KR20210015717A - 항암제 및 다공성 실리카 입자의 제조방법 - Google Patents

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KR20210015717A
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Abstract

본 발명은 항암 활성 펩타이드가 내장된 다수의 다공성 실리카 입자들을 포함하고, 각 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 다수의 질소 함유기가 위치하며, 상기 질소 함유기 중 적어도 일부에 엽산이 결합됨으로써, 암에 대한 표적 전달능이 우수하고, 생체 내 환경에서 침전을 형성하지 않고 안정성이 매우 우수하며, 다양한 암종에 적용 가능한 항암제에 관한 것이다.

Description

항암제 및 다공성 실리카 입자의 제조방법{ANTICANCER DRUG AND PREPARING METHOD FOR POROUS SILICA PARTICLE}
본 발명은 항암제 및 다공성 실리카 입자의 제조방법에 관한 것이다.
유방암은 전세계에서 가장 흔한 암 중 하나로, 암세포 표면의 ER, PR, HER2 등의 호르몬 수용체의 발현 수준이 진단과 치료에 매우 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 전통적인 치료법 중 하나는 이러한 수용체 또는 단백질을 타겟팅하는 항체를 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 치료법 들의 효율은 세포 표면의 바이오마커에 의존적으로 다양하다. 이러한 치료법의 대체재로서, 오토파지 현상이 매력적인 시도가 되어 왔다.
오토파지는 세포 내 항상성을 유지하거나 영양소를 보충하기 위해 세포 내 단백질 또는 세포 소기관을 분해하는 메커니즘이다. 오토파지는 세포를 건강하게 유지하는 데 필수적인 메커니즘이므로, 불균형 오토파지는 세포의 오작동을 유발할 수 있다. 유방암과 같은 일부 암은 오토파지 결핍으로 알려져 있다. 이러한 경우에 오토파지는 종양 형성과 밀접한 관련이 있다. PI3KC3 복합체를 형성하는 동안 오토파지 소체의 개시에 중요한 역할을 하는 Beclin1 단백질은 유방암 치료에 적용하기 위해 주목을 받았다. 특히, 18 개의 아미노산을 갖는 Bec1 펩티드가 확인되었으며, 이는 Beclin1 단백질과 유사한 활성 및 치료 효능을 나타냈다. 따라서, 오토파지 유도 펩티드, Bec1은 유방암의 새로운 치료제 후보가 되었다.
그러나, 펩티드의 소수성 특성은 bec1 펩티드를 유방암 세포로 전달하는데 큰 장애물이 되었다. 이러한 문제를 극복하기 위해, TAT9, 10과 같은 세포 투과성 펩티드를 함께 사용하였다. 그러나, 이들 방법은 암 세포 내로의 bec1의 표적화 된 전달을 달성할 수 없었다.
한국공개특허 제2018-0130364호
본 발명은 항암제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다공성 실리카 입자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 항암 활성 펩타이드가 내장된 다수의 다공성 실리카 입자들을 포함하고, 각 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 다수의 질소 함유기가 위치하며, 상기 질소 함유기 중 적어도 일부에 엽산이 결합되어 있는 항암제.
2. 위 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 0.9% 이하에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
3. 위 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 11% 이상에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
4. 위 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 0.001% 내지 0.3%에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
5. 위 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 이황화 결합에 의해 상기 다공성 실리카 입자에 결합되어 있는 항암제.
6. 위 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 불규칙적으로 배치된 다수의 기공을 포함하는 항암제.
7. 위 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 입경이 50 내지 500 nm이고 기공의 직경이 7 내지 25 nm인 항암제.
8. 위 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 길이가 5aa 내지 50aa인 항암제.
9. 위 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 그 말단에 C(GG)n (n은 1 내지 3)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함하는 항암제.
10. 위 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 항암제.
11. 위 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 BET 표면적이 280 m2/g내지 680 m2/g인 항암제.
12. 위 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 상기 다공성 실리카 입자에 1 : 1 내지 20의 중량비로 내장되는 항암제.
13. 위 1에 있어서, 주사제인 항암제.
14. 위 1에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 전립선암, 고환암, 음경암, 요도암, 요관암, 신우암, 식도암, 후두암, 위암, 위장관암, 피부암, 각질극 세포종, 난포 암종, 흑색종, 폐암, 소세포 폐암종, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 폐 선암, 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 유두암, 방광암, 간암, 담관암, 골암, 모발 세포암, 구강암, 구순암, 설암, 침샘암, 인두암, 소장암, 결장암, 직장암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 뇌암, 중추신경계암, 복막암, 간세포 암, 호지킨 또는 백혈병인, 항암제.
15. 위 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 외부 표면의 질소 원자의 양이 0.1 mmol/g 이상인, 항암제.
16. 다공성 실리카 입자의 내부 기공이 계면활성제로 채워진 상태에서 상기 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 질소 함유기를 도입시키는 제1단계; 상기 질소 함유기의 적어도 일부에 엽산을 결합시키는 제2단계; 상기 다공성 실리카 입자의 내부 기공을 채우고 있던 상기 계면활성제를 제거하는 제3단계; 및 상기 다공성 실리카 입자에 활성 펩타이드를 내장시키는 제4단계를 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
17. 위 16에 있어서, 상기 계면활성제는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride) 및 TMACl(tetramethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
18. 위 16에 있어서, 상기 활성 펩타이드는 상기 다공성 실리카 입자에 1 : 1 내지 20의 중량비로 결합되는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
19. 위 16에 있어서, 상기 엽산은 다공성 실리카 입자 100중량부 대비 0.01 내지 10중량부 처리되는 것인, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
20. 위 16에 있어서, 제1단계 이전에, 상기 계면활성제 및 실리카 전구물질을 용매에 넣고 교반하여 기공이 상기 계면활성제로 채워진 소기공 실리카 입자를 제조하는 단계를 더 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
21. 위 20에 있어서, 제1단계 이전에, 상기 소기공 실리카 입자를 팽창제와 반응시켜 상기 소기공을 팽창시키는 단계를 더 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
22. 위 16 내지 21 중 어느 한 항의 다공성 실리카 입자의 제조방법을 포함하는 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 항암제의 제조방법.
본 발명의 항암제는 항암 활성 펩타이드의 암에 대한 표적 전달능이 우수하다.
본 발명의 항암제는 생체 내 환경에서 침전을 형성하지 않고 안정성이 매우 우수하다.
본 발명의 항암제는 다양한 암종에 대해 적용될 수 있다.
도 1은 Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL 및 이를 이용하여 타겟 세포로 단백질을 전달하는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다. DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 7은 BALL 및 펩티드의 특성을 나타낸 것이다. (a)는 FabBALL의 TEM 이미지이다(scale bar = 200 nm). (b)는 FabBALL의 Hydrodynamic 입경 분포이다. (c)는 각 표면 개질된 BALL의 제타 전위이다. (d) MALDI-TOF MS 로 측정된 Bec1 펩티드의 매스 스펙트럼이다.
