KR101797569B1 - 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101797569B1
KR101797569B1 KR1020150037342A KR20150037342A KR101797569B1 KR 101797569 B1 KR101797569 B1 KR 101797569B1 KR 1020150037342 A KR1020150037342 A KR 1020150037342A KR 20150037342 A KR20150037342 A KR 20150037342A KR 101797569 B1 KR101797569 B1 KR 101797569B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sirna
aunp
glycol chitosan
present
Prior art date
Application number
KR1020150037342A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160112164A (ko
Inventor
이용규
강성훈
이상준
박인규
조광재
너루나비 모하메드
Original Assignee
한국교통대학교산학협력단
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국교통대학교산학협력단, 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 한국교통대학교산학협력단
Priority to KR1020150037342A priority Critical patent/KR101797569B1/ko
Priority to US15/074,443 priority patent/US9669103B2/en
Publication of KR20160112164A publication Critical patent/KR20160112164A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101797569B1 publication Critical patent/KR101797569B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체, 이의 제조방법, 및 상기 핵산 전달체을 포함하는 간질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 간 조직 표적성이 매우 우수하며, 소화관을 통한 흡수율이 매우 높다. 또한, 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체에서 핵산은 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 체내 효소 등의 분해로부터 보호될 수 있다. 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 경구투여용 간질환 치료제로 개발될 수 있다.

Description

금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법{Liver Targeting Metal Nano-particle Based Nucleic Acid Delivery System And Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암에 대해 수술, 방사선 치료법, 화학 치료법, 면역 요법 또는 유전자 치료법 등 다양한 치료 방법이 연구되고 있다. 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 이용한 치료법은 siRNA가 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA induced silencing complex, RISC)의 mRNA에 결합하여 분해시킴으로써 특정 단백질의 발현을 저해 하는 것을 이용한 치료법이다[7, 9]. siRNA를 이용한 치료법은 적은 양으로도 타겟 mRNA의 발현을 효과적으로 저해하는 성질을 가지고 있어 유전자 관련 질병 치료에 다양한 가능성을 가지고 있다[4, 5]. 그러나 siRNA는 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있으며 음이온성의 성질이 있어서 음전하성의 세포막을 투과하기가 어려워 세포내로의 전달성이 떨어지는 단점이 있다[7, 9, 10, 16]. 상기의 문제를 해결하기 위해 바이러스 전달체를 이용한 기술이 대두 되었는데, 이 기술은 비특이적 면역 반응 등의 위험성이 있으며, 생산 공정이 복잡하여 상용화에 문제점이 있다. 따라서, 양이온성 지질 또는 고분자물질을 이용한 전달체와 같은 비바이러스성 전달체가 각광 받고 있다. 상기 비바이러스성 전달체들은 생체 내 안정성이 높고 생산 공정이 쉬워 가격이 저렴하다는 장점이 있다. 그러나 siRNA는 크기가 작고 단단하며 약음이온(weak anion)성질을 가지고 있어서 고분자 복합체(polymer complex)를 형성하기 어려운 단점이 있다[10, 13].
상기 siRNA의 단점을 해결하기 위한 수단으로 금 나노입자(gold nano particle)와 같은 나노구조체가 주목받고 있다. 금 나노입자는 생체적합성이 좋으며 합성이 간단하고 크기 조절 및 표면개질(surface modification)이 용이한 장점이 있다[7].
siRNA의 말단을 티올기(thiol group)로 개질(modification)하면 금 나노입자와 쉽게 결합 할 수 있다. siRNA를 개질하여 금 나노입자와 결합시키면 siRNA가 금 나노입자의 표면에 응축되면서 siRNA 특유의 단단함 또는 약음이온성성질이 해소되어 고분자 복합체를 용이하게 제조할 수 있다[6, 14].
양이온성 고분자를 siRNA 복합체에 사용하면 생체내에서 siRNA의 분해를 막고 음이온성 세포막의 투과도를 증가시킬 수 있다. 종래의 siRNA 전달체로서 이용이 되는 대표적인 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이 있다. 그러나 양이온성 고분자들은 세포사멸을 유도하는 세포독성이 있으며 고분자의 분자량과 분지도(degree of branching)가 커질수록 증가하는 것으로 알려져 있어 생체전달용 siRNA 고분자 복합체에 적용하기에는 어려움이 있다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
1. R.N. Redinger, Am. J. Surg., (2003), 185, 16872. 2. O.B. Ijare, etr al., Magn. Reson. Med., (2005), 53, 14416. 3. R.M. Samstein, et al., Biomaterials., (2008), 29, 7038. 4. A. Elbakry, et al., Nano Lett., (2009), 9, 205964. 5. Y.-K. Oh, et al., Adv. Drug Deliv. Rev., (2009), 61, 85062. 6. A. Manuscript, NIH Public Access., (2010), 131,) 20723. 7. M. Lee, et al., Nanocomplex, (2011) 61386147. 8. F. Li, et al., Mater. Sci. Eng. C., (2012), 32, 201725. 9. L.C. Gomes-da-silva, et al., Acc. Chem. Res., (2012), 45, 116371. 10. S.J. Lee, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., (2012), 51, 72037. 11. H. Sung, et al., Acc. Chem. Res., (2012), 45, 61929. 12. Z. Khatun, et al., J. Control. Release., (2013), 170, 7482. 13. K. Park, et al., Bioconjugate Chem., (2013), 24 (7), pp 12019 14. S. Son, et al., ACS Nano, (2014), 8 (6), 557484 15. Z. Khatun, et al., J. Control. Release. (2014), 177, 6473. 16. H.J. Kim, et al., G. Nanoparticles (2014) 897991.
