CN103611165A - 透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂新剂型和新技术领域，具体说涉及透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体及其制备方法和应用，同时提供一种纳米载药系统，其以透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇为载体，利用环糊精的包合作用力，包合疏水性为客分子，自组装形成超分子载药系统。其优点在于，这种纳米给药体系既可以通过EPR效应将药物被动的传递到肿瘤组织，又可以通过透明质酸的肿瘤靶向作用，提高药物的抗肿瘤效果。表面的PEG分子可以有效避免网状内皮系统摄取，延长体内循环时间。

Description

透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体及其制备方法和应用，尤其涉及该类化合物在药物传递系统中的应用。

背景技术

肿瘤严重威胁着人类的健康，目前化学疗法是治疗癌症的主要手段。然而，化疗药物除了杀死肿瘤细胞外，对正常细胞也存在着一定程度的损害，极大的限制了化疗药物的临床应用。因而开发新型的抗肿瘤药物纳米给药系统越来越引起人们的重视，如紫杉醇白蛋白纳米粒和阿霉素脂质体已经成功应用于临床。纳米制剂的突出优势在于其纳米尺度的粒径，其可以利用EPR效应（enhanced permeation and retention）被动的将抗肿瘤药物传递到肿瘤组织，发挥疗效，减少化学药物的毒副作用。此外还可以利用肿瘤组织高表达的受体对纳米制剂表面进行修饰，将药物靶向的传递到肿瘤组织，提高纳米制剂的摄取量。常用的肿瘤靶向配体有叶酸，环状RGD，转铁蛋白等。透明质酸（hyaluronic acid,HA）是一种体内广泛存在的糖胺多糖，其和蛋白质、核酸一样，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，它是由约2000-25000个β-N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸单糖构成的连续重复的线性分子，因此HA被认为是一种生物相容性良好，可降解的靶向分子，在体内其主要和CD44受体结合，而在肿瘤组织如上皮肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、直肠肿瘤组织、急性白血病等都含有过量表达的CD44受体，因此HA作为抗肿瘤药物的靶向载体，可借助其与肿瘤细胞表面的CD44受体之间的特异性结合，使更多的药物分子进入肿瘤组织，增加抗肿瘤药物在肿瘤部位的蓄积，从而有效地抑制肿瘤细胞的转移和生长。

环糊精（Cyclodextrins）是由D-吡喃葡萄糖单元以α-1,4糖苷键连接的环状低聚寡糖，根据其所含的葡萄糖单元数目的不同，常见的环糊精分为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精。环糊精类分子的特点是其具有一定尺寸的疏水性空腔，可以选择性的包合多种客分子，形成包合物。环糊精及其衍生物在药学上的经典应用主要集中在以下几个方面：①增加难溶性药物的溶解度，提高药物的生物利用度；②改善药物的稳定性；③使挥发油类等易挥发药物粉末化，防止药物挥发；④掩盖药物的不良气味，降低药物的刺激性；⑤利用疏水性环糊精，延缓药物的释放，降低药物释放速率；⑥促进药物的经皮和粘膜吸收。随着纳米技术在药物传递领域的应用，环糊精聚合物广泛应用于化学药物和基因传递系统，如CRXL101，将羟基喜树碱（CPT）通过酯键连接到β-环糊精-聚乙二醇嵌段共聚物上，在羟基喜树碱与环糊精分子内和分子间的包合作用力驱动下，其自组装粒径为40-50nm纳米粒，CRXL101不但能提高CPT的溶解度，改善CPT的稳定性，还能通过EPR效应传递到肿瘤组织。其表面的PEG分子不但改善了载体材料生理相容性，还能够避免网状内皮系统（RES）的摄取，增加循环时间，增加CPT的抗肿瘤作用。

基于以上背景技术，本发明以透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇为骨架，利用环糊精的包合作用力，包合疏水性为客分子，形成超分子载药系统，用于抗肿瘤药物的传递。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，同时提供了该类载体的制备方法。

