CN105288647A - 功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法;功能化白蛋白纳米制剂由功能化白蛋白、金属离子、药物组成;金属离子同时与功能化白蛋白和药物形成配位键,诱导自组装形成纳米颗粒。该纳米制剂可以通过肿瘤细胞表面的白蛋白受体(SPARC)介导的内吞作用将药物靶向性地递送到耐药肿瘤细胞内,有效避免了p-gp泵对药物的外排作用,然后通过pH响应实现配位键在酸性的肿瘤细胞环境中断裂,药物在胞质内释放进入细胞核嵌入DNA而抑制核酸的合成,进而抑制肿瘤细胞的生长。通过体外表征说明该纳米制剂能够实现较好的pH响应性;并通过细胞水平上的活性评价,证明该系统能够有效地将药物递送到细胞内实现较好的pH响应性释放。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法,属于纳米药物及传递载体技术领域。
背景技术
多药耐药(multidrugresistance,MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性,而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。阿霉素(Doxorubicin)是乳腺癌化疗的常用药物,乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药是阿霉素化疗失败的主要原因(DetwilerA,etal.,2013),也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素。现今逆转乳腺癌细胞耐药性的方法较少,目前研究发现MDR的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素(GoncalvesRS,etal.,2012;Zhang,etal.,2013;ZhangLH,etal.,2005)等,但这些耐药逆转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学,且可引起严重的毒副作用等,至今都未取得预期的临床效果,因此在临床上被限制使用。
近年来纳米药物用于逆转肿瘤耐药性受到越来越多的重视,脂质体、高分子聚合物纳米载体、胶束等纳米制剂(XiongXB,etal.,2005;LingPeng,etal.,2015)已被用于逆转肿瘤耐药性的研究。其逆转原理为纳米制剂通过内吞作用进入肿瘤细胞内,通过响应性释放等性质将药物释放在胞质中,在很大程度上避开p-gp泵对游离抗肿瘤药物的外排作用,增加药物的摄取量,进而增强抑制肿瘤细胞增殖的效果。
pH响应性的药物释放系统是一类智能药物释放系统,它能根据所处环境的酸碱度对药物进行可控性的释放。人体的肿瘤胞外环境(pH5.7-7.8)比正常血液或组织(pH约7.4)显酸性,而且细胞内涵体和溶酶体的pH更分别低至5.0和4.5。该类新型纳米载体可通过胞吞途径携载药物进入肿瘤细胞内涵体,避免了P-gp对药物的识别,而后内涵体的酸化(pH的改变)使其发生解聚或溶解,造成膜内外渗透压的变化,使内涵体快速地膨胀破裂,从而集中释放药物至胞浆,完成对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,pH响应性的药物释放系统在生物医药等领域尤其是抗肿瘤领域具有广泛的应用前景。
本发明中使用内源性分子白蛋白及配位基团修饰(如组胺二盐酸盐等),通过化学反应合成功能化白蛋白,不仅能够改变白蛋白的等电点至碱性,可使其在中性环境下形成较好的纳米颗粒;同时接枝的组胺能够提供咪唑基团,提高了载体的缓冲能力,重点是增加了能够与金属离子配位的基团。
发明内容
目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种功能化白蛋白,通过pH响应性金属配位键包载药物,无需有机溶剂及高压均质技术等方式实现纳米颗粒的制备,可以在水溶液中自组装形成纳米颗粒,材料的合成简单易行、纳米颗粒的制备绿色环保。
技术方案:为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种功能化白蛋白,其特征在于:所述功能化白蛋白是通过化学反应将配位基团修饰到白蛋白游离基团上,使具有与金属离子配位的功能。
