CN103191119A - 伊曲康唑抑制Akt激酶活性的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供伊曲康唑用于抑制Akt激酶的新用途，以及施用伊曲康唑和2S，4R，2′S-伊曲康唑作为治疗和预防相关疾病的方法。

Description

伊曲康唑抑制Akt激酶活性的用途

技术领域

本发明涉及一种方法，这种方法能降低受试者组织中Akt激酶活性。伊曲康唑和2S，4R，2′S-伊曲康唑是本发明有效的Akt激酶活性抑制剂。本发明还公开了一种施用伊曲康唑立体异构体抑制肿瘤生长的方法。

背景技术

Akt激酶，也被称为蛋白激酶B(PKB)，对细胞的存活、代谢、增殖和生长起着至关重要的作用(Yang Z-Z等，Physiological functions ofprotein kinase B/Akt.Biochem SocTrans.2004；32：350-54)。超活化的Akt激酶是人类恶性肿瘤中发现的一种最常见的分子(Hennessy BT等，Nat Rev Drug Discov.2005；4：988-1004)。在约40％的乳腺癌和卵巢癌和大于50％的前列腺癌中观察到Akt1活性的增加。因此，Akt被认为是作为癌症治疗的潜在靶点。在过去的几年中，具有不同的结构特征的多个系列的化合物作为Akt抑制剂被广泛报道。(Hirai，H等，MK-2206，an allosteric Akt inhibitor，enhanced antitumor efficacy bystandard chemotherapeutic agent or molecular targeted drugsinvitro and invivo.Mol CancerTher；2010，1956-1967；Rhodes，H等，Characterization of an AKT inhibitor with potentpharmacodynamic and antitumor activity.Cancer Res.2008，2366-2374；Luo，Y等，Potent andselective inhibitors of AKT kinase slow the progress of tumors in vivo.Mol Cancer Ther；2005，977-986)。

最近的研究发现，伊曲康唑，一种用于治疗真菌感染的老药，显示良好的抑制Akt激酶的活性。

发明概要

一方面，本发明提供了一种抑制受试者Akt激酶活性的方法，所述方法包括给予有效量的伊曲康唑的步骤。

另一个方面，本发明提供一种抑制受试者Akt激酶活性的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的2S，4R，2′S-伊曲康唑的步骤。

再一个方面，本发明提供伊曲康唑一种新的用途，用于制备抑制Akt激酶活性的药物的用途。

再一个方面，本发明提供伊曲康唑一种新的用途，用于制备治疗肿瘤疾病的药物的用途。

附图说明

图1：伊曲康唑及其不同的立体异构体的肝毒性实验结果

图2：伊曲康唑及其不同的立体异构体对人的肝细胞毒性实验结果

图3：伊曲康唑及其不同的立体异构体的GSH耗竭实验结果

图4：伊曲康唑及其不同的立体异构体小鼠肝毒性实验小鼠肝脏形态图

发明内容

本发明是基于发现一种用于治疗真菌感染的老药一伊曲康唑，是一种有效的Akt激酶活性抑制剂。这种发现现有药物新用途的研究方法，具有明显的优势。它可以加快药物开发的过程。由于这些药物的毒性、药代动力学和临床特点已被广泛熟知，活性化合物可以作为新的治疗方法进行临床研究和评估。

用于治疗真菌感染的商业用伊曲康唑为下所示的四个化合物(A，B，C和D)以1∶1∶1∶1比例的外消旋混合物。众所周知，不同的立体异构体可能显示完全不同的生物活性、毒性和药代动力学性质。利用现代超临界流体色谱(SFC)分离商业用的伊曲康唑，获得四个独立的顺式非对映异构体A，B，C和D。当然，非对映异构体A，B，C和D也可以通过不对称合成方法获得。

利用与标准品(来源于美国约翰霍普金斯大学药学院刘钧教授实验室)对比证实其结构：A是2S，4R，2′R；B是2R，4S，2′R；C是2S，4R，2′S；D是2R，4S，2′S。

