CN101597312A

CN101597312A - 维甲酰阿糖胞苷缀合物及其药质体、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101597312A
Application number: CNA2008101146999A
Authority: CN
Inventors: 崔国辉; 崔纯莹; 张云玮
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2009-12-09

Abstract

本发明公开具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物以及由该缀合物构建而得的药质体，本发明还公开了它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤剂的应用。本发明将全反式维甲酸与阿糖胞苷4’位氨基偶联，获得具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物，该缀合物具备自组装为药质体的特性，既可保护阿糖胞苷4’位氨基失活，又可使该缀合物及所制备的药质体具有肿瘤靶向性。本发明分别用人白血病细胞HL－60和S₁₈₀腹水癌小鼠评价了本发明式I化合物及由该化合物所制备药质体的体外和体内抗肿瘤活性，实验结果表明，本发明式I化合物及其药质体具有优秀的抗肿瘤活性。

Description

维甲酰阿糖胞苷缀合物及其药质体、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤活性的化合物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的维甲酰阿糖胞苷缀合物以及由该维甲酰阿糖胞苷缀合物构建得到的药质体，本方发明还公开了它们的制备方法以及它们在抗肿瘤中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

许多药物在体内需要多次穿越生物膜才能到达靶部位(器官、组织、细胞和细胞器)。在影响药物跨膜的诸多因素中，亲水亲油平衡性或油水分配系数是影响明显的理化因素。水溶性强的药物和体液相容，不易穿过由脂质双层构成的生物膜。脂溶性强的药物虽容易进入脂质双层，但与体液不相容难以在体液中转运，最终或积存脂肪组织或被代谢为水溶性物质。目前的解决办法是借助药物传递系统来改善药物吸收、分布及获得靶向性。所述药物传递系统主要有脂质体、纳米粒、微球和微囊。这些药物传递系统存在一些共同问题：①用药量难以控制。②存在包封率低、易渗漏，载药量不稳定。③药物在到达靶体之前一旦离开传递系统，传递系统将失去作用。为解决这些问题，出现了药质体。药质体既不是单纯的前药，也不是单纯的药物载体，而是前药和载体的有机结合体。药质体不存在包封率、渗漏和稳定性问题。药质体具有较好的水中扩散性和生物膜渗透性，对需要穿过生物膜(包括吸收、分布、靶向等过程)发挥药效的治疗，如抗病毒治疗、肿瘤治疗和基因治疗非常有意义。

阿糖胞苷是临床上常用的抗白血病药物，分子量为243，临床用药量为40mg/Kg/天。它在体内能干扰DNA的合成从而抑制白血细胞的繁殖。阿糖胞苷在血液中易被嘧啶核苷脱氨酶迅速脱氨而失效。为维持有效的血药浓度，需多次和连续给药，易造成骨髓抑制和消瘦作用。

全反式维甲酸为一长链带有六元脂肪环的不饱和酸，临床上常用的抗白血病药物，其分子量为300，临床用药量为60mg/Kg/天。维甲酸受体是核内转录因子，可调控多种基因的表达，全反式维甲酸通过与核内维甲酸受体结合，而发挥治疗作用的。

阿糖胞苷与全反式维甲酸，两药物用途一致，化合物极性互补，临床用药剂量匹配。全反式维甲酸具有脂溶性强、水溶性差的特点，与之相反，阿糖胞苷的水溶性强但是脂溶性较差，上述特性导致二者均不具有两亲性以致生物利用度低、不能自组装为药质体等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明目的之一是将阿糖胞苷的结构进行修饰，提供一种具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物。

本发明目的之二是提供一种由上述具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物构建而成的药质体。

本发明目的之三是提供上述具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物的制备方法。

本发明目的之四是提供上述药质体的构建方法。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物，其结构式为式I所示：

式I

在二环己基羰二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)的存在下，将全反式维甲酸与阿糖胞苷的4’位氨基偶联，即得到上述式I化合物。

