CN105012271A

CN105012271A - 一种共担载阿霉素和trail的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法

Info

Publication number: CN105012271A
Application number: CN201510385230.9A
Authority: CN
Inventors: 张岩; 李洪仁; 李锋
Original assignee: Shenyang University
Current assignee: Shenyang University
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN105012271B

Abstract

一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法，该制剂由盐酸阿霉素DOX·HCl、人肿瘤坏死因子细胞凋亡配体TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亚胺PEI、羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物CMCS-FA以及注射用水、交联剂等制成的包载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向给药系统。通过制备载阿霉素的白蛋白纳米粒，羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）的合成，制备共包载阿霉素和TRAIL的叶酸靶向白蛋白纳米粒，叶酸介导的主动靶向和肿瘤pH敏感释药提高药物载体在肿瘤的富集；担载的阿霉素和TRAIL可以产生协同抗癌作用，对癌细胞（包括耐药细胞）产生强大的杀伤作用。

Description

一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种载药制剂及制备方法，特别是涉及一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法。

背景技术

据世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》预测，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，至2035年人数将增加到2400万人。新增病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国每年新增癌症患者307万，死亡220万，分别占全球总量的21.9%和26.8%。因此，抗肿瘤药物的市场近年增长迅速，全球2008年到2013年的复合增长率7.2%，在中国这一复合增长率达到20.4%，远高于全球增长水平。

当前治疗的缺陷，化疗是癌症治疗的有效手段，一般的化疗药物有极高的生物毒性而缺乏生物选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，亦杀伤正常组织细胞。由于非特异毒性、缺乏肿瘤选择性以及肿瘤的多药耐药性，对肿瘤的治疗不能达到令人满意的效果，甚至可能造成病人无法耐受而被迫停药。因此如何利用载体输送手段提高药物的肿瘤靶向特异性，提高肿瘤组织对化疗药物的敏感性以及降低系统毒性成为研究的热点。

美国生命科学公司（American Bioscience）开发的靶向化疗药物-无溶剂型紫杉醇白蛋白纳米粒Abraxane^?的问世激发了人们对白蛋白纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究热情。白蛋白具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特点，其独特的靶向性和缓释特性，使其在抗肿瘤药物载体方面具有广阔的应用前景。然而这种靶向作用相对较弱，且其耐药肿瘤细胞疗效较差，限制了其应用。为了进一步提高药物的靶向治疗作用，研究者在白蛋白外层偶联或吸附肿瘤特异性亲和配体使其具有主动靶向性。叶酸是叶酸受体的天然配体，而后者在多数恶性肿瘤中的表达明显高于正常细胞。

因此，本发明以叶酸介导白蛋白纳米粒的肿瘤主动靶向，可以显著提高制剂在肿瘤部位的富集。

近年来，纳米载体共载化疗药物与基因药物的研究屡见报道，特别是在多药耐药（multidurg-resistance, MDR）肿瘤研究领域。共载基因与化疗药物联合治疗癌症，相对传统化疗，该方法可以减少化疗药物的使用剂量，增加药物在靶器官的分布量，以达到减轻毒副作用及提高疗效的目的。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员之一，能选择性的诱导肿瘤细胞、转化细胞凋亡，而对正常组织无毒性，有望成为肿瘤治疗的新方法，备受人们的关注。TRAIL 单独使用较易发生耐药，其与化疗药物（如依托泊苷、顺铂、阿霉素和5-氟尿嘧啶）联合均可见协同或累加效应，能导致细胞凋亡。

本发明涉及的白蛋白纳米粒的另一个特点是具有肿瘤pH敏感释药特性，而且是逐级释放所装载的阿霉素和TRAIL，这主要是得益于层层自组装（Layer-By-Layer Self Assembly）制备技术的优势。首先制备载阿霉素的白蛋白纳米粒，然后在白蛋白表面首先吸附一层聚乙烯亚胺PEI（带正电荷），接着加入协同抗癌剂TRAIL，最后在外层再吸附一层羧甲基壳聚糖-叶酸复合物CMCS-FA（带负电荷）。该设计的优势是除了叶酸可以起到肿瘤靶向作用增加纳米粒子在肿瘤富集外，外层的羧甲基壳聚糖还可以掩蔽PEI的正电荷，降低载体的毒性，而且在肿瘤细胞外的pH条件下羧甲基壳聚糖层恰好可以脱落，首先释放出TRAIL被肿瘤细胞外层的受体识别后，引起肿瘤细胞凋亡，而暴露出的PEI使纳米粒产生电荷翻转，由负变正，提高了与细胞的亲和力，促进载体的细胞内吞。此外，PEI在细胞内溶酶体捕获质子，引起溶酶体破裂，释放出阿霉素，进一步杀伤肿瘤细胞，因此产生协同抗癌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法，该白蛋白纳米粒制剂具有叶酸介导的主动靶向和肿瘤pH敏感释药的特点，该制备方法具有简单易行，可层层组装包载药物，使活性药物在肿瘤部位逐级释放，产生协同抗癌作用的特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，该制剂由盐酸阿霉素DOX·HCl、人肿瘤坏死因子细胞凋亡配体TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亚胺PEI、羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物CMCS-FA以及注射用水、交联剂等制成的包载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向给药系统；其中，所述白蛋白溶液浓度为1.0-5.0%（克/毫升），阿霉素浓度0.001%-0.1%（克/毫升），白蛋白溶液pH值4.0-9.0，TRAIL和DOX的质量比为10:1-1:10，PEI和CMCS的质量比为1:2-1:6。

