CN104622813B - 一种基于主客体作用形成的纳米微球及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种以一端基为金刚烷的聚ε‑己内酯或聚D,L‑丙交酯为疏水核，以多个葡萄糖6位C上羟基修饰了多根聚乙烯基吡咯烷酮高分子链的β‑环糊精为亲水部分，通过金刚烷与β‑环糊精主客体作用形成的纳米粒子。其特征是：它的表面是亲水的聚乙烯基吡咯烷酮，内部是疏水的聚ε‑己内酯或聚D,L‑丙交酯，两部分通过金刚烷与β‑环糊精的主客体作用连接。连接了金刚烷的聚ε‑己内酯或聚D,L‑丙交酯分子量为2000～10000g/mol，β‑环糊精可修饰多根聚乙烯基吡咯烷酮，每根聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为1000～10000g/mol。纳米微球的粒径分布为40～200nm。本发明的纳米微球具有良好的生物兼容性以及稳定性，可作为药物载体，具有缓释作用，本发明公开了其做法与用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于主客体相互作用形成的无毒可生物降解的纳米粒子，可以用作药物卡巴他赛的载体。
背景技术
卡巴他赛是紫杉醇的一种衍生物，为微管抑制类药物，在2010年被美国FDA批准为治疗转移性激素不应性前列腺癌患者的药物。在体外实验中，卡巴他赛对小鼠及人体的多种肿瘤细胞均有杀伤作用，对于多种耐药细胞株，卡巴他赛的抗癌活性也高于多西他赛。卡巴他赛与P-糖蛋白(P-gp)1的亲和力较低，故对于耐药细胞具有一定杀伤力，且此药物易于透过血脑屏障，是一种具有发展前景的新抗癌药物。但卡巴他赛与紫杉醇类似，在水中的溶液度均极低，如何制备稳定有效的卡巴他赛制剂是今后的研究目标。
纳米技术在药物传输方面具有非常好的应用前景，一些纳米材料具有生物可降解，生物兼容性好等优点，是作为药物载体的良好材料。两亲性高分子材料可在水中自组装成为表面亲水，内核疏水的纳米粒子，其疏水内核可作为众多疏水药物的载体。通过将疏水药物负载在纳米粒子核内，可以增加药物溶解度，降低药物毒副作用，增长药物的血液半衰期，从而达到提升药物效果的目的。
主客体化学是近些年来兴起的新的研究方向，它是通过主体分子与客体分子之间以非共价键的方式产生键合，研究较多的是β-环糊精与金刚烷的主客体作用，在水中客体分子金刚烷由于疏水性会自动与主体分子环糊精的疏水性空腔结合，形成较为稳定的主客体作用产物。只需要在相应的化合物上修饰上客体分子，就可以与修饰上主体分子的物质相互作用，从而达到连接两个目标化合物的目的。在纳米粒子中引入主客体作用，可以使纳米粒子的组装更为多变，可以方便的引入不同的组装体，对于纳米粒子的修饰也更加容易。
发明内容
本发明设计了一种生物兼容性、生物可降解的用于药物载体的纳米微球，并提供了其制作方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于主客体作用形成的纳米微球，它是以一端连接了金刚烷的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯为疏水核，以多个葡萄糖6位C上的羟基修饰了聚N-乙烯基吡咯烷酮高分子链的β-环糊精为亲水部分，通过金刚烷与β-环糊精主客体作用形成的纳米微球，它的表面是亲水的聚N-乙烯基吡咯烷酮，内部是疏水的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯，两部分通过金刚烷与β-环糊精的主客体作用连接，连接了金刚烷的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯分子量经凝胶色谱测定为2000～10000g/mol，β-环糊精可修饰4-7根聚N-乙烯基吡咯烷酮，每根聚N-乙烯基吡咯烷酮的分子量经凝胶色谱测定为1000～10000g/mol，纳米微球的平均粒径用动态光散射测定为40～100nm。
一种制备上述金刚烷的聚ε-己内酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球的方法，它包括以下步骤：
步骤1、在氩气环境下将金刚烷胺、ε-己内酯按照比例加入反应瓶中，金刚烷胺与ε-己内酯的摩尔比为1:20～100，再加入10uL辛酸亚锡，在100～140℃下搅拌1～3天，反应结束后加入二氯甲烷溶解产物，加入无水乙醚沉淀出产物，所得白色固体产物真空干燥，得到由金刚烷胺引发的聚ε-己内酯，记为ada-PCL。
