CN115844831B - 一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，主要步骤是：首先构建CRISPR‑Cas9质粒；然后将人血清白蛋白水溶液、聚乙烯亚胺溶液、pCas9/PAR2混合，控制聚乙烯亚胺的氮与质粒的磷酸盐的氮磷比为16:1，涡旋数十秒，静置数十分钟；在搅拌条件下，向混合溶液中加入乙醇溶液，继续搅拌30分钟，再加入戊二醛溶液，搅拌30分钟；再向溶液中加入炎症靶向肽CBP，4℃搅拌过夜，使得CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联；最后采用超滤管超滤纳米粒溶液，除去未结合的白蛋白、戊二醛、乙醇残留，得到TAP/pCas9‑PAR2。本发明的方法不需要将白蛋白HSA修饰成阳离子材料，仍能将外源基因转染进入细胞；具有靶向递送的作用，达到高效、安全地敲除目的基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法。
背景技术
蛋白酶活化受体2(PAR2)属于G蛋白偶联受体(GPCRs)，可以被某些蛋白酶激活，调节下游炎症信号转导及功能。目前，PAR2激动剂较为成熟，但PAR2抑制剂还无法达到精准调控。因此，探索一些新的策略精准调控PAR2基因是十分必要的。
CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术，可通过精准定位基因组某一位点，剪断靶标DNA片段并插入、敲除或替换新的基因片段高效地改造基因。CRISPR的成功实现通常需要Cas9在一组细胞中引出有效的目标基因并敲除，研究发现CRISPR对目标基因的敲除高度依赖于sgRNA引导序列的效力。因此，CRISPR-Cas9系统可代替抑制剂实现PAR2基因的敲除，从而达到精准调控的作用。
目前研究表明，外源性基因在作为药物发挥作用时，必须先克服两大障碍。一是胞外屏障，是指递送载体在到达靶细胞的过程中，包括细胞吞噬系统，胞外基质、降解酶等的影响因素；二是胞内屏障，主要指的是细胞膜、内涵体、溶酶体以及核膜对靶基因进入核内有效表达的影响。正常情况下，在把外源基因导入靶细胞特别是进入细胞核，调控细胞内基因表达以实现基因插入、敲除或替换时，CRISPR等核酸大分子存在胞内稳定性差、摄取率低、易被核酸酶降解、体内外转染效率低等缺点。纳米粒是一类常见的药物载体，能保护和准确输送核酸药物至靶点，可作为CRISPR-Cas9的递送系统。目前很多研究采用阳离子材料如脂质体去包载基因药物，提高了转染效率，但阳离子材料对细胞具有较大的毒性，容易导致细胞死亡。
人血清白蛋白(HSA)是血液系统的重要组成部分，具有结合、运输物质、维持血液渗透压，清除自由基，抗凝血等功能。HSA除了具备可生物降解、无免疫原性、功能基团多、易修饰等特点，作为载体还具有以下有点：首先，作为一种天然的运载蛋白，HSA赋予药物载体较好的载药能力；其次，HSA具有天然的跨膜转运通路以及受体，可实现包载药物对病灶部位的靶向递送。目前HSA大多作为化药的运输载体，比如在紫杉醇、雷帕霉素等小分子药物。HSA本身是带负电的阴离子材料，在不被修饰成阳离子的情况下，很少包载同样电荷性质的基因药物如RNA、DNA等，更没有研究将其用在包载CRISPR-Cas9系统上。为了能够提高转染效率，利用人血清白蛋白基团多的特性，将其修饰成带正电荷的阳离子材料。将HSA修饰成阳离子材料后，虽能提高细胞转染效率，但具有一定毒性，从而诱导细胞死亡，若是运用在正常细胞上，反而会抑制细胞状态，导致实验失败。因此，研究一种既能提高转染效率和靶向性，又对正常细胞没有毒性的HSA基因药物载体，是势在必行的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法。
本发明提供的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，步骤如下：
S1、构建CRISPR-Cas9质粒：
构建eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒作为CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2。
所述质粒自带氨苄抗性的基因-AmpR、连接原核生物基因质粒的起始位点-Ori、启动子-U6、敲除PAR2的基因-F2RL1、Cas9核酸酶和表达嘌呤霉素抗性蛋白的PuroR。
S2、将人血清白蛋白溶于纯水中，调节pH为8，得到10mg/mL的人血清白蛋白溶液；将人血清白蛋白溶液、聚乙烯亚胺(PEI)溶液、pCas9/PAR2混合，控制聚乙烯亚胺的氮与质粒的磷酸盐的氮磷比为16:1，涡旋数十秒，静置数十分钟；