表1：用SFC分离的A-D化合物的旋光度数据

我们在对伊曲康唑生物活性的进一步的研究中发现，伊曲康唑具有显著的Akt激酶自身磷酸化的抑制作用。利用细胞测定方法，发现伊曲康唑及其立体异构体能有效地抑制Akt自身的磷酸化。在此项试验中，伊曲康唑抑制Akt激酶磷酸化的IC₅₀为0.3，其立体异构体A、B、C和D的IC₅₀值分别为0.3、0.8、0.2和1.1μM。此项实验进一步展示了立体异构体A和C对Akt激酶的抑制作用。这项实验结果在之前的文献中从未被报道过，是对已知的伊曲康唑抑制VEGFR-2作用外的靶点又一新发现。

伊曲康唑被认为由CYP 3A4代谢，临床上高剂量和长期使用会引起肝酶升高。提高治疗指数的一种方法是选择一个强而有力的Akt抑制剂，同时减少潜在毒性。对伊曲康唑的四个立体异构体进行了筛选，进行人类肝毒性和谷胱甘肽耗竭分析(GSH depletionassays)。在这些实验中，立体异构体C和D表现出更好的安全性。而立体异构体C和D有相同的2′S结构。

立体化学构型对伊曲康唑抑制Akt活性和安全性有着重要影响，这表明伊曲康唑的立体异构体可能参与与靶点和其他代谢酶的立体相互作用。因此，本发明提供了手性纯的2S，4R，2′S-伊曲康唑的施用方法。本文所述的术语“手性纯”是指基本上不含任何其它立体异构体。一种基本上不含任何其它立体异构体的化合物是指，该化合物由高比例的该立体异构体组成，而非它的光学对映体(在光学异构体的情况下)，或任何其它的非对映异构体(当这种化合物具有一个以上的立体中心的情况下)。在本发明中，基本上不含任何其它的立体异构体的化合物是指由至少约90％(重量)的指定的立体异构体和约10％(重量)或更少的任何其他的立体异构体所组成。另一方面，本发明所述的基本上不含任何其它的立体异构体的化合物是由至少约95％重量的该立体异构体的和大约5％或更少重量的任何其他的立体异构体所组成的化合物。此外，本发明所述基本上不含任何其它的立体异构体的化合物，是指由至少约97％重量该立体异构体和约3％或更少重量的任何其他的立体异构体所组成的化合物。上述百分比是基于立体异构体组合的化合物的总量。

本发明的化合物，伊曲康唑和2S，4R，2′S-伊曲康唑，及它们药学上可接受的盐，可用于治疗动物和患者，通过任何合适的给药途径，包括口服、非肠道(如静脉内、腹膜内和皮下)、透皮、眼内和局部给药，一般优选的给药途径是本发明提及可治疗的任何疾病的口服给药。

本发明的化合物可作为唯一的活性药剂给药，也可以组合使用，与一个或多个本发明的化合物或其它试剂。作为组合物给药时，治疗剂可以配制成单独的组合物，该组合物可同时间或不同时间给药，该治疗剂可作为单一组合物给药。

基于本发明描述的用于治疗疾病的治疗有效量的上述化合物的药物组合物，任选地与药学上可接受的添加剂、载体和/或赋形剂相结合。本技术领域的普通技术人员将认识到，本发明的一种及多种化合物的治疗有效量，会随着某些因素而改变，如感染或治疗的条件、其严重程度、采用的治疗方案、制剂的药代动力学，以及治疗的患者(动物或人)等因素。

为了制备本发明的药物组合物，根据本发明的化合物的治疗有效量的药物组合物，优选能与药学上可接受的载体充分混合，根据常规的药物混合技术产生一个剂量。载体可以采取各种各样的形式，取决于制剂所需的给药形式，例如口服、局部或肠胃外，包括凝胶、霜剂、软膏、洗剂和释放植入制剂等众多形式。在制备口服剂量形式的药物组合物中，可以使用任何常用的药物介质。因此，对于液体口服制剂，如悬浮液、酏剂和溶液，合适的载体和添加剂包括水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂和其他类似物等。对于固体口服制剂，如粉剂、片剂、胶囊剂，和栓剂等固体制剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖载体，如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖和相关载体，稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。如果需要的话，片剂或胶囊剂可以是通过标准技术制成肠溶或缓释。

活性化合物可包含在药学上可接受的载体中或稀释，以给药产生足以治疗适应症的有效剂量，而不引起严重的毒性作用。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可封入明胶胶囊或压成片剂。对于口服治疗给药，活性化合物可与赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。药物相容性的结合剂和/或辅助材料，可作为该组合物的一部分。