步骤2、将一定量的β-环糊精溶于无水DMF中，再加入一定量的吡啶，缓慢滴加一定量的2-溴丙酰溴到上述溶液中，β-环糊精与2-溴丙酰溴的摩尔比为0.07～0.25:1，室温反应12～24小时后，在大量无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色产物真空干燥，所得产物先用大量水洗，再用大量丙酮洗，得到接上多个溴的β-环糊精，n-[6-(2’-溴丙酸酯)]-β-环糊精，记为β-CD-Brn，；
将β-CD-Brn溶解在无水DMF中，加入少量吡啶，缓慢将一定量的固体乙基黄原酸钾加入到此溶液中，β-CD-Br4与乙基黄原酸钾的摩尔比为0.16～0.25:1。室温下反应16～36小时，反应结束后过滤除去不溶物，将滤液加入到大量无水乙醚中沉淀，得到淡黄色固体，所得固体经水洗后真空干燥，得到n-[6-(2’-(乙氧基硫代甲酰硫基)丙酸酯)]-β-环糊精，记为β-CD-(CTA)n；
步骤3、将步骤2得到的β-CD-(CTA)n溶于N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入催化量偶氮二异丁腈(AIBN)；β-CD-(CTA)n，N-乙烯基吡咯烷酮，AIBN的摩尔比为：1:36～800:0.4～1.4,反应体系在氩气氛围下60℃反应1～7天，反应结束后加入二氯甲烷稀释反应液，之后将其加入无水乙醚中沉淀出产物，真空干燥，得到n-[6-(2’-(乙氧基硫代甲酰硫基)丙酸酯)]-β-环糊精为链转移剂聚合的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或，记为β-CD-(PVP)n；
步骤4、将步骤1所得ada-PCL与步骤3所得β-CD-(PVP)n溶解在DMF中，迅速倒入60℃的蒸馏水，ada-PCL与β-CD-(PVP)n的摩尔比为1:1～5，DMF与蒸馏水的体积比为0.1～0.33:1，待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得金刚烷的ε-己内酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球。
一种制备上述金刚烷的聚D,L-丙交酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球的方法，它包括以下步骤：
步骤1、在氩气环境下将无水甲苯、金刚烷胺、D,L-丙交酯按照一定比例加入反应瓶中，金刚烷胺与D,L-丙交酯的摩尔比为1:20～100，再加入10uL辛酸亚锡，在100～140℃下搅拌1～3天，反应结束后加入二氯甲烷溶解产物，再在大量甲醇中沉淀出产物，所得白色固体再用丙酮溶解，在水中沉淀得到白色固体，所得固体真空干燥，即得到由金刚烷胺引发的聚D,L-丙交酯，记为ada-PDLLA。
步骤2、将步骤1所得ada-PDLLA溶解在一定量丙酮中，再将上述制得的β-CD-(PVP)n溶解在水中，在搅拌条件下将β-CD-(PVP)n的水溶液缓慢滴入ada-PDLLA的丙酮溶液中，ada-PDLLA与β-CD-(PVP)n的摩尔比为1:1～5，丙酮与蒸馏水的体积比为0.1～0.33:1，之后透析除去溶液中的丙酮，过滤除去不溶物，即制得空白金刚烷的聚D,L-丙交酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球。
一种负载有卡巴他赛的上述的基于主客体作用形成的纳米微球，它是以上述空白的基于主客体作用形成的纳米微球为载体，负载有卡巴他赛，卡巴他赛的负载质量占纳米粒子总质量的10％～20％。
一种制备上述的负载卡巴他赛的基于主客体作用形成的纳米微球的方法，它是将卡巴他赛溶于少量DMF中，上述的基于主客体作用形成的纳米微球的溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的基于主客体作用形成的纳米微球，所述的卡巴他赛与未载药的基于主客体作用形成的纳米微球的质量比为：0.1～0.3:1，DMF与未载药纳米粒子溶液体积比为：0.1～0.33:1。
本发明所制备的负载卡巴他赛纳米粒子具有很好的药物缓释功能。
本发明所制备的纳米粒子生物兼容性好，结构稳定，可存放较长时间不变质。
附图说明
图1(a)是β-CD-(PVP)4与ada-PCL载药纳米粒子体外释放曲线，图1(b)是β-CD-(PVP)7与ada-PCL载药纳米粒子体外释放曲线。
图2是β-CD-(PVP)4和β-CD-(PVP)7分别与ada-PCL形成的纳米微球的细胞毒性试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例阐述本发明内容，但以下实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：以金刚烷胺为引发剂引发聚合ε-己内酯