도 8은 FabBALL의 특성을 나타낸 것이다. (a)는 방출된 4-티오피리돈(324nm)의 UV-vis 흡수로 측정된 로딩 효율이다. (b)는 형광 fluorescence (ex/em: 492/517)으로 측정된 플루오레세인 컨쥬게이티드 Bec1 펩타이드의 방출 프로파일이다. (c)는 Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL로 12시간 처리된 세포에서의 localization을 나타낸 것이다. (파랑: DAPI, 녹색: fluorescein labelled Bec1, 빨강: Cy3 labelled FabBALL, scale bar=15 ㎛)
도 9는 FabBALL이 오토파지 매개 세포 사멸을 일으킴을 보이는 것이다. (a)는 다양한 농도의 Bec1 펩티드가 단독 또는 FabBALL과 같이 처리되었을 때의 MCF-7 세포의 생존율이다. (b)는 다양한 농도의 FabBALL, abBALL+bec1 및 FabBALL+bec1로 처리된 MCF-7 세포의 생존율이다. (c)는 PBS, bec1, FabBALL, 및 FabBALL+bec1로 처리된 LC3-GFP를 발현하는 MCF-7 세포의 형광이미지이다(blue: DAPI, green: GFP, scale bar= 20 μm). (d)는 각 그룹의 LC3 puncta의 수이다(n=100).
도 10 내지 12은 다양한 암세포주에 대한 항암 활성을 나타낸 것이다. (a)는 전립선암 세포주 PC-3, (b)는 전립선암 세포주 LNCaP, (c)는 난소암 세포주 HeLa에서의 결과이다.
도 13은 입자에서의 질소 함유기 대비 엽산 비율에 따른 용액 안정성 관찰 결과이다.
도 14는 다공성 실리카 입자의 기공 배치를 나타내는 개략도이다.
도 15는 실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 TEM 이미지이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항암제에 관한 것이다.
본 발명의 항암제는 항암 활성 펩타이드가 내장된 다수의 다공성 실리카 입자들을 포함하고, 각 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 다수의 질소 함유기가 위치하며, 상기 질소 함유기 중 적어도 일부에 엽산이 결합되어 있다.
본 발명에 따른 다공성 실리카 입자는 항암 활성 펩타이드가 내장되어 있다. 항암 활성 펩타이드는 기공 내부에 담지되어 있을 수 있다.
예를 들면, 항암 활성 펩타이드는 이황화 결합에 의해 기공 내부에 결합될 수 있다. 암세포는 세포 내 리소좀에 글루타티온(glutathione)이 높은 농도로 존재하므로, 암세포 내에서 상기 이황화 결합이 끊어져 항암 활성 펩타이드가 특이적으로 방출될 수 있다.
이황화 결합은 예를 들면 다공성 실리카 입자 기공 내부의 황 함유기 및 항암 활성 펩타이드 말단의 황 함유기의 반응에 의해 형성된 것일 수 있다. 황 함유기는 예를 들면 머캅토기, 머캅토알킬기 등일 수 있다.
다공성 실리카 입자는 기공 내부의 황 함유기 비율이 높아 항암 활성 펩타이드의 담지율이 높을 수 있다. 예를 들어, 기공 내부의 황 원자 비율이 0.05 mmol/g이상일 수 있다. 구체적으로 0.1 mmol/g 이상, 0.2 mmol/g 이상, 0.3 mmol/g 이상 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상한은 예를 들면 1 mmol/g, 0.7 mmol/g, 0.5 mmol/g, 0.4 mmol/g 등일 수 있다. 이는 원소분석을 통해 확인되는 값일 수 있다.
항암 활성 펩타이드는 말단에 C(GG)n (n은 1 내지 3) 링커를 포함할 수 있다.
상기 링커의 C(시스테인)은 이황화 결합을 이룰 때 사용될 수 있고, GG(다이글라이신)는 펩타이드의 기능에는 영향을 주지 않으면서 펩타이드가 기공 내부로부터 적정 거리 이격되도록 하여 다공성 실리카 입자로부터 보다 용이하게 이탈되도록 할 수 있다.
항암 활성 펩타이드는 항암 활성을 가지면서, 이황화 결합을 이룰 수 있는 작용기를 가지거나, 그러한 작용기를 결합시킬 수 있는 것이라면 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 이황화 결합과 관련하여, 예를 들면 항암 활성 펩타이드는 N 말단 또는 C 말단에 시스테인(C)를 갖는 것일 수 있다.
항암 활성 펩타이드로는 적용하고자 하는 암종에 맞는 항암 활성을 갖는 것이라면 공지된 것도 제한 없이 사용할 수 있으며, 공지된 펩타이드가 이황화 결합이 불가한 것이라면 예를 들어, 그 서열의 N 말단 또는 C 말단에 시스테인이 추가로 결합된 펩타이드를 사용할 수 있다.
항암 활성 펩타이드는 예를 들면 길이가 5aa 내지 50aa 일 수 있고, 구체적으로는 5aa 내지 40aa, 5aa 내지 30aa, 8aa 내지 25aa, 10aa 내지 25aa, 12aa 내지 25aa, 15aa 내지 25aa 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 길이는 링커를 포함한 길이일 수 있다.
항암 활성 펩타이드는 N 말단 또는 C 말단에 PK(Pharmacokinetics) 개선을 위한 당 분야에 공지된 작용기를 더 갖는 것일 수 있다. 이는 예를 들면 지방산, 콜레스테롤, 알킬기, 폴리에틸렌글리콜 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 지방산은 예를 들면 탄소수 8 내지 22의 지방산일 수 있고, 알킬기는 예를 들면 탄소수 1 내지 20의 알킬기일 수 있다.
항암 활성 펩타이드는 2개 이상의 펩티드의 복합체일 수 있다. 예를 들면 이황화 결합 등의 당 분야에 공지된 링커로 복수개의 펩티드가 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항암 활성 펩타이드의 입자에의 담지 비율은 예를 들면 다공성 실리카 입자와 항암 활성 펩타이드의 중량비가 1: 1 내지 20일 수 있다. 중량비가 상기 범위 내인 경우에 펩타이드가 충분히 다 담지되면서, 펩타이드가 담지되지 않은 빈 다공성 실리카 입자가 발생하는 것을 방지할 수 있다. 상기 범위 내에서 예를 들면 1: 1 내지 20, 1: 3 내지 20, 1: 3 내지 15, 1: 5 내지 15, 1: 6 내지 14, 1: 6 내지 12, 1: 6 내지 10 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 외부 표면에 엽산이 결합되어, 암세포 표면의 엽산 수용체에 특이적으로 결합하여 암세포 내로 이입될 수 있다.
다공성 실리카 나노입자는 외부 표면에 질소 함유기를 갖는다. 이에 의해 외부 표면에 엽산이 결합될 수 있다.