본 발명자들은 조직 특이성이 있고 핵산분자의 안정성이 좋으며 체내흡수율이 좋은 핵산분자 전달체를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 금 나노입자, 글라이콜 키토산 및 타우로 콜린산을 이용하여 간 표적성이 있으며 핵산분자의 생체내 안정성이 증가된 핵산 전달체를 성공적으로 개발하였고 이의 간 표적성을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간질환(liver disease) 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체를 제공한다: (a) 금속 나노입자; (b) 상기 금속 나노입자 표면에 결합된 핵산 분자; 및 (c) 상기 핵산 분자에 부착된 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체.
본 발명의 금속 나노입자는 금속의 성질을 갖는 모든 입자로서 나노 단위의 직경을 가지는 금, 은, 백금, 팔라듐 및 철 등의 금속입자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 금속 나노입자의 크기는 나노 단위의 직경, 바람직하게는 8-100 nm, 보다 바람직하게는 10-50 nm, 가장 바람직하게는 12-14 nm의 직경을 의미할 수 있으나 나노크기를 갖는 금속입자라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 또는 자성 나노입자이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용하는 금속 나노입자는 금 나노입자이다.
상기 금 나노입자는 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬우며, 크기 조절이 용이하고, 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가진다.
본 발명에서 이용되는 금 나노입자는 바람직하게는 HAuCl4를 금 공급원으로 하고, 구연산 나트륨(sodium citrate)를 환원제로 하여 HAuCl4를 환원시킴으로서 제조될 수 있다. 상기 제조되는 금 나노입자의 크기는 환원제인 시트레이트(citrate)의 양에 따라서 조절될 수 있다. 상기 환원제인 시트레이트의 첨가량이 증가하면 금 나노입자 생성을 위한 핵형성(nucleation)이 증가하여 결론적으로 금 나노입자의 크기는 감소하게 된다.
상기 금 나노입자는 직경이 100 nm 이상으로 커질 경우 티올기 또는 아민기와 같은 작용기와의 결합이 어렵고, 세포내 침투와 같은 나노 입자로서의 특성이 소멸되기 때문에 본 발명의 금 나노입자의 직경은 바람직하게는 100 nm 미만이다.
본 발명의 핵산 분자는 상기 금속 나노입자의 표면에 결합한다.
상기 핵산 분자는 금속 나노입자의 표면에 결합하기 위하여 추가적인 작용기성(functionality)을 가질 수 있다.
상기 작용기는 티올기 또는 아민기일 수 있으며 핵산의 3’말단에 위치 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 작용기로서 티올기를 가지고 있으며 티올기를 통하여 상기 금속 나노입자의 표면에 결합한다.
상기 핵산 분자가 상기 금속 나노입자의 표면에 결합하면 결합된 핵산 분자에 의해 음이온성질이 증가하여 양이온성 고분자와의 결합이 용이하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산분자는 DNA, RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 안티센스 핵산(antisense nuckeic acid), 핵산 앱타머(nucleic acid aptamer), 리보좀(ribosome), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명에 사용한 핵산은 siRNA이다.
상기 siRNA는 RNA 방해 (RNA interference) 또는 유전자 침묵(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹-다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem-and-loop) 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 표면에 핵산 분자가 결합된 금속 나노입자는 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체에 의하여 코팅된다. 이러한 코팅은 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체가 금속 나노입자의 표면에 결합된 핵산 분자에 부착되어 이루어진다. 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체와 핵산 분자와의 부착은 바람직하게는 양전하 물질과 음전하 물질 사이에 발생하는 정전기적 인력에 의해 발생한다.
본 발명에서 상기 용어 “담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체”는 담즙산과 글라이콜 키토산이 연결되어 이루어진 복합 화합물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체”에서 담즙산과 글라이콜 키토산은 공유결합에 의해 서로 연결되어 있다.
본 발명에서 상기 용어 “담즙산(bile acid)”는 담즙에 주요 성분으로 포함되는 스테로이드 산(steroid acid) 물질을 통칭하는 의미한다.
본 발명에서 담즙산은 장간순환(Enterohepatic circulation)을 이용할 수 있으므로, 본 발명의 핵산 전달체의 간 조직으로의 전달능을 향상시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 담즙산은 디옥시 콜린산(deoxycholic acid), 타우로 디옥시 콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로 콜린산(taurocholic acid), 및 글리코 케노 디옥시 콜린산(glycochenodeoxyhoclic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
본 발명에서 글라이콜 키토산은 양전하성을 띄는 물질로서 “담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체”가 상기 핵산 분자가 결합된 금속 나노입자에 정전기적 인력에 의해 부착할 수 있게 한다.