氩气保护下，将30mg金刚烷胺，2.2mLε-己内酯，10uL辛酸亚锡加入25mL圆底烧瓶中，混合物在120℃下搅拌反应48小时。反应结束后冷至室温，加入10mL二氯甲烷溶解反应产物，之后在200mL无水乙醚中沉淀，得到白色固体产物，真空干燥，得到产物金刚烷胺为引发剂引发聚合ε-己内酯，标记为：ada-PCL。经体积排阻色谱测定分子量为9803g/mol。1HNMR(400MHz,CDCl3,δ):1.41(m,2H),1.67(m,4H),1.99(s,adamantyl),2.07(s,adamantyl),2.32(t,2H),4.08(t,2H)。
实施例2：以金刚烷胺为引发剂引发聚合ε-己内酯
氩气保护下，将30mg金刚烷胺，1mLε-己内酯，10uL辛酸亚锡加入25mL圆底烧瓶中，混合物在120℃下搅拌反应48小时。反应结束后冷至室温，加入10mL二氯甲烷溶解反应产物，之后在200mL无水乙醚中沉淀，得到白色固体产物，真空干燥，得到产物金刚烷胺为引发剂引发聚合ε-己内酯，标记为：ada-PCL。经体积排阻色谱测定分子量为3945g/mol。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):1.41(m,2H),1.67(m,4H),1.99(s,adamantyl),2.07(s,adamantyl),2.32(t,2H),4.08(t,2H)。
实施例3：以金刚烷胺为引发剂引发聚合D,L-丙交酯
在氩气保护下将15mL无水甲苯、30mg金刚烷胺、2g D,L-丙交酯加入50mL圆底烧瓶中，再加入10uL辛酸亚锡，在120℃下搅拌48小时天，反应结束后加入10mL二氯甲烷稀释溶液，再在300mL甲醇中沉淀出产物，所得白色固体再用10mL丙酮溶解，在200mL水中沉淀得到白色固体，所得固体真空干燥，得到金刚烷胺为引发剂引发聚合D,L-丙交酯，标记为：ada-PDLLA。经体积排阻色谱测定分子量为9764g/mol。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):1.58(m,3H),1.99(s,adamantyl),2.07(s,adamantyl),5.21(m,1H)。
实施例4：以金刚烷胺为引发剂引发聚合D,L-丙交酯
在氩气保护下将15mL无水甲苯、30mg金刚烷胺、0.85g D,L-丙交酯加入50mL圆底烧瓶中，再加入10uL辛酸亚锡，在120℃下搅拌48小时天，反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释溶液，再在200mL甲醇中沉淀出产物，所得白色固体再用10mL丙酮溶解，在200mL水中沉淀得到白色固体，所得固体真空干燥，得到金刚烷胺为引发剂引发聚合D,L-丙交酯，标记为：ada-PDLLA。经体积排阻色谱测定分子量为4187g/mol。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):1.58(m,3H),1.99(s,adamantyl),2.07(s,adamantyl),5.21(m,1H)。
实施例5：β-环糊精RAFT链转移剂β-CD-(CTA)4的合成
将1gβ-环糊精、0.6mL吡啶溶于15mL无水DMF中，缓慢滴加0.6mL 2-溴丙酰溴到β-环糊精的DMF溶液中，室温反应24小时，在300mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥，所得固体先用30mL水洗，再用30mL丙酮洗，得到接上四个溴的β-环糊精，标记为：β-CD-Br4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.70(s,12H),4.70(q,4H),4.90(s,7H),3.00-6.00(m,66H,-OH and-CH-ofβ-CD)。通过核磁谱中位移4.90与1.70的峰比值确定溴的个数。位移为4.90的峰是环糊精糖环上的7个特征的氢，位移为1.70的峰是溴边上的CH3的氢，通过积分面积比较可算出位移1.70的峰面积，结果算出来是12个H这说明是4个溴，因此其结构如下：
将0.5gβ-CD-Br4溶解在10mL无水DMF中，加入0.5mL吡啶，缓慢将0.23g的固体乙基黄原酸钾加入到此溶液中，室温下反应16小时，反应结束后过滤除去不溶物，将滤液加入到200mL无水乙醚中沉淀，得到淡黄色固体，所得固体经水洗后真空干燥，得到产物，标记为β-CD-(CTA)4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.30(m,12H),1.50(m,8H),4.3-4.5(m,4H),4.6(s,12H),3.00-6.00(m,66H,-OH and-CH-ofβ-CD)。其结构如下：
