CN111450081A - 增强型化动力治疗的蛋白纳米粒子、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强型化动力治疗的纳米粒子，其制备方法和应用，具体的所述纳米粒子以牛血清白蛋白作为载体，与二价铜离子配位，包裹低剂量的阿霉素而形成；所述Cu2+进入细胞后会被过量表达的GSH还原为Cu+，已有研究表明相对铁离子最佳催化环境为强酸性，Cu+可以在肿瘤组织的微酸性环境下更好的催化H2O2，而且铜离子被还原的过程可以消耗过于丰富的GSH，避免其对·OH的耗损，使得·OH更好的发挥化动力治疗的效果。同时，低剂量的DOX可以诱导癌细胞产生更多的H2O2，产生更多的·OH的同时避免了高剂量化疗药物带来的副作用，使得化动力治疗效果更佳。

Description

增强型化动力治疗的蛋白纳米粒子、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域，具体涉及一类增强型化动力治疗的蛋白纳米粒子药物的制 备及其应用，尤其是一类以牛血清白蛋白为载体用于化动力治疗的纳米药物及其制备方法 和应用。
背景技术
癌症严重威胁了人类的生命健康，传统的癌症治疗手段往往会导致全身毒性等毒作用， 新兴的光动力治疗、光热治疗又受到光渗透肿瘤深度有限的限制，化动力治疗(CDT)利 用了癌细胞特有的微酸性环境和过量表达的H2O2，本身具有一定的肿瘤内部触发的选择性。 但是虽然癌细胞内含有较多的H2O2但是想要达到理想的CDT治疗效果，仍需提高过氧化氢的含量。而且由于癌细胞内含有丰富的GSH，会反过来消耗CDT治疗过程中产生的·OH 导致治疗效果大打折扣。因此，亟需研发具有更好化动力治疗效果的药物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的提供一种增强型化动力治疗的纳米粒子，其制备方 法和在癌症治疗中的应用。所述增强型化动力治疗的纳米粒子是以生物相容性良好的牛血 清白蛋白(BSA)作为载体，与二价铜离子配位，包裹低剂量的传统抗癌药物阿霉素(DOX)，形成DOX@BSA-Cu纳米催化体系发挥CDT治疗作用。Cu2+进入细胞后会被过 量表达的GSH还原为Cu+，已有研究表明相对铁离子最佳催化环境为强酸性，Cu+可以在 肿瘤组织的微酸性环境下更好的催化H2O2，而且铜离子被还原的过程可以消耗过于丰富的 GSH，避免其对·OH的耗损，使得·OH更好的发挥化动力治疗的效果。同时，低剂量的 DOX可以诱导癌细胞产生更多的H2O2，产生更多的·OH的同时避免了高剂量化疗药物带 来的副作用，使得化动力治疗效果更佳。
本发明的另一方面在于保护一种增强型化动力治疗的纳米粒子的制备方法，包括以下 步骤：
d.向浓度为40-60mg/mL的BSA水溶液中滴加5～20mg/mL的CuCl2水溶液0.5～1.5mL， 搅拌后调pH为8～10；BSA与CuCl2的质量比为10:(1～4)
e.在搅拌条件下反应至少2h后，加入150～300μL浓度为5～8mg/mL阿霉素水溶液后 避光反应，其中，体系中DOX与BSA的质量比为1～3.75:100；
f.在搅拌条件下反应至少2h后，加入5～15wt％戊二醛溶液，所述的戊二醛溶液的加入 量按BSA与戊二醛的质量比为(10～5):1，继续搅拌至少2h后透析；所述的增强型化动力治疗纳米粒子，在抗癌药物阿霉素，络合Cu2+后被应用于癌症治疗。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，步骤a中，所述的牛血清白蛋白水溶液的浓 度为45-55mg/mL；
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，步骤a中，所述的CuCl2水溶液的浓度为12-14mg/mL；
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，步骤a中，所述的BSA与CuCl2的质量比为4:1；
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，步骤b中，所述的DOX与BSA的质量比 为3:100；
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述的戊二醛溶液的加入量为BSA：戊二 醛的质量比为(20～25):3；