S3、在搅拌条件下，向步骤S2得到的混合溶液中加入乙醇溶液，继续搅拌30分钟，再加入戊二醛水溶液，搅拌30分钟；
S4、向步骤S3得到的溶液中加入炎症靶向肽CBP，4℃搅拌过夜，使得CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联；最后采用超滤管超滤纳米粒溶液，除去未结合的白蛋白、戊二醛、乙醇残留，得到TAP/pCas9-PAR2。
优选的是，步骤S2中，聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺为分子量10k。
优选的是，步骤S3中，乙醇溶液是体积浓度96％的乙醇溶液。
优选的是，步骤S4中，使用膜孔大小为30kDa的超滤管超滤纳米粒溶液。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
本发明制备了一种负载CRISPR-Cas9系统的人血清白蛋白纳米平台，该平台制备的人血清白蛋白纳米颗粒通过聚乙烯亚胺/人血清白蛋白溶液和质粒在一定氮磷比下获得，操作简单易行；该平台具备不需要将白蛋白HSA修饰成阳离子材料，仍能将外源基因转染进入细胞的功能；在白蛋白HSA表面修饰的多肽靶向到胶原蛋白，具有靶向递送的作用，达到高效、安全地敲除目的基因，在提高转染效率的同时做到无毒性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2的透射电镜图。
图2、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2的粒径分布图。
图3、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2在30天内的粒径变化图。
图4、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2在30天内的多分散性图。
图5、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2对巨噬细胞RAW264.7的转染结果图。
图6、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2在体外细胞中抗酶活性情况图。
图7、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2的PAR2敲除效率图。
图8、基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2对巨噬细胞RAW264.7的毒性结果图。
图9-图11：基于白蛋白的靶向递送纳米粒TAP/pCas9-PAR2的动物爪水肿及HE染色情况图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统，即是一种负载CRISPR-Cas9系统的人血清白蛋白纳米平台，制备方法步骤如下：
(1)CRISPR-Cas9质粒的构建：
构建eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒作为CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2，共同编码鼠源PAR2(F2RL1)sgRNA和Cas9，以及GFP标记的eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒。利用在线工具(https://www.genscript.com/gRNA-database.html)选取gRNA序列(CGTCTTGATCATGAGCACGT，序列如SEQ ID No：2所示)，委托南京Genscript公司构建和确认质粒。该质粒自带氨苄抗性的基因-AmpR、连接原核生物基因质粒的起始位点-Ori、启动子-U6、敲除PAR2的基因-F2RL1、Cas9核酸酶和表达嘌呤霉素抗性蛋白的PuroR构成。
(2)纳米粒的制备
将人血清白蛋白溶于纯水中，得到10mg/mL白蛋白溶液，分别调节pH为4、6、8，以筛选最优pH值。将100μL白蛋白溶液、一定量的PEI(10k)溶液以及2μg的pCas9/PAR2混合，调整PEI的量以制备不同的PEI-氮与质粒-磷酸盐(氮磷)比(8:1、16:1、32:1、64:1)，涡旋20秒，静置20分钟。然后，将上一步的混合溶液加入到去离子水的西林瓶中。在550rpm的条件下不停搅拌，并逐滴加入约2mL的96％的乙醇溶液。搅拌30分钟后，加入100mL5％的戊二醛水溶液作为交联剂改变白蛋白结构，以稳定白蛋白纳米粒。再次搅拌30分钟后，加入100μg的炎症靶向肽CBP(LeuArgGluLeuHisLeuAsnAsnAsnCys，LRELHLNNNC，序列如SEQ ID No：1所示，N代表天冬酰胺)，4℃搅拌过夜，利于CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联。使用膜孔大小为30kDa的超滤管超滤纳米粒溶液，以除去未结合的白蛋白，戊二醛和乙醇等残留物，定容，制备得TAP/pCas9-PAR2纳米粒。