实施例6：β-环糊精RAFT链转移剂β-CD-(CTA)7的合成
将1gβ-环糊精、1mL吡啶溶于15mL无水DMF中，缓慢滴加0.92mL 2-溴丙酰溴到上述β-环糊精溶液中。室温反应24小时后，在300mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥。所得产物先用30mL水洗，干燥后加入10mL丙酮溶解产物，过滤除去不溶物，将所得滤液加入200mL无水乙醚中再次沉淀，真空干燥,得到接上七个溴的β-环糊精，标记为：β-CD-Br7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.70(s,21H),4.70(q,7H),4.90(s,7H),3.00-6.00(m,66H,-OH and-CH-ofβ-CD)。通过核磁谱中位移4.90与1.70的峰比值确定溴的个数。位移为4.90的峰是环糊精糖环上的7个特征的氢，位移为1.70的峰是溴边上的CH3的氢，通过积分面积比较可算出位移1.70的峰面积，结果算出来是21个H这说明是7个溴，因此其结构如下：
将0.5gβ-CD-Br7溶解在10mL无水DMF中，加入0.5mL吡啶，缓慢将0.38g的固体乙基黄原酸钾加入到此溶液中，室温下反应16小时，反应结束后过滤除去不溶物，将滤液加入到200mL无水乙醚中沉淀，得到淡黄色固体，所得固体经水洗后真空干燥，得到产物，标记为β-CD-(CTA)7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.30(m,21H),1.50(m,14H),4.3-4.5(m,7H),4.6(s,21H),3.00-6.00(m,66H,-OH and-CH-ofβ-CD)。其结构如下：
实施例7：β-环糊精引发聚合N-乙烯基吡咯烷酮合成β-CD-(PVP)4
在50mL schlenk瓶中将28mgβ-CD-(CTA)4溶于0.2mL N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入1mg AIBN。在氩气氛围下60℃反应3天。反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释反应液，之后加入200mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥，即得β-CD-(PVP)4。经体积排阻色谱测定分子量为11065g/mol。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.4-4.0(m,PVP),4.89(s,7H,-O-CH-O-ofβ-CD),5.7(m,14H,C(2)-OH and C(3)-OH ofβ-CD)。其结构如下：
实施例8：β-环糊精引发聚合N-乙烯基吡咯烷酮合成β-CD-(PVP)4
在50mL schlenk瓶中将28mgβ-CD-(CTA)4溶于0.36mL N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入1mg AIBN。在氩气氛围下60℃反应3天。反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释反应液，之后加入200mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥，即得β-CD-(PVP)4。经体积排阻色谱测定分子量为20248g/mol。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.4-4.0(m,PVP),4.89(s,7H,-O-CH-O-ofβ-CD),5.7(m,14H,C(2)-OH and C(3)-OH ofβ-CD)。其结构如下：
实施例9：β-环糊精引发聚合N-乙烯基吡咯烷酮合成β-CD-(PVP)7
在50mL schlenk瓶中将20mgβ-CD-(CTA)7溶于0.2mL N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入1mg AIBN。在氩气氛围下60℃反应4天。反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释反应液，之后加入200mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥，即得β-CD-(PVP)7。经体积排阻色谱测定分子量为19764g/mol。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.4-4.0(m,PVP),4.89(s,7H,-O-CH-O-ofβ-CD),5.7(m,14H,C(2)-OH and C(3)-OH ofβ-CD)。其结构如下：