所用白蛋白,选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重组人血清白蛋白、卵清蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白;所修饰的配位基团选自胺基、咪唑基、胍基、羟基、巯基、羧基、磺酸基、磷酸基。
本发明还提供一种功能化白蛋白纳米制剂,由上述的功能化白蛋白、金属离子、药物组成;金属离子同时与功能化白蛋白和药物形成配位键,诱导自组装形成纳米颗粒。功能化白蛋白纳米制剂是将功能化白蛋白、金属离子和药物通过配位诱导的组装方式而形成的。
所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)首先将药物与金属盐按照配位比例为1:0.5-1:4进行混合,得药物与金属离子的配位复合物;
(2)在搅拌条件下,将药物与金属的配位复合物逐滴加入到1-5%(W/V)的功能化白蛋白水溶液中;
(3)使用0.1MNaOH溶液调节pH至6.5-8.0,然后在0~50℃下搅拌0.5-12h;
(4)使用截留分子量为3500-14000的透析袋在水中透析除去游离药物后,冷冻干燥即得。可用水复溶后使用;用于靶向输送药物。
所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述的金属盐为可溶性的锌盐、铁盐、铜盐、钴盐、锰盐、镍盐、镧盐、钆盐、银盐、锆盐、钛盐;选自硝酸锌,硝酸铁,硝酸铜,硝酸钴,硝酸锰,硝酸镍,硝酸镧,硝酸钆,硝酸银,硝酸锆,硝酸钛,氯化锌,氯化铁,氯化铜,氯化钴,氯化锰,氯化镍,氯化锆,氯化镧,氯化钆,氯化银,氯化锆,氯化钛,硫酸锌、硫酸铁、硫酸铜、硫酸钴、硫酸锰、硫酸镍、硫酸镧,硫酸钆,硫酸银,硫酸锆,硫酸钛中的一种或几种。
所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述药物为含有羟基、羰基、巯基、氨基、羧基、胍基、磺酸基或磷酸基的有机化合物。
作为更优选,所述药物为蒽环类药物或黄酮类药物。
作为优选方案,所述蒽环类药物包括盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星、盐酸表阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星、美多比星、达佐霉素、丝裂霉素、博莱霉素、平阳霉素、米托蒽醌、茜素红、邻菲啰啉。
作为优选方案,所述黄酮类药物包括大黄素、黄芩素、黄芩苷、槲皮素、芦丁、陈皮素、甘草苷、水飞蓟素、儿茶素、银杏素、木犀草苷、木犀草素、葛根黄酮。
有益效果:本发明提供的功能化白蛋白与现有技术相比,具有以下优点:
该材料的合成方法简单,使用内源性分子白蛋白及含有配位基团的分子(如组胺二盐酸盐等),通过化学反应合成功能化白蛋白,不仅能够改变白蛋白的等电点至碱性,可使其在中性环境下形成较好的纳米颗粒;同时接枝的组胺能够提供配位基团,提高了载体的缓冲能力,重点是增加了能够与金属离子配位的基团。该功能化白蛋白纳米制剂的制备方法简单易行,不使用有机溶剂,可使其在中性环境下在水溶液中形成较好的纳米颗粒,即将药物及功能化白蛋白通过金属配位键交联起来,并通过调节pH值至中性使其组装成纳米颗粒。本发明的自组装纳米颗粒能够通过内吞途径进入细胞,避开p-gp泵对药物的外排作用,并根据pH的细微变化进行可控的药物释放,实现对耐药肿瘤细胞的有效治疗。
附图说明
图1为实施例1中功能化白蛋白合成示意图。
图2为实施例4中合成的功能化白蛋白的表征:(A)元素分析,(B)SDS-PAGE凝胶电泳实验,(C)缓冲能力试验。
图3为实施例8中制备的纳米颗粒的表征:(A)荧光猝灭法证明BH与Fe3+可以配位,(B)、(C)分别为ICP-MS测定DOX-Fe3+配合物中的Fe和N,(D)DOX、BH-Fe3+、DOX-Fe3+及BH-Fe3+-DOX纳米颗粒(NPs)的紫外吸收光谱,(E)BH-Fe3+-DOX纳米颗粒溶解在pH值为7.4、6.5、5.5、4.5的PBS及1MHCl中的紫外吸收光谱。
图4为实施例9中制备的纳米颗粒的响应性释放:(A)BH-Fe3+-DOX纳米颗粒在pH值为7.4、6.5、5.5、4.5的PBS中的累积释放曲线,(B)BH-Fe3+-DOX纳米颗粒在pH7.4的PBS及1mM的去铁胺(DFO)中的累积释放曲线。
图5为实施例10中制备的纳米颗粒在敏感及耐药乳腺癌细胞中不同药物浓度下不同时间的细胞毒性:(A)MCF-7,24h、(B)MCF-7/ADR,24h(C)MCF-7,72h、(D)MCF-7/ADR,72h。