此外，制备过程中未加入靶向肽时，得到的纳米粒为AP/pCas9-PAR2。
PEI/pCas9-PAR2则是直接将PEI和pCas9-PAR2混合，涡旋20秒，静置20分钟后超滤。TAP/pCas9-PAR2纳米粒的理化性质表征。
基于上述实施例制备的产物进行下述的性能测试：
一、TAP/pCas9-PAR2纳米粒的形态观察及粒径电位检测方法如下：
(1)取制备的TAP/pCas9-PAR2纳米粒溶液，用去离子水稀释后，滴加到云母片和铜网膜上，室温条件下干燥，分别通过透射电镜观察纳米粒的形态。使用马尔文粒径仪测量纳米粒复合物的粒径分布、Zeta电位及表征。
(2)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的包封率、载药量和稳定性：
使用超滤管超滤下纳米粒外所有液体收集并称量体积。使用SYBR-Green检测pCas9-PAR2含量，反向计算包裹的pCas9-PAR2的质量。纳米粒的封装效率和载药能力使用以下公式计算：
包封率(％)＝被包被的质粒的质量/加入总质粒的质量×100％
载药量(％)＝被包被的质粒的质量/纳米粒的质量×100％
纳米粒常温储存，在30天内采用动态光散射技术测定预设时间的粒径的变化，用于考察其纳米颗粒的稳定性。
二、体外实验:
(1)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的体外细胞转染实验
RAW264.7细胞按每孔2×105的细胞数接种在24孔板中，培养过夜。用GFP标记的pCas9-PAR2进行转染实验，将2μgGFP-pCas9-PAR2和搭载GFP-pCas9-PAR2的纳米粒(PEI/pCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2和TAP/pCas9-PAR2)分别加入孔板中，孵育4小时。然后，替换成含10％血清的培养基继续培养44小时。胰酶消化收集细胞，用冷的PBS洗涤三次后，以PBS重悬细胞，上样。用流式细胞术确定细胞转染效率。
(2)抗酶解实验
RAW264.7细胞按每孔2×105的细胞数接种在24孔板中，培养过夜。分别在GFP-pCas9-PAR2的纳米粒(TAP/pCas9-PAR2)和游离的GFP-pCas9-PAR2溶液中加DNase在37℃恒温摇床中孵育30分钟后，加入EDTA(1M)中止反应。将DNase处理过和没处理过的纳米粒与细胞共孵育4小时。孵育结束后将细胞用PBS洗涤三次，加入完全培养基继续培育44小时。最后，通过荧光显微镜观察荧光图像。
(3)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的PAR2敲除效率检测
RAW264.7细胞按每孔2×105的细胞数接种在24孔板中，培养过夜。将2μg的pCas9-PAR2和搭载pCas9-PAR2的纳米粒(PEI/pCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2和TAP/pCas9-PAR2)处理细胞4小时后，替换成含10％血清的培养基继续培养44小时。
结束实验后，RT-PCR方法检测基因水平PAR2敲除，具体步骤如下：提取RNA，于新的无酶离心管中依次精确加入：6μL的RNA、2μL5×gDNAwiperMix、2μLDNase/RNase-free水补足至总体积10.0μL。PCR仪程序运行：42℃，2min；4℃，5min以终止反应。向反应结束的离心管中依次加入以下组分：2μL10×RTMix、1μLRandomHexamers、4μLRNase-Free ddH2O、2ΜlHiScriptIIIEnzymeMix.、1μLOligo(dT)20VN，轻弹混匀后瞬离。PCR仪程运行：37℃，15min；85℃，5s；4℃，10min以终止反应。基于NCBI数据库基因序列信息，或相关文献设计所需引物。以β-ACTIN为内参基因，Tm值均设定在60℃。向八联管中依次精确加入：1μL模板cDNA、0.6μL正向引物、0.6μL反向引物、6.3μL无菌二次纯水、7.5μLTBGreenTMPrimerExTagTMII，轻弹瞬时混匀离心，每个基因设立两个复孔。QPCR仪程运行：两步扩增，预变性，一个循环(95℃，30s)；PCR反应阶段，40个循环(95℃，5s；65℃，30s)，冷却阶段(95℃，5s；60℃，60s；95℃，1s)。以Control组为1，进行CT数据计算。
