JP7394493B2 - 抗癌剤および多孔性シリカ粒子の製造方法 - Google Patents

抗癌剤および多孔性シリカ粒子の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、抗癌剤および多孔性シリカ粒子の製造方法に関する。
乳癌は世界で最も罹患率が高い癌のひとつであり、癌細胞表面のＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２などのホルモン受容体の発現レベルが診断および治療において非常に重要であることが知られている。それ故に、従来の治療法の１つは、このような受容体またはタンパク質を標的とする抗体を使用することである。しかし、この治療法の効率は細胞表面のバイオマーカーに依存して変化する。このような治療法の代替療法として、オートファジー現象が魅力的な試みとなってきた。
オートファジーは、細胞恒常性の維持または栄養素の補充のために細胞内のタンパク質または細胞小器官を分解する機構である。オートファジーは細胞を健康に維持するのに必須となる機構であるので、不均衡になったオートファジーは細胞の誤作動を引き起こす可能性がある。乳癌などのいくつかの癌はオートファジー欠損であることが知られている。この場合、オートファジーは腫瘍形成と密接に関連している。ＰＩ３ＫＣ３複合体の形成中にオートファジー小体の開始に重要な役割を果たすＢｅｃｌｉｎ１タンパク質は、乳癌の治療に適用するために注目された。特に、１８個のアミノ酸を有するＢｅｃ１ペプチドが確認され、これはＢｅｃｌｉｎ１タンパク質と同様の活性および治療効果を示した。このことから、オートファジー誘導ペプチド、Ｂｅｃ１は乳癌の新しい治療薬候補となった。
しかしながら、ペプチドの疎水性の特性は、ｂｅｃ１ペプチドを乳癌細胞に送達するのに大きな障害となった。この問題を解消するために、ＴＡＴ９、１０などの細胞透過性ペプチドを併用したが、この方法では癌細胞へのｂｅｃ１の標的化された送達を達成することができなかった。
本発明は、抗癌剤を提供することを目的とする。
本発明は、多孔性シリカ粒子の製造方法を提供することを目的とする。
１．抗癌活性ペプチドが組み込まれた多数の多孔性シリカ粒子を含み、各前記多孔性シリカ粒子の外部表面に多数の窒素含有基が位置し、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸が結合している抗癌剤。
２．前記項目１において、前記窒素含有基中の０．９％以下に前記葉酸が結合している抗癌剤。
３．前記項目１において、前記窒素含有基中の１１％以上に前記葉酸が結合している抗癌剤。
４．前記項目１において、前記窒素含有基中の０．００１％～０．３％に前記葉酸が結合している抗癌剤。
５．前記項目１において、前記抗癌活性ペプチドは、二硫化結合によって前記多孔性シリカ粒子に結合している抗癌剤。
６．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は不規則に配置された多数の気孔を含む抗癌剤。
７．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、粒径が５０～５００ｎｍであり、気孔の直径が７～２５ｎｍである抗癌剤。
８．前記項目１において、前記抗癌活性ペプチドは、長さが５ａａ～５０ａａである抗癌剤。
９．前記項目１において、前記抗癌活性ペプチドは、その末端にＣ（ＧＧ）ｎ（ｎは１～３）のアミノ酸配列を有するリンカーを含む抗癌剤。
１０．前記項目１において、前記抗癌活性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗癌剤。
１１．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が２８０ｍ２／ｇ～６８０ｍ２／ｇである抗癌剤。
１２．前記項目１において、前記抗癌活性ペプチドは、前記多孔性シリカ粒子に１：１～２０の重量比で組み込まれる抗癌剤。
１３．前記項目１において、注射剤である抗癌剤。
１４．前記項目１において、前記癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、尿道癌、尿管癌、腎盂癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、胃腸管癌、皮膚癌、角化棘細胞腫、卵胞癌腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳頭癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、骨癌、ヘアリー細胞癌、口腔癌、口唇癌、舌癌、唾液腺癌、咽頭癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、ホジキン又は白血病である抗癌剤。
１５．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、前記外部表面の前記窒素原子の量が０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上である抗癌剤。
１６．多孔性シリカ粒子の内部気孔が界面活性剤で満たされた状態で前記多孔性シリカ粒子の外部表面に窒素含有基を導入する第１ステップと、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸を結合させる第２ステップと、前記多孔性シリカ粒子の前記内部気孔を満たしていた前記界面活性剤を除去する第３ステップと、前記多孔性シリカ粒子に活性ペプチドを組み込む第４ステップとを含む、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
１７．前記項目１６において、前記界面活性剤は、ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＡＢｒ（hexadecyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＰｒＣｌ（hexadecyltrimethylpyridinium chloride）およびＴＭＡＣｌ（tetramethylammonium chloride）からなる群より選択される、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
１８．前記項目１６において、前記活性ペプチドは前記多孔性シリカ粒子に１：１～２０の重量比で結合される、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
１９．前記項目１６において、前記葉酸は、前記多孔性シリカ粒子１００重量部に対して０．０１～１０重量部処理される、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
２０．前記項目１６において、第１ステップの前に、前記界面活性剤及びシリカ前駆物質を溶媒に入れて攪拌して、気孔が前記界面活性剤で満たされた小気孔シリカ粒子を製造するステップをさらに含む、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
２１．前記項目２０において、第１ステップの前に、前記小気孔シリカ粒子を膨張剤と反応させて前記小気孔を膨張させるステップをさらに含む、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
２２．前記項目１６～２１のいずれかに記載の多孔性シリカ粒子の製造方法を含む、前記項目１～１５のいずれかに記載の抗癌剤の製造方法。
本発明の抗癌剤は、抗癌活性ペプチドの癌に対する標的送達能に優れている。
本発明の抗癌剤は、生体内環境で沈殿を形成せず、安定性に非常に優れている。
本発明の抗癌剤は、様々な癌腫に適用することができる。
