CN112972422A - 一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用。具体地，该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球由氮化硼纳米球、肿瘤细胞膜和抗肿瘤药物组成；其中，氮化硼纳米球上负载抗肿瘤药物，该肿瘤细胞膜包覆负载抗肿瘤药物的氮化硼纳米球。本发明提供的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球采用肿瘤细胞(HeLa细胞)膜包覆氮化硼纳米球，改善了氮化硼纳米球的分散性、载药量和生物相容性，且具有优异的肿瘤细胞靶向性和抑瘤作用，为靶向肿瘤治疗方法以及药物的制备提供了有效的策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用。
背景技术
癌症对人类健康构成了巨大威胁。尽管常规化学疗法是癌症治疗的标准策略之一，但非选择性的生物分布和严重的副作用常常导致治疗效果欠佳。随着纳米技术的飞速发展，已开发出多种基于纳米材料的药物载体递送系统(DDS)用于治疗恶性肿瘤，因为DDS可以利用高通透性和滞留效应(EPR)到达肿瘤部位。最近，氮化硼纳米材料引起了学术界的广泛关注。作为一种有前途的新型无机纳米材料，氮化硼已应用于许多生物医学领域。氮化硼具有类似于石墨烯的六边形结构，同时具有生物相容性、耐腐蚀和热中子俘获截面大的显着特性[1]。Ciofani等人报道了一种新型的靶向肿瘤的基于氮化硼纳米管的DDS，其具有叶酸和量子点(F-PLL-BNNTs)功能，能够选择性地将高剂量的硼原子输送到肿瘤细胞中[2]。Nakamura和同事证实了用BNNTs作为硼剂进行硼中子俘获治疗的可行性，这是一种可以选择性靶向肿瘤组织的新型二元放射疗法[3]。鉴于它们的多功能性，各种形状的六方氮化硼纳米材料的应用为生物医学提供了新的视野。其中，具有均一球形结构的氮化硼纳米球(BN)由于其具有较低的结构诱导毒性，被认为是最适合在生物医学领域中应用的。Zhi和他的同事报道BN可以有效地将DNA转运到细胞中，并且这些递送系统不影响细胞增殖[4]。我们的研究小组先前曾报道，具有合理表面修饰的BN是有效递送抗癌药物的有前景的纳米材料[5,6]。
尽管BN具有优异的性能，但其在临床应用上，具有分散性差、血液循环受限和缺乏肿瘤选择性的障碍[7]。氮化硼的表面疏水性使其聚集并通过网状内皮系统(RES)从血液中迅速被清除[8]。由于红细胞(RBC)的固有特征(包括其优越的长循环性和非免疫原性)，其被应用于DDS的表面修饰策略。最近，我们获得了用于包覆BN的RBC膜，该膜在溶液中表现出单分散状态，优异的循环半衰期和在生理环境中稳定性增强[9]。然而，RBC膜不具备靶向功能，因而不能对肿瘤进行主动靶向。而且，仅通过基于EPR作用的被动靶向的DDS的肿瘤特异性尚未得到满足。
合理的主动靶向策略可能会进一步提高治疗效果并减少化疗药物的不良副作用。一种传统的策略是用靶向配体(包括抗体、肽或适体)修饰DDS[10]。然而，配体介导的靶向策略受到所涉及的复杂化学制剂的限制。癌细胞膜具有同源粘附特性，可能在提高DDS的肿瘤靶向性上具有潜在的前景，但目前未有关于采用肿瘤细胞包覆BN纳米材料的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球，其包括氮化硼纳米球和肿瘤细胞膜；其中，肿瘤细胞膜包覆氮化硼纳米球。
进一步地，上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球由氮化硼纳米球、肿瘤细胞膜和抗肿瘤药物组成；其中，氮化硼纳米球上负载抗肿瘤药物，该肿瘤细胞膜包覆负载抗肿瘤药物的氮化硼纳米球。
进一步地，上述肿瘤细胞膜来源于HeLa(人宫颈癌细胞系)细胞。
进一步地，上述抗肿瘤药物为DOX(盐酸阿霉素)。
第二方面，本发明提供上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将肿瘤细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球；
步骤三，将DOX加入含有肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球。
进一步地，上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将HeLa细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到HeLa细胞膜包覆的氮化硼纳米球HM-BN；
步骤三，将DOX加入含有HM-BN的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球DOX@HM-BN。
进一步地，氮化硼纳米微球是通过化学气相沉积法制备的，具有均匀球形结构。
进一步地，上述HeLa细胞膜的制备方法如下：
(1)用胰蛋白酶消化HeLa细胞，并用预冷的PBS洗涤3次；
(2)将HeLa细胞重悬于PBS溶液中，补充蛋白酶抑制剂防止细胞膜蛋白降解；
(3)采用均质器以30秒的间隔将细胞破碎20次；将含有细胞膜碎片的均质溶液以3200g离心6分钟；然后将上清液以100000g超速离心30分钟；收集透明的HeLa细胞膜(HM)沉淀物以备后用。
进一步地，步骤三中的离心条件为在4℃；离心速度为13500rpm，离心12分钟。