实施例10：β-环糊精引发聚合N-乙烯基吡咯烷酮合成β-CD-(PVP)7
在50mL schlenk瓶中将20mgβ-CD-(CTA)7溶于0.4mL N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入1mg AIBN。在氩气氛围下60℃反应4天。反应结束后加入5mL二氯甲烷稀释反应液，之后加入200mL无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色固体真空干燥，即得β-CD-(PVP)7。经体积排阻色谱测定分子量为39647g/mol。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.4-4.0(m,PVP),4.89(s,7H,-O-CH-O-ofβ-CD),5.7(m,14H,C(2)-OH and C(3)-OH ofβ-CD)。其结构如下：
实施例11：ada-PCL与β-CD-(PVP)4纳米微球的制备
将10mg实施例1所得ada-PCL与11mg实施例7所得β-CD-(PVP)4溶解在1mL DMF中，迅速倒入3mL 60℃的蒸馏水，溶液立刻散发出淡蓝色散射光。待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测定粒径分布在90nm～120nm。
实施例12：ada-PCL与β-CD-(PVP)4纳米微球的制备
将10mg实施例1所得ada-PCL与11mg实施例8所得β-CD-(PVP)4溶解在1mL DMF中，迅速倒入3mL 60℃的蒸馏水，溶液立刻散发出淡蓝色散射光。待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测定粒径分布在90nm～120nm。
实施例13：ada-PCL与β-CD-(PVP)7纳米微球的制备
将10mg实施例1所得ada-PCL与20mg实施例9所得β-CD-(PVP)7溶解在1mL DMF中，迅速倒入3mL 60℃的蒸馏水，溶液立刻散发出淡蓝色散射光。待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测定粒径分布在70nm～110nm。
实施例14：ada-PCL与β-CD-(PVP)7纳米微球的制备
将10mg实施例1所得ada-PCL与20mg实施例10所得β-CD-(PVP)7溶解在1mL DMF中，迅速倒入3mL 60℃的蒸馏水，溶液立刻散发出淡蓝色散射光。待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测定粒径分布在70nm～110nm。
实施例15：ada-PDLLA与β-CD-(PVP)4纳米微球的制备
将10mg实施例3所得ada-PDLLA溶解在1mL丙酮中，再将11mg实施例7所得β-CD-(PVP)4溶解在3mL水中，在搅拌条件下将β-CD-(PVP)4的水溶液缓慢滴入ada-PDLLA的丙酮溶液中。之后透析除去溶液中的丙酮，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测得粒径分布在80nm～100nm。
实施例16：ada-PDLLA与β-CD-(PVP)4纳米微球的制备
将10mg实施例3所得ada-PDLLA溶解在1mL丙酮中，再将11mg实施例8所得β-CD-(PVP)4溶解在3mL水中，在搅拌条件下将β-CD-(PVP)4的水溶液缓慢滴入ada-PDLLA的丙酮溶液中。之后透析除去溶液中的丙酮，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测得粒径分布在80nm～100nm。
实施例17：ada-PDLLA与β-CD-(PVP)7纳米微球的制备
将10mg实施例3所得ada-PDLLA溶解在1mL丙酮中，再将20mg实施例7所得β-CD-(PVP)7溶解在3mL水中，在搅拌条件下将β-CD-(PVP)7的水溶液缓慢滴入ada-PDLLA的丙酮溶液中。之后透析除去溶液中的丙酮，过滤除去不溶物，即制得纳米微球。经动态光散射测得粒径分布在70nm～100nm。
实施例18：ada-PCL与β-CD-(PVP)4负载卡巴他赛纳米微球的制备
