CN103242401A - 他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物及纳米药质体的制备及其抗肿瘤的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物及纳米药质体的制备及其抗肿瘤的应用。他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物是由他米巴罗汀的羧基与阿糖胞苷的4位氨基偶联制得，具有一定的两亲性，能在水中形成纳米级分散的自组装传递系统，体内外都有良好的抗肿瘤活性。

Description

他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物及纳米药质体的制备及其抗肿瘤的应用

发明领域

本发明属于化学和生物医药领域。特别涉及了一种两亲性他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物及其纳米药质体，同时涉及了偶联物及其纳米药质体的体内外评价。

背景技术

药物对机体的作用依赖于药物体内浓度，吸收、分布、代谢和排泄对此有重要影响。药物经不同途径给药后，需要经过许多生物膜或细胞膜到达作用部位，但水溶性强的药物不易于跨膜，脂溶性强的药物不易于转运。为了提高药物的生物利用度，使其具有靶向性，达到高效、安全的用药目的，水溶性药物的吸收和脂溶性药物的分布成为亟待解决的问题。目前的解决办法是借助药物传递系统来改善药物的吸收与分布。但传统的药物传递系统，如：脂质体、纳米粒、微球等，都存在包封率低，稳定性差、载药量不稳定的问题。为了解决传统药物传递系统存在的问题，越来越多的研究关注自组装药物传递系统（Self-assembled drugdelivery system，SADDS）。

自组装药物传递系统（SADDS）是将药物制备成具有自组装特性的双亲结构，在水中自发形成高度分散的有序聚集体。使其具有与药物分子自身截然不同的性质。它不再是单纯的药物或者药物载体，而是药物与载体的有机结合，克服的传统胶体微粒制剂包封率低、稳定性差等问题。

他米巴罗汀是一种选择性维甲酸受体激动剂，是针对全反式维甲酸（All-transretinoic acid，ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（ALP）的耐药性而开发，对急性早幼粒细胞性自血病(ALP)复发患者具有显著分化诱导能力。目前临床上主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病（APL,M3）复发或难治性病例和骨髓增生异常综合征(MDS)。通过解除PML-RARα融合基因的变异性质，恢复早有粒细胞性白血病细胞及RARα的正常功能，促进早有粒细胞的分化。

阿糖胞苷主要用于急性粒细胞白血病，是典型的嘧啶类抗代谢药，具有周期特异性。易被体内的胞苷脱氨酶降解，代谢为无活性的阿糖尿苷（Ara-U），临床上多采用持续静脉给药或频繁大剂量给药，易产生耐药性及骨髓抑制等不良反应。

他米巴罗汀与阿糖胞苷，用途一致，亲水亲油平衡值互补，临床用药剂量匹配。

发明内容

本发明针对水溶性强的药物不易于转运，脂溶性强的药物不易于分布的用药现状，设计合成了一种具有两亲性的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物，其结构为：

他米巴罗汀是一种选择性维甲酸受体激动剂，作用靶点明确，选择性高，但其脂溶性较强，容易在脂肪组织中蓄积中毒；本发明为降低他米巴罗汀的脂溶性，选择极性强的阿糖胞苷对其进行结构修饰，即在他米巴罗汀的羧基端引入亲水性基团阿糖胞苷，得到两亲性分子。同时，设计优化反应时，我们选择阿糖胞苷4位氨基与他米巴罗汀的羧基缩合，这样既可以降低他米巴罗汀的脂溶性，又可以保护阿糖胞苷4位的氨基。

本发明还提供他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的制备方法，所述方法包括以下步骤

在吡啶溶液中，DCC/HOBt复合催化剂条件下，他米巴罗汀的羧基与阿糖胞苷的4位氨基反应，即得。

优选的，本发明的制备方法如下：

将他米巴罗汀，二环己基羰二亚胺，1-羟基苯并三氮唑，溶解于无水吡啶中混匀，加入阿糖胞苷盐酸盐，搅拌反应，反应完毕，除去吡啶；加入氯仿溶解，放置后过滤，滤液除去氯仿，残留物加入乙醚洗涤，除去乙醚，残留物以氯仿溶解，用盐酸，NaCl和KHSO₄洗涤，浓缩氯仿层，用无水Na₂SO₄干燥过夜，过滤，滤液浓缩至干，用柱层析分离，重结晶得白色固体。