流式细胞技术检测细胞表面PAR2的表达情况：将RAW264.7细胞按每孔2×105的细胞数铺于24孔板中，培养过夜。加入2μg游离的pCas9-PAR2、PEI/pCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2和TAP/pCas9-PAR2处理细胞4小时。PBS洗涤，换成10％FBSDMEM培养基继续培养44小时。收获细胞并与PBS(1％FBS)中的PAR2一抗孵育1小时。用PBS缓冲液冲洗细胞3次，并与Cy3偶联的羊抗兔IgG二抗一起孵育，最后用流式细胞术分析进行荧光检测。
(4)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的体外细胞毒性实验
将RAW264.7细胞按每孔5000的细胞数铺至96孔板，培养过夜。每孔加入不同比例的纳米粒作为实验组，不处理的作为阴性对照、无细胞的作为空白对照以及调零孔。毒性实验是在加入纳米粒37℃下孵育4小时后换成DMEM培养基培养44小时。每孔避光加入CCK8溶液，37℃孵育0.5-1小时后待空白孔中颜色变浅橙色，在450nm波长下测定各孔OD值。
细胞活性的计算如下：
细胞存活率(％)＝(实验组-调零组)/(阴性对照组-调零组)×100％；
细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。
三、TAP/pCas9-PAR2纳米粒的体内动物实验
选用雄性野生型昆明鼠建模。小鼠分别给予10μgpCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2或TAP/pCas9-PAR2。一天后，分别用2f-LIGRL-NH2(2f，300μg/paw，足内注射(i.pl))作为爪水肿模型或仅用生理盐水(100μL)作为肿胀程度对照。分别在1、2、4、6和8小时测量爪子的厚度和宽度。在实验中，足跖肿胀以面积(mm2)归一化至最大肿胀(100％)表示，并以各足跖肿胀变化百分比绘制。在足跖肿胀最大时，每组随机处死1只小鼠，剪下足跖进行苏木精-伊红染色(H&E)进行组织病理学分析。
水肿率＝(测量水肿大小-液体肿胀大小)/初始大小×100％。
测试实验结果分析如下：
(1)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的处方筛选及理化性质表征
基于人血清白蛋白材料制备递送CRISPR-Cas9的纳米粒，加入乙醇、戊二醛进行交联，并引入少许低分子量的PEI(PEI10k)以更好地包裹pCas9-PAR2质粒，提高转染效率。同时，加入了炎症靶向的多肽，以实现体内病灶部位的靶向性，能更好发挥基因编辑及治疗的作用。通过不同pH和氮磷比N/P，制备TAP/pCas9-PAR2纳米粒，使用马尔文粒径仪测量不同pH和不同氮磷比制备的纳米复合物的粒径分布及Zeta电位，结果见表1。结果表明，pH和氮磷比N/P是影响白蛋白纳米径的两大重要因素。当pH小于8时，白蛋白都不能形成很好的纳米粒，随着pH的升高，白蛋白纳米粒粒径逐步减小。在pH＝8的条件下，白蛋白纳米粒能形成粒径小于200nm的颗粒，而且当氮磷比＝16:1时，纳米粒粒径为107.5±9.8nm，PDI最小(0.161±0.027)，表明该比例下制备的纳米粒分布最均一。因此，纳米粒的最优pH为8，氮磷比为16:1。
表1、不同pH和N/P的TAP/pCas9-PAR2纳米粒的粒径分布
取最优条件下制备的TAP/pCas9-PAR2纳米粒溶液，用去离子水稀释后，滴加到云母片和铜网膜上，室温条件下干燥，分别通过透射电镜观察纳米粒的形态，结果见图1。使用马尔文粒径仪测量纳米粒复合物的粒径分布，结果见图2。可以看出，TAP/pCas9-PAR2形貌接近球形，形态均一、分布均匀，平均粒径约100nm。此外，测定了纳米粒的包封率为99.97±0.014％，载药量为0.195±0.00003％。
作为一种纳米粒制剂，需要在日常的保存条件下长期稳定的包裹pCas9-PAR2。为此，在常温条件下连续检测白蛋白纳米粒(最优条件下制备得到)的粒径和多分散性共30天。结果如图3和4显示，在30天内人血清白蛋白纳米粒的粒径尺寸和多分散性相比于初始均无明显变化，粒径仍然保持在110nm左右，多分散性范围仍在0.200左右。
(2)TAP/pCas9-PAR2对巨噬细胞RAW264.7的转染