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述的步骤a、b、c搅拌速度为600-900rpm， 优选700-800rpm。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下，所述的透析截留分子量为3500kDa。
本发明的第三方面在于保护利用上文所述方法制备的增强型化动力治疗的纳米粒子在 制备癌症治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以生物相容性良好，可降解，廉价易 得的牛血清白蛋白为载体，封装了低剂量阿霉素，络合了Cu2+，达到增强型化动力治疗效果。本发明具有快速进入癌细胞的能力，在癌细胞内能够能够有效地产生·OH诱导癌细胞凋亡。
在本发明中，由于而且Cu2+被还原的过程可以消耗过于丰富的GSH，使得·OH更好的 发挥化动力治疗的效果避免其对·OH的耗损，产生的Cu+可以在肿瘤组织的微酸性环境下更 好的催化H2O2。同时，低剂量的DOX可以诱导癌细胞产生更多的H2O2，产生更多的·OH的同时避免了高剂量化疗药物带来的副作用，使得化动力治疗效果更佳。
附图说明
图1纳米粒子的物理化学性质研究；
图2GSH破坏纳米粒子结构；
图3细胞对纳米粒子的摄取；
图4细胞内羟基自由基检测；
图5纳米粒子对MCF-7和4T1细胞系的毒性；
图6纳米粒子促4T1细胞系凋亡检测。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，但是实例的作用仅是解释而非限定本发明。
下述实例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特 殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1:纳米粒子DOX@BSA-Cu的制备步骤：
a.在700rpm的搅拌速度下，将50mg牛血清白蛋白溶解在1mL超纯水中，然后滴加12.5mg/mL的CuCl2水溶液1mL，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH为 碱性环境。
b.在700rpm的搅拌速度下反应4h后，加入200μL浓度为7.5mg/mL阿霉素水溶液 然后避光反应。
c.在700rpm的搅拌速度下反应6h，加入10％戊二醛溶液62.5μL继续搅拌4h。
d.反应后通过3500kDa透析袋透析。
对比例1
按实施例1中acd的方法，制备BSA-Cu的纳米胶囊粒子。
对比例2
a.在搅拌下，将50mg牛血清白蛋白溶解在1mL超纯水中，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH为碱性环境。
b.在搅拌下加入200μL浓度为7.5mg/mL阿霉素水溶液然后避光反应。
c.在搅拌下反应6h，加入10％戊二醛溶液62.5μL继续搅拌4h。反应后通过3500kDa透析袋透析得到DOX@BSA纳米粒子。
对比例3
在搅拌下，将50mg牛血清白蛋白溶解在1mL超纯水中，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH为碱性环境。搅拌4h后加入10％戊二醛溶液62.5μL继续搅拌4h。 反应后通过3500kDa透析袋透析得到BSA纳米粒子。
对比例4
在700rpm的搅拌速度下，将50mg精氨酸溶解在1mL超纯水中，然后滴加12.5mg/mL的CuCl2水溶液1mL，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH为碱性环境。 反应4h后溶液仍为澄清透明，纳米粒子无法形成。
对比例5
在300-500rpm的搅拌速度下，将50mg牛血清白蛋白溶解在1mL超纯水中，然后滴加12.5mg/mL的CuCl2水溶液1mL，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH 为碱性环境。反应4h后，加入200μL浓度为7.5mg/mL阿霉素水溶液然后避光反应6h， 加入10％戊二醛溶液62.5μL继续搅拌4h。反应后通过3500kDa透析袋透析。得到的纳米 粒子非常容易沉淀，稳定性较差。