본 발명에서 글라이콜 키토산은 본 발명의 핵산 전달체의 경구투여시 소화관을 통한 흡수율을 향상시키며, 소화관에 존재하는 효소로부터 핵산 분자의 분해를 방지한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체는 양전하를 띈다.
상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체의 전체적인 전하량의 조절은 글라이콜 키토산과 담즙산의 조성 비율을 조절하여 행할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체에서 글라이콜 키토산 : 담즙산의 결합 비율(conjugation ratio)은 몰비로서 1:1 - 1:100의 범위이며, 보다 바람직하게는 1:50 - 1:100이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간질환(liver disease) 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “약제학적 유효량”은 핵산 전달체의 간질환 치료를 위해 효과적이며 충분한 양을 의미한다.
본 발명에서 상기 간질환(liver disease)은 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간, 또는 간암이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 핵산 전달체는 경구용으로 투여된다.
본 발명의 조성물에 포함되는 활성성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체의 제조 방법을 제공한다:
(a) 금속 나노입자의 표면에 핵산 분자를 결합시키는 단계;
(b) 담즙산과 글라이콜 키토산을 반응시켜 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 제조하는 단계;
(c) 상기 제조된 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 상기 핵산 분자가 표면에 결합된 금속 나노입자에 부착하는 단계.
단계 (a): 금속 나노입자의 표면에 핵산 분자를 결합시키는 단계
먼저, 금속 나노입자를 포함하는 반응용액을 준비하고 준비된 반응용액에 핵산분자를 첨가하여 결합시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 또는 자성 나노입자일 수 있으며, 바람직하게는 금 나노입자이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 티올기(-SH)를 통해 상기 금속 나노입자의 표면에 결합시킨다.
상기 핵산 분자는 상기 금속 나노입자와 충분한 양을 반응시켜 상기 금속 나노입자 표면에 결합시킬 수 있다.
금속 나노입자와 핵산 분자의 결합 반응시 금속 나노입자와 핵산 분자와의 몰비율은 특별히 한정되지 않으며 당업자가 적합한 비율을 선택할 수 있다. 바람직하게는 상기 결합 반응시 금속 나노입자와 핵산 분자의 몰비는 1:1 - 1:300, 보다 바람직하게는 1:1 - 1:200 이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 DNA, RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 안티센스 핵산(antisense nuckeic acid), 핵산 앱타머(nucleic acid aptamer), 리보좀(ribosome), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 및 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)일 수 있으며 바람직하게는 siRNA이다.
단계 (b): 담즙산과 글라이콜 키토산을 반응시켜 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 제조하는 단계.
담즙산과 글라이콜 키토산을 증류수에 각각 용해시켜 용액으로 제조한 후, 상기 두 용액을 혼합하여 반응시켜 담즙산과 글라이콜 키토산이 결합된 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 제조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 담즙산은 디옥시 콜린산(deoxycholic acid), 타우로 디옥시 콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로 콜린산(taurocholic acid), 및 글리코 케노 디옥시 콜린산(glycochenodeoxyhoclic acid)이며 바람직하게는 타우로 콜린산이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체는 전체적으로 양전하를 띄도록 제조한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체의 제조시 글라이콜 키토산 : 담즙산의 피드 비율(feed ratio)은 몰비로서 1:1 - 1:100의 범위 이며, 바람직하게는 1:50 - 1:100의 범위이다.
단계 (c): 상기 제조된 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 상기 핵산 분자가 표면에 결합된 금속 나노입자에 부착하는 단계
상기 제조한 핵산 분자가 표면에 결합된 금속 나노입자와 상기 제조한 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체를 적합한 용매하에서 혼합하여 상기 복합체를 상기 금속 나노입자에 부착한다. 상기 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체는 전체적으로 양전하를 띄며 상기 핵산 분자가 표면에 결합된 금속 나노입자는 음전하를 띄므로 상기 복합체는 금속 나노입자에 정전기적 인력에 의해 부착된다.
본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체, 이의 제조방법, 및 상기 핵산 전달체을 포함하는 간질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 간 조직 표적성이 매우 우수하며, 소화관을 통한 흡수율이 매우 높다.
(ⅲ) 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체에서 유효성분인 핵산은 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 체내 효소 등의 분해로부터 보호될 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 경구투여용 간질환 치료제로 개발될 수 있다.
본 발명은 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체, 이의 제조방법, 및 상기 핵산 전달체을 포함하는 간질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 간 조직 표적성이 매우 우수하며, 소화관을 통한 흡수율이 매우 높다. 또한, 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체에서 핵산은 담즙산 - 글라이콜 키토산 복합체로 코팅됨으로써 체내 효소 등의 분해로부터 보호될 수 있다. 본 발명의 간 표적성 핵산 전달체는 경구투여용 간질환 치료제로 개발될 수 있다.