図１は、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬ及びそれを用いて標的細胞にタンパク質を送達することを示す概略図である。 図２は、本発明の一実施形態による多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図３は、本発明の一実施形態による多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図４は、本発明の一実施形態による多孔性シリカ粒子の製造工程中の小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図５は、本発明の一実施形態による小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図６は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の気孔直径別の顕微鏡写真である。ＤＤＶ（Degradable Delivery Vehicle）は、実施例の粒子であり、括弧内の数字は粒子の直径を、下付き文字の数字は気孔の直径を意味する。例えば、ＤＤＶ（２００）１０は、粒子直径が２００ｎｍ、気孔直径が１０ｎｍである実施例の粒子を意味する。 図７は、ＢＡＬＬ及びペプチドの特性を示すものである。（ａ）はＦａｂＢＡＬＬのＴＥＭ画像である（スケールバー（ｓｃａｌｅ ｂａｒ）＝２００ｎｍ）。（ｂ）はＦａｂＢＡＬＬの流体力学的（hydrodynamic）な粒径分布である。（ｃ）は各表面改質されたＢＡＬＬのゼータ電位である。（ｄ）はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって測定されたＢｅｃ１ペプチドのマススペクトルである。 図８は、ＦａｂＢＡＬＬの特性を示すものである。（ａ）は、放出された４－チオピリドン（３２４ｎｍ）のＵＶ－ｖｉｓ吸収によって測定されたロード効率である。（ｂ）は、蛍光（fluorescence，ｅｘ／ｅｍ：４９２／５１７）によって測定されたフルオレセイン・コンジュゲートＢｅｃ１ペプチドの放出プロファイルである。（ｃ）は、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬで１２時間処理された細胞における局在化（localization）を示す（青：ＤＡＰＩ、緑：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｂｅｃ１、赤：Ｃｙ３ ｌａｂｅｌｌｅｄ ＦａｂＢＡＬＬ、スケールバー＝１５μｍ）。 図９は、ＦａｂＢＡＬＬがオートファジー媒介細胞死を引き起こすことを示すものである。（ａ）は、様々な濃度のＢｅｃ１ペプチドが単独またはＦａｂＢＡＬＬと共に処理された場合のＭＣＦ－７細胞の生存率である。（ｂ）は、様々な濃度のＦａｂＢＡＬＬ、ａｂＢＡＬＬ＋ｂｅｃ１およびＦａｂＢＡＬＬ＋ｂｅｃ１で処理されたＭＣＦ－７細胞の生存率である。（ｃ）は、ＰＢＳ、ｂｅｃ１、ＦａｂＢＡＬＬ、およびＦａｂＢＡＬＬ＋ｂｅｃ１で処理されたＬＣ３－ＧＦＰを発現するＭＣＦ－７細胞の蛍光画像である（青：ＤＡＰＩ、緑：ＧＦＰ、スケールバー＝２０μｍ）。（ｄ）は、各グループのＬＣ３ ｐｕｎｃｔａの数である（ｎ＝１００）。 図１０は、様々な癌細胞株に対する抗癌活性を示すものである。（ａ）は前立腺癌細胞株ＰＣ－３における結果である。 図１１は、様々な癌細胞株に対する抗癌活性を示すものである。（ｂ）は前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰにおける結果である。 図１２は、様々な癌細胞株に対する抗癌活性を示すものである。（ｃ）は卵巣癌細胞株ＨｅＬａにおける結果である。 図１３は、粒子における窒素含有基に対する葉酸の割合による溶液安定性の観察結果である。 図１４は、多孔性シリカ粒子の気孔配置を示す概略図である。 図１５は、実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子のＴＥＭ画像である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は抗癌剤に関する。
本発明の抗癌剤は、抗癌活性ペプチドが組み込まれた多数の多孔性シリカ粒子を含み、各多孔性シリカ粒子の外部表面に多数の窒素含有基が位置し、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸が結合している。
本発明による多孔性シリカ粒子は、抗癌活性ペプチドが組み込まれている。抗癌活性ペプチドは気孔の内部に担持されていてもよい。
例えば、抗癌活性ペプチドは、二硫化結合によって気孔内部に結合することができる。癌細胞は細胞内リソソームにグルタチオン（glutathione）が高濃度で存在するため、癌細胞内で前記二硫化結合が切断されて抗癌活性ペプチドが特異的に放出され得る。
二硫化結合は、例えば、多孔性シリカ粒子の気孔内部の硫黄含有基と抗癌活性ペプチド末端の硫黄含有基との反応によって形成されたものであってもよい。硫黄含有基は、例えば、メルカプト基、メルカプトアルキル基などであってもよい。
多孔性シリカ粒子は、気孔内部の硫黄含有基の割合が高くて、抗癌活性ペプチドの担持率が高いものであってもよい。例えば、気孔内部の硫黄原子の割合が０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上であってもよい。具体的には、０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上、０．２ｍｍｏｌ／ｇ以上、０．３ｍｍｏｌ／ｇ以上などであってもよいが、これらに限定されるものではない。上限は、例えば１ｍｍｏｌ／ｇ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｍｏｌ／ｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇなどであってもよい。これは元素分析によって確認される値であってもよい。
抗癌活性ペプチドは、末端にＣ（ＧＧ）ｎ（ｎは１～３）リンカーを含むことができる。
前記リンカーのＣ（システイン）は二硫化結合をなすのに使用することができ、ＧＧ（ジグリシン）はペプチドの機能には影響を与えずにペプチドが気孔内部から適正な距離を離隔するようにして、多孔性シリカ粒子からより容易に脱離させることができる。
抗癌活性ペプチドは、抗癌活性を有しつつ、二硫化結合を成すことができる官能基を有するか、又はその官能基を結合できるものであればその種類は限定されるものではなく、例えば配列番号１の配列からなるペプチドであってもよい。二硫化結合において、例えば抗癌活性ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン（Ｃ）を有するものであってもよい。
抗癌活性ペプチドとしては、適用しようとする癌種に合った抗癌活性を有するものであれば公知のものも制限なく使用することができる。公知のペプチドが二硫化結合できないものであれば、例えば、その配列のＮ末端またはＣ末端にシステインがさらに結合されたペプチドを使用することができる。
抗癌活性ペプチドの長さは、例えば５ａａ～５０ａａであってもよく、具体的には５ａａ～４０ａａ、５ａａ～３０ａａ、８ａａ～２５ａａ、１０ａａ～２５ａａ、１２ａａ～２５ａａ、１５ａａ～２５ａａなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記長さは、リンカーを含む長さであってもよい。
抗癌活性ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端にＰＫ（pharmacokinetics）の改善のための当該分野で公知の官能基をさらに有するものであってもよい。これは、例えば、脂肪酸、コレステロール、アルキル基、ポリエチレングリコールなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。脂肪酸は、例えば炭素数８～２２の脂肪酸であってもよく、アルキル基は、例えば炭素数１～２０のアルキル基であってもよい。
抗癌活性ペプチドは、２つ以上のペプチドの複合体であってもよい。例えば、二硫化結合などの当分野で公知のリンカーで複数のペプチドが結合されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
抗癌活性ペプチドの粒子への担持割合は、例えば、多孔性シリカ粒子と抗癌活性ペプチドとの重量比が１：１～２０であってもよい。重量比が前記範囲内であると、ペプチドが十分に担持され、ペプチドが担持されていない空の多孔性シリカ粒子が発生することを防止することができる。例えば、前記範囲内で１：１～２０、１：３～２０、１：３～１５、１：５～１５、１：６～１４、１：６～１２、１：６～１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子は、外部表面に葉酸が結合し、癌細胞表面の葉酸受容体に特異的に結合して癌細胞内に移入することができる。
多孔性シリカナノ粒子は、外部表面に窒素含有基を有する。これにより、外部表面に葉酸が結合することができる。
