CN103239404A - 一种双靶向脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双靶向脂质体及其制备方法和应用，所述双靶向脂质体包括脂质体和表面修饰的配体，所述配体为叶酸和转铁蛋白。本发明还提供了一种所述的双靶向脂质体制备方法以及该双靶向脂质体在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。本发明双靶向脂质体采用双配体修饰，发挥了双靶向作用，能够帮助盐酸阿霉素看跨越血脑屏障，且本发明双靶向脂质体的转铁蛋白和叶酸均安全无毒，为体内自身固有成分，安全性高，生物相容性好。

Description

一种双靶向脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种双靶向脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，约占脑肿瘤的半数左右，目前临床治疗以手术切除为主，由于胶质瘤呈浸润性生长，没有明确边界，手术不易全切，因此需要结合术后的放、化疗进行全脑的综合治疗，然而胶质瘤对治疗的敏感性较低，故其复发仍难以避免，这也导致了目前临床疗效较差，生存期短，死亡率高，其中高级别胶质瘤患者的平均生存期尚不足一年，而恶性胶质瘤5年生存率不足5％，其病死率仅次于胰腺癌和肺癌位居第三位。

胶质瘤的化疗通常作为手术后的辅助治疗，为清除残余肿瘤细胞或抑制肿瘤复发而带来的化疗药物的全脑内分布，可能会降低药物在脑内病变部位的浓度、并产生对其他正常脑组织细胞的损伤，因此有必要进行脑内双靶向给药系统的研究，即在其克服血脑屏障(BBB)进入脑内后，通过与细胞表面的特异性受体结合，在病变组织释放药物，以提高疗效和降低毒副作用。

除了部分小分子脂溶性药物，BBB的存在限制了大部分脑部疾病治疗药物的入脑分布，而旨在促进药物透过BBB进入脑内的脑靶向给药系统也由此成为药学界的重要研究领域之一。

目前的研究重点仍是致力于采用各种物理、化学或生物学手段促进药物透过BBB进入脑内，脑毛细血管内皮细胞存在的某些生物学特性可被利用以构建纳米靶向给药系统，如基于内皮细胞浆膜负电性的吸附介导传递(adsorptive-mediated transcytosis，AMT)系统；基于葡萄糖、己糖和氨基酸等营养物质特异性转运载体介导的传递系统(carrier-mediatedtransport system，CMT)；和基于特异性受体如转铁蛋白、胰岛素受体和低密度脂蛋白受体等介导的传递系统(receptor-mediated transport，RMT)。国内近年来在药物脑靶向给药系统方面开展了一系列相关研究，如单抗OX26(或乳铁蛋白)修饰的纳米给药系统、阳离子白蛋白纳米粒、RGD修饰的胶束、以及树状大分子(PAMAM)等。

盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochioride，以下简称DOX)是蒽环类广谱抗肿瘤药，由Fannitilia Resear Laboratories从一种链霉菌(Streptomyeespeueetius var.Caesius)的发酵液中提取获得。DOX对多种肿瘤均具有毒性作用，其作用机制主要是阿霉分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。但是将其运用于脑部疾病需要克服血脑屏障的作用，同时目前临床上使用的DOX主要不良反应是常见脱发、骨髓抑制和心肌毒性，其中心肌毒性是DOX的严重不良反应之一。因此需进一步设计脑靶向给药系统，以提高静脉给药后药物的脑内分布并且进一步增加在肿瘤部位的分布，降低药物的毒副作用。盐酸阿霉素的主要结构如下：

如公开号为CN102166190A的中国专利文献公开了一种双重靶向肿瘤的紫杉醇纳米脂质体及其制备方法，该专利发明将具有双重靶向作用的多肽修饰至紫杉醇纳米脂质体，使得该脂质体有更强的与新生血管内皮细胞细胞核肿瘤细胞的结合能力，及抑制肿瘤细胞能力。

因此，构建靶向于脑胶质瘤的药物靶向系统，促使药物跨越血脑屏障，针对病变位点释放药物，对脑胶质瘤的治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种双靶向脂质体，能够帮助盐酸阿霉素跨越血脑屏障，且对脑胶质瘤的靶向性好。