本发明同时提供了一种安全高效的药物传递系统：该系统以透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇为载体，利用环糊精的包合作用力，包合疏水性药物，自组装形成纳米粒形成超分子载药系统。其优点在于，这种纳米给药体系既可以通过EPR效应将药物被动的传递到肿瘤组织，又可以通过透明质酸的肿瘤靶向作用，提高药物的抗肿瘤效果。表面的PEG分子可以有效避免网状内皮系统摄取，延长体内循环时间。

所述的环糊精为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，或经过对甲基苯磺酰修饰，马来酸酐修饰，羟丙基修饰，甲基，乙基修饰，磺丁基修饰的上述环糊精的衍生物；

透明质酸与环糊精的摩尔比为1：1-20，优选1：3-10，更优选1：3-5，

所述的透明质酸分子量为7,000-200,000道尔顿分子量。优选：7000-100,000,优选9000-12,000。

所述的聚乙二醇的分子量为500-100，000，优选：2000-5000。也可以是上述的聚乙二醇衍生物如聚乙二醇单甲醚，优选聚乙二醇单甲醚。

本发明所提供的载体的制备方法，包括如下步骤：1透明质酸-环糊精的合成。2.金刚烷-聚乙二醇的合成。3.超分子包合物载体的制备。其中1和2是3的基础。

1）透明质酸-环糊精的合成：将透明质酸溶于甲酰胺溶液中，加入脱水缩合剂，用量为透明质酸羧基摩尔比的2-10倍量，在氮气保护条件下将脱水缩合剂加入到透明质酸溶液中，上述混合物室温搅拌反应2-4小时，将用量为透明质酸羧基摩尔数3-10倍的环糊精溶解于甲酰胺溶液中，在氮气保护下，滴加到透明质酸活化液中，滴加完毕后在室温下继续反应48小时，反应后的溶液丙酮沉淀，将沉淀物复溶于甲酰胺溶液中，将上述溶液转入透析袋中，蒸馏水透析3天，然后得冷冻干燥，得到白色粉末，即透明质酸-环糊精载体材料；

2)金刚烷-聚乙二醇的合成：将金刚烷甲酸溶解于无水二氯甲烷中，加入脱水缩合剂，用量为金刚烷酸摩尔比2-10倍量，将脱水缩合剂溶解于重量体积比2-4倍的二氯甲烷溶液中，在氮气保护条件下将脱水缩合剂溶液加入到金刚烷酸溶液中，上述混合物室温搅拌反应1-2小时，将用量为金刚烷酸羧基摩尔数1-2倍的聚乙二醇溶解于甲酰胺溶液中，在氮气保护下，滴加到金刚烷酸活化液中，滴加完毕后，在室温下继续反应48小时，然后乙醚重结晶，干燥得到淡黄色的金刚烷聚乙二醇衍生物；

3)超分子包合物载体的制备：将金刚烷-聚乙二醇和透明质酸按一定摩尔比共溶于水中，搅拌24-48小时，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，然后冷冻干燥，得到载体骨架材料：透明质酸-环糊精/金刚烷-聚乙二醇(HA-CD/ADA-PEG)。

所述的脱水缩合剂为N，N’-羰基咪唑，羰基咪唑，氯甲酸酯，1-羟基苯并三唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中任意的一种。

所述金刚烷酸-聚乙二醇和透明质酸的摩尔比：0-50：100，优选2-20：100。

本发明还提供了透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体在制备纳米载药系统中的应用。即利用环糊精的包合作用力，包合疏水性客分子，形成载药纳米粒，载体和疏水性分子通过主客分子作用力，形成纳米粒，靶向传递到肿瘤组织。

本发明的较佳实施实例中，所述的客分子可以为化疗药物如紫杉醇，多西他赛，阿霉素，羟基喜树碱等，非甾体抗炎药物如吲哚美辛，双氟尼柳，也可以是起协同治疗作用的维生素E琥珀酸酯、维甲酸、不饱和脂肪酸等中的一种或两种以上。