所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的聚乙烯亚胺为线性或分枝状结构，分子量在2 ~25 kDa。

所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的羧甲基壳聚糖的粘均分子量在20~100 kDa，脱乙酰度在80%~90%，羧甲基取代度在60%~80%。

所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的交联剂为戊二醛。

一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，所述方法包括以下制备步骤：

（1）制备载阿霉素的白蛋白纳米粒

采用去溶剂交联法制备阿霉素白蛋白纳米粒，取BSA适量配制水溶液，用1 摩尔每升的氢氧化钠溶液调节pH至8.0。取BSA溶液1毫升，搅拌下向其滴加盐酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分。然后，在搅拌下向上述溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40℃真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇；得到的产物经10 ℃、14000 转/分钟条件下离心10分钟，除去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒；然后向纳米粒中添加适量蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒；

（2）羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）的合成：

取0.2克叶酸（FA）溶于10毫升二甲基亚砜中，向其中加入0.1克的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和0.2 g的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）（FA/NHS/DCC摩尔比为1:2:2），室温活化反应12小时，直到叶酸全部溶解；向上述溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖（CMCS）的磷酸盐缓冲液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC（CMCS/FA/EDC摩尔比为1:1:1），继续室温避光搅拌16小时；然后向溶液中滴加氢氧化钠调节pH至9.0，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，然后用水透析24小时后，冻干处理；

（3）制备共包载阿霉素和TRAIL的叶酸靶向白蛋白纳米粒：

利用层层自组装技术制备共担载阿霉素和TRAIL的纳米粒；取载阿霉素的白蛋白纳米粒溶液1毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使纳米粒表面电荷由负变正，搅拌混匀后加入10微克/毫升的TRAIL溶液，搅拌均匀后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液（pH8.0 磷酸盐缓冲液配制）使纳米粒电荷由正变负，室温搅拌30分钟，即得。

所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤（1）中所述BSA溶液浓度为1.0-5.0%（克/毫升），优选为1.0-2.0%。

所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤（1）中所述阿霉素浓度0.001%-0.1%（克/毫升），优选为0.01-0.05%。

所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤（1）中所述BSA溶液pH值4.0-9.0，优选为7.0-9.0。

所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤（3）中所述加入TRAIL与DOX的质量比为10:1-1:10，优选为5:1-1:5。

所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤（3）中所述加入PEI和CMCS的质量比为1:2-1:6，优选为1:4。

共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂是由改良的去溶剂交联法制备得到载阿霉素的白蛋白纳米粒，再通过“Layer-By-Layer Self Assembly”技术将TRAIL装载于白蛋白纳米粒上，形成以白蛋白和阿霉素为核，羧甲基壳聚糖-叶酸偶合物为壳的白蛋白纳米粒靶向制剂。白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是牛血清白蛋白。

本发明的优点与效果是：

1.本发明制备的载药白蛋白纳米粒是一种乳白色胶状溶液制剂，可用于肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤的治疗。

2.本发明所制得的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒制剂，其具有叶酸受体靶向和肿瘤pH敏感释药的特性，注射后在血液循环中可以保持长时间的稳定，说明羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物存在于纳米粒的外层，利于纳米粒结构的稳定。同时由于其掩蔽了PEI的正电荷，降低了纳米粒的毒副作用。当纳米粒到达肿瘤部位时，其在叶酸介导下对肿瘤产生主动靶向，显著提高了药物在肿瘤部位的蓄积。肿瘤部位pH值低于正常细胞，纳米粒子利用这一性质，在肿瘤部位脱落外层的羧甲基壳聚糖外壳，释放TRAIL，被细胞表面的TRAIL受体识别，诱导细胞凋亡。同时，载体电荷发生翻转，带正电的载体更易进入肿瘤细胞后释放阿霉素，产生协同抗癌作用。