将3mg的卡巴他赛溶于1mL DMF中，将实施例11制备的纳米微球溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的ada-PCL/β-CD-(PVP)4纳米微球。经动态光散射测定纳米微球的粒径分布在100nm～120nm，由高效液相色谱测得卡巴他赛的载药量为13％。
实施例19：ada-PCL与β-CD-(PVP)7负载卡巴他赛纳米微球的制备
将5mg的卡巴他赛溶于1mL DMF中，将实施例13制备的纳米粒子溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的ada-PCL/β-CD-(PVP)7纳米微球。经动态光散射测定纳米微球的粒径分布在80nm～120nm，由高效液相色谱测得卡巴他赛的载药量为14％。
实施例20：ada-PDLLA与β-CD-(PVP)4负载卡巴他赛纳米微球的制备
将3mg的卡巴他赛溶于1mL DMF中，将实施例15制备的纳米粒子溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的ada-PDLLA/β-CD-(PVP)4纳米微球。经动态光散射测定纳米微球的粒径分布在80nm～100nm，由高效液相色谱测得卡巴他赛的载药量为17％。
实施例21：ada-PDLLA与β-CD-(PVP)7负载卡巴他赛纳米微球的制备
将5mg的卡巴他赛溶于1mL DMF中，将实施例17制备的纳米粒子溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的ada-PDLLA/β-CD-(PVP)7纳米微球。经动态光散射测定纳米粒子的粒径分布在80nm～100nm，由高效液相色谱测得卡巴他赛的载药量为18％。
实施例22：负载卡巴他赛纳米微球的体外释放
取实施例18所制备载药纳米微球1mL加入截留分子量为12000g/mol的透析袋中，将透析袋完全浸入5mL 0.1％Tween 80水溶液中，在37℃下搅拌进行释放。每隔一定的时间将5mL释放介质完全取出，再加入新的5mL释放介质继续释放。用高效液相色谱法测定取出的释放介质中所含卡巴他赛的量，根据含量计算出释放的百分数。结果见图1(a)所示。
实施例23：负载卡巴他赛纳米微球的体外释放
取实施例19所制备载药纳米微球1mL加入截留分子量为12000g/mol的透析袋中，将透析袋完全浸入5mL 0.1％Tween 80水溶液中，在37℃下搅拌进行释放。每隔一定的时间将5mL释放介质完全取出，再加入新的5mL释放介质继续释放。用高效液相色谱法测定取出的释放介质中所含卡巴他赛的量，根据含量计算出释放的百分数。结果见图1(b)所示。
实施例24：负载卡巴他赛纳米微球的体外释放
取实施例20所制备载药纳米微球1mL加入截留分子量为12000g/mol的透析袋中，将透析袋完全浸入5mL 0.1％Tween 80水溶液中，在37℃下搅拌进行释放。每隔一定的时间将5mL释放介质完全取出，再加入新的5mL释放介质继续释放。用高效液相色谱法测定取出的释放介质中所含卡巴他赛的量，根据含量计算出释放的百分数。结果如图1(a)所示。
实施例25：负载卡巴他赛纳米微球的体外释放
取实施例21所制备载药纳米微球1mL加入截留分子量为12000g/mol的透析袋中，将透析袋完全浸入5mL 0.1％Tween 80水溶液中，在37℃下搅拌进行释放。每隔一定的时间将5mL释放介质完全取出，再加入新的5mL释放介质继续释放。用高效液相色谱法测定取出的释放介质中所含卡巴他赛的量，根据含量计算出释放的百分数。结果如图1(b)所示。
实施例26：空白纳米微球的体外细胞毒性试验
各种纳米微球的细胞毒性试验由MTT法测定，细胞株为人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，培养时间为48小时。图2为实施例11与实施例13所制备的纳米微球的细胞毒性试验，在48小时作用下，在200ug/mL的浓度内纳米微球对细胞基本没有毒性。其余几种空白纳米微球试验结果与上述两个基本相同，均无明显毒性。体外细胞毒性测试结果表明空白粒子具有良好的生物相容性。
Claims (5)
1.一种基于主客体作用形成的纳米微球，它是以一端连接了金刚烷的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯为疏水核，以多个葡萄糖6位C上的羟基修饰了聚N-乙烯基吡咯烷酮高分子链的β-环糊精为亲水部分，通过金刚烷与β-环糊精主客体作用形成的纳米微球，它的表面是亲水的聚N-乙烯基吡咯烷酮，内部是疏水的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯，两部分通过金刚烷与β-环糊精的主客体作用连接，连接了金刚烷的聚ε-己内酯或聚D,L-丙交酯分子量为2000～10000g/mol，β-环糊精可修饰多根聚N-乙烯基吡咯烷酮，每根聚N-乙烯基吡咯烷酮的分子量为1000～10000g/mol，纳米微球的平均粒径为40～100nm。