本发明的较佳实例中，纳米粒粒径为150-300nm。优选：150-200nm。

前述的载药纳米粒的制备方法包括如下步骤：

透析法是将上述载体及疏水性客分子共溶于有机溶剂，于蒸馏水中透析，0.45μm滤膜过滤，得到自组装的载药纳米粒。

乳化法是将上述载体材料溶于水中，超声条件下加入溶有疏水性药物的二氯甲烷或氯仿溶液，室温搅拌过夜，除去有机溶剂，离心，0.45μm滤膜过滤，得到自组装的载药纳米粒。

本发明具有以下有益效果：1.制备一种新型的多功能透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体材料，载体制备过程简单，易于操作，且所用材料均为可降解材料，具有较好的生物相容性、低免疫源性。2.药物载体疏水区域可控性好，调节透明质酸和环糊精投料比例，可以改变环糊精在载体材料中的比例，进而调整疏水区域大小。3.利用环糊精的包合作用力，装载疏水性客分子，自组装所形成纳米粒，制备方法简便，粒径均一，稳定性好，可作为难溶性药物储库。4.主动靶向和被动靶向相结合，提高肿瘤组织药物摄取量。5.表面的亲水性聚乙二醇增加了纳米复合药物的体内长循环时间，提高抗肿瘤药物的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例1的透明质酸-羟丙基-β-环糊精载体材料的¹HNMR谱图。

图2为本发明实施例5的透明质酸-β-环糊精-载体材料的¹HNMR谱图。

图3为本发明实施例7的金刚烷-聚乙二醇2000单甲醚的¹HNMR谱图。

图4为本发明实施例9透明质酸-羟丙基-β-环糊精/金刚烷-聚乙二醇5000包合物的¹HNMR谱图。

图5实施例1-3的临界胶束浓度。

图6为实施例19的纳米粒透射电镜图。

图7为实施例9的体外释放曲线图。

图8为实施例16-19和阿霉素溶液剂大鼠体内的药物动力学曲线。

图9为实施例16-19和阿霉素溶液剂荷瘤大鼠瘤重。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例中。

实施例1透明质酸-羟丙基-β-环糊精的合成（HA-HP-β-CD）（环糊精取代度为20%）

透明质酸（0.2g，-COOH，0.62mM，M=7000）溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）（0.2g），磁力搅拌3h。然后将HP-β-CD（0.22g，-OH，1.8mM）溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例1化合物的结构，选用的溶剂为D₂O，结果如图1。5.3-5.2ppm为羟丙基环糊精H-1和H-1’中的H，1.3-1.2ppm为羟丙基环糊精中羟丙基峰，而透明质酸中NCOCH3的化学位移为2.2ppm.根据透明质酸结构中-NHCOCH₃和环糊精H-1的积分面积之比可计算制得的聚合物的环糊精取代度为20%

实施例2透明质酸-羟丙基-β-环糊精的合成（HA-HP-β-CD）（环糊精取代度为40%）

透明质酸（0.2g，-COOH，0.62mM，M=7000）溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）（0.2g），磁力搅拌3h。然后将HP-β-CD（0.4g，-OH，3.5mM）溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例1化合物的结构，选用的溶剂为D₂O，5.3-5.2ppm为羟丙基环糊精H-1和H-1’中的H，1.3-1.2ppm为羟丙基环糊精中羟丙基峰，而透明质酸中NCOCH3的化学位移为2.2ppm.根据透明质酸结构中-NHCOCH₃和环糊精H-1的积分面积之比可计算透明质酸环糊精投料比制得的聚合物的环糊精取代度为40%。

实施例3透明质酸-羟丙基-β-环糊精的合成（HA-HP-β-CD）（环糊精取代度为50%）

透明质酸（0.2g，-COOH，0.62mM，M=7000）溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）（0.2g），磁力搅拌3h。然后将HP-β-CD（1.5g，-OH，6.6mM）溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例1化合物的结构，选用的溶剂为D₂O。5.2-5.1ppm为羟丙基环糊精H-1和H-1’中的H，1.3-1.2ppm为羟丙基环糊精中羟丙基峰，而透明质酸中NCOCH3的化学位移为2.2ppm。根据透明质酸结构中-NHCOCH₃和环糊精H-1的积分面积之比制得的聚合物的环糊精取代度为50%