一种双靶向脂质体，包括脂质体和表面修饰的配体，所述配体为叶酸和转铁蛋白。

利用脑毛细血管内皮细胞高表达的转铁蛋白受体以及脑胶质瘤细胞表达的叶酸受体，用配体转铁蛋白和叶酸共同修饰脂质体，以其作为双靶向于脑胶质瘤的载体，能够帮助药物通过血脑屏障，并进一步靶向于脑胶质瘤。

所述双靶向脂质体的粒径为120nm～210nm，优选为170nm～190nm。

该粒径范围内的脑胶质瘤双靶向脂质体为分布均匀的分散体系，粒径大小合适，更容易通过血脑屏障。

所述双靶向脂质体的制备方法包括：

(1)将叶酸与带有氨基基团的脂质衍生物反应制得叶酸修饰的脂质衍生物；

(2)以叶酸修饰的脂质衍生物、磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和带有羧基基团的脂质衍生物为原料制得叶酸修饰的脂质体；

(3)将转铁蛋白与叶酸修饰的脂质体表面的羧基相连，制得所述的脑胶质瘤双靶向脂质体。

步骤(1)中，可用1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)作为缩合剂，将叶酸和氨基相连。

步骤(2)中，所述的叶酸修饰的脂质体具体的制备方法可以为薄膜分散法或硫酸铵梯度法，均可采用现有技术。

步骤(3)中，可用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺作为缩合剂，将转铁蛋白和羧基相连。

步骤(1)中，所述叶酸与带有氨基基团的脂质衍生物的摩尔比为(0.8～1.0)∶(1.0～1.2)。

步骤(2)中，所述叶酸修饰的脂质衍生物、磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和带有羧基基团的脂质衍生物的摩尔比为(0.015～0.019)∶(1.8～2.2)∶(0.8～1.2)∶(0.08～0.12)∶(0.019～0.023)。

所述带有氨基基团的脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物。

所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等，优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱。

所述聚乙二醇脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、氢化磷脂-聚乙二醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇等，优选为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。

上述聚乙二醇脂质衍生物中，聚乙二醇的分子量为2000Da～5000Da，优选为2000Da～3000Da，更优选为2000Da。

所述带有氨基基团的脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物、氢化磷脂-聚乙二醇-氨基交连物、二棕榈酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇-氨基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物等，优选为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物。

所述带有羧基基团的脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交连物、氢化磷脂-聚乙二醇-羧基交连物、二棕榈酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇-羧基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交连物等，优选为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交连物。

所述叶酸与二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物的摩尔比为(0.8～1.0)∶(1～1.2)，优选为1∶1。

更优选的，所述叶酸修饰的脂质体由二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物和叶酸修饰的二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物制成。

所述二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物和叶酸修饰的二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物的摩尔比为(1.8～2.2)∶(0.8～1.2)∶(0.09～0.12)∶(0.019～0.023)∶(0.015～0.019)，更优选为2∶1∶0.11∶0.021∶0.017。

转铁蛋白与叶酸修饰的脂质体表面的羧基相连，所述转铁蛋白与带有羧基基团的脂质衍生物的摩尔比为(0.8～1)∶(1～1.2)。

所述转铁蛋白与二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物的摩尔比为(0.8～1)∶(1～1.2)，优选为1∶1。

本发明还提供了所述的双靶向脂质体在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

本发明的双靶向脂质体对脑胶质瘤的靶向性更强，因此，可以将该双靶向脂质体包载药物，制备成载药脂质体，以载药脂质体作为活性成分，制备用于治疗脑胶质瘤的药物。

本发明还提供了一种药物，包含所述的双靶向脂质体，所述的双靶向脂质体包载有盐酸阿霉素。盐酸阿霉素与双靶向脂质体的摩尔比为0.8～1.2∶8～15，优选为1∶10。

所述的脑胶质瘤具体可为C6脑胶质瘤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明双靶向脂质体采用双配体修饰，其中，经转铁蛋白修饰后，可以被血脑屏障上的转铁蛋白受体识别，以此来增加其跨越血脑屏障的能力，经叶酸修饰后，可以被脑胶质瘤细胞上的叶酸受体识别，以此来增加其主动靶向性，提高脑胶质瘤部位的药物浓度，以此发挥双靶向作用。

