CN107157950B - 一种白蛋白纳米粒及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白蛋白纳米粒的制备方法及通过该方法制备的白蛋白纳米粒以及该白蛋白纳米粒的制药用途。更具体地，本发明涉及一种白蛋白纳米粒的制备方法，该方法包括以下步骤：1)将白蛋白溶解于脲溶液中混匀后，加入硼氢化钠溶液，得到变性白蛋白的脲溶液；2)将无水乙醇或其他有机溶剂加入到所述白蛋白变性的脲溶液中，然后加入纯化水，即形成白蛋白纳米粒。此外，本发明还涉及由上述方法制备的白蛋白纳米粒以及该白蛋白纳米粒的制药用途。

Description

一种白蛋白纳米粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体而言，本发明涉及一种白蛋白纳米粒及其制备方法和用途。
背景技术
脑胶质瘤是中枢神经系统性疾病中最主要的肿瘤，大约占40％，主要分为胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤两种。在过去的几年中，尽管传统的治疗方式(如手术、放疗和化疗)的水平提高很多，但是脑肿瘤患者的生存期并没有得到显著地提高，仍然为不到两年。化疗仍然是治疗脑胶质瘤的主要方式。而化疗由于血脑屏障的存在，使得肿瘤局部的药物浓度较低，加上化疗药物的毒副作用明显，因此疗效不佳。一般来说，联合应用两种或两种以上药物，是克服不良的毒性和其他副作用的一个比较有前途的战略，并且可以减少化疗药物的剂量和到达作用的靶点。
尽管在开发治疗途径中做了巨大的努力，但是，脑肿瘤的治疗仍然是肿瘤学领域的一个严峻的挑战。治疗脑肿瘤的障碍主要有以下几点：1、脑部结构复杂；2、许多脑肿瘤是异质性和侵入性的；3、很难确定肿瘤边缘和侵入的肿瘤；4、治疗药物在肿瘤的部位不能蓄积；5、化疗后期产生耐药。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞构成，从而阻碍药物以及载药系统等进入到脑肿瘤。除此之外，许多化合物进入脑部都被血脑屏障上高表达的包括P-糖蛋白之类的ATP结合盒所限制。因此，有效的靶向脑胶质瘤的唯一办法就是确定一个载药系统，既可以跨越血脑屏障而防止被ABC蛋白排出，又可以杀死脑胶质瘤细胞。
白蛋白是一个分子量为66KDa的血清的主要组成部分的蛋白，由于它的医学意义，充足，低毒，低免疫原性，所以是常用的药物载体。并且，白蛋白可以通过EPR效应较好的蓄积在恶性肿瘤和炎症部位。考虑到白蛋白的EPR效应和较好的在肿瘤间隙的累积，因此将白蛋白开发为药物载体是广受欢迎的。另外，据报道穿膜肽可以导致明显的瘤内摄取和渗透。
在治疗脑肿瘤的研究中，发现了一些在脑肿瘤中高表达的受体，包括SPARC(富含半胱氨酸的分泌蛋白)，可以与白蛋白特异性的结合。Gao等发现了白蛋白纳米粒可以较好地蓄积在肿瘤部位并发挥药效(Gao H,Wang Y,Chen C,et al.Incorporation oflapatinib into core–shell nanoparticles improves both the solubility andanti-glioma effects of the drug[J].International journal of pharmaceutics,2014,461(1):478-488.)。当白蛋白纳米粒在体内通过各种糖蛋白如gp60形成小窝并内吞进入肿瘤部位，可被SPARC特异性的结合，从而形成一个类似储药池的作用，使肿瘤细胞更容易凋亡被杀死。因此，白蛋白纳米粒可以较好的富集在肿瘤部位，不仅是由于大小尺寸在100nm左右的EPR效应所致，更重要的是肿瘤上面SPARC的高表达。
目前制备白蛋白纳米粒的常用方法有两种：交联法与高压匀质法。前者需要用到毒性较大的交联剂(如戊二醛)，残留试剂严重影响用药安全。后者采用高压匀质法，通过专用设备对白蛋白溶液进行高压匀质令其变性形成纳米粒。这两种方法存在设备要求复杂、制备的白蛋白纳米粒产品包载能力弱以及安全性差等的缺陷。因此，仍需要一种安全便捷的方法来生产可以包载多种药物的具有增强的载药能力的白蛋白纳米粒。