实施实例4透明质酸-α-环糊精的合成（HA-α-CD）

透明质酸0.2g(COOH,0.66mM,M=12,000）,溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（0.4g），磁力搅拌3h。然后将α-CD（0.34g,-OH,2mM）溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例4化合物的结构，选用的溶剂为D₂O。5.0-5.2ppm为环糊精H-1和H-1’中的H，而透明质酸中NCOCH3的化学位移为1.8-2.0ppm。

实施例5:透明质酸-β-环糊精的合成（HA-β-CD）

透明质酸0.2g(COOH,0.66mM,M=12,000）,溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（0.4g），磁力搅拌3h。然后将β-CD0.4g(-OH,2mM),溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例5化合物的结构，选用的溶剂为D₂O，结果如图2。5.0-5.2ppm为环糊精H-1和H-1’中的H，而透明质酸中NCOCH3的化学位移为1.8-2.0ppm。

实施例6:透明质酸-γ-环糊精的合成（HA-γ-CD）

透明质酸0.2g,(COOH,0.66mM,M=12,000）,溶于50mL无水甲酰胺中，40℃水浴加热磁力搅拌使其溶解，冷却至室温。加入EDC（0.4g），磁力搅拌3h。然后将γ-CD0.45g(-OH,2mM),溶于5mL无水甲酰胺中，缓慢滴加到HA混合液中。10分钟内加毕，于室温继续搅拌24h。反应混合液于蒸馏水中透析2d，过滤，冷冻干燥，得白色粉末。

实施例7金刚烷-聚乙二醇2000单甲醚的合成（ADA-mPEG2K）

金刚烷酸（ADA，0.2g）溶于20ml无水二氯甲烷中，加入EDC（0.4g），磁力搅拌1h，然后加入mPEG0.6g），30℃氮气保护下，反应48h。反应液用乙醚重结晶3次，收集有机溶剂层，用无水硫酸钠干燥。过滤，反应液旋转蒸发除去有机溶剂，得纯品。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例7化合物的结构，选用的溶剂为ClD₃，结果如图3。1.7-1.8ppm金刚烷酸特征峰，而3.6-3.7ppm为聚乙二醇单甲醚的特征峰。

实施例8金刚烷-聚乙二醇5000单甲醚的合成（ADA-mPEG5K）

金刚烷酸（ADA，0.2g）溶于20ml无水二氯甲烷中，加入EDC（0.4g），磁力搅拌1h，然后加入mPEG2K(1.5g），30℃氮气保护下，反应48h。反应液用乙醚重结晶3次，收集有机溶剂层，用无水硫酸钠干燥。过滤，反应液旋转蒸发除去有机溶剂，得纯品。

实施例9：透明质酸-羟丙基-β-环糊精/金刚烷-聚乙二醇单甲醚5000超分子包合物的制备（PEG取代度为2%）(HA-HP-β-CD/ADA-mPEG5K-2)

将实施例3所得的聚合物0.4g，溶于20ml蒸馏水中，磁力搅拌2h，然后加入ADA-mPEG5K（0.5mg/mL）水溶液3ml,加毕，磁力搅拌24h，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，冷冻干燥，得纯品HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K。

采用核磁共振测定¹HNMR氢谱来确定实施例9聚合物的结构，选用的溶剂为D₂O，结果如图4。5.0-5.2ppm为HP-β-环糊精H-1和H-1’中的H，1.3-1.2ppm为羟丙基环糊精中羟丙基峰，透明质酸中NCOCH3的化学位移为1.8-2.0ppm，而3.6-3.7ppm为聚乙二醇单甲醚的特征峰。根据透明质酸结构中-NHCOCH3和聚乙二醇特征峰的积分面积之比超分子中聚乙二醇取代度为2%。