3.本发明通过工艺优化和处方筛选成功地制备了共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒。透射电镜观察纳米粒子具有球型外观，平均粒径在200纳米左右。Zeta电位结果表明纳米粒子的表面电荷随着PEI和CMCS-FA的加入出现正负变换，说明采用层层自组装技术成功构建了纳米粒子。

4.本发明制备的叶酸受体靶向和肿瘤pH敏感释药的载药白蛋白纳米粒靶向制剂，生物相容性好，制成注射剂后具有良好的缓释性和肿瘤靶向性，可以提高阿霉素的治疗效果，减少其使用的剂量，降低其毒副作用，益于提高患者治疗的耐受性。

附图说明

图1为共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的透射电镜照片；

图2为共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的粒径分布图；

图3为共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂制备过程中ζ-电位变化图；

图4a为共担载阿霉素；

图4b为TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1 制备共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂

（1）取BSA配成2%（克/毫升）的水溶液，用1摩尔每升的氢氧化钠溶液调节pH至8.0。取BSA溶液1毫升，搅拌下向其滴加0.02%的盐酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10 毫升/分，得到含药的白蛋白溶液。然后，在搅拌下向含药白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40℃真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇。得到的产物经10 ℃、14000 转/分钟条件下离心10分钟，弃去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒。然后向纳米粒中添加蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒。

（2）取0.2 g叶酸（FA）溶于10毫升的二甲基亚砜中，加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC，其中FA/NHS/DCC摩尔比为1:2:2，室温活化12小时，直到叶酸全部溶解。向叶酸溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖（CMCS）的磷酸盐缓冲液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），其中CMCS的粘均分子量为50 kDa，脱乙酰度85%，羧甲基取代度60%，CMCS/FA/EDC摩尔比为1:1:1。继续室温避光搅拌16小时，得到反应液。然后向反应液中滴加氢氧化钠调节pH至9.0，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，然后用水透析24小时后，冻干处理，得羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）。

（3）取载阿霉素的白蛋白纳米粒溶液1毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使纳米粒表面电荷由负变正，其中PEI分子量20 kDa，搅拌混匀后加入10微克/毫升的TRAIL溶液1毫升，搅拌均匀后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液（pH8.0 磷酸盐缓冲液配制）0.5毫升使纳米粒电荷由正变负，室温搅拌30分钟，即得共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒。

通过这种方法制备的纳米粒为球状微粒，粒径分布较均匀，平均粒径在200纳米左右（附图1、2）。ζ-电位结果显示（附图3），纳米粒表面电荷有明显翻转的过程，即原来的BSA纳米粒表面荷负电，PEI加入后电荷变正，而CMCS-FA加入后电荷又由正变负（附图3），说明纳米粒是以BSA为核心，PEI和CMCS-FA共同组成纳米粒的外壳，通过层层组装而成。

实施例2 制备共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂

（1）取BSA配成1%（克/毫升）的水溶液，用1摩尔每升的氢氧化钠溶液调节pH至8.0。取BSA溶液1毫升，搅拌下向其滴加0.01%的阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分，得到含药的白蛋白溶液。然后，在搅拌下向含药白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40℃真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇。得到的产物经10 ℃、14000 转/分钟条件下离心10分钟，弃去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒。然后向纳米粒中添加蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒。

（2）取0.2 g叶酸（FA）溶于10毫升的二甲基亚砜中，加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC，其中FA/NHS/DCC摩尔比为1:2:2，室温活化12小时，直到叶酸全部溶解。向叶酸溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖（CMCS）的磷酸盐缓冲液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），其中CMCS的粘均分子量80 kDa，脱乙酰度85%，羧甲基取代度80%，CMCS/FA/EDC摩尔比为1:1:1。继续室温避光搅拌16小时，得到反应液。然后向反应液中滴加氢氧化钠调节pH至9.0，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，然后用水透析24小时后，冻干处理，得羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）。

（3）取载阿霉素的白蛋白纳米粒溶液1毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使纳米粒表面电荷由负变正，其中PEI分子量25 kDa，搅拌混匀后加入100微克/毫升的TRAIL溶液1毫升，搅拌均匀后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液（pH8.0 磷酸盐缓冲液配制）1毫升使纳米粒电荷由正变负，室温搅拌30分钟，即得。

实施例3 制备叶酸受体靶向和肿瘤pH敏感释药的载药白蛋白纳米粒

（1）取BSA配成5%（克/毫升）的水溶液，用1摩尔每升的氢氧化钠溶液调节pH至8.0。取BSA溶液1毫升，搅拌下向其滴加0.05%的阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分，得到含药的白蛋白溶液。然后，在搅拌下向含药白蛋白溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40℃真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇。得到的产物经10 ℃、14000 转/分钟条件下离心10分钟，弃去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒。然后向纳米粒中添加蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒。

