CN105853365B - 一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅‑壳聚糖‑叶酸纳米材料及应用。首先将抗肿瘤药物熊果酸负载到羧基化介孔二氧化硅的内孔道里，再将肿瘤细胞靶向分子叶酸与壳聚糖的部分氨基通过酰胺键连接制备偶联物，最后再将该偶联物与载药的羧基化介孔二氧化硅通过酰胺键偶联而制备。本发明所制备的纳米载体材料粒径分布均匀、分散性好、比表面积大，生物相容性好；可解决熊果酸水溶性差、生物利用度低的缺点；对熊果酸的释放有缓释作用且熊果酸在低pH的条件下释放明显高于在中性条件下的释放；且对叶酸受体高表达的肿瘤细胞具有特异靶向性，可进一步提高熊果酸的抗肿瘤效果，同时还可减少对正常组织细胞的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料及应用。
背景技术
熊果酸（Ursolic acid，UA）是一种五环三萜类化合物，来源于自然界多种天然植物中，具有抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等广泛的药理学活性，尤其以其显著的抗癌活性日益引起了国内外研究者的关注，显示出较大的临床应用潜力和良好的应用前景。尽管熊果酸以其高效低毒的作用特点正日益受到药学领域研究者的重视，但目前国内外将其作为抗癌药物在临床上的开发应用却非常有限。究其原因在于： 1）熊果酸本身在水中的溶解度较小，导致生物利用度低，大大减弱了其在体内实验的效果； 2）熊果酸对肿瘤组织的选择性弱，导致药物分子在体内的输送效率不够高，影响其药效活性，限制其在临床上的开发应用。
纳米载药系统作为一种可提高药物生利用度、可控制药物释放速度及可改变药物体内分布等优点的技术手段，已成为生物纳米材料及药剂学领域的研究热点。介孔二氧化硅纳米颗粒（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）作为一种新型的无机纳米介孔材料，由于其具有粒子形状稳定且规整，粒径与孔径可调；稳定的骨架结构；具有巨大的比表面积(>900 m2/g)和比孔容(>0.9 cm3/g)；易于修饰的内外表面；毒性小，生物相容性好；可以在孔道里负载上各种药物，且负载量高，对药物可起到缓释作用，提高药效的持久性等优点，已成为纳米药剂研究领域的热点。
壳聚糖(Chitosan，CS)是天然高分子中少有的碱性多糖，具有良好的生物相容性、可降解性、无毒性及抗菌活性，在生物医学应用方面具有巨大的潜能。而且壳聚糖还有可质子化的氨基，这些氨基在不同pH条件下可发生质子化/去质子化的改变，使壳聚糖发生弹性态/固定态的转变，将壳聚糖修饰到介孔二氧化硅表面可实现对所负载药物的pH响应性控释释放。
叶酸受体是一种在大部分恶性肿瘤细胞中过度表达，而在正常细胞中低表达的膜糖蛋白，而叶酸是与叶酸受体具有高度亲合力的小分子。基于叶酸受体在肿瘤细胞与正常细胞中的表达差异，将叶酸修饰于药物载体表面，可使药物靶向输送至叶酸受体过度表达的肿瘤细胞中，从而避免对正常细胞产生毒性，提高药物疗效。
专利CN 103920153A中公布了一种壳聚糖偶联介孔二氧化硅的纳米载体材料，但该专利也仅是利用壳聚糖的溶解特性而制备pH敏感型的纳米药物，只能实现药物的定位释放，而不能实现药物的靶向定位释放。我们课题组之前着眼于构建负载熊果酸的介孔二氧化硅纳米递药系统并取得了一定的成效，如在专利CN 104027814A 中，我们公布了一种通过氨基修饰后双重载药的介孔二氧化硅纳米材料，该材料可大幅度提高熊果酸的负载量及其生物利用度，但其在药物靶向定位释放方面的研究有待进一步的提高。
为了克服现有技术的不足，本专利制备了一种负载熊果酸且兼具pH敏感性及叶酸选择靶向性的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸的纳米药物，即解决了熊果酸水溶性差、生物利用度低的缺点；又利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体的作用选择性的浓集于肿瘤细胞处；然后肿瘤细胞经过内吞作用摄取该纳米药物；最后又根据肿瘤细胞生长微环境偏酸性的特点可使药物选择性的靶向定位释放，提高抗肿瘤效果，降低药物的毒副作用。检索国内外文献及专利结果表明，负载熊果酸且兼具pH敏感性及叶酸选择靶向性的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸的纳米药物及其制备方法并未报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可提高熊果酸生物利用度及抗癌效果的兼具pH响应性及靶向性的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料的制备。