对比例6
在700rpm的搅拌速度下，将50mg牛血清白蛋白溶解在1mL超纯水中，然后滴加12.5mg/mL的CuCl2水溶液1mL，搅拌1min后加入浓度为0.1mM的NaOH溶液调pH为碱性 环境。反应4h后，加入300μL浓度为7.5mg/mL阿霉素水溶液然后避光反应6h，加入10％ 戊二醛溶液62.5μL继续搅拌4h。反应后通过3500kDa透析袋透析。得到的纳米粒子非常 容易沉淀，稳定性较差。
效果例1：纳米粒子的物理化学性质研究
通过使用动态光散射(DLS，Malvern S90)在25℃和90°的固定散射角下测量纳米胶 囊在水中的流体动力学直径。用HT7700 EXALENS(日本日立公司)透射电子显微镜(TEM)来观察纳米粒子的形貌。加速电压为120kV。纳米粒子TEM样品是通过将稀释后的分散 液滴加在碳层涂覆的铜网上来制备的。使用Lambda 35紫外可见分光光度计(Perkin Elmer) 在25℃下于水溶液中测量纳米粒子紫外吸收变化。由纳米粒子DOX@BSA-Cu的投射描电 镜图(图1)可得，该方法制备的纳米粒子具平均直径约为30nm的较小尺寸可以快速进入 癌细胞。图1b是纳米粒子的水合粒径分布，由结果可知，纳米粒子在水中分布均一平均水 合粒径在100nm左右；图1c是对纳米粒子DOX@BSA-Cu紫外吸收变化的研究，如图所 示，通过紫外可见吸收光谱确认了DOX@BSA-Cu纳米粒子的成功合成。纯BSA溶液在280 nm处有特征吸收峰，与BSA相比，BSA-Cu和DOX@BSA-Cu位于280nm处的吸收峰消 失了，而在540nm处出现了吸收峰，这是Cu(II)与蛋白质复合物的特征吸收峰，证明了 铜离子与BSA的成功络合。同时，未经包裹的DOX在484nm和535nm处有明显特征吸 收峰，负载到BSA-Cu中后，红移至540和595nm。紫外吸收峰的变化一部分原因是DOX 在被包裹纳米粒子内后通常会发生一定程度的红移，还有可能是由于DOX和Cu2+之间的相 互作用，从而影响了DOX中的电子跃迁从而对紫外吸收峰产生了一定的影响。由结果可 知，该纳米粒子的成功合成。
效果例2：GSH破坏纳米粒子结构验证
在动态光散射(DLS，Malvern S90)在25℃和90°的固定散射角下测量纳米粒子与GSH 反应前后在水中的流体动力学直径变化。取0.5ml DOX@BSA-Cu纳米粒子水溶液稀释至2 mL，将样品置于塑料样品池中，以90°测试角分析。然后加入200μL浓度为2mM的GSH 溶液室温反应10min后再次将样品至于塑料样品池中进行测试。
使用Lambda 35紫外可见分光光度计(Perkin Elmer)在25℃下于水溶液中测量纳米 粒子紫外吸收变化。分别取0.5mg/mL的DOX@BSA和DOX@BSA-Cu纳米粒子水溶液2.5 ml，然后加入0.5ml浓度为1mM的GSH水溶液，立刻放入样品池通过紫外可见分光光度 计测试随反应时间为1，2，3，5，10，20，30，60min的纳米粒子吸收光谱。
由纳米粒子DOX@BSA-Cu的水合粒径分布图(图2a)可得，在加入浓度为2mM的 GSH后，纳米粒子的平均水合粒径粒径从100nm显著增加到了微米级别，这表明在GSH 还原了Cu2+后，纳米粒子开始不稳定，DOX@BSA-Cu在与GSH反应后纳米结构被破坏。 图2b是纳米粒子在加入GSH后紫外吸收变化，由结果可知，在与GSH孵育后， DOX@BSA-Cu的吸收发生明显变化，位于540和595nm处的吸收峰逐渐蓝移至484和535 nm处，最终与未被包裹的DOX特征吸收峰相同，这表明DOX在GSH的存在下逐步从 DOX@BSA-Cu纳米粒子中释放出来，证明了纳米粒子结构的破坏。
效果例3：细胞对纳米粒子摄取实验