全反式维甲酸为一长链带有六元脂肪环的不饱和酸，具有较强的脂溶性；本发明为提高阿糖胞苷的脂溶性，在阿糖胞苷的4’位氨基上引入亲脂基团全反式维甲酸，使其具有合适的油水分配系数。为延缓阿糖胞苷4-氨基的代谢，在4位氨基引入保护基。这样便构成了维甲酰阿糖胞苷缀合物。阿糖胞苷的羟基构成亲水端，全反式维甲酸的脂肪链构成亲脂端。这样，维甲酰阿糖胞苷缀合物便成为两亲性分子。按照常规的药物制剂手段，可将这种两亲性分子制成药质体，提高药物的跨膜能力。例如，将上述的维甲酰阿糖胞苷缀合物按照常规薄膜分散法构建得到具有靶向性、高活性的抗肿瘤药质体。

优选的，一种构建甲酰阿糖胞苷缀合物药质体的方法，包括：

将磷脂和甲酰阿糖胞苷缀合物用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，超声分散(优选为在30℃温度下超声分散20min)，得到具乳光的药质体溶液；该药质体的粒径为150～250nm，Zeta电位为-30～-70mV。

本发明的再一目的是提供一种治疗肿瘤的药用组合物，该药用组合物由治疗上有效剂量的本发明式I化合物或由其制备的药质体与药学上可接受的赋型剂或者载体所组成，即将有效量的本发明式I化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明式I化合物。

本发明的上述药用组合物可以制备成微乳、乳剂、脂质纳米粒、脂质体等药物剂型。

本发明将全反式维甲酸与阿糖胞苷4’位氨基偶联，获得具有两亲性的维甲酰阿糖胞苷缀合物，该缀合物具备自组装为药质体的功能，既可保护阿糖胞苷4’位氨基失活，又可使该缀合物及所制备的药质体具有肿瘤靶向性。

本发明分别用人白血病细胞HL-60评价和S₁₈₀腹水癌小鼠评价了本发明式I化合物及所制备的药质体的体外和体内抗肿瘤活性，实验结果表明，本发明式I化合物及由其所制备的药质体具有优秀的抗肿瘤活性。

附图说明

图1本发明式I化合物的结构式。

图2本发明式I化合物的合成路线图；I)DCC和HOBt，冰浴；II)避光；III)Ar气保护。

图3维甲酰阿糖胞苷药质体的电镜呈像图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1、维甲酰阿糖胞苷缀合物的制备

将0.6g(2mmol)ATRA(全反式维甲酸)，0.454g(2.2mmol)DCC(二环己基羰二亚胺)和0.270g(2mmol)HOBT(1-羟基苯并三氮唑)溶解于适量无水吡啶溶液中，在避光和Ar气保护条件下，冰浴搅拌20分钟后加入0.558g(2mmol)HCl·Ara-C(阿糖胞苷盐酸盐)，保持避光和Ar气保护，室温搅拌2天，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示ATRA和Ara-C的点变浅，将反应液减压旋干，加入适量的氯仿溶解，滤出DCU(二环己基脲)，滤液减压旋干，用过量的乙醚洗残留物，减压旋蒸除去乙醚，以氯仿溶解残留物，分别用0.01N盐酸和饱和NaCl水洗，浓缩氯仿层，用无水Na₂SO₄干燥，柱层析分离(展开剂：二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)。得0.21g标题化合物，为橙色固体。Mp.139-142.6℃；[α]_D ²⁵ ₂₀＝-35.6(c＝1.0，乙醇)；油水分配系数2.924；ESI-MS(m/e)526.4[M+H]⁺，548.2[M+Na]⁺，1052.9[2M]⁺，1075.1[2M+Na]⁺。