图6为实施例10中制备的纳米颗粒在敏感及耐药乳腺癌细胞中的摄取研究:(A)在MCF-7、(B)MCF-7/ADR细胞上,对照相当量的游离药,给予不同浓度的纳米颗粒,观察不同时间段内的摄取量,(C)在MCF-7、MCF-7/ADR细胞中分别给予相当量药物浓度的游离药及纳米颗粒,孵育一定时间后对溶酶体及细胞核进行染色,共聚焦显微镜下观察摄取情况。
图7为实施例10中制备的纳米颗粒对耐药乳腺癌细胞株的细胞凋亡效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
如图1所示,在搅拌条件下,将13.875g组胺二盐酸盐(HA)加入到50ml50%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中,然后使用1MHCl溶液调节体系的pH值到4.75,最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)进行催化,室温搅拌反应6h。加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天;过滤,在-80℃冷冻,干燥得到咪唑化白蛋白(BH)。
实施例2
在搅拌条件下,将17.2g硫酸胍基丁胺(Agm)加入到50ml50%(W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中,然后使用1MHCl溶液调节体系的pH值到4.75,最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)进行催化,室温搅拌反应6h。加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天;过滤,在-80℃冷冻,干燥得到胍基化白蛋白(HSA-Agm)。
实施例3
在搅拌条件下,将15.252g精胺(SPE)加入到50ml50%(W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸盐缓冲溶液中,然后使用1MHCl溶液调节体系的pH值到4.75,最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)进行催化,室温搅拌反应6h。加入4M醋酸盐缓冲盐终止反应后使用截留分子量14000的透析袋在去离子水中透析3天;过滤,在-80℃冷冻,干燥得到胍基化白蛋白(HSA-SPE)。
实施例4
如图2所示,BH的表征(元素分析、SDS-PAGE电泳实验、缓冲能力试验)
2.1首先利用元素分析仪测定BH中各元素(C、H、N)的含量,通过含氮量的变化计算组胺的接枝量,进而计算出BH的分子量。
2.2使用SDS-PAGE电泳证明接枝前后分子量发生变化,本试验根据分子筛原理,分子大小不同的蛋白质产生不同的迁移率,电泳后在不同的水平位置出现蛋白条带。具体操作如下:
2.2.1配制浓度为10%的SDS-PAGE凝胶电泳
2.2.2蛋白变性,称取浓度为1mg/ml为BSA及BH,加入相应量的上样缓冲液,在100℃沸水浴中煮沸5min。
2.2.3上样后电泳,分别加入5μL蛋白Marker、4μLBSA、4μLBH,然后在100V电压下进行电泳,2h后停止。
2.2.4使用去离子水清洗蛋白胶除去电泳缓冲液中的一些物质,避免影响染色。然后使用考马斯亮蓝快速染料对蛋白胶进行染色50min。
2.2.5蛋白胶脱色,清洗染色后的蛋白胶,然后加入脱色液,并在微波炉中加热1min,然后放置到摇床上室温脱色,使用凝胶成像仪观察各蛋白条带。
2.3缓冲能力试验
通过酸碱滴定法测定载体材料的缓冲能力。称取100mgBH,100mgBSA(本应该是100mgBH中所含BSA的量)溶解于10ml150mM的Nacl水溶液中,配制成10mg/ml的溶液,使用0.1MNaOH将各溶液的初始pH调节至10.0,置于磁力搅拌器上,边搅拌边用0.1MHCl标准溶液滴定,5μl/test,使用pH计记录溶液pH的变化情况,作为对照,150mM的氯化钠在相同条件下进行滴定。
实施例5
首先按照1:3的摩尔比将Fe3+逐滴加入到阿霉素(DOX)水溶液中进行第一步配位,然后将混合后的DOX-Fe3+水溶液逐滴加入到BSA-HA水溶液中,搅拌均匀后使用0.1MNaOH调节pH至7.4,体系变成黑红色。搅拌0.5h后使用14000透析袋在在水中透析约6h,至无游离药物透出,冷冻干燥,得到黑红色膨松状固体,用前复溶既得。