本发明还提供了一种含有本发明他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的治疗肿瘤的药用组合物，该药用组合物由包含有效剂量的本发明式1偶联物或其制备的药质体与药学上可接受的赋形剂或者载体组成，即将有效量的本发明偶联物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合。通常该组合物合适于口服给药或者注射给药，也适合其他给药方式。根据不同的给药方式，本发明药物组合物可以含有0.1%-99%重量，优选20-50%的本发明式I偶联物。其药用组合物可制备成微乳、乳剂、脂质纳米粒、脂质体等药物剂型。

本发明优选的药用组合物是纳米药质体，所述纳米药质体的制备方法如下：

将他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物和卵磷脂，溶于有机溶剂中得到溶液；另取注射用溶剂，在搅拌下上述溶液注入到注射用溶剂中，加毕，继续搅拌一定时间，减压旋转蒸发除去有机溶剂，制得纳米药质体。

本发明通过将两种现有的抗白血病药物制备成偶联物，意外的发现，可提高生物利用度，同时具有协同增效作用，本发明进一步的发现，可以将这种两亲性分子制成纳米药质体，并通过优化的制备方法，制备成一种药效优良的全新药物。

本发明为评价本发明式I偶联物及其纳米药质体的抗肿瘤活性，选用人白血病细胞HL-60，人宫颈癌细胞Hela和S₁₈₀腹水瘤小鼠作为给药模型。

本发明按以下步骤实现目标：

1.按照图2所述的路线在二环己基羰二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和吡啶存在下将他米巴罗汀的羧基与阿糖胞苷的4位氨基偶联，得到具有一定的两亲性他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物；

2.优选两亲性偶联物他米巴罗汀-阿糖胞苷纳米药质体的制备方法；

3.选用人白血病细胞HL-60及人宫颈癌细胞Hela评价体外抗癌活性；

4.选用S₁₈₀腹水瘤小鼠评价体内抗癌活性。

附图说明

图1本发明式I化合物的结构式。

图2本发明式I化合物的合成路线图；Ⅰ）DCC和HOBt，冰浴；Ⅱ）加入Ara-C，油浴40℃.

图3本发明式I偶联物的纳米药质体的电镜成像图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物

将0.702g（2mmol）Am80（他米巴罗汀），0.454g（2.2mmol）DCC（二环己基羰二亚胺）和0.270g（2mmol）HOBT（1-羟基苯并三氮唑）溶解于适量无水吡啶溶液中，冰浴搅拌60分钟后加入0.558g（2mmol）Ara-C·HCl（阿糖胞苷盐酸盐），油浴40℃搅拌2天，TLC（氯仿/甲醇，6：1）显示Am80和Ara-C的点变浅，将反应液减压旋干，除去吡啶；加入适量的氯仿溶解，滤出DCU（二环己基脲），滤液减压旋干，残留物用过量乙醚磨洗，过夜，抽干乙醚，残留物以氯仿溶解，分别用0.01N盐酸，饱和NaCl和饱和的KHSO₄洗涤数次，浓缩氯仿层，用无水Na₂SO₄干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩至干。柱层析分离（展开剂：二氯甲烷：甲醇=15：1），重结晶。得0.571g标题化合物，为白色固体。

为证明本发明的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物为一新的化合物，进行了结构确认，有关图谱数据如下：

对其物理化学性能进行了检测，有关数据如下：油水分配系数logP＝0.47；ESI-MS(m/e)575.3[M-H]^-611.3[M+Cl]^-1152.0[2M]^-1187.9[2M+Cl]^-

实施例2他米巴罗汀-阿糖胞苷纳米药质体的制备

以适当的质量比精密称取实施例1所制备的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物和卵磷脂，溶于适量的四氢呋喃中；另量取一定体积的PBS（PH=7.4）缓冲溶液，在不断搅拌下以适当的速度缓慢匀速的将四氢呋喃溶液（针头位于液面下）注入到PBS溶液中，加毕，继续搅拌一定时间，37℃减压旋转蒸发除去四氢呋喃，制得药质体。目测无沉淀，有淡蓝色乳光的均匀分散体系；光学显微镜下可见球形泡囊结构。通过激光纳米粒度仪测定，药质体的粒径在170～250nm，Zeta电位在-20～-70mV。药质体的电镜成像，结果如图3所示。

实施例3他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物对人白血病细胞HL60增殖的抑制作用

受试化合物：实施例1所制备的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物（Am80-Ara-C）；

人白血病细胞株HL-60用RPMI1640培养液（含15%灭火的胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml）定期传代培养。