将MCF-7细胞(大约2×105细胞/mL)接种到35mm直径的共聚焦培养皿中。加入2mlDOX@BSA-Cu纳米粒子浓度为100μg/mL的培养基，在培养箱中分别孵育0，15，30， 60min，用PBS把没有进入细胞的纳米颗粒洗掉，再加入2mL新的培养基和1μL细胞核 染料Hochest33342继续孵育15min。用PBS冲洗去除未进入细胞的Hochest 33342，在 Olympus FV1000-IX81激光共聚焦荧光显微镜60×油镜观察细胞的荧光图像。纳米颗粒选用 DOX的激发波长488nm，荧光强度信号收集560-590nm波段；Hochest 33342选用350nm 为激发波长，荧光强度信号收集445-475nm波段。比例尺：15μm。DOX在488nm的激发 下本身会产生荧光，可以起到追踪纳米粒子的作用，同时MCF-7细胞核被商染核染料 Hoechest 3342染色，以350nm激发接收460±15nm范围的荧光。由图3结果可知，在与 纳米粒子孵育15min后，在细胞质中可以明显观察到DOX的荧光，并且1h后荧光强度达 到饱和。共聚焦结果表明，由于DOX@BSA-Cu纳米粒子的小尺寸，它们可以迅速内化到 癌细胞中。证明了纳米粒子可以快速进入细胞。
效果例4：细胞内羟基自由基检测
将4T1细胞(大约2×105细胞/mL)接种到35mm直径的共聚焦培养皿中。分别加入PBS，DOX@BSA-Cu(100μg/mL)，BSA-Cu(100μg/mL)孵育4h。将培养皿用PBS冲洗去 除未进入细胞的纳米粒子，加入2mL新鲜无血清培养基和1μL活性氧检测探针 DCFH-DA(10mM)孵育20min，用无血清培养基冲洗后在Olympus FV1000-IX81激光共聚 焦荧光显微镜60×油镜观察细胞的荧光图像，DCFH-DA选用488nm为激发波长，荧光强 度信号收集505-535nm波段。比例尺15μm。由图4结果可知，用100μg/mL的 DOX@BSA-Cu纳米粒子处理4T1细胞4h后，癌细胞中的绿色荧光显著增加(图4)。然 而，仅用对比例1BSA-Cu处理的细胞绿色荧光强度明显弱于DOX@BSA-Cu纳米粒子处理 的细胞。这说明了与DOX@BSA-Cu纳米粒子共孵育后，癌细胞内产生的·OH明显多于与 对比例1BSA-Cu纳米粒子共孵育的细胞，这说明了DOX在细胞内诱导了H2O2的产生导 致了更多的·OH的产生，也说明了纳米粒子在细胞内起到了催化H2O2的作用。相比于对比 例1纳米粒子DOX@BSA-Cu可以诱导细胞内更多的·OH产生表现出增强型化动力治疗效 果。
效果例5：纳米胶囊的细胞毒性测试
通过MTT(3-(4,5)-二甲基噻唑(-2-基)-3,5-二苯基四唑)评估细胞活力。将MCF-7、 4T1细胞以1×105细胞/mL的密度接种在96孔板中，并在150μL含10％FBS的培养基中 培养。细胞附着24小时后，然后用150μL/孔的PBS洗涤板。然后将细胞与含有不同浓度 的不同剂型的DMEM一起孵育，药物浓度以剂型中纳米粒子的含量计量，将细胞在培养箱 中进一步培养24h。
为了进行活力测试，将在PBS中制备的10μL MTT(5mg/mL)加入每个孔中，并将 板在5％CO2湿润的培养箱中于37℃孵育4h。然后小心除去培养基，并将紫色晶体溶于 150μLDMSO中。在酶标仪(Thermo Fisher Scientific)上测量570nm处的吸光度。细胞存 活率＝(OD实验组-OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)×100％，其中阴性和空白对照分别是未 用药组和空白培养基组。
由图5所示的结果可得，由于其优异的生物相容性，对比例3BSA纳米粒子对细胞没有表现出明显的细胞毒性，而且由于DOX含量低对比例2DOX@BSA纳米粒子的毒性也 可以忽略不计，这二者细胞存活率均在80％以上。相反，随着对比例1BSA-Cu纳米粒子 和DOX@BSA-Cu纳米粒子浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，这是因为细胞内产生 了·OH。另外，在同等浓度下DOX@BSA-Cu的抑制率明显高于对比例1BSA-Cu。与250 μg/mL DOX@BSA-Cu孵育后，MCF-7和4T1细胞的细胞存活抑制率均约为60％。但是， 在相同浓度下，对比例1BSA-Cu对MCF-7和4T1细胞的细胞存活抑制率约为40％。细胞 毒性的差异是由于DOX的存在，它增加了细胞内H2O2的生成，使得纳米粒子可以聚集更 多的·OH，因此相对于对比例1、2、3，DOX@BSA-Cu导致了效率更高的CDT疗效。
效果例6：纳米粒子促细胞凋亡检测