多孔性シリカナノ粒子は、外部表面の窒素含有基の割合が高くてもよい。例えば、外部表面の窒素原子の割合は０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上であってもよい。具体的には、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上、１ｍｍｏｌ／ｇ以上、１．５ｍｍｏｌ／ｇ以上、２ｍｍｏｌ／ｇ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。上限は、例えば１０ｍｍｏｌ／ｇ、５ｍｍｏｌ／ｇ、３ｍｍｏｌ／ｇ、２．５ｍｍｏｌ／ｇなどであってもよい。この値は、元素分析によって確認することができる。
多孔性シリカ粒子は、外部表面ができるだけ前記窒素含有基を有するように前記置換基を導入する化合物を処理して表面改質したものであってもよい。
窒素含有基は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などであってもよい。これは、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面のシラノール基にアミノアルキル基を結合して生成したものであってもよい。アミノアルキル基は、例えばアミノプロピル基であってもよい。窒素含有基は、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面に前記窒素含有基を有するアルコキシシランを処理して行うことができる。具体的には、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などであってもよい。
窒素含有基を有する化合物は、例えば、多孔性シリカ粒子１００重量部に対して０．１～１０重量部、具体的には０．１～５重量部、より具体的には１～５重量部、さらに具体的には１～３重量部処理したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子の外部表面の葉酸は、外部表面の窒素含有基の少なくとも一部に結合している。これにより、多孔性シリカ粒子が沈殿を形成することなく、優れた分散安定性を示すことができる。例えば、窒素含有基中の０．９％以下または１１％以上に結合していてもよい。具体的には、葉酸は窒素含有基中の０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下に結合していてもよい。その場合、下限は、例えば０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０３％、０．０５％などであってもよいが、これらに限定されるものではない。葉酸は前記上下限のすべての可能な組み合わせを満たすように結合することができる。また、具体的に葉酸は、窒素含有基中の１１％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上に結合していてもよい。上限は１００％であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記の結合割合は、例えば、葉酸の処理量を変えることによって調整することができる。
前記の結合割合は、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面に導入された窒素含有基の量に対する反応時に添加された葉酸の量で計算することができる。例えば、窒素含有基の量は元素分析によって導出される量であってもよい。具体例としては、元素分析の結果、多孔性シリカ粒子の外部表面の窒素原子の割合が２．１ｍｍｏｌ／ｇである場合、葉酸の割合を窒素含有基の０．１％（モル比）にするために、粒子５０ｍｇに０．０４６ｍｇの葉酸を添加して反応させることができるが、これに限定されるものではない。
葉酸と窒素含有基の結合は、例えばアミド結合であってもよく、具体的にはＥＤＣカップリングによるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子はシリカ（ＳｉＯ２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有することができる。
多孔性シリカ粒子は多孔性粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面及び／又は気孔の内部に抗癌活性ペプチドを担持することができる。
多孔性シリカ粒子の気孔は、不規則に配置されていてもよい。通常の多孔性シリカ粒子は規則的な気孔構造（ordered pore structure）を有するが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は、不規則な気孔構造（non－ordered pore structure）を有するものであってもよい。これにより、抗癌活性ペプチドが排出される経路がより不規則で長くなり、ペプチドをより徐放的に放出できる。多孔性シリカ粒子は、例えば図１４、図１５に示すような不規則な気孔配置を有することができるが、これに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が７～２５ｎｍであってもよい。平均気孔直径は、前記範囲内で、例えば７～２５ｎｍ、前記範囲内で、例えば７～２５ｎｍ、７～２３ｎｍ、１０～２５ｎｍ、１３～２５ｎｍ、７～２０ｎｍ、７～１８ｎｍ、１０～２０ｎｍ、１０～１８ｎｍなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子の粒径は、例えば５０～５００ｎｍであってもよい。前記範囲内で、例えば５０～５００ｎｍ、５０～４００ｎｍ、５０～３００ｎｍ、１００～４５０ｎｍ、１００～４００ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１５０～４００ｎｍ、１５０～３５０ｎｍ、２００～４００ｎｍ、２００～３５０ｎｍ、２５０～４００ｎｍ、１８０～３００ｎｍ、１５０～２５０ｎｍなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子のＢＥＴ表面積は、例えば２８０～６８０ｍ２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で、２８０ｍ２／ｇ～６８０ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～６００ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～５００ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～４００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～４５０ｍ２／ｇ、３５０ｍ２／ｇ～４５０ｍ２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子は、気孔のｇ当たりの体積が例えば０．７ｍｌ～２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ～２．０ｍｌ、０．８ｍｌ～２．２ｍｌ、０．８ｍｌ～２．０ｍｌ、０．９ｍｌ～２．０ｍｌ、１．０ｍｌ～２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。ｇ当たりの体積が小さすぎると、分解速度が速くなりすぎることがあり、大きすぎると、製造が困難であるか、完全な形状を有しないことがある。
多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径５ｎｍ未満の小気孔粒子の気孔が平均直径７～２５ｎｍに拡張されたものであってもよい。これにより、気孔直径が大きくなって、大きいか長いペプチドを気孔内部に担持することができ、気孔直径に比べて粒径自体は大きくないため、細胞内への送達及び吸収が容易である。
前記抗癌活性ペプチドと葉酸の結合は、気孔内部に界面活性剤が満たされている多孔性シリカ粒子の外部表面を、窒素含有基を有するように改質するステップと、前記窒素含有基に葉酸を結合させるステップと、多孔性シリカ粒子の気孔内部の界面活性剤を除去するステップと、気孔内部に抗癌活性ペプチドを二硫化結合で結合させるステップと、を含むことができる。
多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよい。前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌及び均質化して得られるものであってもよく、気孔拡張は、前記の得られた小気孔粒子に気孔膨張剤を処理して行われてもよい。