药物配制：

阳性对照组：称取适量的他米巴罗汀（Am80）、阿糖胞苷（Ara-C)及他米巴罗汀与阿糖胞苷的物理混合物（Am80+Ara-C），加入DMSO中，超声充分溶解，终浓度10^-1mol/L。将受试药物溶于DMSO中制备成与阳性对照组等物质的量浓度的溶液。临用前逐级稀释，使其终浓度分别为2×10^-3mol/L，4×10^-4mol/L，8×10^-5mol/L，1.6×10^-5mol/L，3.2×10^-6mol/L，6.4×10^-7mol/L，1.28×10^-7mol/L。

阴性对照组：含的2%DMSO的PBS磷酸盐缓冲液。

空白组：含15%胎牛血清的RPMI1640培养基，不加细胞。

实验方法：

①接种：取对数生长期的HL60细胞，显微镜下计数，将细胞悬液浓度调整至8×10⁴/ml，接种于96孔板，每孔体积90μl。实验设不同浓度实验组、阴性对照组、阳性对照组及空白对照组。其中阳性对照组包括他米巴罗汀、阿糖胞苷和他米巴罗汀与阿糖胞苷的物理混合，实验组和阳性对照组的每个浓度重复3孔，阴性对照组和空白对照组也分别重复3孔。

②培养：37℃、5%CO2孵箱孵育4h后，分别加入10μl已配好的不同浓度梯度的药物，每个浓度重复3孔，培养48h。

③测定光密度值：每孔加MTT（5mg/ml）25μl，37℃培养箱中培养4h。加入三联溶解液100μl，避光过夜，使结晶充分溶解。用自动酶标仪测定光密度OD值(测量波长570nm，参比波长630nm)，计算HL-60细胞生长抑制率。HL-60细胞生长抑制率＝[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。HL-60细胞经药物作用48h后产生的细胞毒性结果见表1。

结果表明：他米巴罗汀在本次实验中，当给药计量小于4×10^-4mol/l时，对HL-60细胞的抑制率最大为15%，当给药计量大于4×10^-4时，对细胞的抑制率为100%。阳性对照组阿糖胞苷和物理混合组在给药剂量下作用相当。受试化合物与他米巴罗汀相比，对HL60细胞的生长抑制作用有明显改善。

表1 不同药物浓度对HL-60细胞的抑制率

实施例4他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物对人宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用

受试化合物：实施例1所制备的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物（Am80-Ara-C）；

人宫颈癌细胞株Hela用DMEM培养液（含10%灭活的胎牛血清，青链霉素的浓度最终各为100单位/ml）定期传代培养。

药物配制：

阳性对照组：称取适量的他米巴罗汀（Am80）、阿糖胞苷（Ara-C)及他米巴罗汀与阿糖胞苷的物理混合物，加入DMSO中，超声充分溶解，终浓度10^-1mol/L。将受试药物溶于DMSO中制备成与阳性对照组等物质的量浓度的溶液。临用前逐级稀释，使其终浓度分别为1×10^-3mol/L，2×10^-4mol/L，1×10^-4mol/L，2×10^-5mol/L，1×10^-5mol/L。

阴性对照组：含的1%DMSO的PBS磷酸盐缓冲液。

空白组：含10%胎牛血清的DMEM培养基，不加细胞。

实验方法：将Hela细胞制成5×10⁴/ml细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100μl。实验设不含肿瘤细胞组、阴性对照组、阳性对照组及各种药物试验组。分别加入上述不同浓度的阳性对照药及所合成的偶联物，每个浓度重复3孔，37℃5%CO₂培养48h，每孔加MTT（1mg/ml）100μl37℃培养箱中培养4h。弃去上液，加二甲亚砜150μl/孔，振荡器振摇10min，自动酶标仪测定光密度OD值(测量波长490nm，参比波长570nm)。Hela细胞存活率＝[(抗癌药物组OD值-不含细胞组OD值)/(细胞对照组光密度值-不含细胞组OD值)]×100%。

Hela细胞经药物作用48h后产生的细胞毒性结果见表2。

结果表明：受试化合物与阿糖胞苷相比，有更好的抗肿瘤活性。与他米巴罗汀相比，量效关系更加优化。

表2 不同药物溶度对Hela细胞的生长率

实施例5他米巴罗汀-阿糖胞苷及药质体对荷肉瘤S₁₈₀小鼠的治疗作用

受试药物：实施例1所制备的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物（Am80-Ara-C）；实施例2所制备的他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的纳米药质体。