本发明双靶向脂质体的转铁蛋白和叶酸均安全无毒，为体内自身固有成分，安全性高，生物相容性好。

附图说明

图1a为叶酸与DSPE-PEG2000-NH₂的反应方程式；

图1b为叶酸、DSPE-PEG2000-NH₂和反应产物的核磁共振图谱；

图2为各类型脂质体的粒径分布；

图3为阿霉素双靶向脂质体的形态；

图4为阿霉素双靶向脂质体的体外释放；

图5为阿霉素双靶向脂质体的在bEnd3细胞内的聚集；

图6为阿霉素双靶向脂质体在体外血脑屏障的转运；

图7为双靶向脂质体的体内靶向性；

图8为阿霉素双靶向脂质体在荷瘤大鼠的脑内分布；

图9为阿霉素双靶向脂质体的体内药效试验结果；

其中，图9中，由左至右，四条曲线分别代表生理盐水、阿霉素溶液、阿霉素脂质体和双靶向脂质体。

具体实施方式

以下的实施例为了更好地理解本发明，但并不局限于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法，下述实施例中的阿霉素均为盐酸阿霉素。

1、实验试剂和细胞

盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochioride，以下简称DOX，M110104)购自于浙江海正药业。

叶酸，胆固醇，转铁蛋白(Sigma公司)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)(美国Avanti Polar Lipids公司，850365)，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)(美国Avanti Polar Lipids公司，880120)，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)(美国Avanti Polar Lipids公司，880125)，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物(DSPE-PEG2000-NH₂)(美国Avanti Polar Lipids公司，880128)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)均购自Sigma公司，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)。SephadexG-100购自瑞典pharmacia Biotech公司。DMEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium)高糖培养基、胎牛血清、胰酶和青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于Gibico公司。

C6大鼠脑胶质瘤细胞和bEnd3大鼠血管内皮细胞均购自中国科学院上海细胞所。

2、实验仪器

激光粒度测定仪(马尔文Zetaszier Nano-S90)；

数显恒温水浴锅(江苏省金坛市江南仪器厂)；

RE-52C旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；

JY92-II超声波细胞粉碎仪(宁波新芝科器研究所)；

KQ-100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

Eppendorf离心机(德国eppendorf公司)；

高效液相色谱仪(德国安捷伦色谱仪1200)；

透析袋(Spctumn)；

核磁共振仪(瑞士BRUKER AVIII500M)；

小动物活体成像仪(美国CRI公司)；

脑定位仪(深圳瑞沃德有限公司)。

实施例1脂质体的制备

1、叶酸修饰的脂质体的制备

(1)叶酸的修饰

1)将6.25mg叶酸溶解于0.5ml无水DMSO中，同时加入125μl吡啶，8.15mg二环己基碳二亚胺(DCC)(吡啶与DMSO均用4A分子筛脱水)，N₂保护，室温(25℃)避光反应4h活化羧基；

2)将25mg DSPE-PEG2000-NH₂加入上述反应体系，避光搅拌反应24h；

3)旋转蒸发器减压蒸发去除混合物中吡啶；

4)加入3.5ml水后，过220nm油膜去除不溶副产物二环己基，上清液用MWCO8000-14000的透析袋透析，用50mM生理盐水2L透析两次，水透析三次，每次均为12h，得到DSPE-PEG2000-F。

(2)脂质体的制备

1)取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)60mg，胆固醇(Chol)10mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)9mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)1.5mg，DSPE-PEG2000-F1mg溶于15ml氯仿中，采用薄膜分散法，60℃，40r/min，蒸去氯仿；

2)加入10ml的120mM硫酸铵溶液水化约1h，形成均匀的乳状液体；

3)水浴超声20min，探头超声100w，30次，过220nm的水膜控制粒径，制备得到叶酸修饰的脂质体(F-脂质体)。

2、普通脂质体的制备

1)取二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)60mg，胆固醇(Chol)10mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)9mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)1.5mg溶于15ml氯仿中，采用薄膜分散法，60℃，40r/min，蒸去氯仿；

