogrol能够克服耐药细胞株的耐药性

所有耐药细胞系在生长抑制实验之前在无药物培养基中生长3天。每个数值是3个独立实验结果，IC₅₀以“均值±标准差”形式表示。VCR，长春新碱；ADR，柔红霉素；RF，耐药倍数。

实验结果：

KB/VCR和MCF-7/ADR是两种常用的多药耐药细胞株，在本实施例中，这两种细胞也表现出多药耐药的特性。如表1所示，KB/VCR细胞相对于KB细胞对VCR和ADR的耐药倍数分别为81.9倍和94.4倍，而MCF-7/ADR细胞跟MCF-7细胞相比对VCR和ADR的耐药倍数分别是38.1倍和20.9倍，显示实验所用耐药细胞具有多药耐药性，且MDR活性类似于文献报道的结果。罗汉果醇对亲本细胞株KB和MCF-7的半数抑制浓度IC₅₀分别为62.18μΜ和82.85μΜ，对耐药细胞株KB/VCR和MCF-7/ADR的IC₅₀分别为71.94μΜ和82.54μΜ，两者之间无显著性差别，多药耐药细胞株KB/VCR和MCF-7/ADR没有表现出对化合物罗汉果醇的交叉耐药，说明罗汉果醇可以逃脱耐药细胞的多药耐药性。罗汉果醇在40μΜ以下的浓度下，对细胞生长无明显的抑制，高于50μΜ的浓度下会抑制细胞的增殖。

结论：Mogrol能够克服耐药细胞株的耐药性，耐药细胞株对Mogrol的敏感性基本相同。

实施例2：CCK-8方法检测Mogrol对肿瘤细胞多药耐药活性的逆转作用

实验材料：同实施例1。

实验方法：

Mogrol增敏实验：KB/VCR,MCF-7/ADR和HCT-8/VCR细胞按照3500/孔的密度接种到96孔板中，24h后不同浓度的VCR，以及不同浓度的VCR和MOGROL一起用含10%胎牛血清的α-MEM配好后被加到各个孔中。培养48h后，弃去培养液，同实施实例1中方法，用CCK-8试剂盒测耐药细胞株及其亲本细胞对VCR和VCR+MOGROL的活性，绘成曲线。每个浓度设3个重复孔，实验重复3次。

实验结果：

KB/VCR细胞对VCR的耐药倍数为81.9倍，当加入10μM的MOGROL后，使KB/VCR细胞对VCR的敏感性增加了2.5倍（表2，图2B），而ADR对耐药细胞MCF-7/ADR的IC₅₀下降了8.2倍（图2D）,VCR对HCT-8/VCR的IC₅₀HCT-8下较降了2.9倍。Mogrol能够逆转肿瘤多药耐药细胞对化疗药物的耐药性。而这种效应在亲本细胞中表现并不明显（图2A,C）。

表2Mogrol逆转KB/VCR以及HCT-8/VCR细胞的多药耐药特性

*FR：Fold Reversal，逆转倍数，为细胞在没有Mogrol处理的情况下对VCR的IC₅₀除以细胞在有相应浓度的Mogrol处理下对VCR的IC₅₀所得到的比值。

结论：Mogrol可以逆转肿瘤多药耐药细胞KB/VCR和HCT-8/VCR的耐药性。

实施例3：流式细胞术检测Mogrol对VCR诱导的KB/VCR细胞凋亡的影响

实验材料：RNase A及PI均购自Sigma公司。

实验方法：

取对数生长期的KB/VCR和KB细胞，按5×10⁴个细胞/孔的密度接种12孔板，24h后待细胞进入对数生长期后加入Mogrol，VCR以及Mogrol和VCR的组合物。48h后，胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，并用预冷PBS清洗细胞两次，重悬于含0.03％的Triton X-100，200mg/ml RNase A和50μg/ml PI的PBS中。避光室温孵育15min后，流式细胞术检测。实验中VPL为阳性对照。由于凋亡过程中细胞产生的DNA碎片会导致细胞的DNA含量减少，因此通过流式细胞检测时在G1期峰的前面会出现一个sub-G1峰。通过计算sub-G1期细胞的所占总细胞的百分比可以反应凋亡细胞占所有细胞的比例。

实验结果：

如图3所示，KB/VCR细胞在80nM VCR单独处理的情况下，约有6.2%左右的细胞发生凋亡，当10μM或者20μM的罗汉果醇与80nM的VCR共同处理后，KB/VCR细胞的凋亡比例上升到14.4%和26.9%，是80nM VCR单独处理时的2.3倍和4.3倍，而10μM或者20μM的罗汉果醇单独处理对KB/VCR细胞的凋亡并无影响，实验中10μM的VPL为阳性对照。上述结果说明罗汉果醇可以促进VCR对耐药细胞KB/VCR的凋亡诱导作用，这种作用随着罗汉果醇浓度的增加而增强。