도 1은 본 발명의 개요를 보여주는 도면이다.
도 2는 제조된 금 나노입자(AuNP)에 대해 UV-VIS 분광법을 수행한 결과 그래프를 보여준다. AuNP가 520nm에서 흡광도를 보인다는 것을 보여준다.
도 3은 제조된 AuNP에 대해 전자현미경(좌측 이미지) 및 투과전자현미경(우측 이미지)실험을 수행한 결과를 보여준다.
도 4는 글라이콜 키토산(GC), 타우로 콜린산(TCA), 및 글라이콜 키토산 - 타우로 콜린산 복합체(GT 복합체: GC-TCA)에 대한 수소핵자기공명(H1-NMR)스펙트럼을 보여준다.
도 5는 AuNP-DEPC, AuNP-siRNA, AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50 또는 AuNP-siRNA-GT100에 대한 UV-VIS 분광법의 결과를 보여준다.
도 6은 형광물질이 결합된 AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50 또는 AuNP-siRNA-GT100을 누드 마우스에 경구투여하고 12시간이 지난 뒤 촬영한 형광이미지를 보여준다. 도 7은 형광물질이 결합된 AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50 또는 AuNP-siRNA-GT100을 누드 마우스에 경구투여하고 12시간이 지난 뒤 촬영한 EX-vivo 형광 이미지를 보여준다.
도 8은 형광물질이 결합된 AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50 또는 AuNP-siRNA-GT100을 누드 마우스에 경구투여하고 12시간이 지난 뒤 각 장기에서 나타나는 형광의 세기를 분석한 결과를 보여준다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 실험재료
글라이콜 키토산(glycol chitosan, GC), 타우로 콜린산(taurocholic acid, TCA), 4-니트로페닐 클로로포름산염(4-Nitrophenyl chloroformate, 4-NPC), 트릴에틸아민(Triethylamine, TEA), 염화금(III) 수화물(gold(III) chloride hydrate, HAuCl4), 트리소디엄 시트레이트 디하이드레이트(Trisodium citrate dehydrate), 디에틸피로카르본산(diethylpyrocarbonate, DEPC), HEPES 버퍼, NaCl은 SIGMA-ALDRICH에서 구입하였다. 티올 그룹으로 개질된 siRNA(siRNA-SH, 서열: 5’-GUCCAGUUUCCCAGGAAUCCCU None-3’: 서열번호 1)는 ST PHARM OLIGO CENTER에서 구입하였다. 6-7 주령된 Balb/C 누드마우스(Nude mouse)는 Orient Bio INC에서 구입하였다.
2. 글라이콜 키토산(GC)-타우로 콜린산(TCA) 복합체의 제조
먼저, 글라이콜키토산(GC) 용액은 글라이콜 키토산을 증류수에 완전히 녹여서 제조하였다. 타우로 콜린산(TCA) 용액은 타우로 콜린산(TCA)을 증류수에 완전히 녹여 제조하고 온도를 0 - 4 ℃로 조절하였다. 4-NPC 용액은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여서 제조하였다. 상기 4-NPC 용액을 TCA 용액에 첨가한 후 TEA를 한 방울씩 첨가하였으며 이때 용액은 완전히 투명한 노란색을 유지하도록 하였다. 이 상태로 30분간 잘 섞어주고 1시간 동안 추가로 섞어주었다. 상기 제조된 TCA 용액에 상기 GC 용액을 첨가하여 24시간동안 잘 섞어주어 반응을 완료하였다. 상기 반응이 완료된 용액을 MWCO(molecular weight cut off)가 1kDa인 멤브레인 필터(membrane filter)를 이용하여 3시간 마다 증류수를 교체하며 24시간동안 투석하였다. 용액의 색이 노란색에서 투명해지면 동결 건조하여 GC에 TCA가 결합된 복합체(GT 복합체)를 분말상태로 수득하였다. 상기 수득한 GT 복합체는 사용전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
3. 금 나노입자(AuNP)의 합성
AuNP의 합성에 이용되는 모든 유리기구는 질산과 염산을 1:3의 부피비로 섞어 제조한 왕수(aqua regia)를 이용하여 세척한 후 사용하였다. 97.5℃로 가열된 증류수 100㎖에 HAuCl4 용액(10㎎/㎖) 2㎖을 첨가하여 30분간 섞어 주었다. 30분 후 73.524mg의 트리소디엄 시트레이트(trisodium citrate)을 증류수에 최소한으로 녹여 AuCl4 용액에 첨가하고 30분간 강하게 섞어주었다. 상기 용액의 색이 투명한 색에서 붉은색으로 변하면 가열을 멈추고 30분간 더 섞어주었다. 제조된 용액을 냉각시키고 빛이 차단된 4℃ 환경에서 보관하였다.