2)加入10ml的120mM硫酸铵溶液水化约1h，形成均匀的乳状液体；

3)水浴超声20min，探头超声100w，30次，过220nm的水膜控制粒径，制备得到普通脂质体。

3、转铁蛋白修饰的脂质体的制备

取EDC·HCl和S-NHS加入上述制备的普通脂质体磷酸缓冲液中(pH5.5，浓度为10mM)，室温搅拌15min后，调整PH为7，加入转铁蛋白(Tf)(普通脂质体的DSPE-PEG2000-COOH∶Tf∶EDC·HCl∶S-NHS的摩尔比为0.67∶0.67∶2.5∶6.3)，继续搅拌2～3小时，得到转铁蛋白修饰的脂质体。未包封的阿霉素、未反应的转铁蛋白、EDC·HCl和S-NHS通过Sephadex G-100柱(1.5cm×25cm)以PBS缓冲液洗脱除去，得到转铁蛋白脂质体修饰的脂质体(Tf-脂质体)。

4、双配体修饰的脂质体的制备

取EDC·HCl和S-NHS加入上述制备的叶酸修饰的脂质体磷酸缓冲液中(pH5.5，浓度为10mM)，室温搅拌15min后，调整PH为7，加入转铁蛋白(Tf)(叶酸修饰的脂质体的DSPE-PEG2000-COOH∶TF∶EDC·HCl∶S-NHS的摩尔比为0.67∶0.67∶2.5∶6.3)，继续搅拌2～3小时，即可。未包封的阿霉素、未反应的转铁蛋白、EDC·HCl和S-NHS通过Sephadex G-100柱(1.5cm×25cm)以PBS缓冲液洗脱除去，得到叶酸和转铁蛋白共同修饰的空白脂质体(Tf(F)-脂质体)。

5、脂质体的载药

分别将普通脂质体、叶酸修饰的脂质体、转铁蛋白修饰的脂质体、转铁蛋白和叶酸共同修饰的空白脂质体用pH7.4的浓度为10mM的PBS作为透析介质透析3h，以增加内外相的pH差。采用硫酸铵梯度法，将上述脂质体于60℃的恒温水浴载药，取8mg盐酸阿霉素溶于1ml的水中，一滴一滴加于上述脂质体中，60℃搅拌孵育1h，分别得到阿霉素脂质体(DOX-脂质体)，叶酸修饰的阿霉素脂质体(F-DOX-脂质体)和转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体(Tf-DOX-脂质体)、双配体修饰的阿霉素脂质体(Tf(F)-DOX-脂质体)。

实施例2配体合成和制剂的表征

(1)DSPE-PEG2000-F的核磁检测

将叶酸、DSPE-PEG2000-NH₂和合成的产物分别溶于DMSO后进行核磁检测。

图1中，a表示合成的产物，b表示叶酸，c表示DSPE-PEG2000-NH2.6.0-9.0ppm之间为叶酸苯环结构上氢峰，3.56-3.75ppm为聚氧乙烯氢峰，2.48ppm为是叶酸分子中Glu的γ，β-CH2上的氢峰，三者的存在说明产物结构中有叶酸及聚氧乙烯的存在，说明成功制备了DSPE-PEG2000-F，由于叶酸修饰的脂质体和双靶向脂质体均以DSPE-PEG2000-F为原料之一，所以在叶酸修饰的脂质体和双靶向脂质体中均成功修饰有叶酸。

(2)转铁蛋白接枝率的计算

脂质体中转铁蛋白的修饰量用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒进行检测，即可计算转铁蛋白接枝率。

通过BCA检测法计算，转铁蛋白修饰的脂质体和双配体修饰的脂质体的转铁蛋白接枝率分别为49.06％±4.51％和47.53±3.21％。

(3)形态和粒径观察

取各类型脂质体各适量，用PBS稀释成至合适浓度，激光粒度测定仪测定粒径分布。

形态学观察：分别将新鲜制备的阿霉素双靶向脂质体以去离子水稀释10倍，并且超声分散约5min。用移液枪吸取20uL，悬滴于洁净的云母片表面，洁净云母片成45度，空气中静置数分钟，过夜晾干，待样品自然干燥并稳定沉积于衬底表面，待测。

