CN103127060A

CN103127060A - 银线草醇d在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN103127060A
Application number: CN2011103865283A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 刘祖龙; 胡立宏; 唐丽莎; 朱恒锐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括肝癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞或者乳腺癌细胞。银线草醇D属于天然产物，生物利用度高、性质稳定，具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

银线草为金粟兰科植物银线草(Chloranthus Japonicus Sieb)的全草或根及根茎。倍半萜类化合物是金粟兰科植物中比较重要的一类化合物，在整个金粟兰科植物中均有分布，具有消炎解痉、抑制微生物等生物活性。银线草中得到半萜类化合物结构复杂其骨架可分为桉叶烷型、环桉烷型、吉马烷型、菖蒲烷型等数种类型，同时它们具有内酯、酮、醇、多聚体等多种形式。

银线草全株供药用，具有祛湿散寒、活血止痛、散瘀解毒之功效。民间验方有许多有关银线草的记载，如银线草外敷可治疗疮疖、疥癣、无名肿毒、蛇咬伤、乳腺炎等疾病。

Kawabata等1990年首次从银线草中分离出了1个由2个环桉型倍半萜内酯聚合而成的二聚体化合物，命名为银线草醇A(shizukaol A)，在1992年从银线草中分离得到了3个由2个环桉型倍半萜内酯聚合而成的二聚体化合物，命名为银线草醇B-D(shizukaol B-D)。

申请号为200910095051.6、申请日为20091013、名称为“乌药烷型二聚倍半萜类化合物，其制备方法及其在制药中的应用”的中国发明专利申请中详细阐述了银线草醇D的制备方法，并且表明银线草醇D能够明显增加L6细胞葡萄糖的消耗量，提示其能够促进胰岛素的作用，促进糖的摄取和转运。

银线草醇D，英文名为Shizukaol D，CAS No.：142279-42-3。其结构式如下：

银线草醇D是天然产物，生物利用度较高、性质较稳定，具有临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入，其分子作用机制将逐步明确，这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究，并有助于提高此类化合物的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供银线草醇D的药物用途。

本发明提供了银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌、抗胃癌、抗胰腺癌、抗宫颈癌、抗白血病或者抗乳腺癌的药物。该抗肿瘤药物可以是针剂或者片剂。

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将银线草醇D加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、肺腺癌细胞、胃癌、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是SMMC-7721、Focus、QGY和HepG2。一般而言，加入银线草醇D的终浓度为1-100μM。例如，1-5μM，1-10μM，5-10μM，1-20μM，5-30μM，1-60μM，5-90μM，10-40μM，1-50μM，5-60μM，15-25μM，5-50μM，15-60μM，25-40μM，5-40μM，等等。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是银线草醇D。所述的肿瘤可以是肝癌、肺腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌或者血癌。

本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与银线草醇D发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拈抗剂等。

本发明及其抑制剂、拈抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的银线草醇D为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的银线草醇D可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的银线草醇D还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的银线草醇D被用作药物时，可将治疗有效剂量的银线草醇D施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用。银线草醇D是天然产物，副作用较小，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

具体实施方式

实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，SMMC-7721和HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4.药物准备：

银线草醇D溶于DMSO(二甲基亚砜)，配制成100mM或50mM的母液备用。

实施例1MTS法测定银线草醇D对肝癌细胞的生长抑制作用

HepG2(购自ATCC)3×10³/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入银线草醇D(购自中国科学院上海药物研究所)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算银线草醇D对HepG2细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HepG2细胞数量为对照的一半时银线草醇D的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：银线草醇D对HepG2细胞的IC50值为25.40μM。

用同样的方法测试SMMC-7721细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对SMMC-7721细胞的IC50值为约15.17μM。

用同样的方法测试Sk-hep1细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对Sk-hep1细胞的IC50值为约11.50μM。

用同样的方法测试QGY细胞(购自ATCC)，结果银线草醇D对Sk-hep1细胞的IC50值为约16.10μM。

用同样的方法测试Focus细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对Sk-hep1细胞的IC50值为约5.70μM。

实施例2银线草醇D对人胰腺癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。

步骤：

1)将PANC-1细胞(购自中国科学院细胞库)均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为3×10³个。

2)待贴壁，过夜后加药，加药(银线草醇D浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM)，每个浓度有3个复孔。

3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10∶1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：银线草醇D对PANC-1细胞的IC50值为13.26μM。

实施例3银线草醇D对人乳癌细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测银线草醇D对MCF-7的作用，结果显示银线草醇D对MCF-7细胞的IC50值为9.41μM。

实施例4银线草醇D对人肺腺癌细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测银线草醇D对A549的作用，结果显示银线草醇D对A549细胞的IC50值为478μM。

实施例5银线草醇D对人胃癌细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测银线草醇D对HGC的作用，结果显示银线草醇D对HGC细胞(购自ATCC，American Tissue Culture Collection，美国组织培养库)的IC50值为10.05μM。

实施例6银线草醇D对人宫颈癌细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测银线草醇D对HELA的作用，结果显示银线草醇D对HELA细胞(购自ATCC，American Tissue Culture Collection，美国组织培养库)的IC50值为38.22μM。

实施例7银线草醇D对人白血病细胞的生长抑制作用

按照实施例2的方法检测银线草醇D对K562的作用，结果显示银线草醇D对K562细胞(购自ATCC，American Tissue Culture Collection，美国组织培养库)的IC50值为2.58μM。

Claims

1.银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、白血病或者乳腺癌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗宫颈癌药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的剂型是栓剂、洗剂、片剂或者胶囊。

5.一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将银线草醇D加入肿瘤细胞的培养液中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞或者宫颈癌细胞。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，加入银线草醇D的终浓度为1-100μM。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，加入银线草醇D的终浓度为5-40μM。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是银线草醇D。

10.如权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、白血病或者乳腺癌。