药物维甲酰酚胺(4-HPR)是维A酸的人工合成衍生物，临床上维甲酰酚胺已经作为乳腺癌(Veronesi U,Mariani L,Decensi A,et al.Fifteen-year results of arandomized phase III trial of fenretinide to prevent second breast cancer[J].Annals of oncology,2006,17(7):1065-1071.)，膀胱癌(Sabichi A L,Lerner S P,Atkinson E N,et al.Phase III Prevention Trial of Fenretinide in Patients withResected Non–Muscle-Invasive Bladder Cancer[J].Clinical Cancer Research,2008,14(1):224-229.)等癌症的预防用药。研究发现其主要的副作用为眼睛适应黑暗能力减弱，皮肤黏膜干燥，瘙痒，荨麻疹以及胃肠道不适等轻微症状(Cazzaniga M,Varricchio C,Montefrancesco C，et al.Fenretinide(4-HPR):a preventive chance for women atgenetic and familial risk？[J].BioMed Research International,2012)。因此，它是一个新兴的有前景的抗肿瘤药物，对于肿瘤的化疗具有重要意义。但是维甲酰酚胺的抗肿瘤机制研究的并不是十分清楚。
紫杉醇(PTX)是一直被广泛应用于实体瘤包括脑胶质瘤的抗肿瘤药。然而，由于紫杉醇较差的水溶性故必须使用表面活性剂比如蓖麻油。但是蓖麻油通常会给病人带来严重的过敏反应。为了避免蓖麻油的过敏反应，同时又可以保持药物的溶解性，取而代之有多种药物制剂形式，如，脂质体，聚合物纳米粒，胶束等等。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终得到本发明。
本发明的一个目的是提供一种白蛋白纳米粒的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种由上述方法制备的白蛋白纳米粒。
本发明的再一个目的是提供所述白蛋白纳米粒在药物制备中的用途。
因此，根据一个方面，本发明提供了一种白蛋白纳米粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)将白蛋白(优选牛血清白蛋白)溶解于pH范围为6-9，优选8.0-8.3，更优选8.3的脲溶液(所述脲溶液的浓度范围优选为1-20mol/L，更优选5-8mol/L)中混匀后，加入(优选在反应体系中最终浓度范围为0.001-1mol/L，更优选0.01-0.1mol/L)硼氢化钠溶液，即得到变性白蛋白的脲溶液。
2)将适量无水乙醇加入到所述白蛋白变性的脲溶液中，然后加入纯化水，即形成白蛋白纳米粒。
在一个实施例中，可以进一步包括在上述步骤1)之前用多肽或其他分子修饰白蛋白的步骤。优选地，所述多肽与白蛋白通过交联剂交联，更优选地，通过双功能的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)进行交联。
在一个实施例中，所述多肽是穿膜肽或靶向肽，优选为分子量为1-2KDa的穿膜肽(如低分子量鱼精蛋白或TAT)或者靶向肽(如T7、RGD或LRP1)，所述其他分子为甘露糖或叶酸等。在一个实施例中，所述低分子量鱼精蛋白的氨基酸序列可为VSRRRRGGRRRRRRC(SEQID NO:1)。
在一个实施例中，在上述步骤2)中，将药物溶于无水乙醇或其他有机溶剂中作为药物储备液，取所述药物储备液在涡旋的过程中逐滴加入到步骤1)得到的白蛋白变性的脲溶液中，然后加入纯化水后涡旋，由此得到包载药物的白蛋白纳米粒或包载药物的多肽修饰的白蛋白纳米粒。
在一个实施例中，所述药物为抗肿瘤药物，优选地，所述药物可以包括但不限于，选自维甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一种或多种，更优选地，所述药物可为维甲酰酚胺或紫杉醇，最优选为维甲酰酚胺和紫杉醇。
根据本发明的低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白(BSA-LMWP)的具体制备方法如下：
称取5mg SMCC溶解于200μL无水DMSO中，称取200mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于pH7.2的磷酸盐缓冲液中，待溶解完全后，将SMCC溶液逐滴加到BSA溶液中，室温搅拌1h，产物通过FPLC分子筛进行纯化，检测波长为280nm，流速为1ml/min。首先将Desalting和FPLC进行连接，使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为流动相平衡柱子约4-5个柱体积，即40-50ml，然后将反应产物注入到进样环中，将紫外基线调为零后以1ml/min的速度样品进入到Desalting中，约3min后通过程序设定仪器收集洗脱出来的紫外峰，等待紫外基线恢复到零后，依次进行下一针的纯化。称取6mg巯基化的低分子量鱼精蛋白(LMWP)溶于1ml 0.1M磷酸盐缓冲溶液中(pH7.2)中，滴入到收集到的洗脱峰中，置于4℃，搅拌过夜。产物BSA-LMWP通过FPLC肝素柱进行分离，检测波长280nm，流速1ml/min。首先将Heparin与FPLC进行连接，流动相为：A相是0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)，B相是0.1M磷酸盐缓冲液/2M NaCl(pH7.2)，用100％B相平衡2个柱体积后，换做A相平衡4-5个柱体积，然后将样品注入进样环中，紫外基线调为零，以1ml/min的流速流入柱内，2min后即样品全部进入Heparin中，再次进样2ml，待全部样品进完后，紫外基线为零后，换做100％B流动相进行洗脱，通过设定仪器程序收集紫外洗脱峰，即获得BSA-LMWP。