3. AuNP의 DEPC 처리, siRNA의 결합, 및 글라이콜 키토산 또는 글라이콜 키토산-타우로 콜린산 복합체를 이용한 코팅
상기 시트레이트(citrate)에 의해 안정화된 AuNP 용액에 총 부피비 0.1%의 DEPC(diethylpyrocarbonate)을 첨가하여 12시간동안 충분히 섞어준 후 121℃로 60분간 가압멸균처리를 수행하여 DEPC가 처리된 AuNP를 준비하였다. 티올기(thiol group)로 개질된 siRNA와 DEPC 처리된 AuNP는 몰비를 맞추어 잘 섞어준 후 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 1M의 NaCl용액을 첨가하여 0.1M 내지 0.3M의 염용액 조건을 형성하였다. siRNA가 결합된 AuNP 용액은 15,000xg의 속도로 15분간 원심분리하여 결합이 안된 siRNA를 제거하여 준 후 HEPES 버퍼로 재현탁하였다[6, 14, 16]. 상기 과정을 세 번 반복하여 결합되지 않은 siRNA를 최대한 제거한 후 GC 용액 또는 GT 복합체 용액을 이용하여 다시 현탁한 후 1시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 상기 반응 후 15,000xg의 속도로 15분간 원심분리하여 결합이 안된 고분자를 제거하고, HEPES버퍼를 이용하여 다시 현탁하였다. 상기 과정을 3회 반복 수행한 후 동결건조하여 건조된 시료를 얻어 사용하였다[7, 10].
4. 인 비보(In vivo) 에서의 핵산 전달체의 경구투여 흡수 경로 확인
6-7주령인 Balb/C 누드마우스(nude mouse)는 실험 약물을 투여하기 하루 전부터 먹이를 제거하여 위장내의 음식물에 대한 노이즈(noise)를 방지하였다. 또한 로다민(Rhodamine)B를 이용하여 염색한 글라이콜 키토산(GC)과 서로 다른 몰비의 GC와 TCA의 결합비를 가진 GT 복합체로 코팅된 AuNP를 쥐에 경구투여 한 후 매 3시간 마다 Kodak image station을 통하여 쥐의 형광이미지를 촬영하였다. 경구투여한 지 12시간이 지난 후 쥐를 해부하여 위, 소장, 간, 심장, 폐, 콩팥, 신장의 형광이미지를 촬영하여 각 장기 별로 흡수된 정도를 확인하였다. 그 후 각 장기의 무게를 측정하고 100g/L로 PBS를 추가하여 균질화(homogenizing)하였다. 균질화 후 만들어진 혼탁액을 원심분리하여 상층액을 채취하고 VARITO SKAN FLASH를 통하여 형광의 정도를 측정하였다.
실험결과
1. 제조된 AuNP의 특성 확인
트리소디엄 시트레이트(trisodium citrate)로 안정화된 음이온성 AuNP의 형성을 확인하기 위하여 UV-VIS 분광법(UV-Visible spectroscopy), 제타전위(zeta-potential), 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS), 전자현미경(scanning electron microscope, SEM), 및 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)을 수행하였다.
가장 기본적으로 금 나노입자형성을 확인하기 위해서 UV-VIS 분광법 수행한 결과, AuNP가 520nm에서 흡광한 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 나노입자의 크기와 형태, 응집의 여부를 확인하기 위해 DLS, SEM, TEM을 수행하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 우선 AuNP의 DLS값은 18.25± 1.51nm를 보였으며 SEM과 TEM에서도 DLS의 결과와 일치하는 크기로 확인되었다(도 3 참조). 상기 결과들에 의하면, 제조된 AuNP는 응집되지 않은 단일 분자의 상태로 퍼져서 존재한다는 것을 확인하였다. 트리소디엄 시트레이트를 이용하여 안정화시킨 AuNP는 트리소디엄 시트레이트에 의해 음전하를 가지게 된다. 이를 확인하기 위하여 제타전위를 측정한 결과, 상기 제조된 AuNP는 제타전위 -13± 1.38mV로 음이온성을 나타내는 것을 확인하였다.
2. GC - TCA 복합체의 제조 결과 및 특성 확인
글리콜 키토산(GC)과 타우로 콜린산(TCA)의 복합체를 제조하기 위하여 4-NPC와 TEA를 이용하여 GC의 아민기(amine group)와 TCA의 히드록실기(hydroxyl group)를 결합시켰으며 수소핵자기공명분광법(1H-NMR spectroscopy)을 수행하여 GC와 TCA의 결합을 확인하였다(도 4 참조). 수소핵자기공명분광법에서 GC를 특정 지을 수 있는 피크는 4.4 ppm과 3.5 ppm에 나타나며 TCA를 특정 지을 수 있는 피크는 2.8ppm과 0.75ppm에 나타난다. 도 4의 GT 고분자도 같은 위치에서 피크를 가진다는 것을 확인 하였다[2].