片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂及其类似物可以包含任何下列成分或类似性质的化合物：粘结剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；分散剂如作为藻酸或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，它可以包含液体载体如脂肪油。此外，剂量单位形式可含有改变剂量单位物理形式的各种其它材料，例如涂层的糖、紫胶、或肠溶制剂。

适用于本发明口服给药的制剂可作为独立的单位，如胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为含水液体或不含水的液体中的悬浮液；或作为水包油型液体乳液或油包水型乳液；作为大丸剂等等。

片剂可通过压制或模制，任选一种或多种辅助成分。压制的片剂可在合适的机器中制备，其中有效成分以粉末或颗粒的自由流动形式进行压缩，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制的片剂可在合适的机器中制备，用一种惰性液体稀释剂润湿粉末状化合物，混合成型。片剂可以任选地被涂覆或刻痕，并可以配制成缓释或控释制剂，以便活性成分的释放。

制备药物活性成分组合物的缓释或控释制剂的方法，在本领域中是已知的，并在几项已发表的美国专利中得以描述，这些专利包括但不限于：美国专利号3870790、4226859、4369172、4842866和5705190。涂料包裹可作为小肠给药的化合物使用。(参见如美国专利号6638534、5541171、5217720、和6569457，以及其列出的参考文献)。

其活性化合物或其药学上可接受的盐也可以作为以下剂型的组成部分施用：酏剂、悬浮液、糖浆、晶片、口香糖或类似物。除了含有活性化合物外，糖浆还可以含有蔗糖或果糖作为增甜剂和某些防腐剂、染料和着色剂和香料等。

用于肠胃外、真皮内、皮下、或局部施用的溶液或悬浮液可包括下列组分：无菌稀释剂，如水注射液、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和等渗调节剂，如氯化钠或葡萄糖。

制备的活性化合物与载体，将保护化合物以免其从体内迅速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊包封的给药系统。可使用可生物降解的，生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这种制剂的制备方法对本领域中的技术人员是显而易见的。

所属领域的技术人员将认识到，除了片剂，可以配制其它剂型以使活性成分缓释或控释。这样的剂型包括但不限于：胶囊剂、制粒和软胶囊。

脂质体悬浮液也可以是药学上可接受的载体。这些可以根据本技术领域的技术人员已知的方法制备。例如，脂质体制剂可以通过以下方法制备：使相应的脂质溶解在无机溶剂中，然后蒸发，在容器的表面上留下薄膜的干脂质，然后在容器中引入活性化合物的水溶液。然后用手旋转该容器，使自由脂质材料从容器的两侧分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。本领域普通技术人员公知的其它方法制备，也可以在本发明中使用。

为方便施用，该制剂可以单位剂量的形式提供，并可通过常规的制药技术来制备。这样的技术包括将相应的活性成分和药用载体或赋形剂混合的步骤。在一般情况下，制备的制剂将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者，均匀和紧密地混合，然后，如有必要，将产物成形。

适合于在口腔中局部给药的制剂和组合物在调味的基础上包括以下成分的锭剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；含有活性成分的惰性软锭剂包括明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；漱口水，包括合适给药的液体载体。

适于皮肤局部给药的制剂可制成软膏剂、乳膏剂、凝胶剂和糊剂，作为药物上可接受的载体给药。一种优选的局部给药系统是含有该成分给药的透皮贴剂。

用于直肠给药的制剂可用合适的碱制成的栓剂，这些碱如可可脂或水杨酸盐。

适于经鼻给药的制剂，其特征在于，所述载体是一种固体，包括具有一个粗粉末的颗粒尺寸，如在20-500微米的范围内，通过鼻烟给药的方式，即，容器的粉末通过快速吸入从鼻腔通到鼻子。合适的制剂，其特征在于，所述载体是一种液体，如喷鼻剂或滴鼻剂，包括活性成分的水或油溶液。

适于阴道给药的制剂可作为阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其含有除了活性成分外，载体是本领域已知的和合适的。

肠胃外制剂可封入安瓿、一次性注射器或玻璃、塑料制成的多剂量小瓶中。如果静脉给药，优选的载体包括：例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