图2表示各类型脂质体的粒径分布，均在170nm左右，且较为均一。图3表示阿霉素双靶向脂质体的形态，可以看出均较为圆整。

(4)脂质体中载药量的测定

取上述制备的各种类型脂质体各25μl，分别加入乙腈975μl破坏，水浴超声3min后，1200r/min离心5min，取上清用紫外高效液相检测法检测制剂中药物含量。

经含量测定，阿霉素脂质体载药量为93.52±0.16μg/mg，叶酸修饰的阿霉素脂质体载药量为92.44±0.12μg/mg，转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体载药量为92.32±0.07μg/mg，双配体脂质体的载药量为91.25±0.06μg/mg。

实施例3双靶向阿霉素脂质体的释放

透析法测定叶酸和转铁蛋白共同修饰的阿霉素脂质体(即双靶向阿霉素脂质体或阿霉素双靶向脂质体)纳米给药系统的体外释放。

MWCO8000-14000Da的透析袋内分别放置5ml总量为1mg阿霉素溶液和阿霉素制剂，透析外相为30ml释放液，释放液为含0.5％Tween80的磷酸盐缓冲液(PH7.4，浓度10mM)，37℃，75次/分振摇条件下，间隔一定时间取样1ml，同时补加1ml新鲜释放液，取样的样品高速离心后取上清液进HPLC测定DOX含量。

图4为阿霉素溶液和双配体修饰的阿霉素脂质体(即叶酸和转铁蛋白共同修饰的阿霉素脂质体)体外释放曲线。结果发现，阿霉素溶液组释放速度最快，4h即释放完全，双靶向阿霉素脂质体组由于阿霉素与硫酸铵结合较牢固，不易释放到释放液中，释放缓慢，具有较好的长循环缓释作用。

实施例4bEnd3细胞的摄取

(1)取对数生长期的1×10⁶个/孔的永生化血管内皮细胞bEnd3细胞以2ml/孔接种于6孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，弃去培养液，pH7.4的PBS缓冲液漂洗一遍；

(2)分别加入含药物浓度为10μg/ml的各种阿霉素制剂的Hank’s缓冲液2ml，37℃孵箱培养4h；

(3)除去Hank’s缓冲液，用冰PBS缓冲液迅速漂洗3次，-80℃与40℃反复冻融各3次，每次30min；

(4)每孔加入1ml PBS缓冲液，用细胞刮刀刮下细胞，转移至2ml离心管，探头超声破碎(功率：100W；工作时间：2s；间歇时间：3s；超声次数：30次)；12000r/min离心5min，取上清液用荧光高效液相仪检测DOX浓度。

通过对bEnd3细胞分别进行双靶向阿霉素脂质体(DOX双靶向脂质体)、阿霉素脂质体(DOX脂质体)、转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体(F-DOX-脂质体)以及叶酸修饰的阿霉素脂质体(Tf-DOX-脂质体)这四种阿霉素制剂给药处理，由图5可以看到，双靶向阿霉素脂质体的摄取量显著高于阿霉素脂质体、转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体以及叶酸修饰的阿霉素脂质体(P＜0.05)。

实施例5双靶向阿霉素脂质体在体外血脑屏障的转运

(1)体外血脑屏障的建立

将bEnd3细胞接种在预先涂有2％明胶的插件上(Corning，NY，USA；孔径0.4μm，直径12mm，表面积1.12cm²)，细胞密度为37500个/孔，培养7天。上层加培养液500ul，下层加培养液1500ul，每两天换一次培养液。

实验前，单层细胞的强度用跨膜电阻仪来测定它的转移上皮电阻。TEER值＞250Ω/cm²方可用于实验。同时用辣根过氧化酶(HRP)(RZ＝3.0-3.5，酶活性＞265U/mg，Mw＝44kDa)作为一个血脑屏障模型渗透性的指标。