该纳米颗粒表示为UA@MSN-CS-FA，其中UA为熊果酸，MSN为介孔二氧化硅，CS为壳聚糖，FA为叶酸。本发明所制备的纳米材料（MSN-CS-FA）粒径分布均匀、分散性好，具有很低的细胞毒性。所制备的纳米药物即解决了熊果酸水溶性差、生物利用度低的缺点；又利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体的作用选择性的浓集于肿瘤细胞处；然后经过内吞作用肿瘤细胞对该纳米药物进行摄取；最后又根据肿瘤细胞生长微环境偏酸性的特点可使药物选择性的靶向定位释放，提高抗肿瘤效果，降低药物的毒副作用。
本发明是通过采用的以下的技术方而实现的是
一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料，其特征在于制备方法为：1）.将熊果酸负载到羧基化介孔二氧化硅的内孔道里，得到载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅；将叶酸与壳聚糖通过酰胺键连接制备偶联物，2）将偶联物与载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅通过酰胺键偶联得到所述的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米载体材料。
具体的制备方法是：
1）将十六烷基三甲基溴化铵：乙二醇：氨水：水按质量比为0.5~0.8:10~15:1.5~3.5:90混合后，50℃~70℃搅拌20~40 min，随后以十六烷基三甲基溴化铵：四乙氧基硅烷：2-氰乙基三乙氧基硅烷的质量比为0.5~0.8：0.8~1.0：0.1~0.3加入四乙氧基硅烷和2-氰乙基三乙氧基硅烷，反应于50℃~70℃恒温水浴搅拌1h~4h，50℃~70℃恒温陈化12h~48h，反应产物离心，依次用水和乙醇反复多次洗涤离心后分散于酸性乙醇中加热回流6h~48h，回流结束后离心分离以去除未反应的模板剂十六烷基三甲基溴化铵后，冷冻干燥，再将反应产物于质量百分比35%~60%硫酸溶液加热，在温度为80℃~100℃下回流水解20 h~30 h，反应产物离心，水洗，冷冻干燥，即得羧基化介孔二氧化硅；
2）将步骤1）中所制得的羧基化介孔二氧化硅以0.5-2.5mg/mL,优选1mg/mL的比例分散在丙酮溶液中，超声溶解，按熊果酸与羧基化介孔二氧化硅的质量比为0.5-3:2的比例加入熊果酸，室温搅拌12h~48h，离心，再用水洗，冷冻干燥即得负载熊果酸的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3）将叶酸溶解在二甲基亚砜中，配制成5mg/mL~10mg/mL浓度的溶液，再按叶酸:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为2:1~3:1加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下避光搅拌1 h~2h，得叶酸活性酯的二甲基亚砜溶液；将壳聚糖溶解于质量分数为0.5%~2%的乙酸溶液中，配制成1.5-2.5mg/mL浓度的溶液；搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的二甲基亚砜溶液，室温下避光反应10 h~24 h，然后用碱调节溶液pH至中性，离心分离后用超纯水洗涤，再离心并冷冻干燥即得叶酸壳聚糖偶联物；这里碱可以选用常见的氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱或碱溶液。
4）将叶酸壳聚糖偶联物溶于质量分数为0.5%~2%的乙酸溶液中，配制成质量分数为1%~3%的叶酸壳聚糖偶联物溶液；
将载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒以0.5 mg/mL~3mg/mL的比例溶解于N-N二甲基甲酰胺，按载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺按质量比为2~5：8~15：4~8加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温下搅拌3~8小时，再按载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒：叶酸壳聚糖偶联物质量比为2~5：6~15加入叶酸壳聚糖偶联物，于室温下搅拌8~24小时，离心，再用水洗，冷冻干燥即得介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米载体材料。