此外，根据本发明的空白或载药白蛋白纳米粒的具体制备方法如下：
3.0g Tris碱和28.0g脲溶于水中，用浓盐酸调节其pH为8.3，备用。分别称取100mgBSA以及上述制备的BSA-LMWP溶解于400μl水中后转移至5.6ml的脲溶液中混匀，然后加入1.05ml无水乙醇混匀，加入0.1ml硼氢化钠溶液后8000rpm离心3min，依次室温静止30min，50℃水浴30min，放置室温后备用，以制得BSA变性的脲溶液和BSA-LMWP变性的脲溶液。
空白纳米粒的制备：
取0.1ml无水乙醇在涡旋的过程中逐滴加入到上述BSA变性的脲溶液或BSA-LMWP变性的脲溶液中，然后加入0.5ml纯化水后涡旋，形成空白的白蛋白纳米粒或者低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒。
载药白蛋白纳米粒的制备：
PTX和4-HPR溶于无水乙醇中作为药物储备液，取0.1ml在涡旋的过程中逐滴加入到BSA变性的脲溶液或BSA-LMWP变性的脲溶液中，然后加入0.5ml纯化水后涡旋，形成载药的白蛋白纳米粒或者低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒。
通过上述方法制得的白蛋白纳米粒的粒径约为150-200nm。
根据另一个方面，本发明提供了一种由上述的方法制备得到的白蛋白纳米粒。
在一个实施例中，所述白蛋白纳米粒是多肽或其他小分子修饰的白蛋白纳米粒。
在一个实施例中，所述多肽是穿膜肽或靶向肽，优选为分子量为1-2KDa的穿膜肽(如低分子量鱼精蛋白或TAT)或者靶向肽(如T7、RGD或LRP1)，所述其他分子为甘露糖或叶酸等。在一个实施例中，所述低分子量鱼精蛋白的氨基酸序列可为VSRRRRGGRRRRRRC(SEQID NO:1)。
在一个实施例中，所述白蛋白纳米粒是包载药物的白蛋白纳米粒或包载药物的多肽修饰的白蛋白纳米粒。
在一个实施例中，所述药物为抗肿瘤药物，优选地，所述药物可以包括但不限于，选自维甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一种或多种，更优选地，所述药物可为维甲酰酚胺或紫杉醇，最优选为维甲酰酚胺和紫杉醇。
在一个实施例中，所述白蛋白纳米粒可用于治疗肿瘤，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤，优选地为实体瘤，更优选地，为脑胶质瘤。
根据另一个方面，本发明提供了一种白蛋白纳米粒在药物制备中的用途。
在一个实施例中，所述药物为抗肿瘤药物，优选地，所述药物可以包括但不限于，选自维甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一种或多种，更优选地，所述药物可为维甲酰酚胺或紫杉醇，最优选为维甲酰酚胺和紫杉醇。
在一个实施例中，所述白蛋白纳米粒用于包载药物。
本发明中白蛋白纳米粒的制备方法具有以下优点：避免了毒性交联剂，无需要大型专用设备，便捷可控，更为重要的是在完全变性条件下，增强了白蛋白的载药能力，可实现两种或两种以上药物的同时包载。
根据本发明的包载抗肿瘤药物或疏水性药物的多肽修饰的白蛋白纳米粒不仅可以提高难溶性药物的溶解度，还可以降低其引起的毒副反应。
根据本发明的包载维甲酰酚胺和紫杉醇的低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒具有以下优点：一方面，通过一种具有生物相容性，可生物降解，绿色环保，无毒的药物载体，同时将紫杉醇和维甲酰酚胺递送到肿瘤细胞中；另一方面，这两个药物相互作用，促进细胞凋亡，并增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，联合低剂量的化疗药物，即可达到增效减毒的效果。
附图说明
图1为根据本发明制备实施例2制备载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)的过程以及抗肿瘤作用图。