この場合、気孔内部に界面活性剤が満たされた状態で粒子が得られるが、このとき、気孔の外部表面を、窒素含有基を有するように改質することができる。これは前述のように、窒素含有基を有する化合物を処理して行われてもよい。気孔内部に界面活性剤が満たされた状態で表面改質を行うことにより、気孔内部ではなく気孔外部のみが窒素含有基を有するように改質することができる。
その後、多孔性シリカ粒子に葉酸を処理することで、前記窒素含有基に葉酸に結合させることができる。
例えば、葉酸は前述の割合を満たすように処理することができる。
その後、気孔内部に抗癌活性ペプチドを結合させるために、気孔内部の界面活性剤を除去する。
気孔内部の界面活性剤は、例えば酸処理によって行うことができる。具体的には、酸を含むアルコールで処理して行うことができる。酸は、例えば塩酸であってもよいが、これに限定されるものではない。
アルコールは、例えば炭素数１～３のアルコールであってもよく、具体的にはエタノールであってもよい。
酸処理は撹拌下で行うことができ、例えば４～２４時間、具体的には８～２４時間、より具体的には１２～２０時間行うことができる。
酸処理は加熱下で行うことができ、例えば８０℃～１５０℃、具体的には９０℃～１３０℃で行うことができる。
その後、気孔内部に抗癌活性ペプチドを二硫化結合で結合させる。
二硫化結合の形成のために、多孔性シリカ粒子は、気孔内部が硫黄含有基を有するように改質されたものであってもよい。これは、例えば硫黄含有基を有する化合物を処理して行われてもよい。これは硫黄含有基を有するアルコキシシランであってもよく、具体的には（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3－Mercaptopropyl)trimethoxysilane）であってもよいが、これに限定されるものではない。
これに硫黄含有基を有する抗癌活性ペプチドを処理すると、二硫化結合が形成されながら抗癌活性ペプチドが結合できる。
抗癌活性ペプチドの結合は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子と抗癌活性ペプチドを混合して行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
また、前記溶媒としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、ホウ酸塩－緩衝食塩水（Borate－buffered saline）、トリス－緩衝食塩水（Tris－buffered saline）などを使用することもできる。
表面改質は、例えば溶媒に分散した多孔性シリカ粒子を前述の化合物と反応させて行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他のジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子の前述した化合物との反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃～１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃～１６０℃、８０℃～１５０℃、１００℃～１６０℃、１００℃～１５０℃、１１０℃～１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子の前述した化合物との反応は、例えば４時間～２０時間、例えば、前記範囲内で４時間～１８時間、４時間～１６時間、６時間～１８時間、６時間～１６時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
各工程間では洗浄を行うことができる。
前記洗浄は水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、具体的には３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
粒子の製造方法の具体例は以下の通りである。
前記小気孔の粒子は、例えば平均気孔直径が１ｎｍ～５ｎｍの粒子であってもよい。
前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌して得ることができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他のジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７～１．５の体積比、例えば１：０．８～１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる。
前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ～１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ～８ｇ、２ｇ～８ｇ、３ｇ～８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）、ＴＥＯＳ（テトラエチルオルソシリケート）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記攪拌は、例えば１０分～３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～４ｍｌ、０．５ｍｌ～３ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。
前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～３ｍｌ、２ｍｌ～３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間～１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間～１５時間、４時間～１５時間、４時間～１３時間、５時間～１２時間、６時間～１２時間、６時間～１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。
前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間～２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間～２０時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１６時間、１０時間～１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
その後、反応産物を洗浄及び乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他のジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
先に例示した方法により製造される粒子は、その表面及び気孔内部に、反応に用いられた残留有機物質（界面活性剤など）が残っていることがあるので、それを除去するために洗浄が行われるものであり得る。通常、この有機物質の除去のために、酸処理（または酸性の有機溶媒処理）を行うことができるが、本発明は、この酸処理を行わないため、洗浄後も気孔内部に残留有機物質が残っているものであり得る。
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されず、真空状態で行うこともできる。
その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張することができる。気孔の拡張は、小気孔シリカ粒子を気孔膨張剤と反応させて行うことができる。
前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ－ジメチルヘキサデシルアミン（N,N－dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。
前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。
前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ～２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ～１５０ｇ、１０ｇ～１００ｇ、３０ｇ～１００ｇ、４０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～８０ｇ、６０ｇ～８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。