上述的兼具一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明所用羧基化介孔二氧化硅作为药物载体，将它与生物相容性好、毒性低的壳聚糖及能特异性识别肿瘤细胞的叶酸分子相偶联并负载上抗肿瘤药物熊果酸，该纳米药物可以有效解决熊果酸水溶性差的问题，进一步提高熊果酸在生物体内的利用度，并显著增加其对肿瘤细胞的靶向性；本发明所制得的载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米颗粒具有规则的孔道，粒径分布均匀，载药量大，生物相容性好，在水中分散性好，解决了熊果酸溶解性差和生物利用度低的缺点；在其外表面修饰上的壳聚糖分子具有pH敏感性的特质而叶酸分子具有叶酸受体靶向性，这样该介孔二氧化硅递药系统兼具pH敏感性和叶酸受体靶向性，使熊果酸能够靶向肿瘤细胞实现定位释放，从而解决了熊果酸对肿瘤组织的选择性弱，导致药物分子在体内的输送效率不够高的缺点，并且避免对正常组织的损伤作用。因此，在载药与药物控释领域具有广泛应用前景与价值。
附图说明
图1是实施例1所制备的羧基化介孔二氧化硅的粒径分布图；
图2是实施例1所制备的羧基化介孔二氧化硅的氮气吸附-脱附等温线图谱；
图3是实施例1所制备的羧基化介孔二氧化硅的孔径分布图；
图4是实施例3所制备的羧基化介孔二氧化硅的粒径分布图；
图5是实施例6所制备叶酸偶联壳聚糖的红外图谱；
图6是实施例7药物UA@MSN-CS-FA累积释放百分比与时间的关系图；
图7是实施例9中MTT法考察纳米药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体的实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 羧基化介孔二氧化硅的制备：
（1）称取0.6 g 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），90 mL超纯水溶解，加入乙二醇(EG)10 mL ，氨水2.75 mL(25%~28%)。上述溶液于60℃搅拌30 min，随后迅速加入1.0 mL四乙氧基硅烷（TEOS）和0.2mL2-氰乙基三乙氧基硅烷（CPTES），反应于60℃恒温水浴搅拌2h，60℃恒温陈化24 h，得到乳白色悬着液；
（2）将上述（1）中所得的乳白色悬着液于13000rpm离心30min，依次用水和乙醇反复多次洗涤离心后分散于酸性乙醇（浓盐酸：乙醇=5:1，V:V）中加热回流24小时，回流结束后离心分离以去除未反应的模板剂CTAB后，冷冻干燥；
（3）将上述（2）中所得的反应产物在酸性条件下（48%硫酸溶液）加热（100℃）回流水解24 h，反应产物于13000rpm离心20min水洗离心纯化三次，冷冻干燥，即得MSN-COOH产物。并将样品进行粒径测试，结果见图1，平均粒径为120nm；进行氮气吸附-脱附等温检测，结果见图2，粒子的孔径分布见图3；粒径比表面积为887.2 m2/g，孔径为2.8 nm，孔容为1.32cm3/g。
实施例2 壳聚糖与叶酸偶联物CS-FA的制备：
（1）叶酸活性酯的制备：称取100mg叶酸(FA)，用10 mL 二甲基亚砜（DMSO）溶解，再加入50mg EDC，室温下避光搅拌1 h，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；
（2）叶酸偶联壳聚糖的制备：称取40mg壳聚糖（CS）溶解于1%的乙酸溶液20mL中，磁力搅拌条件下缓慢加入上述步骤（1）中所得的叶酸活性酯的DMSO溶液，室温下避光反应16h，然后用1M的NaOH调pH至中性，13000rpm离心30min，用超纯水洗涤离心3次，冷冻干燥即得CS-FA。
实施例3 壳聚糖包裹介孔二氧化硅的制备
称取30mg 羧基化介孔二氧化硅（MSN-COOH），溶于30mL N-N二甲基甲酰胺(DMF)中，加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温下搅拌4小时；再加入5mL 2%（w/w）的壳聚糖溶液（2%（w/w）乙酸作为溶剂），于室温下搅拌12小时，13000rpm离心30min，用超纯水洗涤离心3次，冷冻干燥即得MSN-CS。并将样品进行粒径测试，结果见图4，平均粒径为190nm；
实施例4 叶酸偶联壳聚糖包裹介孔二氧化硅的制备