다공성 실리카 나노입자는 외부 표면의 질소 함유기 비율이 높을 수 있다. 예를 들면 외부 표면의 질소 원자 비율이 0.1 mmol/g 이상일 수 있다. 구체적으로 0.5 mmol/g 이상, 1 mmol/g 이상, 1.5 mmol/g 이상, 2 mmol/g 이상 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상한은 예를 들면 10 mmol/g, 5 mmol/g, 3 mmol/g, 2.5 mmol/g 등일 수 있다. 이는 원소분석을 통해 확인되는 값일 수 있다.
다공성 실리카 입자는 외부 표면이 가능한 만큼 상기 질소 함유기를 갖도록 상기 치환기를 도입하는 화합물을 처리하여 표면 개질한 것일 수 있다.
질소 함유기는 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등일 수 있다. 이는 예를 들어, 다공성 실리카 입자의 외부 표면의 실라놀기에 아미노알킬기를 결합시켜 생성된 것일 수 있다. 아미노알킬기는 예를 들면 아미노프로필기일 수 있다. 질소 함유기는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 상기 질소 함유기를 갖는 알콕시실란을 처리하여 수행될 수 있다. 이는 구체적으로, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등일 수 있다.
질소 함유기를 갖는 화합물은 예를 들어 다공성 실리카 입자 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부, 구체적으로 0.1 내지 5중량부, 보다 구체적으로 1 내지 5중량부, 더욱 구체적으로 1 내지 3중량부 처리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자의 외부 표면의 엽산은 외부 표면의 질소 함유기 중 적어도 일부에 결합되어 있다. 이에 의해 다공성 실리카 입자가 침전을 형성하지 않고 우수한 분산 안정성을 나타낼 수 있다. 예를 들면 질소 함유기 중 0.9% 이하 또는 11% 이상에 결합되어 있을 수 있다. 구체적으로, 엽산은 질소 함유기 중 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하에 결합되어 있을 수 있다. 그러한 경우 하한은 예를 들면 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.03%, 0.05% 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 엽산은 상기 상하한의 모든 가능한 조합을 만족하도록 결합될 수 있다. 또한, 구체적으로 엽산은 질소 함유기 중 11% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상에 결합되어 있을 수 있다. 상한은 100% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 결합 비율은 예를 들면 엽산의 처리량을 변경함으로써 조절할 수 있다.
상기 결합 비율은 예를 들면 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 도입된 질소 함유기의 양 대비 반응시에 첨가된 엽산의 양으로 계산될 수 있으며, 예를 들면 질소 함유기의 양은 원소 분석을 통해 도출된 양일 수 있다. 구체적인 예를 들자면, 원소 분석 결과 다공성 실리카 입자 외부 표면의 질소 원자 비율이 2.1 mmol/g인 경우, 엽산 비율을 질소 함유기의 0.1%(몰비)로 맞추기 위해서, 입자 50 mg에 0.046 mg의 엽산을 첨가하여 반응을 시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
엽산과 질소 함유기의 결합은 예를 들면 아마이드 결합일 수 있고, 구체적으로, EDC 커플링에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 실리카(SiO2) 소재의 입자이며, 나노 사이즈의 입경을 가질 수 있다.
다공성 실리카 입자는 다공성 입자로서, 나노사이즈의 기공을 갖고, 그 표면 및/또는 기공 내부에 항암 활성 펩타이드를 담지할 수 있다.
다공성 실리카 입자의 기공은 불규칙하게 배치되어 있을 수 있다. 통상 다공성 실리카 입자는 규칙적인 기공 구조(ordered pore structure)를 가지지만, 본 발명에 따른 다공성 실리카 입자는 불규칙적인 기공 구조(non-ordered pore structure)를 갖는 것일 수 있다. 이에 의해 항암 활성 펩타이드가 배출되는 경로가 보다 불규칙하고 길어져, 펩타이드가 보다 서방적으로 방출될 수 있다. 다공성 실리카 입자는 예를 들면 도 14, 15에 예시된 바와 같은 불규칙적인 기공 배치를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경이 7 내지 25nm일 수 있다. 평균 기공 직경은 상기 범위 내에서 예를 들면 7 내지 25nm, 상기 범위 내에서 예를 들면 7 내지 25nm, 7 내지 23nm, 10 내지 25nm, 13 내지 25nm, 7 내지 20nm, 7 내지 18nm, 10 내지 20nm, 10 내지 18nm 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 구형 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 입경은 50 내지 500nm일 수 있다. 상기 범위 내에서 예를 들면 50 내지 500nm, 50 내지 400nm, 50 내지 300nm, 100 내지 450nm, 100 내지 400nm, 100 내지 350nm, 100 내지 300nm, 150 내지 400nm. 150 내지 350nm, 200 내지 400nm, 200 내지 350nm, 250 내지 400nm, 180 내지 300nm, 150 내지 250nm 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 BET 표면적은 280 내지 680m2/g일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 280m2/g 내지 680m2/g, 280m2/g 내지 600m2/g, 280m2/g 내지 500m2/g, 280m2/g 내지 400m2/g, 300m2/g 내지 650m2/g, 300m2/g 내지 600m2/g, 300m2/g 내지 550m2/g, 300m2/g 내지 500m2/g, 300m2/g 내지 450m2/g, 350m2/g 내지 450m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 기공의 g당 부피가 예를 들면 0.7ml 내지 2.2ml일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7ml 내지 2.0ml, 0.8ml 내지 2.2ml, 0,8 ml 내지 2.0ml, 0.9 ml 내지 2.0ml, 1.0 ml 내지 2.0ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. g당 부피가 과도하게 작아지면 분해 속도가 너무 빨라질 수 있고, 과도하게 큰 입자는 제조가 어렵거나, 온전한 형상을 가질 수 없을 수 있다.
다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경 5nm 미만의 소기공 입자의 기공이 평균 직경 7 내지 25nm로 확장된 것일 수 있다. 이에 의해 기공 직경이 커서 크거나 긴 펩타이드를 기공 내부에 담지할 수 있으며, 기공 직경에 비해 입경 자체는 크지 않아 세포 내로의 전달 및 흡수가 용이하다.
상기 항암 활성 펩타이드 및 엽산의 결합은 기공 내부에 계면활성제가 채워져 있는 다공성 실리카 입자의 외부 표면을 질소 함유기를 갖도록 개질하는 단계; 상기 질소 함유기에 엽산을 결합시키는 단계; 다공성 실리카 입자의 기공 내부의 계면활성제를 제거하는 단계; 및 기공 내부에 항암 활성 펩타이드를 이황화 결합으로 결합시키는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 소기공의 입자 제조 및 기공 확장 공정을 거쳐 제조된 것일 수 있는데, 상기 소기공의 입자는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반 및 균질화시켜 얻어지는 것일 수 있고, 기공 확장은 상기 얻어진 소기공 입자에 기공 팽창제를 처리하여 수행되는 것일 수 있다.
이러한 경우 기공 내부에 계면활성제가 채워진 상태로 입자가 얻어지는데, 이때 기공 외부 표면을 질소 함유기를 갖도록 개질할 수 있다. 이는 전술한 바와 같이, 질소 함유기를 갖는 화합물을 처리하여 수행된 것일 수 있다. 기공 내부에 계면활성제가 채워진 상태로 표면 개질을 함으로써, 기공 내부가 아닌 기공 외부만 질소 함유기를 갖도록 개질할 수 있다.