(2)待血脑屏障模型建立以后，将阿霉素脂质体、转铁蛋白修饰的阿霉素脂质体、叶酸修饰的阿霉素脂质体和双靶向阿霉素脂质体分别以30μg/ml的阿霉素浓度加入模型上层，以Hank’s缓冲液作为转运媒介；分别在2h，3h，4h时间点从下层接收液中取样200ul，并且补加新鲜的Hank’s缓冲液。样品中药物含量用荧光HPLC测定。

建立的血脑屏障模型，跨膜电阻可高达200Ω/cm²，同时用HRP透过率验证了模型的致密性，符合实验要求。由图6中可以看到，双配体修饰的阿霉素脂质体在体外血脑屏障模型上的转运率均高于普通脂质体(p＜0.05)以及单配体修饰的脂质体(p＜0.05)，并且随着转运时间的延长，优势愈加明显。

实施例6双靶向阿霉素脂质体的体内靶向性评价

1、建立脑胶质瘤体内模型

(1)细胞准备

取对数期C6脑胶质瘤细胞，用PBS将其调整为1×10⁶/10μl，置于冰浴中备用。

(2)动物准备

取220g左右的Wistar清洁级雄性大鼠，称重，于手术前12小时禁食、禁水；用质量分数为10％水合氯醛按400mg/kg剂量腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于脑立体定位仪上。术区剃毛，碘酒消毒、酒精脱碘各三遍，手术过程中注意保温。

(3)靶点定位

大鼠头部正中纵向切口，用止血钳将头部皮肤左右分开，以刀片刮去颅盖骨膜，暴露颅骨，以大鼠颅顶的前囟点为定点，当微量注射器的针尖对准此点时，读取立体定位仪三维坐标上标尺的数值，此数值即是“0”点坐标。大鼠右侧大脑尾状核，坐标为前囟中点前1.0mm，正中矢状线右侧旁开3.0mm处，然后，在此点用铅笔作一标记。用颅钻在靶点钻孔一枚，勿伤及硬脑膜，直径1.0mm。将注射器及其针头移至骨孔，核对骨孔的准确度，修正骨孔。

(4)接种C6脑胶质瘤细胞

用微量注射器吸取10μl细胞悬液，使其达到1×10⁶个细胞，垂直刺入硬脑膜6mm，退针1mm(距硬脑膜下5mm)，微量注射泵将细胞悬液以1μl/min的速度注入靶区，注射时间为10min，留针5min，使细胞充分沉积，避免返流。将针缓慢拔出之后，用骨蜡封闭骨孔，生理盐水冲洗手术部位，缝合皮肤后消毒皮肤，待大鼠苏醒之后单笼饲养。假手术组以PBS代替细胞悬液进行同样操作。注射青霉素五天抗炎。

2、体内靶向性研究

Wistar大鼠植瘤14天后分成两组，利用小动物活体成像系统分别考察DIR(细胞膜荧光探针)溶液，DIR脂质体，双配体修饰的DIR脂质体在体内的分布情况。

具体操作步骤如下，将荷瘤大鼠腹腔注射质量分数为10％水合氯醛麻醉，给药前置于活体成像仪暗箱平台上，荧光测定条件同上，扫描本底强度并相应提高检测阂值以消除背景值。将DIR溶液，DIR脂质体，转铁蛋白和叶酸共同修饰的DIR脂质体以50μg/只的DIR浓度尾静脉注射荷瘤2周的wistar大鼠。2小时和24小时后，心室灌流，取脑和心脏离体观察荧光强度。

荷瘤wistar大鼠尾静脉注射阿霉素溶液，阿霉素脂质体，双配体修饰的阿霉素脂质体，于给药后2小时后用质量分数为10％水合氯醛腹腔麻醉，心脏灌流生理盐水后，4％多聚甲醛灌注20min，取脑组织，用PBS漂洗10遍，置于4％多聚甲醛中固定24h后，依次置于15％和30％蔗糖溶液脱水24h，O.C.T包埋，冷冻切片，厚度为20μm，PBS漂洗后用lμgml的DAPI染色10min，PBS漂洗，荧光显微镜观察药物在脑胶质瘤中的分布和荧光强度。

