CN105213369B - 银线草醇d在制备治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了银线草醇D在制备抗肝癌药物中的应用，所述的抗肝癌药物是抑制或者延缓细胞迁移的药物。在肝癌细胞的培养液中加入银线草醇D，能够明显减缓肝癌细胞的划痕愈合，明显减缓肝癌细胞的迁移速度。银线草醇D属于天然产物，生物利用度高、性质稳定,具有临床使用价值。本发明的小分子化合物银线草醇D抑瘤效果明显，绿色环保，可作为新的抗肝癌药物或者其辅助成分进行开发，为治疗和治愈肝癌提供了新的途径和手段。

Description

银线草醇D在制备治疗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及银线草醇D在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。

肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要代谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤将导致未及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富的血流供应，与人体的重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤发病隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。

目前，治疗方法包括手术、肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波以及化疗和放射治疗等方法。生物治疗,中医中药治疗肝癌也多有应用。目前肝癌的治疗以手术为首，这是因为放疗和化疗的副作用。许多化疗药物对正常细胞也有杀伤作用，导致患者自身免疫系统在治疗过程中收到较大损伤。副作用较少的药物凤毛麟角，因此寻找新的候选化合物是肝癌预防和治疗的重要课题。

银线草为金粟兰科植物银线草(Chloranthus Japonicus Sieb)的全草或根及根茎。倍半萜类化合物是金粟兰科植物中比较重要的一类化合物，在整个金粟兰科植物中均有分布，具有消炎解痉、抑制微生物等生物活性。银线草中得到半萜类化合物结构复杂其骨架可分为桉叶烷型、环桉烷型、吉马烷型、菖蒲烷型等数种类型，同时它们具有内酯、酮、醇、多聚体等多种形式。

银线草全株供药用，具有祛湿散寒、活血止痛、散瘀解毒之功效。民间验方有许多有关银线草的记载，如银线草外敷可治疗疮疖、疥癣、无名肿毒、蛇咬伤、乳腺炎等疾病。

Kawabata等1990年首次从银线草中分离出了1个由2个环桉型倍半萜内酯聚合而成的二聚体化合物，命名为银线草醇A(shizukaol A)，在1992年从银线草中分离得到了3个由2个环桉型倍半萜内酯聚合而成的二聚体化合物，命名为银线草醇B-D(shizukaol B-D)。

申请号为200910095051.6、申请日为20091013、名称为“乌药烷型二聚倍半萜类化合物,其制备方法及其在制药中的应用”的中国发明专利申请中详细阐述了银线草醇D的制备方法，并且表明银线草醇D能够明显增加L6细胞葡萄糖的消耗量，提示其能够促进胰岛素的作用，促进糖的摄取和转运。

银线草醇D，英文名为Shizukaol D，CAS No.：142279-42-3。银线草醇D是天然产物，生物利用度较高、性质较稳定,具有临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入,其分子作用机制将逐步明确,这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究,并有助于提高此类化合物的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供银线草醇D的药物用途。

本发明提供了银线草醇D在制备抗肝癌药物中的应用，所述的银线草醇D抑制或者延缓肝癌细胞迁移。

本发明所述的肝癌物药物制成针剂或者片剂。

本发明所述的肿瘤来源于smmc-7721、SK-hep1、HepG2、QGY、Hep3B或者FOCUS细胞。

本发明中,所述的抗肝癌药物可以是银线草醇D和其他治疗肝癌药物的组合物。例如,所述的其他治疗肝癌药物是索拉菲尼。

另一方面,本发明提供将银线草醇D加入体外培养的肿瘤细胞的培养液中，抑制该肿瘤细胞的迁移和生长的方法；

其中,体外培养的肿瘤细胞的培养液中,加入的银线草醇D的药物浓度大于0且小于50μmol/L。

一般而言，加入银线草醇D的终浓度为1-100μM。例如，1-5μM，1-10μM，5-10μM，1-20μM，5-30μM，1-60μM，5-90μM，10-40μM，1-50μM，5-60μM，15-25μM，5-50μM，15-60μM，25-40μM，5-40μM，等等。较好的,银线草醇D的药物浓度小于20μmol/L。