RAW264.7细胞接种在24孔板中过夜，每孔加入纳米粒分别加入孔板中，孵育4小时后，替换10％血清的培养基继续培养44小时。胰酶消化收集细胞，用流式细胞术确定细胞转染效率。结果见图5，图中误差线代表平均值±SEM.***P＜0.001VS.Control.###P＜0.001VS.pCas9-PAR2.^^^P＜0.001VS.AP/pCas9-PAR2。可以看出，PEI/pCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2和TAP/pCas9-PAR2纳米粒均呈现出一定的转染能力，并在人血清白蛋白添加后转染效果明显增强。TAP/pCas9-PAR2纳米粒的转染效果明显高于PEI/pCas9-PAR2，转染效果提高了约3倍，表明白蛋白纳米粒比单独的阳离子材料PEI的转染效率高。以氮磷比N/P＝16:1的TAP/pCas9-PAR2组与AP/pCas9-PAR2组相比，在RAW264.7上调了38％，具有统计学上的显著性差异(^^^P＜0.001)。同时，TAP/pCas9-PAR2组转染效率较pCas9-PAR2组显著地提高了约30倍(###P＜0.001)。可以看出，TAP/pCas9-PAR2更有效的促进细胞跨膜运输，转染效果最好。
(3)TAP/pCas9-PAR2在体外细胞抗酶活性情况
将pCas9-PAR2和TAP/Cas9-PAR2用高浓度的DNaseI处理30min后再与细胞共孵育。在荧光显微镜下，如图6所示，DNase处理的TAP/pCas9-PAR2能够显示出与未处理的TAP/pCas9-PAR2相近的荧光强度。这充分说明了TAPpCas9-PAR2是能够保护好pCas9-PAR2原有结构，从而完成剪切PAR2的目的。而未处理的pCas9-PAR2孵育的细胞不展现绿色荧光，说明即使是体外细胞培养条件下的低酶条件下，pCas9-PAR2也无法保持原有结构。这展示pCas9-PAR2作为质粒的使用缺陷，以及纳米粒作为递送工具所独有的优势。
(4)TAP/pCas9-PAR2的PAR2敲除效率
RAW264.7细胞接种在24孔板中，培养过夜。每孔中加入PEI/pCas9-PAR2、AP/Cas9-PAR2和AP/pCas9-PAR2或游离pCas9-PAR2处理细胞4小时。PBS洗涤，换成含10％血清的DMEM培养基继续培养44小时。提取RNA，并逆转扩增，RT-PCR方法检测基因水平。同时，用流式细胞仪方法检测细胞表面蛋白的表达情况。
如图7所示，图中，误差线代表平均值±SEM.**P＜0.01,***P＜0.001VS.Control。结果表明TAP/pCas9-PAR2帮助递送CRISPR-Cas9系统成功敲除PAR2。由流式结果得出，在PEI/pCas9-PAR2和TAP/pCas9-PAR2处理后，PAR2的表达均有下降(***P＜0.001)，且TAP/pCas9-PAR2组的PAR2基因敲除最为完整，表明白蛋白纳米粒较阳离子材料PEI对PAR2基因的敲除效率更高。其中，在RAW264.7细胞中Control组与TAP/pCas9-PAR2组相比PAR2基因下调了68.9％(***P＜0.001)。同时，通过RT-PCR检测基因水平的表达，也可得出相同结论，即TAP/pCas9-PAR2处理后明显降低了RAW264.7细胞的PAR2表达。综上，TAP/pCas9-PAR2能准确敲除体外细胞的PAR2基因。
(5)TAP/pCas9-PAR2对巨噬细胞RAW264.7的毒性试验结果
将RAW264.7细胞铺至96孔板，培养过夜。加入不同比例的纳米粒作实验组，不处理的作为阴性对照、无细胞的作为空白对照以及调零孔。毒性实验是在加入纳米粒37℃下孵育4小时后换成DMEM培养基培养44小时。每孔避光加入CCK8溶液，待空白孔中颜色变浅橙色，在450nm波长下测定各孔OD值，结果见图8。实验结果得出，该纳米粒的材料孵育后的细胞存活率与未处理组细胞存活率无差异，表明纳米粒材料的相容性较好，对细胞无明显毒性，符合作为递送材料的基本性质，能安全递送pCas9-PAR2。
(6)TAP/pCas9-PAR2纳米粒的体内动物实验