이후, 다공성 실리카 입자에 엽산을 처리하여 상기 질소 함유기에 엽산을 결합시킬 수 있다.
예를 들면 엽산은 전술한 비율을 만족하도록 처리할 수 있다.
이후, 기공 내부에 항암 활성 펩타이드를 결합시키기 위해 기공 내부의 계면활성제를 제거한다.
기공 내부의 계면활성제는 예를 들면 산 처리에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 산을 포함하는 알코올로 처리하여 수행될 수 있다. 산은 예를 들면 염산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
알코올은 예를 들면 탄소수 1 내지 3의 알코올일 수 있고, 구체적으로는 에탄올일 수 있다.
산 처리는 교반 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 4 내지 24시간, 구체적으로 8 내지 24시간, 보다 구체적으로 12 내지 20시간 수행될 수 있다.
산 처리는 가열 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 80℃ 내지 150℃, 구체적으로 90℃ 내지 130℃로 수행될 수 있다.
이후, 기공 내부에 항암 활성 펩타이드를 이황화 결합으로 결합시킨다.
이황화 결합 형성을 위해 다공성 실리카 입자는 기공 내부가 황 함유기를 갖도록 개질된 것일 수 있다. 이는 예를 들면 황 함유기를 갖는 화합물을 처리하여 수행된 것일 수 있다. 이는 황 함유기를 갖는 알콕시실란일 수 있고, 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에 황 함유기를 갖는 항암 활성 펩타이드를 처리하면 이황화 결합이 형성되면서 항암 활성 펩타이드가 결합될 수 있다.
항암 활성 펩타이드의 결합은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 항암 활성 펩타이드를 혼합하여 수행될 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
표면 개질은 예를 들면 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 전술한 화합물과 반응시켜 수행할 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 전술한 화합물과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 전술한 화합물과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
각 공정 사이에는 세척이 수행될 수 있다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
입자 제조 방법에 대한 구체적인 예시는 하기와 같다.
상기 소기공의 입자는 예를 들면 평균 기공 직경이 1nm 내지 5nm인 입자일 수 있다.
상기 소기공의 입자는 용매에 계면활성제와 실리카 전구물질을 넣고 교반하여 얻어질 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 메탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 물과 유기 용매의 혼합 용매 사용시 그 비율은 예를 들면 물과 유기용매를 1: 0.7 내지 1.5의 부피비, 예를 들어, 1: 0.8 내지 1.3의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 예를 들면 용매 1리터당 1g 내지 10g, 예를 들어 상기 범위 내에서 1g 내지 8g, 2g 내지 8g, 3g 내지 8g 등의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질은 용매에 계면활성제를 첨가하여 교반한 후에 첨가될 수 있다. 실리카 전구물질은 예를 들면 TMOS(Tetramethyl orthosilicate), TEOS(Tetramethyl orthosilicate) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반은 예를 들면 10분 내지 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구물질은 예를 들면 용매 1리터당 0.5ml 내지 5ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 4ml, 0.5ml 내지 3ml, 0.5ml 내지 2ml, 1ml 내지 2ml 등으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라 촉매로서 수산화나트륨을 더 사용할 수 있으며, 이는 용매에 계면활성제를 첨가한 후 실리카 전구물질의 첨가 전에 교반하면서 첨가될 수 있다.
상기 수산화나트륨은 예를 들면 1M 수산화나트륨 수용액 기준으로 용매 1리터당 0.5ml 내지 8ml, 예를 들어 상기 범위 내에서 0.5ml 내지 5ml, 0.5ml 내지 4ml, 1ml 내지 4ml, 1ml 내지 3ml 2ml 내지 3ml 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 전구 물질의 첨가 후에 용액을 교반하며 반응시킬 수 있다. 교반은 예를 들면 2시간 내지 15시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 3시간 내지 15시간, 4시간 내지 15시간, 4시간 내지 13시간, 5시간 내지 12시간, 6 시간 내지 12시간, 6시간 내지 10시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 시간(반응 시간)이 너무 짧은 경우에는 결정핵 생성(nucleation)이 부족할 수 있다.
상기 교반 이후에는 용액을 숙성(aging)시킬 수 있다. 숙성은 예를 들면 8시간 내지 24시간 할 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 8시간 내지 20시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 반응산물을 세척 및 건조시켜 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있다.
상기 미반응 물질의 분리는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있고, 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
앞서 예시한 방법으로 제조되는 입자는 그 표면 및 기공 내부에 반응에 사용된 잔여 유기물질(계면활성제 등)이 남아 있을 수 있는 바, 이를 제거하기 위해 세척이 수행되는 것일 수 있다. 통상 이러한 유기물질의 제거를 위해 산 처리(또는 산성의 유기용매 처리)가 수행될 수 있으나, 본 발명은 이러한 산 처리를 수행하지 않아 세척 이후에도 기공 내부에 잔여 유기물질이 남아 있는 것일 수 있다.
상기 건조는 예를 들면 20℃ 내지 100℃로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 진공 상태에서 수행될 수도 있다.
이후, 상기 얻어진 다공성 실리카 입자의 기공을 확장할 수 있다. 기공 확장은 소기공 실리카 입자를 기공 팽창제와 반응시켜 수행될 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 트리헥실벤젠, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있고, 구체적으로, 트리메틸벤젠을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 기공 팽창제는 예를 들면 N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine,DMHA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기공 확장은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자를 기공 팽창제와 혼합하고, 가열하여 반응시켜 수행될 수 있다.
상기 용매는 예를 들면 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 예를 들면 용매 1리터당 10g 내지 200g, 예를 들어 상기 범위 내에서 10g 내지 150g, 10g 내지 100g, 30g 내지 100g, 40g 내지 100g, 50g 내지 100g, 50g 내지 80g, 60g 내지 80g 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자는 용매 중에 고르게 분산되어 있는 것일 수 있고, 예를 들면 용매에 다공성 실리카 입자를 첨가하고 초음파 분산시킨 것일 수 있다. 혼합용매를 사용하는 경우에는 제1 용매에 다공성 실리카 입자를 분산시킨 후에 제2 용매를 첨가한 것일 수 있다.