本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是SMMC-7721。

本发明所述的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

以本发明的银线草醇D为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的银线草醇D可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的银线草醇D还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的银线草醇D被用作药物时，可将治疗有效剂量的银线草醇D施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了银线草醇D在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是银线草醇D在制备能够明显抑制肝癌细胞的迁移抗肿瘤药物中的应用。肿瘤的发生是由于细胞增殖与分化的异常；侵袭和转移是肿瘤的另一特征；肿瘤细胞较正常细胞有着更强的变形和运动能力。本发明实验结果的生长曲线表明，银线草醇D能够抑制肿瘤细胞的增殖；用划痕试验检测细胞的迁移能力，结果显示，划痕24h后，肿瘤细胞SMMC-7721和FOCUS细胞较未加入银线草醇D的阴性对照组迁移速度减缓，说明银线草醇D能明显抑制细胞的迁移能力。银线草醇D具有抑制细胞的增殖及迁移能力，可以作为治疗肝癌药物的先导化合物。

本发明的小分子化合物银线草醇D是天然产物，绿色环保，副作用较小。可作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，为治疗和治愈肿瘤提供新的途径和手段。

附图说明

图1是focus细胞划痕结果图，

其中，加药与未加药组，划痕的宽度分别为562和546微米，经过24小时，划痕的宽度变为分别是424和518微米；

如图1所示，10微摩银线草醇D处理48小时后的focus细胞，与未加药的对照组相比，细胞迁移速度明显减慢，细胞密度明显较低，因而划痕愈合也较慢。

图2是SMMC-7721的划痕宽度统计柱状图，

其中，纵坐标是划痕的宽度，单位为微米；

与未加药的对照组相比，10微摩银线草醇D处理48小时后的SMMC-7721细胞，24小时后划痕宽度减小较慢。

具体实施方式

本发明实施例中，采用的实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，SMMC-7721和HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4.药物准备：

银线草醇D溶于DMSO(二甲基亚砜),配制成100mM或50mM的母液备用。银线草醇D，英文名为Shizukaol D，CAS No.：142279-42-3。其结构式如下：

实施例1MTS法测定银线草醇D对肝癌细胞的生长抑制作用

HepG2(购自ATCC)3×10³/孔接种至96孔板,培养24小时使之贴壁后加入银线草醇D(购自西力药业)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算银线草醇D对HepG2细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HepG2细胞数量为对照的一半时银线草醇D的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：银线草醇D对HepG2细胞的IC50值为25.40μM。

用同样的方法测试SMMC-7721细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对SMMC-7721细胞的IC50值为约15.17μM。

用同样的方法测试Sk-hep1细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对Sk-hep1细胞的IC50值为约11.50μM。

用同样的方法测试QGY细胞(购自ATCC)，结果银线草醇D对QGY细胞的IC50值为约16.10μM。

用同样的方法测试Focus细胞(购自中科院细胞库)，结果银线草醇D对Focus细胞的IC50值为约5.70μM。

实施例2银线草醇D对人肝癌细胞的迁移效果的影响

划痕实验步骤：

按照2-5x10⁵个细胞传代一个75cm²细胞培养中瓶。待肿瘤细胞贴壁后加入终浓度为5μM的银线草醇D，培养24小时。Pbs洗1次，然后胰酶消化，离心，计数，准备接种6孔板。

先用marker笔在6孔板背后做标记。划痕大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在空中加入约2-4x10⁵个已经加药或者对照组细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基或者含有2％胎牛血清的DMEM培养基。取样，拍照。

放入37度5％CO₂培养箱，培养。24小时时取样，拍照。

结果显示，与不加药的对照相比较，银线草醇D能够显著抑制肝癌细胞的迁移。

如图1所示，10微摩银线草醇D处理48小时后的focus细胞，与未加药的对照组相比，细胞迁移速度明显减慢，细胞密度明显较低，因而划痕愈合也较慢。

图2是SMMC-7721的划痕宽度统计柱状图。0小时时，划痕宽度几乎一样。无血清培养24小时后，与未加药的对照组相比，10微摩银线草醇D处理48小时后的SMMC-7721细胞，24小时后划痕宽度减小较慢。

Claims (9)

1.银线草醇D在制备抗肝癌迁移药物中的应用，其特征在于，所述的应用是银线草醇D抑制或者延缓肝癌细胞迁移。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肝癌迁移药物是针剂或者片剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝癌细胞来源于smmc-7721、SK-hep1、Hep3B或者FOCUS细胞。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肝癌迁移药物是银线草醇D和其他治疗肝癌药物的组合物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的其他治疗肝癌药物是索拉菲尼。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将银线草醇D加入体外培养的贴壁肝癌细胞的培养液中，抑制该贴壁肝癌细胞的运动。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将银线草醇D加入体外培养的肝癌细胞的培养液中，抑制该肝癌细胞的迁移。

8.如权利要求6或者7所述的应用，其特征在于，银线草醇D的药物浓度大于0且小于50μmol/L。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，银线草醇D的药物浓度大于0且小于20μmol/L。