小鼠分别给予10μgpCas9-PAR2、AP/pCas9-PAR2或TAP/pCas9-PAR2。一天后，分别用2f-LIGRL-NH2(2f，300μg/paw，足内注射)作为爪水肿模型，仅用生理盐水作为肿胀程度对照。分别在1、2、4、6小时测量爪子的厚度和宽度，实验结果见图9-11。误差线代表平均值±SEM.*P＜0.05，**P＜0.01,***P＜0.001VS.2f.#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001VS.pCas9-PAR2。可以看出，TAP/pCas9-PAR2处理的小鼠能够明显减轻足肿胀，有效降低爪部水肿程度，且在0.5小时肿胀度仅为2f组的0.4倍(*P<0.05)，这表明炎症靶向肽的加入有利于CRISPR精准地实现PAR2基因编辑，达到更好的抑制爪水肿的效果。同时，在小鼠水肿差异最大时(0.5小时)，处死小鼠，将小鼠爪部固定在多聚甲醛中，用于下一步HE染色鉴定爪部的炎性浸润状况。HE染色结果表明与卡尺测量结果相同，与Control组相比，pCas9-PAR2组爪组织水肿相对较严重，其次是2f组，AP/pCas9-PAR2组水肿相对较轻，TAP/pCas9-PAR2组和Control组均未见明显水肿，AP/DCas9-PAR2组，pCas9-PAR2和2f组的炎性细胞浸润均相对略重，TAP/pCas9-PAR2组和Control组均未见明显炎性细胞浸润。
以上结果均表明，TAP/pCas9-PAR2通过体内准确敲除PAR2基因实现对小鼠爪水肿的治疗作用。本发明制备的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统，不需要将白蛋白HSA修饰成阳离子材料，仍能将外源基因转染进入细胞的功能；在白蛋白HSA表面修饰的多肽靶向到胶原蛋白，具有靶向递送的作用，达到高效、安全地敲除目的基因，在提高转染效率的同时做到无毒性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1、构建CRISPR-Cas9质粒：
构建CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2，采用鼠源PAR2的CRISPR质粒，鼠源F2RL1sgRNA序列如SEQ ID No：2所示；
S2、将人血清白蛋白溶于纯水中，调节pH为8；将人血清白蛋白溶液、聚乙烯亚胺溶液、pCas9/PAR2混合，控制聚乙烯亚胺的氮与质粒的磷酸盐的氮磷比为16:1，涡旋数十秒，静置数十分钟；
S3、在搅拌条件下，向步骤S2得到的混合溶液中加入乙醇溶液，继续搅拌30分钟，再加入戊二醛水溶液，搅拌30分钟；
S4、向步骤S3得到的溶液中加入炎症靶向肽CBP，4℃搅拌过夜，使得CBP与白蛋白纳米粒充分的偶联；最后采用超滤管超滤纳米粒溶液，除去未结合的白蛋白、戊二醛、乙醇残留，得到TAP/pCas9-PAR2。
2.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S1中，构建eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0质粒作为CRISPR的敲除质粒pCas9-PAR2。
3.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，所述质粒自带氨苄抗性的基因-AmpR、连接原核生物基因质粒的起始位点-Ori、启动子-U6、敲除PAR2的基因-F2RL1、Cas9核酸酶和表达嘌呤霉素抗性蛋白的PuroR。
4.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，人血清白蛋白溶液中，人血清白蛋白浓度为10mg/mL。
5.如权利要求4所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺为分子量10k。
6.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S3中，乙醇溶液是体积浓度96％的乙醇溶液。
7.如权利要求1所述的基于白蛋白的CRISPR/Cas9靶向递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S4中，使用膜孔大小为30kDa的超滤管超滤纳米粒溶液。
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| PAR2 induces ovarian cancer cell motility by merging three signalling pathways to transactivate EGFR;Yuhong Jiang等;Br J Pharmacol.;第178卷(第4期);913-933 * |
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| 蛋白酶激活受体在免疫炎症性疾病中的研究进展;宋佳等;胃肠病学和肝病学杂志;第31卷(第2期);第230-233页 * |
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