对于非肠道配方，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液；其它成分，包括那些酸性分散体。当然，使用的无菌水需要保持无菌状态，其组合物和载体也必须灭菌。也可以制备注射悬浮液，其中可采用适当的液体载体、悬浮剂及类似物等。

适合肠胃外给药的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂的预期接收者血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，可以包括悬浮剂和增稠剂，该制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶中，并可在的冷冻干燥(冻干)条件下存储，仅需要加入无菌液体载体，例如使用前加入的注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以从上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备得到。

活性化合物的给药频率和范围可以是连续(静脉滴注)到几天的每日口服给药(例如Q.I.D每日四次)，可包括口服、局部、眼部、胃肠外、肌内、静脉内、皮下，透皮(可包括渗透促进剂)、颊和栓剂给药，还包括通过眼睛或眼部的给药途径。

受试者的治疗应用可以是在原本的部位，也可以在需要的部位施用。多种技术可以让受试者的组合物在需要的部位施用，如注射剂，使用导管、套管、弹丸、支架、持续药物释放的聚合物、或其他用于内部放置的装置。从患者身上移摘的器官或组织，可浸入到含有本发明组合物的培养液中，本发明组合物可涂到该器官上，或可以其他任何方便的方式使用。

该方法特别适合用于治疗眼部疾病，如青光眼、增殖性玻璃体视网膜病变、黄斑水肿，包括糖尿病性黄斑水肿、与年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、葡萄膜炎、眼新生血管形成和眼内感染等。这些装置作为眼部设备特别适合用于治疗眼组织胞浆菌病患者，其中所述的设备装置通过外科手术植入眼内玻璃体内。

可替代地，本发明的化合物可以与至少一个已知的癌症化疗剂分开给药。在一个实施例中，本发明的化合物和至少一个已知的癌症化疗剂基本上同时给药，即该化合物在相同的时间施用，或一前一后施用，只要该化合物在相同的时间在血液中达到治疗水平。在另一个实施例中，本发明的化合物和至少一个已知的癌症化疗剂给药，根据他们的个人剂量时间表，只要该化合物在血液中达到治疗水平。

但是应当理解，除了上述特别提到的成分外，本发明的制剂包括在本领域中可考虑到的常规的制剂类型，例如，包括那些适合于口服给药的矫味剂。

本发明的化合物可以是市售的或通过分离和合成获得。正如本领域技术人员可以理解的，该通式化合物进一步的合成方法对本技术领域的普通技术人员是显而易见。此外，获得所需化合物的各种合成步骤可以交替的顺序或次序执行。用于合成化合物的合成化学转换方法和本文描述的保护基团的方法(保护和脱保护)在本领域中是已知的，并包括但不限于以下文献及其后续版本的描述：R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，2nd.Ed.，Wiley-VCH Publishers(1999)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，3rd.Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1999)；and L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)。.

优选的单位剂量制剂是如上述的，含有制剂日剂量或单位、每天分剂量，或给药的成分的适当馏分。

本发明和/或本发明化合物用于抑制血管生成相关病症或疾病的剂量方案受多种因素的影响，包括疾病的类型，患者的年龄、体重、性别，病人的健康状况，病情的严重程度，给药途径，和施用的特定化合物等。因此，给药方案可以在较宽的范围内变化，但也可以常规地使用标准方法确定。

受试者的剂量方案将取决于若干因素，如给药方式、病症的性质、受试者的体重、处方医生的判断等。

本发明中化合物的量包括活性制剂的治疗量是指用于治疗感染或病症的有效量。一般情况下，化合物制剂的治疗有效量的通常范围从约0.025mg/kg/day到约2.5g/kg/day，优选约0.1mg/kg/day至约100mg/kg/day或更多，取决于所使用的化合物、病症或感染的处理方法、给药途径等因素，以及通过本发明可以设想到的此剂量范围内的例外情况。在其最优选的形式中，本发明的化合物的用量范围从约1mg/kg/day至约100mg/kg/day给药。在一些情况下，本发明的化合物的治疗有效量可以是一个低剂量的治疗有效量，范围在约0.001mg/kg/day至约10mg/kg/day，优选为约0.025mg/kg/day至约1mg/kg/day或更少，取决于所使用的化合物、病症或感染的处理方法、给药途径等。化合物的剂量将取决于所治疗的病症、具体化合物和其它临床因素，如患者的体重、状况，给药途径等。应当理解的是，本发明对人类和兽类适用。