实施例6
首先按照1:3的摩尔比将Fe3+逐滴加入到槲皮素(Que)水溶液中进行第一步配位,然后将混合后的Que-Fe3+水溶液逐滴加入到BH水溶液中,搅拌均匀后使用0.1MNaOH调节pH至7.0,搅拌1.5h后使用3500透析袋在在水中透析约6h,至无游离药物透出,冷冻干燥,得到膨松状固体,用前复溶既得。
实施例7
首先按照1:3的摩尔比将Zn2+逐滴加入到大黄素(Emo)水溶液中进行第一步配位,然后将混合后的Emo-Zn2+水溶液逐滴加入到BH水溶液中,搅拌均匀后使用0.1MNaOH调节pH至6.4,搅拌10h后使用10000透析袋在在水中透析约6h,至无游离药物透出,冷冻干燥,得到膨松状固体,用前复溶既得。
实施例8
如图3所示,BH-Fe3+-DOX纳米颗粒的表征
粒径(DLS、TEM)、电位:将冻干纳米颗粒溶解在水溶液中(浓度约为1-5mg/ml),经0.8μm的水洗滤膜过滤后,使用马尔文激光粒度仪进行测定。
包封率、载药量:使用紫外分光光度法测定。首先建立盐酸阿霉素在水及1MHCl水溶液中的标准曲线;称取一定量的纳米颗粒,然后加入3ml1MHCl水溶液将纳米颗粒破坏掉,然后使用紫外分光光度计测定纳米颗粒中阿霉素的含量。包封率=(纳米颗粒中实际药物的含量/理论载药量)*100%,载药量=(纳米颗粒中药物的重量/纳米颗粒的总重量)*100%。
Fe的含量:使用ICP-MS测定纳米颗粒中铁的含量。
荧光淬灭法、XPS、UV证明配位键的存在
使用荧光淬灭法测定咪唑化白蛋白与Fe3+混合后荧光强度的变化,用于证明Fe3+与咪唑化白蛋白上的配位基团之间形成配位键,具体步骤如下:配制10mg/ml的咪唑化白蛋白溶液和100mMFe(NO3)3·9H2O水溶液,然后配制一系列含有不同量Fe3+的咪唑化白蛋白混合溶液,即向10份2ml1mg/ml的咪唑化白蛋白溶液中分别将0、0.5、1、2、4、6、10、20、30、40μl100mMFe(NO3)3·9H2O水溶液,最后补加水溶液至总体积为2.04ml;将溶液混合均匀后使用荧光分光光度计测定荧光强度。
XPS:(将含有铁的配合物送样检测)测定BH-Fe3+空白载体、最终的制剂NPs、DOX-Fe3+配合物中铁的能级是否发生改变。
UV:使用紫外分光光度计测定DOX·HCl、DOX-Fe3+、空白载体(BH-Fe3+)、纳米颗粒(BH-Fe3+-DOXNPs)的紫外可见光谱。其浓度分别为1.13mM、54.54mMDOX(Fe3+与DOX的配位比为1:2)、1mg/ml、1mg/ml,根据吸收峰的位移、原有峰的消失或新峰的出现判断配位键的形成。
实施例9
分别称取冻干纳米颗粒(17.57mg/9ml、12.11mg/6ml、13.82mg/6ml、13.95mg/10ml)溶于pH7.4、6.5、5.5、4.5的PBS溶液中,然后取3ml纳米颗粒溶液装在截留分子量为14000的透析袋中,然后将透析袋放入装有40ml的释放介质的锥形瓶中,在37℃、120rpm条件下震荡,分别在0.5、1、2、4、6、8、12、24h定时取样并补加相同量的空白释放介质,平行做3组;最终使用紫外分光光度计测定纳米颗粒在不同pH介质中各个时间点药物的释放量,进而得出药物的累积释放曲线,如图4所示。
验证纳米颗粒对去铁胺(DFO)的响应性,释放介质为1mM的DFO溶液,其余操作同上。
实施例10
如图5所示,细胞毒性试验:分别将对数生长期的敏感乳腺癌细胞MCF-7、耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR接种到96孔板中,6000/孔;在37℃、5.0%CO2的培养箱中培养24h,然后给予空白载体、游离药物及纳米颗粒,敏感株乳腺癌细胞给予游离药物的浓度分别为10-3、10-2、10-2、1、5、10μM,耐药株乳腺癌细胞给予相当游离药物的浓度分别为10-2、10-1、10、50、100μM空白载体及纳米颗粒为游离药物相当量折合后的浓度;孵育24、72h后,使用MTT法测定细胞存活率。