표 1은 합성된 GT 복합체(GT 고분자)의 GC와 TCA의 결합비 및 제타 전위값을 보여준다. GC와 TCA의 결합비는 TNBSA(2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid) assay를 통해 GC의 1차(primary) 아민기와 TCA와의 결합을 통해 감소된 GC의 1차 아민기의 수를 측정하여 산출하였다. 그 결과, GC:TCA 피드 비율(feed ratio, 몰비)을 1 : 50, 100, 200, 300으로 증가시켰을 때, GC와 TCA의 결합비(몰비)가 42.80± 0.35, 94.77± 0.22, 152.05± 0.21, 162.60 ± 0.13으로 점차 증가함을 확인하였다.
TCA와 결합하지 않은 GC의 제타전위는 45.90± 0.1mV로 상당한 양전하를 띈다. 그러나 GC에 TCA가 결합하면 TCA의 결합이 증가함에 따라 29.51± 1.70mV, 0.44± 0.37mV, -8.31± 0.13mV, -27.11± 0.21 mV로 점차 중성에 가까워지고 결합비가 1:150 이상이 되면 강한 음전하를 띄는 것이 확인되었다. 상기 실험을 바탕으로 강한 음전하를 띄는 siRNA가 결합된 AuNP와 결합할 수 있는 양전하성을 띄는 GT 고분자를 선택하였다. 선택된 GT 복합체 고분자는 표 1의 시료번호 1, 2, 및 3이다.
Figure 112015026382999-pat00001
3. siRNA를 결합시킨 AuNP의 제조 및 이의 특성 확인
DEPC를 처리하여 RNase-free AuNP를 제조한 후, 제조한 AuNP에 티올기로 개질한 siRNA(siRNA-SH)를 결합시켜 그 차이를 DLS와 제타전위를 통해 확인하였다. siRNA로 결합시키지 않은 AuNP와 siRNA를 결합시킨 AuNP에 대해 DLS 실험을 수행한 결과, AuNP의 크기가 siRNA의 결합에 의해 18.25± 1.51nm에서 21.85± 1.08nm로 약간 증가한 것을 확인할 수 있었다. siRNA는 아주 작은 크기이기 때문에 결과 또한 큰 차이를 나타내진 않았지만, siRNA의 결합에 의한 크기의 증가를 확인할 수 있었다. siRNA 결합 또는 siRNA 비-결합 AuNP의 전기적 특성을 확인하기 위하여 제타전위값을 확인하였다. siRNA와 AuNP는 각각 -7.29±
4.86mV와 -13± 1.38mV의 아주 작은 음전하 값을 가지지만, AuNP에 siRNA를 결합시킨 이후에는 결합비(AuNP:siRNA)가 1:10, 50, 100으로 증가할수록 제타전위값이 -23.23± 1.16mV. -26.35± 1.80mV, -28.60± 0.90 mV으로 변화한 것을 확인 할 수 있었다(표 2 참조).
Figure 112015026382999-pat00002
4. AuNP-siRNA-GC 또는 AuNP-siRNA-GT 전달체의 제조 및 특성 확인
하기 표 3은 siRNA를 1:100의 결합비(몰비)로 결합시킨 AuNP에 GC를 코팅하거나 GT 복합체를 코팅한 후의 측정한 DLS 값과 제타전위값을 보여준다.
Figure 112015026382999-pat00003
측정 결과 GC, GT50 또는 GT100을 코팅한 AuNP-siRNA 복합체의 DLS값은 58.52 ± 9.69nm, 99.26 ± 3.21nm 또는 114.83 ± 1.66nm로 TCA의 결합비가 높은 GT 복합체을 사용할수록 나노입자의 직경이 커지는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 TCA가 결합할수록 GC의 양전하가 약해짐에 따라 음전하인 AuNP-siRNA 복합체와의 전하-전하 결합(charge-charge interaction)이 약해져 결과적으로 입자가 강하게 응집하여 작은 입자를 구성할 힘이 부족하기 때문이다. 표 1의 제타전위값을 확인하면 TCA가 많이 결합한 GC 일수록 제타전위값이 확연히 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 AuNP-DEPC, AuNP-siRNA, AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50, AuNP-siRNA-GT100을 UV-VIS 분광분석기를 통하여 분석한 결과 그래프이다. 상기 실험을 통하여 siRNA, GC, GT 복합체와 AuNP가 결합하여 최종 전달체 물질을 생성할 때 AuNP의 응집현상이 얼마나 제어되었는가를 확인할 수 있는데, 결과적으로 AuNP와 siRNA를 결합한 AuNP-siRNA의 경우 최대의 흡광도를 가지는 파장대는 522nm로 응집현상이 일어나지 않았으며, siRNA가 AuNP에 결합한 것을 확인할 수 있었다. AuNP-siRNA-GC, AuNP-siRNA-GT50, AuNP-siRNA-GT100의 경우 흡광도가 최대인 파장대는 528 nm로 기존의 금 나노입자의 파장대인 522nm에서 오른쪽으로 6nm 정도 피크(peak)가 이동한 것을 확인할 수 있다. 이는 무시해도 될 정도로 아주 작은 값으로 결과적으로 AuNP의 응집 현상이 없이 최종물질의 합성이 안정적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
5. AuNP-siRNA-GC 또는 AuNP-siRNA-GT 전달체의 경구투여 및 흡수경로 확인