상기 기공 팽창제는 예를 들면 용매 100부피부에 대하여 10 내지 200부피부, 상기 범위 내에서, 10 내지 150부피부, 10 내지 100부피부, 10 내지 80부피부, 30 내지 80부피부, 30 내지 70부피부 등의 비율로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 120℃ 내지 190℃로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 120℃ 내지 190℃, 120℃ 내지 180℃, 120℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 170℃, 130℃ 내지 160℃, 130℃ 내지 150℃, 130℃ 내지 140℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 예를 들면 6시간 내지 96시간 수행 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 96시간, 30시간 내지 80시간, 30시간 내지 72시간, 24시간 내지 80시간, 24시간 내지 72시간, 36시간 내지 96시간, 36시간 내지 80시간, 36시간 내지 72시간, 36시간 내지 66시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 88시간, 48시간 내지 80시간, 48시간 내지 72시간, 6시간 내지 96시간, 7시간 내지 96시간, 8시간 내지 80시간, 9시간 내지 72시간, 9시간 내지 80시간, 6시간 내지 72시간, 9시간 내지 96시간, 10시간 내지 80시간, 10시간 내지 72시간, 12시간 내지 66시간, 13시간 내지 60시간, 14시간 내지 96시간, 15시간 내지 88시간, 16시간 내지 80시간, 17시간 내지 72시간 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 예시한 범위 내에서 시간 및 온도를 조절하여 반응이 과다하지 않으면서 충분히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 늘리거나, 반응 온도가 낮아지면 반응 시간을 짧게하는 등에 의할 수 있다. 반응이 충분하지 않으면 기공의 확장이 충분하지 못할 수 있고, 반응이 과다하게 진행되면 기공의 과다 확장에 의해 입자가 붕괴될 수 있다.
상기 반응은 예를 들면 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있다. 구체적으로, 상온에서 상기 온도까지 0.5℃/분 내지 15℃/분의 속도로 단계적으로 승온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 15℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 교반 하에 수행될 수 있다. 예를 들면 100rpm 이상의 속도로 교반될 수 있고, 구체적으로 100rpm 내지 1000rpm의 속도로 수행도리 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 이후에는 반응액을 서서히 냉각시킬 수 있으며, 예를 들면 단계적으로 감온하여 냉각시킬 수 있다. 구체적으로 상기 온도에서 상온까지 0.5℃/분 내지 20℃/분의 속도로 단계적으로 감온시켜 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 범위 내에서 1℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 20℃/분, 3℃/분 내지 12℃/분, 3℃/분 내지 10℃/분 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 냉각 이후에 반응 산물을 세척 및 건조시켜 기공이 확장된 다공성 실리카 입자를 얻을 수 있고, 필요에 따라 세척 전에 미반응 물질의 분리가 선행될 수 있다.
상기 미반응 물질의 분리는 예를 들면 원심분리로 상등액을 분리하여 수행될 수 있고, 원심분리는 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 등일 수 있다.
상기 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 알코올, 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 6,000 내지 10,000rpm으로 수행될 수 있으며, 그 시간은 예를 들면 3분 내지 60분, 예를 들어 상기 범위 내에서 3분 내지 30분, 3분 내지 30분, 5분 내지 30분 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세척은 원심분리를 하지 않고, 필터로 입자를 걸러내어 수행될 수도 있다. 필터는 다공성 실리카 입자의 직경 이하의 기공을 가지는 것일 수 있다. 반응액을 그러한 필터로 걸러내면 입자만이 필터 위에 남고, 그 필터 위에 물 및/또는 유기용매를 부어 세척할 수 있다.
상기 세척 시에 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
본 발명의 항암제는 담지된 항암 활성 펩타이드를 체내에 안정적으로 전달하고, 암세포 내에서 타겟에 방출할 수 있다.
본 발명의 항암제의 대상인 암은 표면에 엽산 수용체를 과발현하는 모든 암으로서, 예를 들면, 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 전립선암, 고환암, 음경암, 비뇨생식관 암, 고환종, 식도암, 후두암, 위암, 위장관암, 피부암, 각질극 세포종, 난포 암종, 흑색종, 폐암, 소세포 폐암종, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 폐 선암, 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 유두암, 방광암, 간암, 담관암, 신장, 골암, 골수 장애, 림프 장애, 모발 세포암, 구강 및 인두(경구)암, 구순암, 설암, 구강암, 침샘암, 인두암, 소장암, 결장암, 직장암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 뇌암, 중추신경계암, 복막암, 간세포 암, 두부 암, 경부 암, 호지킨, 백혈병 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 항암제 내성암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항암제는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 항암제는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항암제는 주사제일 수 있다. 본 발명의 항암제는 생체 환경, 혈액 등에서 침전을 형성하지 않는 것으로서, 얇은 주사 바늘로도 투여가 가능하여 주사제 제형인 경우 특히 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항암제는 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 항암제의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 전달체의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 발명의 항암제는 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 항암제는 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 다공성 실리카 입자의 내부 기공이 계면활성제로 채워진 상태에서 상기 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 질소 함유기를 도입시키는 제1단계; 상기 질소 함유기의 적어도 일부에 엽산을 결합시키는 제2단계; 상기 다공성 실리카 입자의 내부 기공을 채우고 있던 상기 계면활성제를 제거하는 제3단계; 및 상기 다공성 실리카 입자에 활성 펩타이드를 내장시키는 제4단계를 포함한다.
제1 단계에서는 다공성 실리카 입자의 내부 기공이 계면활성제로 채워진 상태에서 상기 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 질소 함유기를 도입시킨다.
계면활성제는 예를 들면 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), TMACl(tetramethylammonium chloride) 등일 수 있고, 구체적으로는 CTAB를 사용할 수 있다.
기공 내부에 계면활성제가 채워진 상태로 표면 개질을 함으로써, 기공 내부가 아닌 기공 외부만 질소 함유기를 갖도록 개질할 수 있다.
질소 함유기는 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등일 수 있다. 이는 예를 들어, 다공성 실리카 입자의 외부 표면의 실라놀기에 아미노알킬기를 결합시켜 생성된 것일 수 있다. 아미노알킬기는 예를 들면 아미노프로필기일 수 있다. 질소 함유기는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 상기 질소 함유기를 갖는 알콕시실란을 처리하여 수행될 수 있다. 이는 구체적으로, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등일 수 있다.
질소 함유기를 갖는 화합물은 예를 들어 다공성 실리카 입자 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부, 구체적으로 0.1 내지 5중량부, 보다 구체적으로 1 내지 5중량부, 더욱 구체적으로 1 내지 3중량부 처리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 앞서 예시한 방법으로 제조된 것일 수 있다. 본 발명의 방법은 앞서 예시한 다공성 실리카 입자를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다공성 실리카 입자는 앞서 예시한 스펙을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 단계에서는 상기 질소 함유기의 적어도 일부에 엽산을 결합시킨다.
외부 표면에 질소 함유기를 갖는 다공성 실리카 입자를 엽산과 반응시키면, 엽산이 질소 함유기에 결합될 수 있다.
엽산은 예를 들면 질소 함유기 중 0.9% 이하 또는 11% 이상에 결합시킬수 있다. 구체적으로, 엽산을 질소 함유기 중 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하에 결합시킬 수 있다. 그러한 경우 하한은 예를 들면 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.03%, 0.05% 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 엽산을 상기 상하한의 모든 가능한 조합을 만족하도록 결합시킬 수 있다. 또한, 구체적으로 엽산을 질소 함유기 중 11% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상에 결합시킬 수 있다. 상한은 100% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 결합 비율은 예를 들면 엽산의 처리량을 변경함으로써 조절할 수 있다.