实施例2维甲酰阿糖胞苷药质体的制备

称取实施例1所制备的维甲酰阿糖胞苷缀合物于茄形瓶中，加入适量卵磷脂用氯仿充分溶解，置于旋转蒸发仪上，恒温水浴35℃旋转蒸发去除溶剂，至瓶壁上出现一层凝胶薄膜，加入磷酸盐缓冲液，然后用手或在旋涡混合器上振荡，至全部或部分膜脱落，于水浴超声20min，借助卵磷脂目标化合物均可以在磷酸盐缓冲液中形成均匀的分散体系，目测无粒子，有淡蓝色散射光。光学显微镜下可见到一些均匀的很小粒子游动，初步判定得到泡囊状的药质体。通过在激光纳米粒度仪的测量，药质体粒径在150～250nm，Zeta电位在-30～-70mV。药质体的电镜呈像，结果如图3所示。

实验例1维甲酰阿糖胞苷缀合物对人白血病细胞HL-60增殖的抑制作用实验

受试化合物：实施例1所制备的维甲酰阿糖胞苷缀合物(ATRA-Ara-C)；

人白血病细胞株HL-60用RPMI1640培养液(含10％灭活的胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml)定期传代培养。

药物配制：阳性对照是将全反式维甲酸(ATRA)、阿糖胞苷(Ara-C)及全反式维甲酸和阿糖胞苷的物理混合物(ATRA+Ara-C)溶于含1‰乙醇的PBS磷酸盐缓冲液中制成5×10^-6mol/L浓度的溶液，将受试化合物溶于1‰乙醇的PBS磷酸盐缓冲液中制成与阳性对照组等物质的量浓度的溶液。临用前稀释得8×10^-9mol/L、4×10^-8mol/L、2×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、5×10^-6mol/L五个浓度。阴性对照是含1‰乙醇的PBS磷酸盐缓冲液。

实验方法：取对数生长期的HL-60细胞，制成5×10⁴/ml细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100μl。实验设不含肿瘤细胞组、阴性对照组、阳性对照组及受试化合物药物试验组，加入上述不同浓度的阳性对照药及所合成的化合物共4个药物，每个浓度重复3孔，37℃，5％CO₂培养48h，每孔加MTT 5mg/ml 25μl，37℃培养箱中孵育4小时。将96孔板1000r/min离心10min，弃去上液，每孔加二甲亚砜100μl，振荡器振摇10min，自动酶标仪测定光密度OD值(测量波长570nm，参比波长630nm)。HL-60细胞存活率＝[(抗癌药物组OD值-不含细胞组OD值)/(细胞阴性对照组OD值-不含细胞组OD值)]×100％并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。实验结果见表1。

表1的数据表明受试化合物对HL-60细胞系的IC₅₀与阳性对照Ara-C以及ATRA与Ara-C的物理混合组相当，而阳性对照组ATRA没有明显的细胞毒作用，对HL-60细胞的抑制率本实验最大为20％，没有得到IC₅₀值。该结果说明，受试化合物与Ara-C以及ATRA与Ara-C的物理混合组相比，其抗HL-60细胞的作用相当；受试化合物与ATRA相比，对细胞的生长抑制作用有较大的提高。