图2为根据本发明制备实施例1中的低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白的表征图。其中，A为白蛋白与交联剂SMCC反应脱盐柱的流出图，B为白蛋白与低分子量鱼精蛋白反应后肝素柱纯化的洗脱图，C为白蛋白与低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
图3为根据本发明实验实施例1中的载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSA NP)和载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)的粒径图。
图4为根据本发明实验实施例1中的载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSA NP)和载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)的透射电镜图。
图5为根据本发明实验实施例1中的载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSA NP)和载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)的电位图。
图6为根据本发明实验实施例2中的载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSANP)、载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)、PTX+4-HPR以及PTX对脑胶质瘤细胞U87的抑制效果。
图7为根据本发明实验实施例2中的载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSANP)、载药低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)、PTX+4-HPR以及PTX对U87细胞的凋亡图。
图8表示本发明实验实施例2中PTX与4-HPR联合对U87细胞的细胞凋亡蛋白Caspase 3表达的影响。
图9为根据本发明实验实施例1中的白蛋白纳米粒(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSA NP)的细胞摄取效果图。
图10为根据本发明实验实施例1中的白蛋白纳米粒体(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSA NP)外模拟跨越血脑屏障的细胞摄取效果图。
图11为根据本发明实验实施例1中的白蛋白纳米粒(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSA NP)肿瘤球摄取效果图。
图12为根据本发明实验实施例3中的不同药物(PTX、4-HPR+PTX、载药PTX+4-HPR的BSA NP以及载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)对荷U87脑胶质瘤皮下瘤的动物模型的肿瘤抑制情况。
图13为根据本发明实验实施例3中的不同药物(PTX、4-HPR+PTX、载药PTX+4-HPR的BSA NP以及载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)对荷U87脑胶质瘤皮下瘤的动物模型的肿瘤照片。
图14为根据本发明实验实施例3中的不同药物(PTX、4-HPR+PTX、载药PTX+4-HPR的BSA NP以及载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)对荷U87脑胶质瘤皮下瘤的动物模型的体重变化和脏器系数图。
图15为根据本发明实验实施例3中的不同药物(PTX、4-HPR+PTX、载药PTX+4-HPR的BSA NP以及载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)对荷U87脑胶质瘤原位瘤的动物模型的肿瘤变化、体重变化以及脏器系数图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
试剂和药品