实施例10：透明质酸-羟丙基-β-环糊精/金刚烷-聚乙二醇单甲醚5000超分子包合物的制备（PEG取代度为5%）(HA-HP-β-CD/ADA-mPEG5K-5)

将实施例3所得的聚合物0.4g，溶于20ml蒸馏水中，磁力搅拌2h，然后加入ADA-mPEG5K（0.5mg/mL）水溶液7.5ml,加毕，磁力搅拌24h，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，冷冻干燥，得纯品HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-5。

实施例11：透明质酸-羟丙基-β-环糊精/金刚烷-聚乙二醇单甲醚5000超分子包合物的制备（PEG取代度为10%）(HA-HP-β-CD/ADA-mPEG5K-10)

将实施例3所得的聚合物0.4g，溶于20ml蒸馏水中，磁力搅拌2h，然后加入ADA-mPEG5K（1mg/mL）水溶液7.5ml,加毕，磁力搅拌24h，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，冷冻干燥，得纯品HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-10。

实施例12：透明质酸-羟丙基-β-环糊精/金刚烷-聚乙二醇单甲醚5000超分子包合物的制备（PEG取代度为20%）(HA-HP-β-CD/ADA-mPEG5K-20)

将实施例3所得的聚合物0.4g，溶于20ml蒸馏水中，磁力搅拌2h，然后加入ADA-mPEG5K（1mg/mL）水溶液15ml,加毕，磁力搅拌24h，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，冷冻干燥，得纯品HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-20。

基于上述载体材料，利用环糊精的包合作用力，包合疏水性客分子，形成纳米粒，所述纳米粒包括前述方案中的超分子包合物和疏水性客分子，两部分通过主客分子作用力，形成载药纳米粒，靶向传递到肿瘤组织，骨架材料可以表面修饰聚乙二醇，也可以不修饰。所述的客分子为化疗药物如紫杉醇，多西他赛，阿霉素，喜树碱等，非甾体抗炎药物如吲哚美辛，双氟尼柳，也可以治疗协同作用的维生素E琥珀酸酯、维甲酸、不饱和脂肪酸等中的一种或两种以上，但不受限于所列药物。

在载药纳米粒制备过程中，选择阿霉素(Dox)为模型药物,维生素E琥珀酸酯(VES)或维甲酸(RA)作为辅助治疗药物，实施实例3，11-13，发明的聚合物作为载体材料。

测试实施例1-3载体材料的临界胶束浓度

以无水乙醇为溶剂配制浓度为3×10^-6mol/L的芘溶液，加至20mL具塞试管中，氮气流挥发无水乙醇。称取适量的不同取代度的透明质酸-羟丙基环糊精聚合物，以二次蒸馏水为溶剂，配制成不同浓度的聚合物溶液，终浓度分别为1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9mol/L和1×10-¹⁰mol/L，分别取10mL加入到含有芘的试管中（芘的终浓度为3×10^-7mol/L），避光超声4h并放置过夜，采用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度。

采用芘荧光探针法测定星形聚合物的临界胶束浓度（CMC），以log C(mol/L)为横坐标，芘在336nm和338nm处的荧光强度比值（I₃₃₈/I₃₃₆）为纵坐标作图，结果如图附图5所示，曲线的拐点为共聚物的临界胶束浓度（CMC）值。随着透明质酸和环糊精投料比的变化，所形成的聚合物的临界胶束浓度不同。

实施例14：HA-HP-β-CD与阿霉素纳米粒的制备

精密称取实施例3所得聚合物10mg，溶于4ml蒸馏水中，溶有阿霉素的二氯甲烷溶液作为油相(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

实施例15：HA-β-CD/ADA-mPEG2K与阿霉素维甲酸纳米粒的制备

精密称取实施例3所得聚合物10mg，溶于5ml蒸馏水中，精密称取维甲酸（RA）1mg，溶于阿霉素二氯甲烷溶液中(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