表1.目标化合物对HL-60细胞株作用的IC₅₀

实验例2维甲酰那糖胞苷缀合物及其药质体对S₁₈₀腹水小鼠的治疗作用

受试化合物：实施例1所制备的维甲酰那糖胞苷缀合物(RAA)；实施例2所制备的维甲酰那糖胞苷缀合物的药质体；

建立模型：取腹腔接种了S₁₈₀腹水瘤第8天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，浸泡于75％酒精内5分钟后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤，用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出，于开口处用吸管轻轻插入腹腔吸出腹水转移至15ml无菌离心管内，以生理盐水适量稀释，1000转/分离心5分钟，弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹打使瘤细胞均匀悬浮，1000转/分离心5分钟，弃去上清液，加入灭菌生理盐水15ml，用吸管轻轻吹打悬浮，1000转/分离心5分钟，弃去上清液，加入10ml生理盐水，再次用吸管轻轻吹打均匀，取100ul该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放入冰中待用。取100ul上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100ul台盼兰染液，混匀，取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数，将原液中的存活瘤细胞稀释成1.0×10⁷个/ml，放置于冰上以备用于接种。用碘伏和75％酒精棉球将雄性昆明种小鼠(20±2g)右侧腋下消毒，用1ml无菌注射器将0.2ml腹水瘤细胞接种液，接种于已消毒的小鼠右侧腋下皮内，按此方法给每批昆明种小鼠接种肿瘤悬液，完毕后随机分组，放入动物室饲养。

药物配制：本实验设药物混悬剂和药质体两种剂型；

混悬剂治疗组为实施例1所制备的维甲酰那糖胞苷缀合物的CMC-Na混悬液，阳性对照为全反式维甲酸(ATRA)、阿糖胞苷阿糖胞苷(Ara-C)和维甲酸与阿糖胞苷的物理混合物(ATRA+Ara-C)的CMC-Na溶液，阴性对照为CMC-Na溶液；

药质体治疗组为各化合物的药质体，分散体系为灭菌的PBS溶液，阳性对照是全反式维甲酸、阿糖胞苷和维甲酸与阿糖胞苷的物理混合物的脂质体，阴性对照为空白脂质体；各组药物以3.3×10^-5mmol/g等摩尔配制，药质体均用实施例2所述的薄膜分散法制备，分散体系为灭菌的PBS溶液；药物混悬液制备：称取药物，研碎，用0.5％CMC-Na制成混悬液。

实验方法：将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共8组。各组小鼠正常饲养，每天腹腔注射上述药物，0.2ml/只。8天后将各组荷瘤小鼠处死，取瘤称重，按抑瘤率＝[(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。所得的数据以(X±SD)表示，组间用双样本等方差的t检验。结果见表2，表3

表2.RAA的混悬剂对S₁₈₀腹水小鼠的治疗作用

n＝10，^#)与CMC-Na组瘤重比较，P＜0.05；*)与CMC-Na组瘤重比较，P＜0.01；组间：RAA/ATRA，P＜0.05，其余组间均P＞0.05。

表3.RAA的药质体对S₁₈₀腹水小鼠的治疗作用

n＝10，*)与空白脂质体组瘤重比较，P＜0.01；组间：RAA/ATRA，P＜0.01，其余组间均P＞0.05。

混悬组与药质体组组间均P＞0.05。

Claims

1、维甲酰阿糖胞苷缀合物，其结构式为式I所示：

式I。

2、一种制备权利要求1所述甲酰阿糖胞苷缀合物的方法，包括：将全反式维甲酸与阿糖胞苷的4’位氨基偶联，即得。

3、按照权利要求2的方法，其特征在于：在DCC/EDC和HOBt存在下，将全反式维甲酸与阿糖胞苷的4’位氨基进行偶联。

4、含有权利要求1所述甲酰阿糖胞苷缀合物的药质体。

5、按照权利要求4所述的药质体，其特征在于：该药质体的粒径为150～250nm，Zeta电位为-30～-70mV。

6、一种制备权利要求5所述药质体的方法，包括：将磷脂和权利要求1所述甲酰阿糖胞苷缀合物用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入磷酸盐缓冲液，超声分散，即得。

7、按照权利要求1所述维甲酰阿糖胞苷缀合物，其特征在于：按照药物制剂常规方法制备成微乳剂、乳剂、脂质纳米粒或脂质体。

8、一种治疗肿瘤的药用组合物，该药用组合物由治疗上有效量的权利要求1所述的式I化合物或权利要求4所述的药质体与药学上可接受的赋型剂或者载体组成。

9、权利要求1所述的甲酰阿糖胞苷缀合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10、权利要求4所述的药质体在制备抗肿瘤药物中的用途。