前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０～２００体積部、前記範囲内で１０～１５０体積部、１０～１００体積部、１０～８０体積部、３０～８０体積部、３０～７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、例えば１２０℃～１９０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃～１９０℃、１２０℃～１８０℃、１２０℃～１７０℃、１３０℃～１７０℃、１３０℃～１６０℃、１３０℃～１５０℃、１３０℃～１４０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、例えば６時間～９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間～９６時間、３０時間～９６時間、３０時間～８０時間、３０時間～７２時間、２４時間～８０時間、２４時間～７２時間、３６時間～９６時間、３６時間～８０時間、３６時間～７２時間、３６時間～６６時間、３６時間～６０時間、４８時間～９６時間、４８時間～８８時間、４８時間～８０時間、４８時間～７２時間、６時間～９６時間、７時間～９６時間、８時間～８０時間、９時間～７２時間、９時間～８０時間、６時間～７２時間、９時間～９６時間、１０時間～８０時間、１０時間～７２時間、１２時間～６６時間、１３時間～６０時間、１４時間～９６時間、１５時間～８８時間、１６時間～８０時間、１７時間～７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。
前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分～１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～１５℃／分、３℃／分～１５℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、攪拌下で行うことができる。例えば１００ｒｐｍ以上の速度で攪拌することができ、具体的には１００ｒｐｍ～１，０００ｒｐｍの速度で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記反応後は、反応液を徐々に冷却することができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分～２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～２０℃／分、３℃／分～２０℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
本発明の抗癌剤は、担持された抗癌活性ペプチドを体内に安定的に送達し、癌細胞内でターゲットに放出することができる。
本発明の抗癌剤の対象となる癌は、表面に葉酸受容体を過剰発現する全ての癌であり、例えば、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、泌尿生殖器癌、睾丸腫、食道癌、喉頭癌、胃癌、胃腸管癌、皮膚癌、角化棘細胞腫、卵胞癌腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳頭癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、腎臓、骨癌、骨髄疾患、リンパ系疾患、ヘアリー細胞癌、口腔及び咽頭（経口）癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、ホジキン、白血病などであってもよいが、これらに制限されるものではない。
前記癌は、抗癌剤耐性癌であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の抗癌剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
本発明の抗癌剤は、いずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。より具体的には、本発明の抗癌剤は注射剤であってもよい。本発明の抗癌剤は生体環境、血液等で沈殿を形成しないものであり、薄い注射針でも投与可能であるので、注射剤製剤である場合に特に好ましく用いることができる。
本発明の抗癌剤は、薬学的に有効な量で投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の薬学的組成物は、個々の治療剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
本発明の抗癌剤の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の送達体の具体的な効能程度によって異なり得る。例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ～１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりに一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
本発明の抗癌剤は、同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。
また、本発明の抗癌剤は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当該分野で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。
また、本発明は、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法に関する。
本発明の方法は、多孔性シリカ粒子の内部気孔が界面活性剤で満たされた状態で前記多孔性シリカ粒子の外部表面に窒素含有基を導入する第１ステップと、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸を結合させる第２ステップと、前記多孔性シリカ粒子の内部気孔を満たしていた前記界面活性剤を除去する第３ステップと、前記多孔性シリカ粒子に活性ペプチドを組み込む第４ステップとを含む。
第１ステップでは、多孔性シリカ粒子の内部気孔が界面活性剤で満たされた状態で、前記多孔性シリカ粒子の外部表面に窒素含有基を導入する。
界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる
気孔内部に界面活性剤が満たされた状態で表面改質を行うことにより、気孔内部ではなく気孔外部のみが窒素含有基を有するように改質することができる。
窒素含有基は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などであってもよい。これは、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面のシラノール基にアミノアルキル基を結合して生成したものであってもよい。アミノアルキル基は、例えばアミノプロピル基であってもよい。窒素含有基は、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面に前記窒素含有基を有するアルコキシシランを処理して行うことができる。具体的には、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などであってもよい。
窒素含有基を有する化合物は、例えば、多孔性シリカ粒子１００重量部に対して０．１～１０重量部、具体的には０．１～５重量部、より具体的には１～５重量部、さらに具体的には１～３重量部処理したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
多孔性シリカ粒子は、前述の方法で製造されたものであってもよい。本発明の方法は、前述の多孔性シリカ粒子を製造するステップをさらに含むことができる。
多孔性シリカ粒子は、前述の仕様を有するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
第２ステップでは、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸を結合させる。