상기 결합 비율은 예를 들면 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 도입된 질소 함유기의 양 대비 반응시에 첨가된 엽산의 양으로 계산될 수 있으며, 예를 들면 질소 함유기의 양은 원소 분석을 통해 도출된 양일 수 있다.
엽산은 예를 들면 다공성 실리카 입자 100중량부에 대하여 0.001 내지 200중량부, 구체적으로 0.001 내지 100중량부, 0.001 내지 50중량부, 0.001 내지 30중량부, 0.001 내지 10중량부, 0.001 내지 5중량부, 0.001 내지 3중량부, 0.001 내지 1중량부, 0.001 내지 0.5중량부, 0.01 내지 10중량부, 0.01 내지 5중량부, 0.01 내지 3중량부, 0.01 내지 2중량부, 0.1 내지 10중량부, 0.1 내지 5중량부, 0.1 내지 3중량부, 0.1 내지 2중량부, 10 내지 200중량부, 10 내지 150중량부, 10 내지 100중량부, 20 내지 200중량부, 20 내지 150중량부, 20 내지 100중량부, 20 내지 50중량부, 30 내지 200중량부, 30 내지 150중량부, 30 내지 100중량부, 50 내지 200중량부, 50 내지 150중량부, 50 내지 100중량부 등으로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제3 단계에서는 상기 다공성 실리카 입자의 내부 기공을 채우고 있던 상기 계면활성제를 제거한다.
기공 내부의 계면활성제는 예를 들면 산 처리에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 산을 포함하는 알코올로 처리하여 수행될 수 있다. 산은 예를 들면 염산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
알코올은 예를 들면 탄소수 1 내지 3의 알코올일 수 있고, 구체적으로는 에탄올일 수 있다.
산 처리는 교반 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 4 내지 24시간, 구체적으로 8 내지 24시간, 보다 구체적으로 12 내지 20시간 수행될 수 있다.
산 처리는 가열 하에 수행될 수 있으며, 예를 들면 80℃ 내지 150℃, 구체적으로 90℃ 내지 130℃로 수행될 수 있다.
제4단계에서는 상기 다공성 실리카 입자에 활성 펩타이드를 내장시킨다.
활성 펩타이드는 예를 들면 기공 내부에 이황화 결합으로 결합시킬 수 있다.
이황화 결합 형성을 위해 다공성 실리카 입자는 기공 내부가 황 함유기를 갖도록 개질된 것일 수 있다. 이는 예를 들면 황 함유기를 갖는 화합물을 처리하여 수행된 것일 수 있다. 이는 황 함유기를 갖는 알콕시실란일 수 있고, 구체적으로는 (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에 황 함유기를 갖는 활성 펩타이드를 처리하면 이황화 결합이 형성되면서 항암 활성 펩타이드가 결합될 수 있다.
활성 펩타이드의 결합은 예를 들면 용매 중의 다공성 실리카 입자와 활성 펩타이드를 혼합하여 수행될 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있으며, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 시클로헥산온 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄소계 방향족류; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 PBS(phosphate buffered saline solution), SBF(Simulated Body Fluid), Borate-buffered saline, Tris-buffered saline 등을 사용할 수도 있다.
표면 개질은 예를 들면 용매에 분산시킨 다공성 실리카 입자를 전술한 화합물과 반응시켜 수행할 수 있다.
상기 용매는 물 및/또는 유기용매일 수 있고, 유기용매는 예를 들면 1,4-디옥산 등의 에테르류(특히 고리형상 에테르류); 클로로포름, 염화메틸렌, 4염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 퍼클로로에틸렌, 디클로로프로판, 염화아밀, 1,2-디브로모에탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸이소부틸케톤, γ-부티로락톤, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 시클로펜타논, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논 등의 케톤류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 테트라메틸벤젠 등의 탄소계 방향족류 ; N,N-디메틸포름아미드, N,N-디부틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 알킬아미드류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올류; 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디에틸렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노부틸에테르, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 프로필렌글리콜모노에틸에테르, 디프로필렌글리콜디에틸에테르, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르 등의 글리콜에테르류(셀로솔브); 그외 디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디에틸아세트아미드, 디메틸포름아미드(DMF), 디에틸포름아미드(DEF), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N-메틸피롤리돈(NMP), N-에틸피롤리돈(NEP), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, N,N-디메틸메톡시아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸포스포아미드, 테트라메틸우레아, N-메틸카르로락탐, 테트라히드로퓨란, m-디옥산, P-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 톨루엔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 전술한 화합물과의 반응은 예를 들면 가열 하에 수행될 수 있고, 가열은 예를 들면 80℃ 내지 180℃, 예를 들어 상기 범위 내에서 80℃ 내지 160℃, 80℃ 내지 150℃, 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 150℃, 110℃ 내지 150℃ 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자의 전술한 화합물과의 반응은 예를 들면 4시간 내지 20시간, 예를 들어 상기 범위 내에서 4시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 16시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 14시간 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
각 공정 사이에는 세척이 수행될 수 있다.
상기 세척은 물 및/또는 유기용매로 할 수 있고, 구체적으로는 용매별로 녹일 수 있는 물질이 상이하므로 물과 유기용매를 1회 또는 수회 번갈아 사용할 수 있으며, 물 또는 유기용매 단독으로도 1회 또는 수회 세척할 수 있다. 상기 수회는 예를 들면 2회 이상, 10회 이하, 예를 들어, 3회 이상 10회 이하, 4회 이상 8회 이하, 4회 이상 6회 이하 등일 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실시예 1. 다공성 실리카 입자
1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 다공성 실리카 입자의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 1.5g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10ml에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10ml, TMB (trimethyl benzene) 10ml를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160℃, 48시간 반응시켰다.
반응은 25℃에서 시작하여 10℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1~10℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25℃에서 10분간 8000rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70℃ 오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 17.2nm, 입경 200nm)를 얻었다.
(2) 다공성 실리카 입자의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140℃, 72시간으로 변경한 것을 제외하고는 상기 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 다공성 실리카 입자의 제조 (10L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 300nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920ml, 메탄올 850ml를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 500nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800ml, 메탄올 1010 ml, CTAB 10.6g을 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 1000nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620ml, 메탄올 1380ml, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 4nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 7nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(9) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 17nm)
기공 확장시에 TMB를 11mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(11) 다공성 실리카 입자의 제조
소기공 입자의 제조시에 증류수 900ml, 메탄올 850 ml, CTAB 8g을 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
2. 입자의 형성 및 기공의 확장 확인
실시예 1-1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 2 내지 5).