低分子量鱼精蛋白(VSRRRRGGRRRRRRC(SEQ ID NO:1))(上海丽昂有限公司)；牛血清白蛋白(Amersco)；4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(美国ProteoChem公司)；磷酸氢二钠、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司)；脲、Tris碱(上海杰瑞生物科技有限公司)；维甲酰酚胺(CAS：65646-68-6，南京圣赛化工有限公司)；紫杉醇(大连美仑生物技术有限公司)；DMEM细胞培养基(Gibco，Invitrogen，USA)；澳洲血源胎牛血清、0.25％胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗、BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(Sigma，美国)；二甲基亚砜、碳酸氢纳、盐酸(国药集团化学试剂有限公司)；
Figure GDA0002986892060000082
小室(8μm，Corning，USA)；ECL化学发光显色液(
Figure GDA0002986892060000081
West PicoChemiLuminescentSustral，Thermo Scientific，USA)；兔抗SPARC(H-90)多克隆抗体(Cat：SC-22574，Santa Cruz)；兔抗Caspase3多克隆抗体(Cell Signaling Technology)。
制备实施例1：低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白的合成
1.白蛋白的活化
称取5mg SMCC溶解于200μl无水DMSO中，称取200mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于pH7.2的磷酸盐缓冲液中，待溶解完全后，将SMCC溶液逐滴加到BSA溶液中，室温搅拌1h，产物通过FPLC分子筛进行纯化，检测波长为280nm，流速为1ml/min。首先将Desalting和FPLC进行连接，使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为流动相平衡柱子约4-5个柱体积，即40-50ml，然后将反应产物注入到进样环中，将紫外基线调为零后以1ml/min的速度样品进入到Desalting中，约3min后通过程序设定仪器收集洗脱出来的紫外峰(参见图2A)，等待紫外基线恢复到零后，依次进行下一针的纯化。
2.白蛋白与低分子量鱼精蛋白偶联
称取6mg低分子量鱼精蛋白(LMWP，序列为VSRRRRGGRRRRRRC(SEQ ID NO:1))溶于1ml0.1M磷酸盐缓冲溶液中(pH7.2)中，滴入到收集到的洗脱峰中，置于4℃，搅拌过夜。产物BSA-LMWP通过FPLC肝素柱进行分离，检测波长280nm，流速1ml/min。首先将Heparin与FPLC进行连接，流动相为：A相：0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)，B相：0.1M磷酸盐缓冲液/2M NaCl(pH7.2)，用100％B相平衡2个柱体积后，换做A相平衡4-5个柱体积，然后将样品注入进样环中，紫外基线调为零，以1ml/min的流速流入柱内，2min后即样品全部进入Heparin中，再次进样2ml，待全部样品进完后，紫外基线为零后，换做100％B相进行洗脱，通过设定仪器程序收集紫外洗脱峰，即获得BSA-LMWP(参见图2B)。
3.BSA-LMWP样品的保存
将收集到的洗脱峰通过BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定，具体操作步骤为：首先将蛋白标准品稀释成浓度为0.5mg/ml备用，标准曲线样品按照梯度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml依次加入到96孔板中，补齐到20μl，样品进行同样的操作，最后每个孔中加入200μl BCA工作液(Solution A:SolutionB＝50:1)，37℃静置20min，在562nm检测波长下测量，绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度，取50mg冻干备用。
制备实施例2：白蛋白纳米粒以及低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒的制备
准备脲溶液：
3.0g Tris碱和28.0g脲溶于水中，用浓盐酸调节其pH为8.3，备用。分别称取100mgBSA以及上述制备的BSA-LMWP溶解于400μl水中后转移至5.6ml的脲溶液中混匀，然后加入1.05ml无水乙醇混匀，加入硼氢化钠溶液，其在反应体系中最终浓度范围为0.01-0.1mol/L，之后8000rpm离心3min，依次室温静止30min，50℃水浴30min，放置室温后备用，以制得BSA变性的脲溶液和BSA-LMWP变性的脲溶液。
空白纳米粒的制备：