外部表面に窒素含有基を有する多孔性シリカ粒子を葉酸と反応させると、葉酸を窒素含有基に結合させることができる。
葉酸は、例えば、窒素含有基中の０．９％以下または１１％以上に結合していてもよい。具体的には、葉酸は窒素含有基中の０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下に結合していてもよい。その場合、下限は例えば０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０３％、０．０５％などであってもよいが、これらに限定されるものではない。葉酸は前記上下限のすべての可能な組み合わせを満たすように結合することができる。また、具体的には葉酸は、窒素含有基中の１１％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上に結合していてもよい。上限は１００％であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記の結合割合は、例えば葉酸の処理量を変えることによって調整することができる。
前記の結合割合は、例えば、多孔性シリカ粒子の外部表面に導入された窒素含有基の量に対する反応時に添加された葉酸の量で計算することができる。例えば、窒素含有基の量は元素分析によって導出された量であってもよい。
葉酸は、例えば、多孔性シリカ粒子１００重量部に対して０．００１～２００重量部、具体的には０．００１～１００重量部、０．００１～５０重量部、０．００１～３０重量部、０．００１～１０重量部、０．００１～５重量部、０．００１～３重量部、０．００１～１重量部、０．００１～０．５重量部、０．０１～１０重量部、０．０１～５重量部、０．０１～３重量部、０．０１～２重量部、０．１～１０重量部、０．１～５重量部、０．１～３重量部、０．１～２重量部、１０～２００重量部、１０～１５０重量部、１０～１００重量部、２０～２００重量部、２０～１５０重量部、２０～１００重量部、２０～５０重量部、３０～２００重量部、３０～１５０重量部、３０～１００重量部、５０～２００重量部、５０～１５０重量部、５０～１００重量部などの量で処理できるが、これらに限定されるものではない。
第３ステップでは、前記多孔性シリカ粒子の内部気孔を満たしていた前記界面活性剤を除去する。
気孔内部の界面活性剤は、例えば酸処理によって行うことができる。具体的には、酸を含むアルコールで処理して行うことができる。酸は、例えば塩酸であってもよいが、これらに限定されるものではない。
アルコールは、例えば炭素数１～３のアルコールであってもよく、具体的にはエタノールであってもよい。
酸処理は撹拌下で行うことができ、例えば４～２４時間、具体的には８～２４時間、より具体的には１２～２０時間行うことができる。
酸処理は加熱下で行うことができ、例えば８０℃～１５０℃、具体的には９０℃～１３０℃で行うことができる。
第４ステップでは、前記多孔性シリカ粒子に活性ペプチドを組み込む。
活性ペプチドは、例えば気孔内部に二硫化結合で結合させることができる。
二硫化結合の形成のために、多孔性シリカ粒子は、気孔内部が硫黄含有基を有するように改質されたものであってもよい。これは、例えば硫黄含有基を有する化合物を処理して行われてもよい。これは硫黄含有基を有するアルコキシシランであってもよく、具体的には（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。
これに硫黄含有基を有する活性ペプチドを処理すると、二硫化結合が形成されながら抗癌活性ペプチドが結合することができる。
活性ペプチドの結合は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子と活性ペプチドを混合することによって行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、ホウ酸塩－緩衝食塩水（Borate－buffered saline）、トリス－緩衝食塩水（Tris－buffered saline）などを使用することもできる。
表面改質は、例えば溶媒に分散した多孔性シリカ粒子を前述の化合物と反応させて行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他のジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子の前述した化合物との反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃～１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃～１６０℃、８０℃～１５０℃、１００℃～１６０℃、１００℃～１５０℃、１１０℃～１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子の前述した化合物との反応は、例えば４時間～２０時間、例えば、前記範囲内で４時間～１８時間、４時間～１６時間、６時間～１８時間、６時間～１６時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
各工程間では洗浄を行うことができる。
前記洗浄は水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
実施例
実施例１．多孔性シリカ粒子
１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
２）気孔の拡張
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１～１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１７．２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
（２）多孔性シリカ粒子の製造
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（３）多孔性シリカ粒子の製造（１０Ｌスケール）
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（４）多孔性シリカ粒子の製造（粒径３００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（５）多孔性シリカ粒子の製造（粒径５００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（６）多孔性シリカ粒子の製造（粒径１，０００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（７）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径４ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（８）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（９）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径１７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（１０）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径２３ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（１１）多孔性シリカ粒子の製造
小気孔粒子の製造時に蒸留水９００ｍｌ、メタノール８５０ｍｌ、ＣＴＡＢ ８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
２．粒子の形成及び気孔拡張の確認
実施例１－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図２～５）。
図２は、実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図３は、実施例１－１－（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
図４は、実施例１－１－（１）の小気孔粒子の写真、図５は、実施例１－１－（１）と１－１－（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
３．気孔直径及びＢＥＴ表面積の計算