도 2는 실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 3은 실시예 1-1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고,
도 4는 실시예 1-1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 5는 실시예 1-1-(1)과 1-1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
3. 기공 직경 및 BET 표면적 계산
실시예 1-1-(1)의 소기공 입자, 실시예 1-1-(1), (7), (8), (10), (11)의 다공성 실리카 입자의 표면적을 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 직경의 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 6에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 기공 직경(nm) BET 표면적(m2/g)
실시예 1-1-(1)의 소기공 입자 2.1 1337
실시예 1-1-(7) 4.3 630
실시예 1-1-(8) 6.9 521
실시예 1-1-(1) 17.2 377.5
실시예 1-1-(10) 23 395
실시예 1-1-(11) 12.3 379
4. 표면 개질
실시예 1-1-(1)의 100mg의 나노입자(BALL)를 10mL 톨루엔에 분산시키고, 110℃로 가열하였다. 온도가 110℃에 도달했을 때 2ml의 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)를 첨가하고, 16시간 동안 환류하였다. 15분간 8500rpm으로 원심분리하여 입자(aBALL, BALL에 질소함유기 결합)를 얻고, 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 2회 세척하였다.
침전물을 수득하여 에탄올 하에서 엽산 0.1mg, N-hydroxysuccinimide (NHS) 1.2mg, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 2mg과 반응시켰다.
15분간 8500rpm으로 원심분리하여 입자(FaBALL, aBALL에 엽산 결합)를 얻고, 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 10회 세척하였다.
얻어진 입자는 HCl/염산 용액(1:5 v/v)로 옮기고 110℃에서 16시간 환류시켰다. 15분간 8500rpm으로 원심분리하여 CTAB이 제거된 입자를 얻고, 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 10회 세척하였다.
얻어진 입자는 10mL 톨루엔에 분산시키고, 110℃로 가열하였다. 온도가 110℃에 도달했을 때 1ml의 3-mercaptopropyltriethoxysilane (MPTES)를 첨가하고, 16시간 동안 환류하였다. 15분간 8500rpm으로 원심분리하여 입자(FabBALL, FaBALL에 머캅토프로필기 결합, 기공 내부 황 원자 비율 0.3 mmol/g)를 얻고, 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 10회 세척하였다.
5. 입자 특성 평가
얻어진 FabBALL을 TEM으로 관찰하고, 입경을 측정하였다. 그리고 각 BALL의 제타 전위를 측정하였다(도 7).
6. 엽산 양 평가
도 13에 표시된 바와 같이, 엽산의 처리량을 달리한 것을 제외하고는 실시예 1-4와 동일한 방법으로 표면 개질을 수행하고, 입자의 침전 여부를 확인하였다.
입자의 질소 함유기(아미노프로필기) 대비 엽산의 양을 0%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10% 및 100%로 하였고, 이는 엽산의 첨가량을 달리하여 조절하였다. 구체적으로, 원소분석을 통해 아미노프로필기의 도입량을 확인하고(질소 원자 비율 2.1 mmol/g), 질소 함유기 대비 엽산의 몰비율을 1:1(100%), 10:1(10%), 100:1(1%), 1000:1(0.1%), 10000:1(0.01%)을 맞추기 위해 입자 12 mg에 엽산을 각각 19 mg, 1.9 mg, 0.19 mg, 0.019 mg, 0.0019 mg을 첨가하고, EDC는 각각 41 mg, 4.1 mg, 0.41 mg, 0.041 mg, 0.0041 mg을 넣고, NHS는 25 mg, 2.5 mg, 0.25 mg, 0.025 mg, 0.0025 mg을 첨가하였다.
개질하여 얻어진 입자를 PBS에 8 mg/ml의 농도로 첨가하였고, 엽산량이 1%, 10%인 경우에는 침전이 형성되었다.
7. 입자의 염료 라벨링
실시예 1-2에서 얻어진 입자 10mg을 물 1ml에 부유하고 N-hydroxysuccinimyl ester-activated Cyanine3 (Cy3-NHS) 20 ㎍을 혼합하였다. 혼합액은 교반하에 16시간 반응시켰다. 미반응 형광 염료는 에탄올 및 물로 10회 세척하여 제거하였다. 건조시켜 염료 라벨링된 입자를 얻고, 물에 재분산시켰다.
8. 세포 배양
MCF-7 세포(autophagy deficient breast cancer cell overexpressing folate receptor)를 50 units/mL 페니실린/스트렙토마이신 용액 및 10% fetal bovine serum (FBS)를 혼합한 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
9. 세포 내 유입 평가
FabBALL 및 abBALL의 MCF-7 세포로의 endocytosis 효율 차이를 평가하였다. 염료 라벨링된 FabBALL 및 abBALL를 MCF-7 세포에 처리하고, 형광 강도를 평가하였다. 평균 형광 강도는 FabBALL이 abBALL보다 2배 높았다(도 8 c).
실시예 2. 펩티드의 로딩 및 방출
1. 펩티드의 합성
Bec1 펩타이드(CGGTNVFNATFHIWHSGQFGT, 서열번호 1)를 Rink amide resin을 사용하여 solid phase 합성법으로 합성하였다. 형광 라벨링을 위해, 3 eq fluorescein, 3 eq NHS 및 3 eq EDC를 펩티드에 첨가하였다. 얻어진 펩티드는 HPLC로 정제하여 MALDI-ToF Mass spectrometry로 확인하였다.
2. 로딩 효율 측정
초과량의 4,4-dipyridyldisufide를 실시예 1-2-5의 입자에 첨가하고, 에탄올로 3회 세척하였다. 이후 서로 다른 양의 입자를 20% DMSO 용액 하의 고정된 양의 Bec1 펩티드에 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 15분간 8500rpm으로 원심분리하여 상등액을 얻고, 324nm에서의 흡광도를 측정하였다. 잔여 펩티드의 농도는 4-thiopyridone의 스탠다드 커브와 비교하여 계산하였다. 펩티드는 FabBALL에 약 10% w/w만큼 로딩되었다.(도 8a)
3. 펩티드 방출
실시예 1-2-4의 입자 100 ㎍과 형광 라벨링된 Bec 펩티드 10 ㎍을 다른 농도의 GSH를 갖는 160 ㎕의 1x PBS에서 혼합하였다. DMSO 40 ㎕를 첨가하여 Bec1 펩티드를 용해시키고 형광 강도를 측정하였다. 방출되는 펩티드의 양은 Bec1 펩티드의 최초 형광에 기초하여 계산하였다.
GSH가 없을 때는 12시간 동안 3% 이하의 펩티드만 방출되었지만, 10 mM 또는 2 mM의 글루타티온(GSH) 존재 하에, 펩티드가 FabBALL로부터 12시간 이내에 30% 많이 방출되었다(도 8b). 이는 펩티드 방출이 환원 환경에 의존적이고 사이토플라즘 내에서 더 촉진됨을 보여준다.
6. 세포독성 평가
MCF-7 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 10,000 세포/웰로 시딩하였다. 1일 후, 서로 다른 농도의 각 입자 (4 - 500 ㎍/mL)는 각 웰에서 세럼 함유 배지로 1일간 처리되었다. 이후 배지를 MTT assay kit 10 ㎕를 함유한 세럼 프리 배지를 교체하여 4시간 배양하고, 상등액을 아스피레이션하였다. 각 웰에 DMSO를 첨가하여 포르마잔을 녹이고 1시간 반응시켰다. 흡광도는 570nm 파장에서 측정하였고 세포생존율은 비처리군의 것과의 상대값으로 계산하였다.
