CN102526073A

CN102526073A - 罗汉果醇h9在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102526073A
Application number: CN2012100024350A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 刘祖龙; 唐丽莎; 胡立宏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属于化工及医药技术领域，具体为涉及化合物H9在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了化合物H9在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、肺腺癌细胞、肺腺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。化合物H9属于天然产物，毒副作用小、生物利用度高、性质稳定,具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

罗汉果醇 H9 在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药技术领域，具体涉及一种葫芦烷型四环三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

本发明涉及的葫芦烷型四环三萜类化合物结构式如下：

Figure 2012100024350100002DEST_PATH_IMAGE002

其CAS号为64675-48-5，在本发明中简称为H9, 有俗称为罗汉果醇。

H9在罗汉果中被发现，但是含量很低，较难大批量的分离纯化。申请号为200710039126、发明名称为“罗汉果醇的提纯制备方法”的中国发明专利公开了一种H9的提纯制备方法。该方法包括步骤：（１）先将罗汉果粉碎，加入乙醇提取得醇浸膏；（２）醇浸膏悬浮于水，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏，取母液；（３）母液中加入盐酸溶液和乙酸乙酯，加热进行酸水解；水解后分取乙酸乙酯层，用碱液调节至中性，分离乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到含H9的浸膏；（４）将浸膏进行硅胶柱层析，氯仿洗脱，回收氯仿；再用氯仿－甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得罗汉果醇粗品；（５）取罗汉果醇粗品进行重结晶，即得纯度大于９５％以上的罗汉果醇。通过酸水解制备高纯度H9的简便方法，相对而言，具有纯度高、得率高、工艺简单、成本低等优点。

MOTOHIKO UKIYA等报道，H9对EB病毒抗原有一定的抑制作用（Inhibitory Effects of Cucurbitane Glycosides and Other Triterpenoids from the Fruit of Momordica grosvenori on Epstein−Barr Virus Early Antigen Induced by Tumor Promoter 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate， J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 6710-6715）。

H9是一种天然产物，生物利用度较高、性质较稳定, 具有临床使用价值。随着人们对此类生物碱的化学和生物学研究的深入, 其分子作用机制将逐步明确, 这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究, 并有助于提高此类化合物的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供H9的新的药物用途。

本发明提供H9在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤是由HepG2细胞或者Focus细胞引起的肿瘤，尤其是肿瘤是肝癌或者胃癌。

所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌、抗胃癌、抗胰腺癌、抗宫颈癌、抗肺腺癌、抗白血病或者抗乳腺癌的药物。

所述的抗肿瘤药物的剂型可以是针剂或者片剂。

本发明还提供一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将H9加入肿瘤细胞的培养液中。

所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、肺腺癌细胞、肺腺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是SMMC-7721、Focus、QGY和HepG2。

一般而言，加入H9的终浓度为1-100μM。例如，1-5μM，1-10μM，3-10μM，1-20μM，3-30μM，1-40μM，5-20μM，10-40μM，1-50μM，3-36μM，15-25μM，5-50μM，15-50μM，25-40μM，5-40μM，5-30μM，10-20μM，5-100μM，3-100μM，15-100μM，等等。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是H9。所述的肿瘤可以是肝癌、肺腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌或者血癌。

本发明的小分子化合物（H9）可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与H9 发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8， pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的H9 为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的H9 可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的H9 还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的H9 被用作药物时，可将治疗有效剂量的H9施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了H9在制备抗肿瘤药物中的应用。H9是天然产物，副作用较小，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

实验方法：

1. 细胞复苏

1) 从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2) 从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3) 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10% Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，SMMC-7721和HepG2等细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml 青霉素和100μg/ml链霉素。

细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90%汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25 cm²传代于一个75 cm² 的培养瓶中。方法：

1) 用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2) 加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3) 用含10-15%的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

细胞冻存

1) 取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2) 弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10% DMSO，40% DMEM和50% Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5- 1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1 -1.5ml。

3) 将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4. 药物准备：

H9溶于DMSO(二甲基亚砜),配制成100mM或50mM的母液备用。

实施例1 MTS法测定H9对肝癌细胞的生长抑制作用

HepG2（购自ATCC）3×10³ /孔接种至96孔板,培养24小时使之贴壁后加入H9（中国科学院上海药物研究所），设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5% CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒（Promega 公司）测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100 μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液（10 ml无血清培养基中加入2 ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀）。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值（参考波长630-700 nm，测定波长490 nm），计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算H9对HepG2细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HepG2细胞数量为对照的一半时H9的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：H9对HepG2细胞的IC50值为3.50μM。

用同样的方法测试Focus细胞（购自中科院细胞库），结果H9对Focus细胞的IC50值为约13.73μM。

用同样的方法测试QGY细胞（购自ATCC），结果H9对QGY细胞的IC50值为约68.80μM。

上述结果表明，H9对肝癌细胞HepG2、Focus有较好的抑制效果，对QGY细胞也有一定的抑制作用。

实施例2 H9对人胰腺癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒（日本同仁化学研究所）检测。

步骤：

1) 将PANC-1细胞（购自中国科学院细胞库）均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为3*10³个。

2) 待贴壁，过夜后加药，加药（H9浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM），每个浓度有3个复孔。

3) 培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10：1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4) 以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：H9对PANC-1细胞的IC50值为283.8μM。

上述结果表明，H9对胰腺癌细胞PANC-1有一定的抑制作用。

实施例3 H9对人胃癌细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测H9对HGC的作用，结果显示H9对HGC细胞（购自ATCC，American Tissue Culture Collection，美国组织培养库）的IC50值为103.69μM。

上述结果表明，H9对胃癌细胞HGC细胞有一定的抑制作用。

Claims

1.化合物H9在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌或者胃癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是由HepG2细胞或者Focus细胞引起的肿瘤。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的剂型是针剂、片剂或者胶囊。

6.一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将H9加入肿瘤细胞的培养液中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞或者胃癌细胞。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加入H9的终浓度为1-100μM。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的活性成分是化合物H9。

10.如权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌或者胃癌。