结论：Mogrol能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，增强VCR诱导的KB/VCR细胞的凋亡。

实施例4：流式细胞术检测Mogrol对细胞内罗丹明123、CFDA和Mitoxantone蓄积的影响实验材料：罗丹明123、CFDA和Mitoxantone购自Sigma公司。

实验方法：

KB/VCR和MCF-7/ADR细胞按照1×105/孔的密度接种到12孔板中，24h后加入不同浓度的Mogrol，继续培养3h后，加入5μM的罗丹明123、2μM的CFDA或者3μM的Mitoxantone，避光孵育30min后，PBS清洗两遍除去细胞表面残留的染料。胰酶消化收集细胞，流式细胞术检测。激发光波长为488nm，罗丹明123和CFDA发射光波长为530nm（FL1），MX发射光波长为630nm(FL3)。

实验结果：

罗丹明123是P-gp糖蛋白的特异性底物（是唯一的或者特异性底物吗？），通过488nm波长的激光激发后能够产生绿色荧光，可以通过荧光显微镜观察和流式细胞术检测。结果如图4所示。在没有罗汉果醇处理的情况下，Rho123在KB/VCR细胞内聚集非常少，经过3小时10μM罗汉果醇处理后，荧光显微镜下观察，细胞内的绿色荧光（Rho123）有所增强，20μM罗汉果醇处理3h后，细胞内的荧光强度明显增强。

在KB/VCR和MCF-7/ADR细胞中，另外两种ABC转运蛋白MRP1和ABCG2也呈现出高表达的状态，罗汉果醇逆转耐药的作用也可能是通过抑制这两种蛋白质的功能实现的。因此应用同样的方法，通过流式细胞仪分别检测了罗汉果醇对MRP1和ABCG2的特异性底物CFDA和Mitoxantone在KB/VCR和MCF-7/ADR细胞内聚集的影响。结果如图5所示。DMSO对照组和罗汉果醇处理组的细胞对两种染料的聚集没有表现出明显差异，提示罗汉果醇对MRP1和ABCG2蛋白的转运功能无明显影响。

结论：罗汉果醇能够抑制P-gp糖蛋白对药物的转运功能（罗丹明被视为与药物转运途径相同吗）是的。，是P-gp糖蛋白的调节剂；罗汉果醇对MRP1和ABCG2蛋白的转运功能无明显影响。

实施例5：P-gp GLO^TM试剂盒检测MOGROL对P-gp糖蛋白ATP酶活性的影响

实验材料：P-gp GLO试剂盒购自Promega公司

实验方法：

为了测试MOGROL对P-gp活性的影响，采用promega公司的P-gp-Glo^TM试验系统测定P-gp蛋白ATP酶活性的变化，操作方法参照试剂盒说明书。胆矾酸钠（Na₃VO₄）为P-gp蛋白ATP酶活性的抑制剂。首先将不同浓度的MOGROL和5mM MgATP，25μg重组的人类P-gp蛋白膜组分混合，37℃温育40min后，加入ATP检测缓冲液，室温孵育20min。将待测混合液转入96孔白板中，应用多重检测系统测定冷光读数。将测得的冷光值减去Na₃VO₄处理的样品的冷光值，即得到该样品的冷光值的相对变化值（ΔRLU）。

实验结果：

通过计算ΔRLU的值，可以反映P-gp蛋白对ATP的消耗情况，间接反映P-gp蛋白的ATP酶活性。结果如图6所示。随着罗汉果醇浓度的增加，反应体系内ATP的消耗量逐渐增多，测得的冷光值与对照组之间差异逐渐加大。罗汉果醇刺激P-gp糖蛋白ATP酶活性的半最大效应浓度（EC50）约为37.51μM。

结论：罗汉果醇能够促进P-gp糖蛋白的ATPase活性，通过竞争性的方式抑制P-gp糖蛋白对目标药物的外排作用Mogrol可以促进P-gp蛋白的ATP酶活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.Mogrol在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的应用是Mogrol在制备抗肿瘤药物的耐药逆转剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，Mogrol是肿瘤多药耐药逆转剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌或胰腺癌。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，Mogrol是抗肿瘤药物的增敏剂。

6.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物的有效成分是抗肿瘤药物和Mogrol。

7.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是细胞周期特异性药物或者细胞周期非特异性药物。

8.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。

9.一种促使体外耐药肿瘤细胞增敏的方法，其特征在于，在耐药肿瘤细胞的培养基中加入Mogrol。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或者胰腺癌。