实例16：HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-2与阿霉素维生素E琥珀酸酯纳米粒的制备

精密称量实施实例9所得超分子包合物50mg，溶于10ml蒸馏水中，精密称取VES3mg，溶于2ml阿霉素二氯甲烷溶液中(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

将实施例16中制备的载药纳米粒透射电镜测定纳米粒的大小和形态，结果如图6。透射电镜图表明载药纳米粒为均一球形，粒径在190-200nm。

实例17：HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-5与阿霉素维生素E琥珀酸酯纳米粒的制备

精密称量实施实例10所得超分子包合物50mg，溶于10ml蒸馏水中，精密称取VES3mg，溶于2ml阿霉素二氯甲烷溶液中(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

实例18：HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-10与阿霉素维生素E琥珀酸酯纳米粒的制备

精密称量实施实例11所得超分子包合物50mg，溶于10ml蒸馏水中，精密称取VES3mg，溶于2ml阿霉素二氯甲烷溶液中(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

实例19：HA-HP-β-CD/ADA-PEG5K-20与阿霉素维生素E琥珀酸酯纳米粒的制备

精密称量实施实例12所得超分子包合物50mg，溶于10ml蒸馏水中，精密称取VES2.5mg，溶于2ml阿霉素二氯甲烷溶液中(1mg/ml)。超声条件下，将油相滴入水相中，得初乳，室温搅拌过夜，挥去残留的二氯甲烷，离心，过0.45μm滤膜，除去未被包裹的疏水性药物，得载药纳米粒。

测试实施例19载药纳米粒的体外释放

采用透析法考察DOX载药胶束的体外释放特征。精密量取载药纳米粒溶液1mL置于透析袋中，透析袋两端夹紧，置于30mL的不同pH值的释放介质中（pH7.4磷酸盐缓冲液及pH6.5、pH5.5醋酸盐缓冲液）。于37℃恒温振荡器中以100rpm/min进行释放度考察。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h取样1mL，并补充相应体积的释放介质，样品经0.45μm微孔滤膜过滤，采用HPLC方法测定DOX含量。

结果如图7，载药纳米粒的释放具有pH敏感的特性，在生理条件下释放缓慢，能够使纳米粒在循环过程中保持稳定，24h只是释放了20%左右，达到长循环效果；在较低pH环境中，药物很快释放，发挥疗效，释放60%。

实施例16-19载药纳米粒在大鼠体内药物动力学研究

取健康雄性大鼠18只大鼠，随机分为3组，给药前禁食12h,自由饮水，分别尾静脉注射DOX-Sol、实施实例16-19制备的非PEG化载药纳米粒（Dox-NPs）和实施实例8制备的PEG化载药纳米粒（PEG-Dox-NPs）。静脉注射给药后采血时间点：0.08、0.17、0.33、0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、24、36、48、96、120、144、168、192、216和240h。在各采

血时间点通过眼眶取血0.25mL，取血后立即移入经肝素处理的试管中，离心10min（13000×g），分离血浆，于–20℃冰箱中冷冻直至分析，药时曲线见图8和药物动力学参数如

表2表2：实施例16-19的主要药物动力学参数

实施例16-19载药纳米粒药效学研究

将处于对数生长期的4T1乳腺癌细胞用PBS洗3次，用PBS调制细胞混悬液至细胞数为1×10⁶个/mL，注射入健康状况良好的Balb/C小鼠腹腔中，每只腹腔注射细胞悬液约0.2mL，注意观察接种小鼠的腹水生长情况。待7d左右小鼠腹腔充满腹水后，颈椎脱臼处死，固定于手术板上，用碘伏消毒动物皮肤，无菌条件下在洁净工作台内抽取腹水，加适量PBS稀释至1×10⁶个/mL的细胞混悬液。将癌细胞悬液接种于小鼠右侧腋窝皮下，0.2mL/只。建立了鼠乳腺癌4T瘤株腋下接种模型。