对于人类的口服给药，剂量为约0.1～100mg/kg/day之间，优选约1～10mg/kg/day之间。

如果是全身性给药而非局部的，一般的剂量范围内能使患者血液中活性化合物产生有效血药浓度的范围是约0.04-400mg/cc或更多。

化合物以任何合适的单位剂量的形式给药更为方便，活性成分的每单位剂量形式包括但并不限于1-3000mg，优选5-500mg。10-250mg的口服剂量通常最方便的。

药物组合物中的活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、分布、代谢和排泄率以及那些本技术领域技术人员已知的其他因素。值得注意的是，剂量值也将随症状的严重程度以得到减少。需要更进一步理解的是，对于任何特定的患者，随着时间的推移，需根据个体的需要、专业人士对组合物给药和监察所作出的判断，调整特定的剂量；本文上述的浓度范围是只是示例性的，而不是为了限制所要求保护的组合物的范围或施用。活性成分可以一次性给药，也可以被分成一些较小的剂量在不同的时间间隔给药。

在某些方案中，该化合物的每天一次给药；在其它方案中，每天两次给药；在又其他方案中，化合物给药每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每七天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次，每两个月一次、每半年一次或每年一次。根据个别病人的需要，可以调整给药间隔。对于较长的时间间隔给药，延长释放或药房配方都可以使用。

本发明的化合物可用于治疗急性的疾病和状况，也可以用于治疗慢性疾病。在某些实施方案中，本发明的化合物给药的时间段，超过两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年，或五年、十年、十五年；或例如任何以日、月或年的时间段范围，低的范围是14日至15年，高的范围是15日至20年(例如4周15年，6个月和20年)。在某些情况下，对部分病人终生施用本发明的化合物可能是有利的。在优选的实施方案中，对病人进行监察以检查的疾病或病症的进展，并相应地调整剂量。在优选的实施方案中，本发明的有效治疗周期是至少两周、三周、一个月、两月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、或五年、十年、十五年、二十年的，或至患者终生。

此外，通过阅读上述的其它详细描述的方案，其目的、特征和本发明附带的优势对于本领域技术人员是显而易见的。

本发明还提供了药物包或试剂盒，包括一个或多个容器，填充有本发明的药物组合物中的一个或多个成分。这样的容器可以由监管药品或生物制品制造、使用或销售的政府机构以证书的形式批准，该证书体现了监管人用药生产、使用或销售的政府机构的批准。此外，本发明的化合物可与其它治疗化合物联合使用。

本发明还提供用于治疗或预防与血管新生相关的疾病或病症(或症状)的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒还以单位剂量的形式提供了一种抑制血管生成的化合物的有效量，以及其施用到患有血管生成抑制，或与血管新生相关的易患疾病或症状的说明书，其特征在于：一种抑制血管生成的有效量为小于500mg的化合物。在优选的实施方案中，该试剂盒包括一个无菌的容器，该容器包含抑制血管生成的化合物，这样的容器可以是盒、安瓿瓶、瓶子、管形瓶、管、包、袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其他适合用于保持药物的材料构成。该说明书一般包括下列内容的信息：血管生成抑制的化合物可治疗的疾病或病症或与血管新生相关的症状。在优选实施例中，所述说明书包括下列中的至少一项：对血管生成抑制的化合物的描述；治疗疾病或障碍或与血管生成相关症状的给药和剂量方案；注意事项；警告；适应症；禁忌症；药物过量的信息；不良反应；动物药理学；临床研究和/或参考文献。该说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或作为容器标签，或者作为一个单独的片材、小册子、卡片或折叠文件随附于容器中/外。

实施例

实施例1：超临界流体色谱(SFC)的商业伊曲康唑分离

采用超临界流体色谱(SFC)分离商业上用的伊曲康唑，制备四个独立的顺式非对映异构体A，B，C和D。根据SFC条件使用ChiralCel的OJ-H柱，三个分辨良好的峰来自于商业用的伊曲康唑。根据与标准品对比，可以确认第一峰为A(2S，4R，2′R-伊曲康唑)，第二个峰是B(2R，4S，2′R-伊曲康唑)和C(2S，4R，2′S-伊曲康唑)，第三个峰是D(2R，4S，2′S-伊曲康唑)。中间组分包含B和C可进一步用ChiralPak的AS-H柱分离。