実施例１－１－（１）の小気孔粒子、実施例１－１－（１）、（７）、（８）、（１０）、（１１）の多孔性シリカ粒子の表面積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer－Emmett－Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔直径の分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett－Joyner－Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真を図６に、計算の結果を下記表１に示す。
４．表面改質
実施例１－１－（１）の１００ｍｇのナノ粒子（ＢＡＬＬ）を１０ｍＬのトルエンに分散し、１１０℃に加熱した。温度が１１０℃に達した時点で、２ｍｌの３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を添加し、１６時間還流した。１５分間８５００ｒｐｍで遠心分離して粒子（ａＢＡＬＬ、ＢＡＬＬに窒素含有基を結合）を得、エタノール及び蒸留水で交互に２回洗浄した。
沈殿物を得、エタノール下で葉酸０．１ｍｇ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１．２ｍｇ、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル)－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２ｍｇと反応させた。
１５分間８５００ｒｐｍで遠心分離して粒子（ＦａＢＡＬＬ、ａＢＡＬＬに葉酸を結合）を得、エタノール及び蒸留水で交互に１０回洗浄した。
得られた粒子をＨＣｌ／塩酸溶液（１：５ｖ／ｖ）に移し、１１０℃で１６時間還流した。１５分間８５００ｒｐｍで遠心分離してＣＴＡＢが除去された粒子を得、エタノール及び蒸留水で交互に１０回洗浄した。
得られた粒子を１０ｍＬトルエンに分散し、１１０℃に加熱した。温度が１１０℃に達したとき、１ｍｌの３－メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）を添加し、１６時間還流した。１５分間８５００ｒｐｍで遠心分離して粒子（ＦａｂＢＡＬＬ、ＦａＢＡＬＬにメルカプトプロピル基を結合、気孔内部の硫黄原子の割合は０．３ｍｍｏｌ／ｇ）を得、エタノール及び蒸留水で交互に１０回洗浄した。
５．粒子特性の評価
得られたＦａｂＢＡＬＬをＴＥＭで観察し、粒径を測定した。そして、各ＢＡＬＬのゼータ電位を測定した（図７）。
６．葉酸量の評価
図１３に示すように、葉酸の処理量を変えた以外は実施例１－４の方法と同様にして表面改質を行い、粒子の沈殿が生じるかどうかを確認した。
粒子の窒素含有基（アミノプロピル基）に対する葉酸の量を０％、０．０１％、０．１％、１％、１０％及び１００％とした。これは葉酸の添加量を変えて調整した。具体的には、元素分析によりアミノプロピル基の導入量を確認し（窒素原子の割合は２．１ｍｍｏｌ／ｇ）、窒素含有基に対する葉酸のモル比を１：１（１００％）、１０：１（１０％）、 １００：１（１％）、１０００：１（０．１％）、１００００：１（０．０１％）にするために、粒子１２ｍｇに葉酸をそれぞれ１９ｍｇ、１．９ｍｇ、０．１９ｍｇ、０．０１９ｍｇ、０．００１９ｍｇ添加し、ＥＤＣをそれぞれ４１ｍｇ、４．１ｍｇ、０．４１ｍｇ、０．０４１ｍｇ、０．００４１ｍｇ添加し、ＮＨＳは２５ｍｇ、２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．００２５ｍｇ添加した。
改質して得られた粒子をＰＢＳに８ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、葉酸量が１％、１０％の場合には沈殿が形成された。
７．粒子の染料標識
実施例１－２で得られた粒子１０ｍｇを水１ｍｌに浮遊し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｙｌ ｅｓｔｅｒ）－活性（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３－ＮＨＳ）２０μｇを混合した。混合液は攪拌下で１６時間反応させた。非反応の蛍光染料は、エタノールおよび水で１０回洗浄して除去した。乾燥して染料標識された粒子を得、水に再分散した。
８．細胞の培養
ＭＣＦ－７細胞（autophagy deficient breast cancer cell overexpressing folate receptor）を、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン溶液および１０％ ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum、FBS）を混合したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
９．細胞内流入の評価
ＦａｂＢＡＬＬおよびａｂＢＡＬＬのＭＣＦ－７細胞へのエンドサイトーシス（endocytosis）効率の差を評価した。染料標識されたＦａｂＢＡＬＬおよびａｂＢＡＬＬをＭＣＦ－７細胞に処理し、蛍光強度を評価した。平均蛍光強度はＦａｂＢＡＬＬの方がａｂＢＡＬＬよりも２倍高かった（図８ｃ）。
実施例２．ペプチドのロード及び放出
１．ペプチドの合成
Ｂｅｃ１ペプチド（ＣＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧＴ、配列番号１）をリンクアミドレジン（Rink amide resin）を用いて、固相（solid－phase）合成法により合成した。蛍光標識のために、３ｅｑのフルオレセイン（fluorescein）、３ｅｑのＮＨＳおよび３ｅｑのＥＤＣをペプチドに添加した。得られたペプチドはＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ質量分析（Mass spectrometry）で確認した。
２．ロード効率の測定
過剰量の４，４－ジピリジルジスルフィド（4,4-dipyridyldisufide）を実施例１－２－５の粒子に添加し、エタノールで３回洗浄した。その後、互いに異なる量の粒子を２０％ＤＭＳＯ溶液下の固定量のＢｅｃ１ペプチドに添加し、１時間反応させた。１５分間８５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を得、３２４ｎｍにおける吸光度を測定した。残りのペプチドの濃度は、４－チオピリドン（4-thiopyridone）の標準曲線（standard curve）と比較して計算した。ペプチドは、ＦａｂＢＡＬＬに約１０％ｗ／ｗだけロードされた（図８ａ）。
３．ペプチドの放出
実施例１－２－４の粒子１００μｇと蛍光標識されたＢｅｃペプチド１０μｇを、異なる濃度のＧＳＨを有する１６０μｌの１×ＰＢＳ中で混合した。ＤＭＳＯの４０μｌを添加してＢｅｃ１ペプチドを溶解し、蛍光強度を測定した。放出されるペプチドの量は、Ｂｅｃ１ペプチドの最初の蛍光に基づいて計算した。
ＧＳＨが存在しないときは、１２時間の間、３％以下のペプチドのみが放出されたが、１０ｍＭまたは２ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下では、ペプチドがＦａｂＢＡＬＬから１２時間以内に３０％多く放出された（図８ｂ）。これは、ペプチドの放出が還元環境に依存し、サイトプラズム内でさらに促進されることを示している。
４．細胞毒性の評価
ＭＣＦ－７細胞を９６ウェル細胞培養プレートに１０，０００細胞／ウェルで播種（seeding）した。１日後、異なる濃度の各粒子（４～５００μｇ／ｍＬ）を各ウェルで血清含有培地で１日間処理した。その後、培地をＭＴＴアッセイキット（assay kit）１０μｌを含有する無血清培地に交換して４時間培養し、上澄液をアスピレーションした。各ウェルにＤＭＳＯを加えてホルマザンを溶解し、１時間反応させた。吸光度は５７０ｎｍ波長で測定し、細胞生存率は非処理群との相対値として計算した。
細胞生存率は、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬとＢｅｃ１ペプチドをＭＣＦ－７細胞に処理した後、ＭＴＴアッセイで比較した。Ｂｅｃ１ペプチドのみを処理した場合には、細胞生存率は非処理群と比較して大きく変化しなかった。これに対して、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬを処理した場合には、細胞生存率が大幅に減少した（図９ａ、ｂ）。ＦａｂＢＡＬＬは、Ｂｅｃ１ペプチドの標的送達に高い効率を示すことを確認した。