如图6所示,细胞摄取实验:分别将对数生长期的敏感乳腺癌细胞MCF-7、耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR接种到12孔板中,10万/孔;在37℃、5.0%CO2的培养箱中培养24h,分别给予10μM的游离药物和相当游离药物浓度的载药纳米颗粒,摄取0.5、2、3h后使用PBS清洗三次,然后使用胰酶适当消化,将胰酶吸走后加入500μL空白培养基收集细胞,然后使用流式细胞仪测定药物的摄取量(BD,FL2通道);同时应用共聚焦显微镜观察细胞摄取情况,分别将对数生长期的敏感乳腺癌细胞MCF-7、耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR接种到共聚焦皿中,10万/孔;在37℃、5.0%CO2的培养箱中培养24h,分别给予10μM的游离药物和相当游离药物浓度的载药纳米颗粒,摄取3h后弃去培养基并使用PBS清洗三次,然后使用4%多聚甲醛固定15min,弃去并用PBS清洗三次,最后使用DAPI染色15min,在共聚焦显微镜下观察细胞摄取。
如图7所示,细胞凋亡:分别将对数生长期的耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR接种到12孔板中,10万/孔;在37℃、5.0%CO2的培养箱中培养24h,设置Contrl、空白载体、游离药物、纳米颗粒四组,各组中含有药物的浓度相同为10μM,加入样品24h后使用无EDTA的胰酶消化收集细胞至1.5mlEP管中,25℃、2000rpm下离心5min,弃去上清后使用PBS清洗两次,最后使用细胞凋亡检测试剂盒测定各组细胞的凋亡程度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种功能化白蛋白,其特征在于:所述功能化白蛋白是通过化学反应将配位基团修饰到白蛋白游离基团上,使具有与金属离子配位的功能。
2.根据权利要求1所述的功能化白蛋白,其特征在于:所用白蛋白,选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、卵清蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白;所修饰的配位基团选自胺基、咪唑基、胍基、羟基、巯基、羧基、磺酸基、磷酸基。
3.一种功能化白蛋白纳米制剂,其特征在于:由权利要求1或2所述的功能化白蛋白、金属离子、药物组成;金属离子同时与功能化白蛋白和药物形成配位键,诱导自组装形成纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)首先将药物与金属盐按照配位比例为1:0.5-1:4进行混合,得药物与金属离子的配位复合物;
(2)在搅拌条件下,将药物与金属的配位复合物逐滴加入到1-5%(W/V)的功能化白蛋白水溶液中;
(3)使用0.1MNaOH溶液调节pH至6.5-8.0,然后在0~50℃下搅拌0.5-12h;
(4)使用截留分子量为3500-14000的透析袋在水中透析除去游离药物后,冷冻干燥即得。
5.根据权利要求4所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述的金属盐为可溶性的锌盐、铁盐、铜盐、钴盐、锰盐、镍盐、镧盐、钆盐、银盐、锆盐、钛盐;选自硝酸锌,硝酸铁,硝酸铜,硝酸钴,硝酸锰,硝酸镍,硝酸镧,硝酸钆,硝酸银,硝酸锆,硝酸钛,氯化锌,氯化铁,氯化铜,氯化钴,氯化锰,氯化镍,氯化锆,氯化镧,氯化钆,氯化银,氯化锆,氯化钛,硫酸锌、硫酸铁、硫酸铜、硫酸钴、硫酸锰、硫酸镍、硫酸镧,硫酸钆,硫酸银,硫酸锆,硫酸钛中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述药物为含有羟基、羰基、巯基、氨基、羧基、胍基、磺酸基或磷酸基的有机化合物。
7.根据权利要求6所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述药物为蒽环类药物或黄酮类药物。
8.根据权利要求7所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述蒽环类药物包括盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星、盐酸表阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星、美多比星、达佐霉素、丝裂霉素、博莱霉素、平阳霉素、米托蒽醌、茜素红、邻菲啰啉。
9.根据权利要求7所述的功能化白蛋白纳米制剂的制备方法,其特征在于:所述黄酮类药物包括大黄素、黄芩素、黄芩苷、槲皮素、芦丁、陈皮素、甘草苷、水飞蓟素、儿茶素、银杏素、木犀草苷、木犀草素、葛根黄酮。
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