商业用的伊曲康唑溶解于甲醇∶二氯甲烷＝1∶1的溶剂中至约20mg/ml，将4mL注入MG公司制备型SFC CHIRALPAK AS-10μ(300×50mm I.D)中。梯度为0-35％B(流动相A为CO₂，B为甲醇)在9min周期中运行200mL/min。馏分分离后，通过旋转蒸发器在水浴40℃进行干燥，得到对映异构体A和C的混合物，和对映异构体B和D的混合物。

对映异构体A和C的混合物溶解于甲醇∶二氯甲烷＝1∶1的溶剂中至约20mg/ml，将4mL注入MGIII制备型的ChiralPak AS-10μ(300×50mm I.D)中。梯度为0-30％的B(流动相A为CO₂；B为甲醇)在4min周期中运行200mL/min。馏分分离后，通过旋转蒸发器水浴40℃进行干燥，以得到纯的非对映体A和C。

对映异构体B和D的混合物溶解于甲醇∶二氯甲烷＝1∶1至的溶剂中至约20mg/ml，将4mL注入Thar350的ChiralCel OJ-10μ(300×50mm I.D)中。梯度为0-40％的B(流动相A为CO₂，B为甲醇)在5min周期中运行200mL/min。馏分分离后，通过旋转蒸发器水浴40℃进行干燥，得到纯的非对映异构体B和D。

实施例2：Akt激酶磷酸化试验

培养人视网膜内皮细胞生长至接近融合。然后加入对照(EGM-2培养基)和各种浓度的伊曲康唑以及异构体A、B、C和D，培养72小时。细胞用4％甲醛固定，Akt的细胞的活化程度通过Signaline酶联免疫吸附测定试剂盒测定Akt磷酸化的程度，得到各组的IC₅₀值。在此项试验中，伊曲康唑抑制Akt激酶磷酸化的IC₅₀为0.3μM，其立体异构体A、B、C和D的IC₅₀值分别为0.3、0.8、0.2和1.1μM。此项实验展示了立体异构体C对Akt激酶有更好的抑制作用。

表1：伊曲康唑及立体异构体对Akt激酶磷酸化抑制IC₅₀

化合物	IC50(μM)
		伊曲康唑	0.3
立体异构体A	0.3
		立体异构体B	0.8
立体异构体C	0.2
		立体异构体D	1.1

实施例3：人肝毒性试验

从XenoTech，LLC(Lenexa，KS)公司获得三名捐献者的人肝细胞(6孔板)，用基质胶覆盖。捐助者的年龄和性别为：22岁男性、54岁男性和63岁男性。每一个捐赠者的肝细胞活力不少于74％。收到肝细胞后，其运输期间的培养基用以下培养介质替换：Williams培养基E并补充加入10％牛胎儿血清(Invitrogen公司，Carlsbad，加利福尼亚州)、青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich公司)和L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)。然后肝细胞在5％CO₂潮湿环境下37℃温育过夜。培养过夜之后，培养介质更换为新鲜的Williams培养基E加入上述补充物质，肝细胞与DMSO(对照品，最终体积0.1％)，伊曲康唑(2μM或10μM)、其立体异构体A、B、C和D(2μM或10μM)进行孵育72小时。温育后，除去培养介质以检测肝功能，采用购自BioVision公司的试剂盒测定丙氨酸氨基转氨酶(alanine amino transaminase，ALT)的活性水平。

统计分析结果：使用上述的3个独立的人肝细胞进行肝毒性数据分析实验，用GraphPad Prism5.04版本，学生的t检验方法(Student’s t-test)对这些数据进行统计分析，显示出统计意义：^*P＜0.05；^**P＜0.01。结果如图1所示。从图1中可以看出，伊曲康唑异构体C和D的丙氨酸氨基转氨酶活性与空白对照(DMSO)相比无显著性差异，与伊曲康唑及其异构体A和B则具有显著性差异。此肝细胞毒性实验进一步说明，伊曲康唑立体异构体C一方面拥有较高的生物活性，另一方面具有更好的安全性。