由图7可以看出，在体荧光结果显示双配体修饰的阿霉素脂质体在2h即入脑，且随着时间增长至24h，累积的荧光强度越强。从该图可以看出，随着时间的推移，大鼠脑部的荧光强度逐渐增加，并且荧光发光部位偏向脑部右侧，位于内毗连线之后，两耳连线之前，与植瘤的部位一致，即右侧纹状体，因此显示双配体修饰的DIR脂质体在肿瘤部位蓄积，表明其对胶质瘤的靶向性。

另外，从入脑药物含量上，双配体修饰的脂质体组入脑最多，其次是普通脂质体组，这说明双配体修饰的阿霉素脂质体进入脑实质后，在脑胶质瘤部位有一定的蓄积。结果显示，双配体修饰的制剂既可通过BBB，又可靶向于胶质瘤，具有一定的体内二级靶向作用。并且双配体制剂组心脏的荧光强度明显小于溶液组。

为了更为直观的比较靶向脂质体在恶性脑胶质瘤部位的蓄积，在荷瘤大鼠尾静脉注射2mg/kg阿霉素浓度的阿霉素溶液，阿霉素脂质体和双配体修饰的阿霉素脂质体2h后对脑组织进行冰冻切片。如图8所示，双配体修饰的阿霉素脂质体组在原位脑胶质瘤脑部的荧光强度明显强于普通阿霉素脂质体组和阿霉素溶液组，且主要荧光分布在肿瘤区域，这表明双配体修饰的阿霉素脂质体组具有更强的恶性胶质瘤靶向性。

实施例7体内药效学评价

参照实施例6的方法建立C6细胞原位胶质瘤模型大鼠共24只，随机分为四组(n＝6)。于细胞接种后第8天，11天，14天，17天分别尾静脉给予2mg/kg的阿霉素浓度的阿霉素溶液，阿霉素脂质体和双配体修饰的阿霉素脂质体，以生理盐水作为对照。观察大鼠生存状态并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

从图9可以看出，经过四次给药治疗后，双靶向阿霉素脂质体组具有明显抗肿瘤效果，其生存时间依次大于普通阿霉素脂质体和阿霉素溶液组，且中位生存时间双配体修饰的阿霉素脂质体有了较大的延长。结果显示，双配体修饰的阿霉素脂质体组的平均生存时间为30天，显著高于对照组(20天，P＝0.00019)，阿霉素溶液组(24天，P＝0.0402)和阿霉素脂质体组(27天，P＝0.0037)。综上，双配体修饰的阿霉素脂质体对抗脑胶质瘤具有更好的治疗效果。

Claims (10)

1.一种双靶向脂质体，包括脂质体和表面修饰的配体，其特征在于，所述配体为叶酸和转铁蛋白。

2.如权利要求1所述的双靶向脂质体，其特征在于，粒径为120～210nm。

3.如权利要求1的双靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括：

（1）将叶酸与带有氨基基团的脂质衍生物反应制得叶酸修饰的脂质衍生物；

（2）以叶酸修饰的脂质衍生物、磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和带有羧基基团的脂质衍生物为原料制得叶酸修饰的脂质体；

（3）将转铁蛋白与叶酸修饰的脂质体表面的羧基相连，制得所述的脑胶质瘤双靶向脂质体。

4.如权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述叶酸与带有氨基基团的脂质衍生物的摩尔比为（0.8～1.0）：（1.0～1.2）。

5.如权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述叶酸修饰的脂质衍生物、磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和带有羧基基团的脂质衍生物的摩尔比为（0.015～0.019）：（1.8～2.2）：（0.8～1.2）：（0.08～0.12）：（0.019～0.023）。

6.如权利要求3的制备方法，其特征在于，所述带有氨基基团的脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物。

7.如权利要求3的制备方法，其特征在于，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱。

8.如权利要求3的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇脂质衍生物为二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。

9.如权利要求1或2所述的双靶向脂质体在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

10.一种药物，其特征在于，包含所述的双靶向脂质体，所述的双靶向脂质体包载有盐酸阿霉素。

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