５．細胞内ペプチドの放出測定のための細胞の蛍光画像
ＭＣＦ－７細胞をガラス底の１２ウェル細胞培養プレートに１００，０００細胞／ウェルで播種した。１日後、染料標識された粒子５μｇと蛍光標識されたｂｅｃ１ペプチド０．５μｇを混合し、細胞は無血清培地下で複合体で互いに異なる期間（１、２、３、６、１２、２４時間）処理された。粒子で処理された細胞を４％ＰＦＡ溶液で１５分間固定し、１ｘＰＢＳ溶液で２回洗浄した。細胞の核はＤＡＰＩ溶液で染色した。画像はデルタビジョン顕微鏡（Delta－vision microscope）から得た。
蛍光標識されたＦａｂＢＡＬＬをＭＣＦ－７細胞に処理し、Ｂｅｃ１ペプチドが効果的に放出されるかを確認した。１２時間後、緑色蛍光標識されたＢｅｃ１ペプチドの蛍光がかなりの量で確認された。これはペプチドがＦａｂＢＡＬＬからサイトプラズム内で良好に放出されることを示す（図８ｄ）。
６．ＬＣ３ ＧＦＰを発現するＭＣＦ－７細胞株の構築およびＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａの数の測定
リポフェクタミン（lipofectamine）２０００を用いて、ＬＣ３－ＧＦＰプラスミドをＭＣＦ－７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＭＣＦ－７は、３ヶ月間Ｇ４１８の８００μｇ／ｍＬで選択された。ＧＦＰの発現は、１ヶ月以上観察し、プラスミドが適切に挿入されたことを確認した。ＬＣ３－ＧＦＰを発現するＭＣＦ－７細胞を１００，０００個播種した。
染料標識された粒子４０μｇとｂｅｃ１ペプチド４μｇを混合し、無血清培地下で細胞に６時間処理した。細胞を４％ＰＦＡで固定し、核をＤＡＰＩで染色した。画像はデルタビジョン顕微鏡（Delta－vision microscope）から得、ＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａの数を各群ごとに１００個の細胞で測定した。
ＬＣ３タンパク質はオートファゴソーム（autophagosome）のエロンゲーション（elongation）過程に関与するバイオマーカーであり、オートファジーの進行によってその発現レベルが増加することが知られている。この観点から、ＧＦＰ ｐｕｎｃｔａの増加は、オートファジーが首尾よく誘導されたことを示す。Ｂｅｃ１ペプチドのみを処理した場合には、非常に少ないＧＦＰ ｐｕｎｃｔａが観察された。これに対して、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬを処理した場合には、多量のＧＦＰ ｐｕｎｃｔａが確認された（図９ｃ、ｄ）。
７．様々な癌細胞株における効果の確認
前記ＭＣＦ－７における細胞毒性の評価と同様の方法で、ＰＣ－３、ＬＮＣａＰ、ＨｅＬａ細胞における細胞毒性を評価した。
これらの細胞株の全てにおいて、Ｂｅｃ１ペプチドを担持したＦａｂＢＡＬＬを処理した場合に有効な効果が示されることを確認した（図１０～１２）。

Claims (20)

  1. 抗癌活性ペプチドが組み込まれた多数の多孔性シリカ粒子を含み、各前記多孔性シリカ粒子の外部表面に多数の窒素含有基が位置し、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸が結合し、
    前記多孔性シリカ粒子は、粒径が５０～５００ｎｍであり、気孔の直径が７～２５ｎｍであり、
    前記抗癌活性ペプチドの長さは、５ａａ～５０ａａであることを特徴とする抗癌剤。
  2. 前記窒素含有基中の０．９％以下に前記葉酸が結合している、請求項１に記載の抗癌剤。
  3. 前記窒素含有基中の１１％以上に前記葉酸が結合している、請求項１に記載の抗癌剤。
  4. 前記窒素含有基中の０．００１％～０．３％に前記葉酸が結合している、請求項１に記載の抗癌剤。
  5. 前記抗癌活性ペプチドは、二硫化結合によって前記多孔性シリカ粒子に結合している、請求項１に記載の抗癌剤。
  6. 前記多孔性シリカ粒子は、不規則に配置された多数の気孔を含む、請求項１に記載の抗癌剤。
  7. 前記抗癌活性ペプチドは、その末端にＣ（ＧＧ）ｎ（ｎは１～３）のアミノ酸配列を有するリンカーを含む、請求項１に記載の抗癌剤。
  8. 前記抗癌活性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗癌剤。
  9. 前記多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が２８０ｍ２／ｇ～６８０ｍ２／ｇである、請求項１に記載の抗癌剤。
  10. 前記抗癌活性ペプチドは、前記多孔性シリカ粒子に１：１～２０の重量比で組み込まれる、請求項１に記載の抗癌剤。
  11. 注射剤である、請求項１に記載の抗癌剤。
  12. 前記癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、尿道癌、尿管癌、腎盂癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、胃腸管癌、皮膚癌、角化棘細胞腫、卵胞癌腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、乳頭癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、骨癌、ヘアリー細胞癌、口腔癌、口唇癌、舌癌、唾液腺癌、咽頭癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、ホジキン又は白血病である、請求項１に記載の抗癌剤。
  13. 前記多孔性シリカ粒子は、前記外部表面の前記窒素原子の量が０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上である、請求項１に記載の抗癌剤。
  14. 多孔性シリカ粒子の内部気孔が界面活性剤で満たされた状態で前記多孔性シリカ粒子の外部表面に窒素含有基を導入する第１ステップと、前記窒素含有基の少なくとも一部に葉酸を結合させる第２ステップと、前記多孔性シリカ粒子の前記内部気孔を満たしていた前記界面活性剤を除去する第３ステップと、前記多孔性シリカ粒子に活性ペプチドを組み込む第４ステップとを含み、
    前記多孔性シリカ粒子は、粒径が５０～５００ｎｍであり、気孔の直径が７～２５ｎｍであり、
    前記活性ペプチドの長さは、５ａａ～５０ａａであることを特徴とする、活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  15. 前記界面活性剤は、ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＡＢｒ（hexadecyltrimethylammonium bromide）、ＴＭＰｒＣｌ（hexadecyltrimethylpyridinium chloride）およびＴＭＡＣｌ（tetramethylammonium chloride）からなる群より選択される、請求項１４に記載の活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  16. 前記活性ペプチドは、前記多孔性シリカ粒子に１：１～２０の重量比で結合する、請求項１４に記載の活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  17. 前記葉酸は、前記多孔性シリカ粒子１００重量部に対して０．０１～１０重量部処理される、請求項１４に記載の活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  18. 第１ステップの前に、前記界面活性剤およびシリカ前駆物質を溶媒に入れて撹拌し、気孔が前記界面活性剤で満たされた小気孔シリカ粒子を製造するステップをさらに含む、請求項１４に記載の活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  19. 第１ステップの前に、前記小気孔シリカ粒子を膨張剤と反応させて前記小気孔を膨張させるステップをさらに含む、請求項１８に記載の活性ペプチドが組み込まれた多孔性シリカ粒子の製造方法。
  20. 請求項１４～１９のいずれか一項に記載の多孔性シリカ粒子の製造方法を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗癌剤の製造方法。
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