상기와 같이 AuNP-siRNA-GC 또는 AuNP-siRNA-GT 전달체를 합성하고 인 비보(in vivo)에서 회장에서의 흡수 여부와 간으로의 전달여부를 확인하고자 형광물질이며 친수성인 로다민(Rhodamine) B를 글라이콜 키토산과 결합하여 염색하였다. 6-7주령된 Balb/C 누드마우스에 상기 전달체를 경구투여한 후 12시간 후의 이미지를 확인하였다(도 6 참조). 도 6을 보면, 인 비보에서 시간이 지남에 따라 전달체의 위치가 변화하는 것을 볼 수 있는데, 이는 전달체가 소장 기관을 통해 다른 장기로 흡수됨을 의미하며, 이는 경구투여를 통한 전달체의 체내 흡수가 가능함을 시사한다. 또한, 도 7과 도 8의 결과를 보면, 12시간 후의 각 장기의 형광이미지와 전달체가 흡수된 정도를 확인할 수 있다. 소화관을 보면 AuNP-siRNA-GC 전달체의 경우는 많은 양이 위에서 잔존하는 것을 확인할 수 있다. 그러나, AuNP-siRNA-GT 전달체의 경우 소장의 끝부분인 회장부근에서 많은 양의 약물흡수가 일어났음을 보여준다. 그리고, AuNP-siRNA-GT 전달체에서 TCA의 결합비가 증가할수록 약물흡수가 많이 일어나는데, 이는 TCA의 효과임을 의미하며 복합체가 담즙산과 같은 경로인 소장의 회장부분을 통해 흡수되어 간으로의 약물 흡수가 일어남을 의미한다. 또한, AuNP-siRNA-GT 전달체에서 TCA의 결합비가 1:50인 전달체 보다 TCA의 결합비가 1:100인 전달체의 약물흡수가 더욱 활발하게 일어남을 보여주며, 위에서의 잔존도도 적은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 간을 제외한 장기인 심장, 폐, 콩팥, 신장에서도 형광도가 극히 적음을 미루어 보아 AuNP-siRNA-GT 전달체가 생체 내 다른 장기로 흡수되지 않고 배출되었다는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
결론
티올기로 개질한 siRNA와 AuNP를 GT복합체로 코팅하여 안정적인 AuNP-siRNA-GT 전달체를 성공적으로 제조하였다. 제조한 AuNP-siRNA-GT 전달체를 누드마우스에 경구투여하여 AuNP-siRNA-GT 전달체의 체내흡수 및 이동을 확인한 결과, AuNP-siRNA-GT 전달체는 담즙산의 흡수 경로인 소장의 회장부분을 통하여 흡수되어 간 특이적으로 이동되는 것을 확인하였다. 이 결과는 본 발명의 AuNP-siRNA-GT 전달체가 경구투여를 통하여 체내로 효과적으로 흡수될 수 있음을 의미하며, 체내의 장간순환(enterohepatic circulation)을 통해 간으로 이동하여 간 조직 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. GC 고분자만을 부착시킨 전달체는 간으로 이동하지 않고 위에 머물러 있는 것이 확인 되었으며 TCA의 결합 비율을 증가시킬수록 회장으로의 흡수가 촉진되어 간으로의 이동능이 향상되는 것을 확인하였다. 또한, 간을 제외한 장기인 심장, 폐, 콩팥, 신장에서의 형광도는 극히 약하여 이로 미루어보아 약물의 생체 내 다른 장기로 약물이 흡수되지 않고 배출됨을 알 수 있었다. 이는 AuNP-siRNA-GT 전달체가 다른 장기로 흡수되어 잔존함으로 인해 발생하는 장기독성과 같은 부작용을 최소화할 수 있음을 시사한다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
<110> Korea National University Of Transportation Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Liver Targeting Metal Nano-particle Based Nucleic Acid Delivery System And Manufacturing Method Thereof <130> MP15-0077 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence which modified by SH-group in 3' end <400> 1 guccaguuuc ccaggaaucc cu 22

Claims (14)

  1. 금 나노입자;
    상기 금 나노입자 표면에 결합된 siRNA 분자; 및
    상기 siRNA 분자에 부착된 타우로 콜린산(taurocholic acid) - 글라이콜 키토산 복합체;로 구성되는 것을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA 분자는 티올기(-SH)를 통해 상기 금 나노입자의 표면에 결합된 것을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 타우로 콜린산(taurocholic acid) - 글라이콜 키토산 복합체는 타우로 콜린산과 글라이콜 키토산이 공유결합에 의해 연결된 것임을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체.
  7. 삭제
  8. 제 1, 2, 및 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타우로 콜린산(taurocholic acid) - 글라이콜 키토산 복합체에서 글라이콜 키토산 : 타우로 콜린산의 결합 비율(conjugation ratio)은 몰비로서 1:50 - 1:100의 범위인 것을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체.
  9. 제 1, 2, 및 6 항 중 어느 한 항의 핵산 전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간질환(liver disease) 치료용 약제학적 조성물.