实施例4：人肝细胞死亡测试

根据试剂盒的使用说明，采用细胞死亡检测ELISA试剂盒(罗氏公司，Indianapolis，IN)测定施用伊曲康唑及其类似物后的人细胞生存能力(Bumpus，N.N.，Toxicol Appl Pharmacol，2011.257(2)：p.227-34)。结果如图2所示。从图2中可以看出，在肝细胞毒性实验测试中，2μM和10μM的情况下，使用伊曲康唑异构体C和D的细胞存活率与异构体A和B相比具有显著性差异。

实施例5：人体肝细胞GSH耗竭分析试验

人体肝细胞用两种不同浓度的伊曲康唑、立体异构体A、B、C和D(2μM and10μM)培养12小时。除去培养液，向细胞中加入0.5ml3％磺基水杨酸。用细胞刮刀刮下每一个孔，沉淀的蛋白质离心5分钟。酸性上清液用100mM磷酸钾缓冲液(KPP)稀释，pH7.4。细胞内谷胱甘肽采用高效液相色谱法(HPLC)测定，定量分析添加Ellman试剂的上述肝细胞裂解液产生的5-硫基-2-硝基苯甲酸(Chen，W.，et al.，Determination ofthiols and disulfides via HPLC quantification of 5-thio-2-nitrobenzoic acid.J Pharm BiomedAnal，2008.48(5)：p.1375-80)。结果如图3所示。GSH耗竭分析试验表明，在10μM高浓度的情况下，使用立体异构体C和D与伊曲康唑、异构体A、异构体B相比具有显著性差异。

实施例6：小鼠肝毒性试验

小鼠分别进行以下处理，空白(40％羟丙基-β-环糊精，2.5％的丙二醇，pH4.5)，伊曲康唑(20和50mg/kg)，立体异构体A和C(20和50mg/kg，40％羟丙基-β-环糊精，2.5％的丙二醇，pH4.5)，腹腔注射(i.p.)七天，每天一次。分离小鼠肝脏，固定在中性缓冲的10％的福尔马林中嵌入石蜡组织切片。每个肝脏观察到一个至少5-μm切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，以评估肝脏的形态。

结果

在20mg/kg和50mg/kg的剂量下，立体异构体A诱导小鼠脂肪肝。H&E染色处理显示，立体异构体A处理过的小鼠的肝脏观察到大量脂肪滴。伊曲康唑和立体异构体C治疗处理的的小鼠肝脏则显示是正常。结果如图4所示。

Claims (11)

1.一种抑制受试者Akt激酶活性的方法，其特征在于：施用伊曲康唑或其药学上可接受的盐作为治疗剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中伊曲康唑为2S，4R，2′R-伊曲康唑、2R，4S，2′R-伊曲康唑、2S，4R，2′S-伊曲康唑或2R，4S，2′S-伊曲康唑。

3.如权利要求2所述的方法，其中伊曲康唑为2S，4R，2′S-伊曲康唑。

4.一种抑制受试者Akt激酶活性的方法，该方法包括以下步骤：给受试者施用有效量的伊曲康唑。

5.如权利要求4所述的方法，其中伊曲康唑为2S，4R，2′R-伊曲康唑、2R，4S，2′R-伊曲康唑、2S，4R，2′S-伊曲康唑或2R，4S，2′S-伊曲康唑。

6.如权利要求5所述的方法，其中伊曲康唑为2S，4R，2′S-伊曲康唑。

7.如权利要求4-6任一项所述的方法，其中受试者是人类。

8.伊曲康唑在制备与抑制Akt激酶活性相关疾病的药物中的用途。

9.如权利要求4所述的用途，其中，与抑制Akt激酶活性相关疾病为肿瘤，类风湿关节炎，糖尿病视网膜病变，黄斑病变，或皮肤疾病如牛皮癣，红斑狼疮。

10.如权利要求8或9所述的用途，其中所述伊曲康唑为2S，4R，2′R-伊曲康唑、2R，4S，2′R-伊曲康唑、2S，4R，2′S-伊曲康唑或2R，4S，2′S-伊曲康唑。

11.如权利要求10所述的用途，其中伊曲康唑为2S，4R，2′S-伊曲康唑。

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