세포 생존율은 Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL와 Bec1 펩티드를 MCF-7 세포에 처리한 후 MTT assay로 비교하였다. Bec1 펩티드만 처리했을 때는 세포 생존율은 비처리군에 비해 크게 변화하지 않았다. 그러나, Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL을 처리했을 때는 세포 생존율이 크게 감소하였다(도 9 a,b). FabBALL은 Bec1 펩티드의 표적 전달에 높은 효율을 보임을 확인하였다.
6. 세포 내 펩티드 방출 측정을 위한 세포의 형광 이미지
MCF-7 세포를 유리 바닥의 12웰 세포 배양 플레이트에 100,000 세포/웰로 시딩하였다. 1일 후, 염료 라벨링된 입자 5 ㎍과 형광 라벨링된 bec1 펩티드 0.5 ㎍을 혼합하고, 세포는 세럼 프리 배지 하에서 복합체로 서로 다른 기간(1, 2, 3, 6, 12, 24 시간) 동안 처리되었다. 입자로 처리된 세포는 4% PFA 용액으로 15분간 고정시키고, 1x PBS 용액으로 2번 세척하였다. 세포의 핵은 DAPI 용액으로 염색하였다. 이미지는 Delta-vision microscope로 얻었다.
형광 라벨링된 FabBALL을 MCF-7 세포에 처리하여 Bec1 펩티드가 효과적으로 방출되는지 확인하였다. 12시간 후에 녹색 형광 라벨링된 Bec1 펩티드의 형광이 상당한 양으로 확인되었고, 이는 펩티드가 FabBALL로부터 사이토플라즘 내에서 잘 방출되는 것을 보여준다(도 8d).
7. LC3 GFP를 발현하는 MCF-7 세포주의 구축 및 GFP-LC3 puncta의 수의 측정
lipofectamine 2000을 사용하여, LC3-GFP plasmid를 MCF-7 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 MCF-7는 3개월간 G418 800 ㎍/mL로 선택되었다. GFP 발현은 1개월 이상 관찰하여 플라스미드가 적절히 삽입된 것을 확인하였다. LC3-GFP를 발현하는 MCF-7 세포 100,000개를 시딩하였다.
염료 라벨링된 입자 40 ㎍과 bec1 펩티드 4 ㎍을 혼합하고 세럼 프리 배지 하에서 6시간 동안 세포에 처리하였다. 세포는 4% PFA로 고정되고, 핵은 DAPI로 염색되었다. 이미지는 Delta-vision microscope로 얻고, GFP-LC3 puncta의 수를 각 그룹마다 100개 세포에서 측정하였다.
LC3 단백질은 autophagosome의 elongation 과정에 관여하는 바이오마커이고, 오토파지의 진행에 따라 그 발현 수준이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서, GFP puncta의 증가는 오토파지가 성공적으로 유도되었음을 보여준다. Bec1 펩티드만 처리했을 때는 굉장히 적은 GFP puncta가 관찰되었다. 그러나, Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL을 처리했을 때는 많은 양의 GFP puncta가 확인되었다(도 9 c,d).
8. 다양한 암세포주에서의 효과 확인
상기 MCF-7에서의 세포독성 평가와 동일한 방법으로 PC-3, LNCaP, HeLa 세포에서의 세포 독성을 평가하였다.
이들 세포주 모두에서 Bec1 펩티드를 담지한 FabBALL을 처리했을 때 유효한 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 10 내지 12).
<110> LEMONEX INC. <120> ANTICANCER DRUG AND PREPARING METHOD FOR POROUS SILICA PARTICLE <130> 20P07004 <150> US 62/880733 <151> 2019-07-31 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Gly Gly Thr Asn Val Phe Asn Ala Thr Phe His Ile Trp His Ser 1 5 10 15 Gly Gln Phe Gly Thr 20

Claims (22)

  1. 항암 활성 펩타이드가 내장된 다수의 다공성 실리카 입자들을 포함하고, 각 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 다수의 질소 함유기가 위치하며, 상기 질소 함유기 중 적어도 일부에 엽산이 결합되어 있는 항암제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 0.9% 이하에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 11% 이상에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 질소 함유기 중 0.001% 내지 0.3%에 상기 엽산이 결합되어 있는 항암제.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 이황화 결합에 의해 상기 다공성 실리카 입자에 결합되어 있는 항암제.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 불규칙적으로 배치된 다수의 기공을 포함하는 항암제.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 입경이 50 내지 500 nm이고 기공의 직경이 7 내지 25 nm인 항암제.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 길이가 5aa 내지 50aa인 항암제.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 그 말단에 C(GG)n (n은 1 내지 3)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함하는 항암제.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 항암제.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 BET 표면적이 280 m2/g내지 680 m2/g인 항암제.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 활성 펩타이드는 상기 다공성 실리카 입자에 1 : 1 내지 20의 중량비로 내장되는 항암제.
  13. 청구항 1에 있어서, 주사제인 항암제.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 전립선암, 고환암, 음경암, 요도암, 요관암, 신우암, 식도암, 후두암, 위암, 위장관암, 피부암, 각질극 세포종, 난포 암종, 흑색종, 폐암, 소세포 폐암종, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 폐 선암, 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 유두암, 방광암, 간암, 담관암, 골암, 모발 세포암, 구강암, 구순암, 설암, 침샘암, 인두암, 소장암, 결장암, 직장암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 뇌암, 중추신경계암, 복막암, 간세포 암, 호지킨 또는 백혈병인, 항암제.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 외부 표면의 질소 원자의 양이 0.1 mmol/g 이상인, 항암제.
  16. 다공성 실리카 입자의 내부 기공이 계면활성제로 채워진 상태에서 상기 다공성 실리카 입자의 외부 표면에 질소 함유기를 도입시키는 제1단계; 상기 질소 함유기의 적어도 일부에 엽산을 결합시키는 제2단계; 상기 다공성 실리카 입자의 내부 기공을 채우고 있던 상기 계면활성제를 제거하는 제3단계; 및 상기 다공성 실리카 입자에 활성 펩타이드를 내장시키는 제4단계를 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 계면활성제는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride) 및 TMACl(tetramethylammonium chloride)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 활성 펩타이드는 상기 다공성 실리카 입자에 1 : 1 내지 20의 중량비로 결합되는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 엽산은 다공성 실리카 입자 100중량부 대비 0.01 내지 10중량부 처리되는 것인, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  20. 청구항 16에 있어서, 제1단계 이전에, 상기 계면활성제 및 실리카 전구물질을 용매에 넣고 교반하여 기공이 상기 계면활성제로 채워진 소기공 실리카 입자를 제조하는 단계를 더 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 제1단계 이전에, 상기 소기공 실리카 입자를 팽창제와 반응시켜 상기 소기공을 팽창시키는 단계를 더 포함하는, 활성 펩타이드가 내장된 다공성 실리카 입자의 제조방법.
  22. 청구항 16 내지 21 중 어느 한 항의 다공성 실리카 입자의 제조방법을 포함하는 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 항암제의 제조방법.
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