称取30mg 羧基化介孔二氧化硅（MSN-COOH），溶于30mL N-N二甲基甲酰胺(DMF)中，加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温下搅拌4小时；再加入5mL 2%的壳聚糖叶酸（CS-FA）溶液（2%乙酸作为溶剂），于室温下搅拌12小时，13000rpm离心30min，用超纯水洗涤离心3次，冷冻干燥即得MSN-CS-FA。并将样品进行粒径测试，平均粒径约为200nm；
实施例5 负载熊果酸的叶酸偶联壳聚糖包裹介孔二氧化硅的制备：
（1）称取30mg羧基化介孔二氧化硅（MSN-COOH）分散到30mL丙酮溶液中，超声溶解1小时，加入20mg熊果酸（UA），室温搅拌24小时，13000rpm离心20min去除为负载的熊果酸，水洗涤离心，冷冻干燥即得负载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒（UA@MSN-COOH）；
（2）称取30mg上述（1）中所得的负载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒（UA@MSN-COOH）溶于30mL N-N二甲基甲酰胺(DMF)中，加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温下搅拌4小时，再加入5mL2%的壳聚糖溶液（用2%乙酸作为溶剂），于室温下搅拌12小时；13000rpm离心30min，用超纯水洗涤离心3次，冷冻干燥即得UA@MSN-CS；
（3）称取30mg上述（1）中所得的负载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒（UA@MSN-COOH）溶于30mL N-N二甲基甲酰胺(DMF)中，加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，于室温下搅拌4小时，再加入5mL2%的壳聚糖叶酸（CS-FA）溶液（用2%乙酸作为溶剂），于室温下搅拌12小时；13000rpm离心30min，用超纯水洗涤离心3次，冷冻干燥即得UA@MSN-CS-FA。
实施例6
利用红外光谱法对实施例2中制得的叶酸与壳聚糖的偶联物进行红外谱图分析，结果见图5。由红外谱图结果显示：CS-FA的红外谱线在1560cm-1左右出现了一个新的吸收峰，表明壳聚糖的游离氨基和叶酸的羧基形成了酰胺键，即成功合成了壳聚糖与叶酸的偶联物。
实施例7 体外释放度的测定
选取pH值7.4、6.8、5.5的PBS缓冲液为释放介质，考察实施例5中的纳米药物UA@MSN-CS-FA的体外释放行为。将纳米药物分散到pH值为7.4的PBS缓冲溶液中至其终浓度为1mg/mL，吸取2mL于透析袋（MWCO=14000）内。分别将透析袋置于40mL pH值7.4、6.8、5.5的PBS释放介质中，在37℃下恒温振荡进行体外释放实验，间隔一定时间取样，利用紫外-可见分光光度计对样品溶液进行定量测定，绘制累积释放百分比与时间的关系图，见图6。由图可知，在释放体系的pH值为5.5时，药物的释放量多，这是因为已经聚合的壳聚糖在低pH下会溶解进而释放药物熊果酸，而肿瘤细胞的微环境偏酸性，所以该纳米递药系统是一种肿瘤靶向的pH响应系统。
实施例8 考察纳米材料的细胞学毒性
具体实施步骤如下：
选取处于对数生长期且状态良好的叶酸受体高表达的宫颈癌细胞HeLa及叶酸受体低表达的肝癌细胞HepG2，经胰蛋白酶消化后，用血球计数板计数，调整细胞密度为1×105 个/mL，配成细胞悬液；于每孔100 µL接种到96孔板，周围用PBS封板，置于37 ℃，5 %CO2培养箱中隔夜培养；当细胞密度达到80%时加入不同浓度梯度的纳米材料MSN-COOH、MSN-CS和MSN-CS-FA，培养24 h；去除培养液，加入100μL用无血清无酚红培养基稀释后的MTT溶液，37 ℃培养4 h；取出96孔板，吸出MTT溶液后加入100 μL DMSO，并在摇床上缓慢摇晃10 min，摇匀后多功能酶标仪于570 nm处检测OD值，使用GraphPad Prism 5计算细胞增殖抑制率。结果发现，所制备的纳米材料MSN-COOH、MSN-CS和MSN-CS-FA在1~200μg/mL剂量范围内对细胞几乎无毒，细胞存活率均在75%以上。
实施例9 考察纳米药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用
具体实施步骤如下：