  10. (a) 금 나노입자의 표면에 siRNA 분자를 결합시키는 단계;
    (b) 타우로 콜린산과 글라이콜 키토산을 반응시켜 타우로 콜린산 - 글라이콜 키토산 복합체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제조된 타우로 콜린산 - 글라이콜 키토산 복합체를 상기 siRNA 분자가 표면에 결합된 금 나노입자에 부착하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 siRNA 분자는 티올기(-SH)를 통해 상기 금 나노입자의 표면에 결합시키는 것을 특징으로 하는 금속 나노입자 기반 간 표적성(liver targeting) 핵산 전달체의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
KR1020150037342A 2015-03-18 2015-03-18 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법 KR101797569B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150037342A KR101797569B1 (ko) 2015-03-18 2015-03-18 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법
US15/074,443 US9669103B2 (en) 2015-03-18 2016-03-18 Metal-particle-based oral-administrating liver-specific nucleic acid delivery system and method of manufacturing the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150037342A KR101797569B1 (ko) 2015-03-18 2015-03-18 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160112164A KR20160112164A (ko) 2016-09-28
KR101797569B1 true KR101797569B1 (ko) 2017-11-22

Family

ID=57101967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150037342A KR101797569B1 (ko) 2015-03-18 2015-03-18 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9669103B2 (ko)
KR (1) KR101797569B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101741977B1 (ko) * 2016-04-26 2017-05-31 한국교통대학교산학협력단 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물
CN108096571B (zh) * 2017-12-27 2021-08-17 河南科技大学 一种用于防治结核病的结核多肽疫苗及其制备方法、应用
US11103529B1 (en) * 2021-01-05 2021-08-31 King Abdulaziz University Zero-valent gold nanoparticles as a cancer therapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101255149B1 (ko) 2011-10-14 2013-04-22 포항공과대학교 산학협력단 금속 나노 입자 기반 핵산 전달용 조성물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1147204A1 (en) 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101255149B1 (ko) 2011-10-14 2013-04-22 포항공과대학교 산학협력단 금속 나노 입자 기반 핵산 전달용 조성물 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Marine drugs, 12(12), 6038-6057 (2014. 12. 17.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160112164A (ko) 2016-09-28
US9669103B2 (en) 2017-06-06
US20170065724A1 (en) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fang et al. Hyaluronic acid-modified mesoporous silica-coated superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles for targeted drug delivery
Xia et al. pH-responsive gold nanoclusters-based nanoprobes for lung cancer targeted near-infrared fluorescence imaging and chemo-photodynamic therapy
Malik et al. Recent advances in gold and silver nanoparticle based therapies for lung and breast cancers
Rajan et al. Poly-carboxylic acids functionalized chitosan nanocarriers for controlled and targeted anti-cancer drug delivery
Jiang et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy
Mu et al. Unsaturated nitrogen-rich polymer poly (l-histidine) gated reversibly switchable mesoporous silica nanoparticles using “graft to” strategy for drug controlled release
KR101179471B1 (ko) 자기 집합체 고분자 나노입자를 이용한 ｓｉＲＮＡ 전달 시스템
CN107849567A (zh) 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
Gorain et al. Dendrimer-based nanocarriers in lung Cancer therapy
Han et al. Functionalization and optimization-strategy of graphene oxide-based nanomaterials for gene and drug delivery
Ma et al. Enhanced immunotherapy of SM5-1 in hepatocellular carcinoma by conjugating with gold nanoparticles and its in vivo bioluminescence tomographic evaluation
Mi et al. Self‐Targeting, Immune Transparent Plasma Protein Coated Nanocomplex for Noninvasive Photothermal Anticancer Therapy
WO2012009448A2 (en) Cationic polymer coated mesoporous silica nanoparticles and uses thereof
Thakur et al. Nanoparticles as an emerging tool to alter the gene expression: Preparation and conjugation methods
KR101797569B1 (ko) 금속 나노입자 기반 간 표적성 핵산 전달체 및 이의 제조방법
Hou et al. A novel high drug loading mussel-inspired polydopamine hybrid nanoparticle as a pH-sensitive vehicle for drug delivery
Wang et al. One-step self-assembling method to prepare dual-functional transferrin nanoparticles for antitumor drug delivery
Narwade et al. Advanced cancer targeting using aptamer functionalized nanocarriers for site-specific cargo delivery
Khoshnood et al. N doped-carbon quantum dots with ultra-high quantum yield photoluminescent property conjugated with folic acid for targeted drug delivery and bioimaging applications
Liu et al. Nanoparticle-mediated therapeutic management in cholangiocarcinoma drug targeting: Current progress and future prospects
KR20100000203A (ko) 금나노입자를 이용한 표적지향형 항암약물전달체
Han et al. DNA as highly biocompatible carriers for drug delivery
Fadaka et al. Stage-specific treatment of colorectal cancer: A microRNA-nanocomposite approach
KR102003239B1 (ko) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법
CN112972422A (zh) 一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)