（2）取0.2 g叶酸（FA）溶于10毫升的二甲基亚砜中，加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC，其中FA/NHS/DCC摩尔比为1:2:2，室温活化12小时，直到叶酸全部溶解。向叶酸溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖（CMCS）的磷酸盐缓冲液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），其中CMCS的粘均分子量40 kDa，脱乙酰度80%，羧甲基取代度70%，CMCS/FA/EDC摩尔比为1:1:1。

然后继续室温避光搅拌16小时，得到反应液。然后向反应液中滴加氢氧化钠调节pH至9.0，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，然后用水透析24小时后，冻干处理，得羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）。

（3）取载阿霉素的白蛋白纳米粒溶液1毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使纳米粒表面电荷由负变正，其中PEI分子量10 kDa，搅拌混匀后加入50 微克/毫升的TRAIL溶液1毫升，搅拌均匀后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液（pH8.0 磷酸盐缓冲液配制）0.8毫升使纳米粒电荷由正变负，室温搅拌30分钟，即得。

实施例4 共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂对不同肿瘤细胞的增殖抑制实验

将贴壁培养、对数生长期的人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR和人恶性胶质瘤细胞U87 MG细胞株，用0.05%的胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的细胞培养液制成单细胞悬液。然后将细胞接种于96孔板内，每孔1×10⁴个。将培养板移至二氧化碳培养箱中，37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时，细胞贴壁后，吸弃培养液，分别给予阿霉素溶液（1微克/毫升）、TRAIL溶液（300纳克/毫升）、阿霉素和TRAIL混合溶液和共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒（阿霉素2 微克/毫升，TRAIL 1微克/毫升）。给药后继续培养24小时、48小时和72小时，每孔加入2 微克/毫升的MTT溶液50微升，继续培养4小时后吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150微升，轻轻震荡，10分钟后在490纳米处用酶标仪测定吸光度值（OD值）。细胞抑制率=（对照组OD值-给药组OD值）/对照组OD值×100%。

结果显示（附图4a、b），阿霉素与TRAIL联用可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，对乳腺癌耐药细胞仍然有效，纳米粒组与溶液组比较，产生更显著的抑制作用。

Claims

1.一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其特征在于，该制剂由盐酸阿霉素DOX·HCl、人肿瘤坏死因子细胞凋亡配体TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亚胺PEI、羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物CMCS-FA以及注射用水、交联剂等制成的包载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向给药系统；其中，所述白蛋白溶液浓度为1.0-5.0%（克/毫升），阿霉素浓度0.001%-0.1%（克/毫升），白蛋白溶液pH值4.0-9.0，TRAIL和DOX的质量比为10:1-1:10，PEI和CMCS的质量比为1:2-1:6。

2. 按权利要求1所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其特征在于，其使用的聚乙烯亚胺为线性或分枝状结构，分子量在2 ~25 kDa。

3. 按权利要求1所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其特征在于，其使用的羧甲基壳聚糖的粘均分子量在20~100 kDa，脱乙酰度在80%~90%，羧甲基取代度在60%~80%。

4. 按权利要求1所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其特征在于，其使用的交联剂为戊二醛。

5. 一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下制备步骤：

（1）制备载阿霉素的白蛋白纳米粒

采用去溶剂交联法制备阿霉素白蛋白纳米粒，取BSA适量配制水溶液，用1 摩尔每升的氢氧化钠溶液调节pH至8.0；

取BSA溶液1毫升，搅拌下向其滴加盐酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分；

然后，在搅拌下向上述溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40℃真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇；得到的产物经10 ℃、14000 转/分钟条件下离心10分钟，除去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒；然后向纳米粒中添加适量蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒；

（2）羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物（CMCS-FA）的合成：

（3）制备共包载阿霉素和TRAIL的叶酸靶向白蛋白纳米粒：

6. 按权利要求5所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述BSA溶液浓度为1.0-5.0%（克/毫升），优选为1.0-2.0%。

7. 按权利要求5所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述阿霉素浓度0.001%-0.1%（克/毫升），优选为0.01-0.05%。

8. 按权利要求5所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述BSA溶液pH值4.0-9.0，优选为7.0-9.0。

9. 按权利要求5所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述加入TRAIL与DOX的质量比为10:1-1:10，优选为5:1-1:5。

10. 按权利要求5所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述加入PEI和CMCS的质量比为1:2-1:6，优选为1:4。