取0.1ml无水乙醇在涡旋的过程中逐滴加入到上述BSA变性的脲溶液或BSA-LMWP变性的脲溶液中，然后加入0.5ml纯化水后涡旋，形成空白的白蛋白纳米粒或者低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒。
载药白蛋白纳米粒的制备：
PTX和4-HPR溶于无水乙醇中作为药物储备液，取0.1ml在涡旋的过程中逐滴加入到BSA变性的脲溶液或BSA-LMWP变性的脲溶液中，然后加入0.5ml纯化水后涡旋，形成载药的白蛋白纳米粒或者低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒。
实验实施例1：白蛋白纳米粒以及低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒的体外表征实验
(1)粒径和电位
取纯化后的白蛋白纳米粒(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSA NP)各100μl，用纯化水稀释到终体积为1ml，使用马尔文粒径仪进行粒径和电位的测定，结果如图3和图5所示。
(2)TEM
将白蛋白纳米粒(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSA NP)分别滴加到预先水化后的铜网上，1min后吸干，滴加醋酸釉负染1min后自然晾干。用透射电镜对白蛋白纳米粒进行测定分析，结果如图4所示。
(3)体外稳定性实验
制备的BSA NP和L-BSA NP分别溶解于10％FBS的磷酸盐缓冲液中(pH7.4)，放置于37℃中，在设定的时间点(12h，24h，48h，72h)取部分进行粒径的测定。
(4)细胞摄取实验
考察白蛋白纳米粒(BSA NP)和低分子量鱼精蛋白修饰的白蛋白纳米粒(L-BSANP)在脑胶质瘤U87上的摄取情况。具体操作如下：首先待细胞长满后，消化并收集两种细胞，吹打均匀后，用细胞计数板进行计数，将细胞种在24孔板中，每孔加入500μl密度为2×106个细胞/ml的细胞悬液，置于细胞培养箱中培养24h后，弃去培养上清，将混有标记有FITC的BSA NP和L-BSA NP的新鲜培养基分别加入到各自孔中孵育1h，然后将培养上清弃去，用PBS洗三遍，加入4％多聚甲醛37℃固定10min，弃去多聚甲醛，用PBS洗三遍后，加入DAPI孵育20min，用PBS清洗三遍后，置于倒置荧光显微镜下观察。为了定量考察两种细胞对BSA NP和L-BSA NP的摄取情况，使用流式细胞仪进行检测。具体操作步骤同上，分别给予混有标记有FITC的BSA NP和L-BSA NP的新鲜培养基，孵育1h后，用PBS清洗一遍，胰酶消化并收集细胞，3000rpm离心5min后，用PBS再洗两遍，加入500μl PBS置于流式细胞仪上检测，结果如图9所示。
(5)体外模拟血脑屏障
选择bEnd.3细胞构建体外血脑屏障。具体操作方法是：将bEnd.3细胞消化并收集后接种于Transwell小室的上室中，接种后隔天换液，五天后，细胞致密，将U87细胞种与小室的下室，每孔20000细胞，培养24h后，分别将标记有FITC的BSA NP和L-BSA NP加入到上室中，并且保持上室与下室的液面齐平。孵育4h后，用胰酶消化并收集下室的U87细胞，PBS清洗三遍后，使用流式细胞仪进行检测，结果如图10所示。
(6)体外肿瘤球实验
为了进一步考察白蛋白纳米粒的穿透能力，更接近于肿瘤的真实环境，使用肿瘤球作为体外模拟肿瘤的模型。具体操作步骤如下：首先，对细胞培养板进行预处理，即将0.1％的琼脂糖加入96孔板中，冷却后备用。然后消化并收集U87细胞，用细胞计数板进行计数，以2×104个细胞/ml密度的细胞种与96孔板中，隔天换液，一周后进行实验，将包载香豆素-6的BSA NP和L-BSA NP分别于肿瘤球进行孵育4h，然后用冷PBS洗三遍后进行激光共聚焦的拍摄，结果如图11所示。
实验实施例2
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴蓝，商品名：噻唑蓝)法，流式细胞仪检测细胞凋亡分别测定紫杉醇，紫杉醇+维甲酰酚胺，载有紫杉醇和维甲酰酚胺的白蛋白纳米粒BSA NP以及载有紫杉醇和维甲酰酚胺的穿膜肽修饰的白蛋白纳米粒L-BSA NP体外抗肿瘤效应
MTT法检测对肿瘤细胞的抑制作用
首先在脑胶质瘤U87细胞上验证维甲酰酚胺和紫杉醇可联合使用杀死细胞。具体操作步骤为：消化并收集细胞，用细胞计数板计数，并调整细胞浓度为5×104个细胞/ml，将细胞种于96孔板中，每孔5000个细胞，继续放置细胞培养箱培养24h，然后将PTX、PTX+4-HPR、载药PTX+4-HPR的BSA NP和载药PTX+4-HPR的L-BSA NP四组分别给药，给药浓度按照紫杉醇的浓度计算，浓度范围为0.1025-8μg./ml，其中PTX和4-HPR的用量比为1：1，培养48h后，将20μlMTT溶液加入，再继续培养4小时，然后小心吸去培养上清，每孔加入200μlDMSO，37℃孵育15min后，用酶标仪检测细胞培养板的OD值，根据公式存活率(survival rate，SR)＝实验组平均OD值/对照组平均OD值×100％，计算各组的细胞存活率。