建立模型：取腹腔接种了S₁₈₀腹水瘤第8天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，浸泡于75%酒精内，5分钟后以消毒纱布包裹置于超净台内。用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出，将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水转移至装有约3ml灭菌生理盐水的15ml的离心管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹打，使腹水与生理盐水混匀，肿瘤细胞均匀悬浮。试管加盖，1000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液后，加9ml无菌生理盐水，用吸管轻轻吹打，使瘤细胞均匀悬浮,离心管加盖，1000转/分钟，离心5分钟,弃去上清液。试管底部有的乳白色的沉淀物。往试管底部的乳白色沉淀物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀悬浮。取100μl该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放置于冰上以备用于接种。取100μl上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100μl台盼兰染液，混匀。取10μl该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数，将原液中的存活瘤细胞稀释成1.0×10⁷个/ml，放入冰中待用于接种。

取雄性昆明钟小鼠，用碘伏和75％酒精棉球将雄性昆明种小鼠(20±2g)右侧腋下消毒，用1ml无菌注射器将0.2ml腹水瘤细胞接种液，接种于已消毒的小鼠右侧腋下皮内。按此方法给每批昆明种小鼠接种肿瘤悬液，完毕后随机分组，放入动物室饲养。

药物配制：本实验设药物混悬剂和药质体两种剂型。混悬剂治疗组为各化合物的CMC-Na混悬液，阳性对照为他米巴罗汀、阿糖胞苷、他米巴罗汀与阿糖胞苷的物理混合物及目标化合物的CMC-Na溶液，阴性对照为CMC-Na溶液。药质体治疗组为各化合物的药质体，分散体系为灭菌的PBS缓冲溶液，阳性对照是他米巴罗汀、阿糖胞苷、他米巴罗汀与阿糖胞苷的物理混合物及目标化合物的纳米药质体，阴性对照为空白脂质体；各组药物以3.5mmol/L等摩尔配制，药质体用前述的四氢呋喃注入法制备，分散体系为灭菌的PBS缓冲溶液。

药物混悬液制备：精确称取药物，研碎，用0.5%CMC-Na制成混悬液。

实验方法：将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共10组。各组小鼠正常饲养，从接种后24小时开始静脉注射上述药物0.2mL，于1、3、5、7天给药，共4次。7天后将各组荷瘤小鼠处死，解剖，取瘤，并称体重和瘤重，按抑瘤率＝[(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。获得的数据以（X±SD）表示，组间用双样本等方差的t检验。

实验结果如表3：单从混悬组看，受试化合物的抗肿瘤活性要高于阳性对照组的抗肿瘤活性；将各组制备成药质体后，药质体组的活性要高于混悬组的抗肿瘤活性；且制备为药质体后，受试化合物的抗肿瘤活性要高于阳性对照组。

表3 Am80-Ara-C混悬组及药质体组对S₁₈₀小鼠的治疗作用

n=10

^*表示与CMC-Na组瘤重比较，P<0.01；#表示与CMC-Na组瘤重比较，P<0.05&表示与空白脂质体组瘤重比较，P<0.01；^**表示与Amm80-Ara-C混悬组瘤重比较，P<0.01；##表示与Amm80-Ara-C药质体组瘤重比较，P<0.01。

Claims (8)

1.他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物，结构式为式I所示：

2.权利要求1所述他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的制备方法，在吡啶溶液中，DCC/HOBt复合催化剂条件下，他米巴罗汀的羧基与阿糖胞苷的4位氨基反应，即得。

3.权利要求1所述他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物作为抗肿瘤剂的应用。

4.一种治疗肿瘤的药用组合物，该药用组合物由权利要求1所述偶联物与药学上可接受的载体组成。

5.含权利要求1所述他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的纳米药质体，其特征在于：粒经170～250nm，Zeta-电位–20～-70mV。

6.权利要求5所述纳米药质体的制备方法，包括：称取权利要求1所述偶联物和磷脂，溶于四氢呋喃，将其注入PBS缓冲溶液，搅拌一定时间，旋转蒸发除去溶剂，即得。

7.权利要求5所述他米巴罗汀-阿糖胞苷纳米药质体作为抗肿瘤剂的应用。

8.包含权利要求1所述他米巴罗汀-阿糖胞苷偶联物的乳剂、脂质体。

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