接种7-14d，待肿瘤体积生长至100-200mm³，对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药。将荷瘤小鼠随机分成3组（每组10只），组内标号，分别为模型对照组（生理盐水）、阿霉素溶液剂和实施例16-19。对照组尾静脉给予生理盐水，其余各组分别尾静脉注射给予相应制剂，每隔2d给药1次，连续给药3次，给药剂量为10mg/kg。给药15天后，将大鼠处死，称瘤重。

由图9可知，与溶液剂相比，peg化的阿霉素纳米粒具有明显的抗肿瘤活性。

Claims (10)

1.透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于：透明质酸与环糊精的摩尔比为1：1-20，所述的环糊精为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，或经过对甲基苯磺酰修饰，马来酸酐修饰，羟丙基修饰，甲基，乙基修饰，磺丁基修饰的上述环糊精的衍生物；透明质酸分子量为7,000-200,000 道尔顿分子量，所述的聚乙二醇的分子量为500-100，000。

2.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于，透明质酸与环糊精的摩尔比为1：3-10，优选1：3-5。

3.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于，所述的透明质酸分子量为7000-100,000, 优选9000-12，000。

4.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于，聚乙二醇的分子量为2000-5000。

5.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于，所述金刚烷酸-聚乙二醇和透明质酸的摩尔比：0-50：100，优选2-20：100。

6.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体，其特征在于，所述的聚乙二醇为聚乙二醇衍生物，优选聚乙二醇单甲醚。

7.如权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）透明质酸-环糊精的合成：将透明质酸溶于甲酰胺溶液中，加入脱水缩合剂，用量为透明质酸羧基摩尔比的2-10倍量，在氮气保护条件下将脱水缩合剂加入到透明质酸溶液中，上述混合物室温搅拌反应2-4小时，将用量为透明质酸羧基摩尔数3-5倍的环糊精溶解于甲酰胺溶液中，在氮气保护下，滴加到透明质酸活化液中，滴加完毕后在室温下继续反应48小时，反应后的溶液丙酮沉淀，将沉淀物复溶于甲酰胺溶液中，将上述溶液转入透析袋中，蒸馏水透析3天，然后得冷冻干燥，得到白色粉末，即透明质酸-环糊精载体材料；

2) 金刚烷-聚乙二醇的合成：将金刚烷甲酸溶解于无水二氯甲烷中，加入脱水缩合剂，用量为金刚烷酸摩尔比2-10倍量，将脱水缩合剂溶解于重量体积比2-4倍的二氯甲烷溶液中，在氮气保护条件下将脱水缩合剂溶液加入到金刚烷酸溶液中，上述混合物室温搅拌反应1-2小时，将用量为金刚烷酸羧基摩尔数1-2倍的聚乙二醇溶解于甲酰胺溶液中，在氮气保护下，滴加到金刚烷酸活化液中，滴加完毕后，在室温下继续反应48小时，然后乙醚重结晶，干燥得到淡黄色的金刚烷聚乙二醇衍生物；

3) 超分子包合物载体的制备：将金刚烷-聚乙二醇和透明质酸按一定摩尔比共溶于水中，搅拌24-48小时，将上述包合物溶液转移到透析袋中，蒸馏水透析72小时，然后冷冻干燥，得到载体骨架材料：透明质酸-环糊精/金刚烷-聚乙二醇。

8.如权利要求6所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体的制备方法，其特征在于脱水缩合剂为N，N’-羰基咪唑，羰基咪唑，氯甲酸酯，1-羟基苯并三唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中任意的一种。

9.权利要求1所述的透明质酸-环糊精-金刚烷聚乙二醇载体在制备纳米载药系统中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的纳米载药系统中，疏水性客分子为紫杉烷类，蒽醌类，喜树碱类抗癌药物，或者是非甾体抗炎药物吲哚美辛，双氟尼柳，维生素E琥珀酸酯、维甲酸、不饱和脂肪酸中的一种或两种以上。

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