流式细胞仪检测细胞凋亡
具体操作方法：消化并收集U87细胞，用细胞计数板计数，将细胞接种于6孔板中培养24h后，将细胞分组为，空白组，DMSO处理的阳性对照组，PTX、PTX+4-HPR、载药PTX+4-HPR的BSA NP、载药PTX+4-HPR的L-BSA NP四个实验组，分别按照紫杉醇的浓度进行给药，给药浓度是2μg/ml，PTX和4-HPR的用量比为1：1，即：PTX(2μg/ml)、PTX(2μg/ml)+4-HPR(2μg/ml)、载药BSA NP(PTX(2μg/ml)+4-HPR(2μg/ml)、载药L-BSA NP(PTX(2μg/ml)+4-HPR(2μg/ml)继续培养48h后，收集培养上清，并消化收集细胞，PBS洗二遍，弃去上清，加入1×annexin binding buffer重悬细胞后，再加入5μlAlexa Flour 488annexin V，避光孵育20min后，再加入PI工作液孵育5min，进行流式细胞仪的检测，用流式细胞仪相关软件分析结果。
结果如下：
(1)通过MTT法检测白蛋白纳米粒对肿瘤细胞的抑制作用。相同的紫杉醇浓度下，紫杉醇与维甲酰酚胺联合应用组的IC50明显低于单纯紫杉醇组(IC50＝7μg/ml)，白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSA NP)组的IC50与紫杉醇和维甲酰酚胺组的相当，然而修饰穿膜肽的白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)组IC50明显低于未修饰的白蛋白纳米粒。分析原因：可能是白蛋白纳米粒通过SPARC主动靶向到U87细胞表面是需要时间并消化能量的，没有游离药物直接起作用的快；并且药物包载到纳米粒中释放也是需要一定时间，所以与游离药物相比，细胞抑制作用不明显。修饰穿膜肽后，会促进纳米粒穿透细胞膜，可以较多的进入到胞内发挥作用，在一定程度上抵消了以上所述劣势。
(2)应用流式细胞仪对U87细胞凋亡的实验结果分析如图7所示。紫杉醇浓度为2μg/ml时，PTX组凋亡为9.69％，PTX+4-HPR组为14.1％，载药PTX+4-HPR的BSA NP组为24.8％，载药PTX+4-HPR的L-BSA NP组是27.6％。可以看出PTX+4-HPR组是单独PTX组的1.5倍，细胞凋亡实验也证明维甲酰酚胺可以促进细胞凋亡。同时也证明穿膜肽修饰的白蛋白纳米粒在相同浓度下可以诱导凋亡的细胞数是游离药物组的2倍。
紫杉醇与维甲酰酚胺联合对细胞凋亡蛋白的作用
Caspase家族是一种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在细胞凋亡的起始阶段和执行过程中发挥着重要作用，其中Caspase3是细胞凋亡的主要执行者，出于细胞凋亡的核心，对整个细胞凋亡的过程起着重要的作用。在正常细胞中Caspase3以没有激活的酶原形式存在，只有在凋亡信号下才使其激活成活性Caspase3，进一步导致细胞凋亡。为了进一步研究维甲酰酚胺与紫杉醇共同作用可以促进细胞凋亡，通过western blot检测细胞凋亡蛋白可以看出：同样浓度为2μg/ml的维甲酰酚胺几乎没有凋亡，与空白相比CleavedCaspase3水平基本没有变化，而紫杉醇组的Cleaved Caspase3水平略有提高，证明紫杉醇引起U87细胞的凋亡，然而在紫杉醇和维甲酰酚胺的共同作用下，pro Caspase3下调，相应的Cleaved Caspase 3表达量上调(见图8)，证明维甲酰酚胺与紫杉醇共同作用可以促进U87细胞的凋亡，结果与流式细胞仪检测细胞凋亡一致。
实验实施例3
包载药物的白蛋白纳米粒在脑胶质瘤皮下移植瘤和脑原位瘤上的抗肿瘤实验
(1)U87移植瘤的建立
消化并收集U87细胞，1000rpm离心3min后弃去细胞培养上清，加入无血清培养基，细胞计数板计数，调整细胞密度为5×107个细胞/ml。置于冰水浴中，保持细胞活力。
将待种瘤的Blbc/nude小鼠置于生物安全柜中，异氟烷麻醉后，用75％酒精棉球擦拭待种瘤部位，消毒。然后用移液枪吹匀细胞，使用1ml无菌注射器吸去200μl悬液，注入皮下，按压片刻后放回笼子。随时观察肿瘤生长情况。待瘤体积为100-200mm3，即可进行下一步实验。
(2)U87原位瘤的建立
消化并收集稳转荧光素的U87细胞(Luc-U87细胞)，1000rpm离心3min后弃去细胞培养上清，加入无血清培养基，细胞计数板计数，调整细胞密度为5×107个细胞/ml。置于冰水浴中，保持细胞活力。