2.一种制备权利要求1所述基于主客体作用形成的纳米微球的方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤1、在氩气环境下将金刚烷胺、ε-己内酯按照比例加入反应瓶中，金刚烷胺与ε-己内酯的摩尔比为1:20～100，再加入10μL辛酸亚锡，在100～140℃下搅拌1～3天，反应结束后加入二氯甲烷溶解产物，加入无水乙醚沉淀出产物，所得白色固体产物真空干燥，得到由金刚烷胺引发的聚ε-己内酯，记为ada-PCL；
步骤2、将β-环糊精溶于无水DMF中，再加入催化量吡啶，缓慢滴加2-溴丙酰溴到上述β-环糊精的DMF溶液中，β-环糊精与2-溴丙酰溴的摩尔比为0.07～0.25:1，室温反应12～24小时后，在无水乙醚中沉淀出产物，得到的白色产物真空干燥，所得产物先用水洗，再用丙酮洗涤，得到接上多个溴的β-环糊精，n-[6-(2’-溴丙酸酯)]-β-环糊精，记为β-CD-Brn；
将β-CD-Brn溶解在无水DMF中，加入催化量吡啶，缓慢将固体乙基黄原酸钾加入到此溶液中，β-CD-Br4与乙基黄原酸钾的摩尔比为0.16～0.25:1，室温下反应16～36小时，反应结束后过滤除去不溶物，将滤液加入到无水乙醚中沉淀，得到淡黄色固体，所得固体经水洗后真空干燥，得到n-[6-(2’-(乙氧基硫代甲酰硫基)丙酸酯)]-β-环糊精，记为β-CD-(CTA)n；
步骤3、将步骤2得到的β-CD-(CTA)n溶于N-乙烯基吡咯烷酮单体中，加入催化量偶氮二异丁腈(AIBN)；β-CD-(CTA)n，N-乙烯基吡咯烷酮，AIBN的摩尔比为：1:36～800:0.4～1.4,反应体系在氩气氛围下60℃反应1～7天，反应结束后 加入二氯甲烷稀释反应液，之后将其加入无水乙醚中沉淀出产物，真空干燥，得到n-[6-(2’-(乙氧基硫代甲酰硫基)丙酸酯)]-β-环糊精为链转移剂聚合的聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，记为β-CD-(PVP)n；
步骤4、将步骤1所得ada-PCL与步骤3所得β-CD-(PVP)n溶解在DMF中，迅速倒入60℃的蒸馏水，ada-PCL与β-CD-(PVP)n的摩尔比为1:1～5，DMF与蒸馏水的体积比为0.1～0.33:1，待溶液冷却后透析除去溶液中DMF，过滤除去不溶物，即制得金刚烷的ε-己内酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球。
3.一种制备权利要求1所述基于主客体作用形成的纳米微球的方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤1、在氩气环境下将无水甲苯、金刚烷胺、D,L-丙交酯按照比例加入反应瓶中，金刚烷胺与D,L-丙交酯的摩尔比为1:20～100，再加入10μL辛酸亚锡，在100～140℃下搅拌1～3天，反应结束后加入二氯甲烷溶解产物，再在甲醇中沉淀出产物，所得白色固体再用丙酮溶解，在水中沉淀得到白色固体，所得固体真空干燥，即得到由金刚烷胺引发的聚D,L-丙交酯，记为ada-PDLLA；
步骤2、将步骤1所得ada-PDLLA溶解在丙酮中，再将权利要求2步骤3所述制得的β-CD-(PVP)n溶解在水中，在搅拌条件下将β-CD-(PVP)n的水溶液缓慢滴入ada-PDLLA的丙酮溶液中，ada-PDLLA与β-CD-(PVP)n的摩尔比为1:1～5，丙酮与蒸馏水的体积比为0.1～0.33:1，之后透析除去溶液中的丙酮，过滤除去不溶物，即制得空白金刚烷的聚D,L-丙交酯为客体、β-环糊精为主体的纳米微球。
4.一种负载有卡巴他赛的基于主客体作用形成的纳米微球，其特征是：它是以权利要求1所述空白的基于主客体作用形成的纳米微球为载体，负载有卡巴他赛，负载的卡巴他赛的质量占纳米粒子总质量的10％～20％。
5.一种制备权利要求4所述的负载卡巴他赛的基于主客体作用形成的纳米微球的方法，其特征是：它是将卡巴他赛溶于DMF中，将权利要求1所述的基于主客体作用形成的纳米微球的溶液加热至60℃，迅速倒入卡巴他赛的DMF溶液中，冷却至室温后透析除去DMF，过滤除去不溶物，即得负载卡巴他赛的基于主客体作用形成的纳米微球，所述的卡巴他赛与未载药的基于主客体作用形成的纳米微球的质量比为：0.1～0.3:1，DMF与未载药纳米粒子溶液体积比为：0.1～0.33:1。
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