选取处于对数生长期且状态良好的叶酸受体高表达的宫颈癌细胞Hela及叶酸受体低表达的肝癌细胞HepG2，经胰蛋白酶消化后，用血球计数板计数，调整细胞密度为1×105 个/mL，配成细胞悬液；于每孔100 µL接种到96孔板，周围用PBS封板，置于37 ℃，5 %CO2培养箱中隔夜培养；当细胞密度达到80%时加入不同浓度梯度的药物MSN-COOH@UA，MSN-CS@UA、MSN-CS-FA@UA及UA培养24 h；去除培养液，加入100μL用无血清无酚红培养基稀释后的MTT溶液，37 ℃培养4 h；取出96孔板，吸出MTT溶液后加入100 μL DMSO，并在摇床上缓慢摇晃10 min，摇匀后多功能酶标仪于570 nm处检测OD值，使用GraphPad Prism 5计算细胞增殖抑制率。结果如图7所示，可知纳米药物MSN-COOH@UA，MSN-CS@UA、MSN-CS-FA@UA及UA对肿瘤细胞HeLa和HepG2均有一定增殖抑制作用。在HeLa和HepG2两种细胞中，药物UA@MSN-CS的作用效果较药物UA@MSN-COOH的作用效果更为显著；在HeLa细胞中，UA@MSN-CS-FA作用效果明显较UA@MSN-CS的好，而在HepG2细胞中，UA@MSN-CS-FA和UA@MSN-CS的作用效果相当。这说明通过在纳米药物上偶联壳聚糖和叶酸分子可提高药物的靶向抗肿瘤效果，该纳米药物具有一定的医药业应用前景与应用价值。
Claims (2)
1.一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料，其特征在于制备方法为：
1）将十六烷基三甲基溴化铵：乙二醇：氨水：水按质量比为0.5~0.8:10~15:1.5~3.5:90混合后，50℃~70℃搅拌20~40 min，随后以十六烷基三甲基溴化铵：四乙氧基硅烷：2-氰乙基三乙氧基硅烷的质量比为0.5~0.8：0.8~1.0：0.1~0.3加入四乙氧基硅烷和2-氰乙基三乙氧基硅烷，反应于50℃~70℃恒温水浴搅拌1h~4h，50℃~70℃恒温陈化12h~48h，反应产物离心，依次用水和乙醇反复多次洗涤离心后分散于酸性乙醇中加热回流6h~48h，回流结束后离心分离以去除未反应的模板剂十六烷基三甲基溴化铵后，冷冻干燥，再将反应产物于质量百分比35%~60%硫酸溶液加热，在温度为80℃~100℃下回流水解20 h~30 h，反应产物离心，水洗，冷冻干燥，即得羧基化介孔二氧化硅；
2）将步骤1）中所制得的羧基化介孔二氧化硅以0.5-2.5mg/mL的比例分散在丙酮溶液中，超声溶解，按熊果酸与羧基化介孔二氧化硅的质量比为0.5-3:2的比例加入熊果酸，室温搅拌12h~48h，离心，再用水洗，冷冻干燥即得负载熊果酸的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3）将叶酸溶解在二甲基亚砜中，配制成5mg/mL~10mg/mL浓度的溶液，再按叶酸:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为2:1~3:1加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下避光搅拌1 h~2h，得叶酸活性酯的二甲基亚砜溶液；将壳聚糖溶解于质量分数为0.5%~2%的乙酸溶液中，配制成1.5-2.5mg/mL浓度的溶液；搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的二甲基亚砜溶液，室温下避光反应10 h~24 h，然后用碱调节溶液pH至中性，离心分离后用超纯水洗涤，再离心并冷冻干燥即得叶酸壳聚糖偶联物；
4）将叶酸壳聚糖偶联物溶于质量分数为0.5%~2%的乙酸溶液中，配制成质量分数为1%~3%的叶酸壳聚糖偶联物溶液；
将载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒以0.5 mg/mL~3mg/mL的比例溶解于 N-N二甲基甲酰胺，按载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺按质量比为2~5：8~15：4~8加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温下搅拌3~8小时，再按载熊果酸的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒：叶酸壳聚糖偶联物质量比为2~5：6~15加入叶酸壳聚糖偶联物，于室温下搅拌8~24小时，离心，再用水洗，冷冻干燥即得介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米载体材料。
2.如权利要求1所述的兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的介孔二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
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