待小鼠麻醉后，将其固定在脑立体定位仪装置上，剪开头皮，找到颅骨冠状缝与矢状缝的交汇点，以此点为坐标原点确定三维空间的位置，分别向左移动2mm，向下移动1.8mm，即为接种脑肿瘤的正确位置；用颅钻钻开头骨，用微量注射器将细胞缓慢注入小鼠左脑内，完毕后，缓慢抽出进样器；缝合伤口，放回动物房，每天观察裸鼠的饮食、运动和健康状况等，约一周以后腹腔注射荧光素酶(30mg/Kg)，10min后应用小动物活体成像仪检测。
(3)荷皮下移植瘤裸鼠抗肿瘤效应
将U87移植瘤随机分为五组，每组四只，具体为PBS组(空白对照组)、紫杉醇组(PTX)，紫杉醇+维甲酰酚胺组(4-HPR+PTX)、载药白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的BSA NP)组、载药低分子量鱼精蛋白修饰白蛋白纳米粒(载药PTX+4-HPR的L-BSA NP)组。给药剂量按照紫杉醇的剂量计算，即，PTX(4mg/kg)组的紫杉醇浓度为4mg/kg。4-HPR+PTX组、载药PTX+4-HPR的BSA NP组和载药PTX+4-HPR的L-BSA NP组的紫杉醇浓度均为2mg/kg，与之相对应的4-HPR也为2mg/kg。给药方式选择尾静脉注射给药。每两天给药一次，并用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，电子称称量体重，整个给药周期为18天，共给药8次。实验终点时，采用CO2窒息仪将所有动物安乐死，剖离主要脏器(包括心肝脾肺肾)，称重后浸泡于4％多聚甲醛中，选取代表性的做HE病理切片。剖离肿瘤，PBS洗净后，称重并拍照。
按照下述公式计算抑瘤率：
抑瘤率(％)＝(1－T/C)×100％
其中，T：治疗组平均瘤重；C：阴性对照组平均瘤重。
(4)荷脑原位瘤裸鼠抗肿瘤效应
待原位脑肿瘤接种6天后随机分为五组，每组4只，分组情况和给药方法同上。分别在第10天，第17天，第24天通过腹腔注射荧光素酶，观测脑部肿瘤大小，且每两天称量体重。
图13是在给药过程中的肿瘤体积的增长图。从图中可以看出，相对于紫杉醇+维甲酰酚胺组，载药且修饰有穿膜肽的白蛋白纳米粒组可以看到肿瘤有明显的减小。同时还可以发现，高剂量的紫杉醇组(4mg/kg)与白蛋白纳米粒组抗肿瘤效果相当，即表明该白蛋白纳米粒在保证治疗效果的基础上可以显著减少化疗药物紫杉醇的剂量。这也减少了对动物的毒副作用。图13直观地显示了给药完成后各组的肿瘤照片。从图中可以看出，注射PBS组(空白对照组)的小鼠肿瘤明显较大，而修饰有穿膜肽的白蛋白纳米粒组有明显的减小。同样在脑原位瘤动物模型结果图15A发现PBS组脑瘤生长迅速较大，且体重减轻严重，游离药物组同样动物消瘦严重，考虑与游离药物毒副作用较大有关。通过实验终点剖离动物内脏，图15C显示PBS组的脾脏系数与其他实验组相比偏大，可能与炎症反应有关系。
在整个实验过程中可以观察到，本发明的载药穿膜肽修饰的白蛋白纳米粒给药体系的毒性较低，整个实验过程中没有动物体重明显下降的情况。
综上，本发明的修饰有穿膜肽的白蛋白纳米粒可以有效地介导纳米粒穿透进入细胞内部，释放药物，具有显著的抗肿瘤效果。对肿瘤细胞的体内外的生长抑制作用都表现出了明显的作用。同时，本发明的载药白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的原位瘤也具有显著的作用。
Figure IDA0000936208600000011

Claims (4)

1.一种白蛋白纳米粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）将白蛋白溶解于pH范围为6-9，浓度为5-8 mol/L的脲溶液中混匀后，加入硼氢化钠溶液，即得到白蛋白变性的脲溶液，其中，所述硼氢化钠在反应体系中最终浓度范围为0.01-0.1 mol/L；
2）将药物溶于无水乙醇或其他有机溶剂中作为药物储备液，取所述药物储备液在涡旋的过程中逐滴加入到步骤1）得到的白蛋白变性的脲溶液中，然后加入纯化水后涡旋，由此得到包载药物的白蛋白纳米粒，
其中，所述方法还包括在步骤1）之前用多肽修饰白蛋白的步骤，其中，所述多肽是氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的低分子量鱼精蛋白，
其中，所述药物为维甲酰酚胺和紫杉醇。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述白蛋白为牛血清白蛋白。
3.一种由权利要求1或2所述的方法制备得到的白蛋白纳米粒。
4.如权利要求3所述的白蛋白纳米粒在抗肿瘤药物制备中的用途，其中，所述肿瘤为脑胶质瘤。
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