将4T1细胞(大约2×105细胞/mL)接种到35mm直径的共聚焦培养皿中。分别加入BSA(100μg/mL)，DOX@BSA(100μg/mL)，DOX@BSA-Cu(100μg/mL)，BSA-Cu(100μg/mL) 孵育8h。将培养皿用PBS冲洗去除未进入细胞的纳米粒子，195μl Annexin V-FITC结合液。 先后加入5μl Annexin V-FITC，加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光 孵育10-20分钟，使用铝箔进行避光。随即在Olympus FV1000-IX81激光共聚焦荧光显微 镜60×油镜观察细胞的荧光图像，Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)均使用488nm激发，前者 接收525±15nm波段后者接收615±15nm波段。比例尺30μm。AV染色通过反映膜完整性 的丧失证明细胞凋亡或坏死过程。由于PI只能通过受损的细胞膜，所以它可以染色晚期凋 亡或死亡细胞的细胞核。如图6所示，由于BSA和低剂量DOX的无毒性，将4T1细胞与 对比例3BSA和对比例2DOX@BSA纳米颗粒(100μg/mL)孵育8h后，几乎观察不到 FITC和PI荧光。然而，在被对比例1BSA-Cu(100μg/mL)处理的细胞共聚焦图像中观察 到明显的FITC荧光，这表明BSA-Cu导致了大多数癌细胞处于早期凋亡。值得注意的是， 相比于对比例1、2、3用DOX@BSA-Cu处理后，可以在细胞中明显观察到FITC和PI荧 光，这表明细胞处于早凋或者晚凋状态。以上结果说明了DOX@BSA-Cu纳米粒子可以比 对比例更有效的导致癌细胞的凋亡，起到了增强型CDT的作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本 领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发 明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于增强型化动力治疗的白蛋白纳米粒子，其特征在于，以牛血清白蛋白作为载体，与二价铜离子配位，包裹低剂量的阿霉素，形成纳米粒子。
2.如权利要求1所述的用于增强型化动力治疗的白蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.向浓度为40-60mg/mL的BSA水溶液中滴加5～20mg/mL的CuCl2水溶液0.5～1.5mL，搅拌后调pH为8～10；BSA与CuCl2的质量比为10:(1～4)；
b.在搅拌条件下反应至少2h后，加入150～300μL浓度为5～8mg/mL阿霉素水溶液后避光反应，其中，体系中DOX与BSA的质量比为1～3.75:100；
c.在搅拌条件下反应至少2h后，加入5～15wt％戊二醛溶液，所述的戊二醛溶液的加入量按BSA与戊二醛的质量比为(10～5):1，继续搅拌至少2h后透析。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，所述的牛血清白蛋白水溶液的浓度为45-55mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，所述的CuCl2水溶液的浓度为12-14mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，所述的BSA与CuCl2的质量比为4:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，所述的DOX与BSA的质量比为3:100。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的戊二醛溶液的加入量为BSA：戊二醛的质量比为(20～25):3。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a、b、c搅拌速度为600-900rpm。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的透析截留分子量为3500kDa。
10.如权利要求2所述方法制备的增强型化动力治疗的纳米粒子在制备癌症治疗药物中的应用。
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