第三方面，本发明提供上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球在制备治疗肿瘤药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球采用肿瘤细胞(HeLa细胞)膜包覆氮化硼纳米球，改善了氮化硼纳米球的分散性、载药量和生物相容性，且具有优异的肿瘤细胞靶向性和抑瘤作用，为靶向肿瘤治疗方法以及药物的制备提供了有效的策略。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备及其同型肿瘤靶标药物递送示意图；
图2显示了本发明一实施例中BN和HM-BN的透射电子显微镜图像；
图3显示了本发明一实施例中HM-BN的表征图；其中，(A)BN、HM和HM-BN的平均直径和(B)Zeta电位；(C)HeLa细胞(I)、HM(II)和HM-BN(III)中的SDS-PAGE蛋白质谱；(D)BN和HM-BN的流体动力学直径与时间的关系；(E)分散在PBS中14天后的BN和HM-BN的流体力学直径和多分散系数(PDI)；
图4显示了本发明一实施例中(A)HeLa和(B)MCF-7细胞与浓度增加的BN和HM-BN孵育72小时的细胞活力试验结果；
图5显示了本发明一实施例中(A)在BN和HM-BN上负载的DOX量；(B)在pH 7.4和pH5.0下DOX@HM-BN的药物释放曲线；
图6显示了本发明一实施例中(A)与游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN共培养4小时(DOX，红色；细胞核，蓝色)的HeLa细胞的CLSM图像；(B)通过流式细胞术定量分析细胞摄取；比例：20μm；
图7显示了本发明一实施例中采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)定量评估HeLa细胞和MCF-7细胞对DOX@BN或DOX@HM-BN的细胞摄取结果；
图8显示了本发明一实施例中与游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN共培养后，通过CCK-8分析HeLa和MCF-7细胞的活力；
图9显示了本发明一实施例中用PBS、游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN(浓度为4μg/mL)处理的癌细胞的体外抗肿瘤活/死细胞活力研究(绿色：活细胞；红色：死细胞)；比例：50μm；
图10显示了本发明一实施例中HeLa荷瘤小鼠(n＝6)体内抑瘤作用的研究；(A)用PBS、游离DOX、DOX@BN或DOX@HM-BN处理后的肿瘤体积生长曲线；(B)治疗期间小鼠的体重；(C)不同处理后主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)的H&E染色；数据表示为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
本发明提供了一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球及其制备方法和应用。具体地，该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球由氮化硼纳米球、肿瘤细胞膜和抗肿瘤药物组成；其中，氮化硼纳米球上负载抗肿瘤药物，该肿瘤细胞膜包覆负载抗肿瘤药物的氮化硼纳米球。
在本发明一优选的实施方式中，上述肿瘤细胞膜来源于HeLa细胞。
在本发明一优选的实施方式中，上述抗肿瘤药物为DOX。
此外，上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备方法包括如下步骤：
步骤一，将肿瘤细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，得到肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球；
步骤三，将DOX加入含有肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球。
在本发明一优选的实施方式中，上述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将HeLa细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到HeLa细胞膜包覆的氮化硼纳米球HM-BN；
步骤三，将DOX加入含有HM-BN的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到该肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球DOX@HM-BN。
在本发明一优选的实施方式中，氮化硼纳米微球是通过化学气相沉积法制备的，具有均匀球形结构。
在本发明一优选的实施方式中，上述HeLa细胞膜的制备方法如下：
(1)用胰蛋白酶消化HeLa细胞，并用预冷的PBS洗涤3次；
(2)将HeLa细胞重悬于PBS溶液中，补充蛋白酶抑制剂防止细胞膜蛋白降解；
(3)采用均质器以30s的间隔将细胞破坏20次；将含有细胞膜碎片的均质溶液以3200g离心6分钟；然后将上清液以100000g超速离心30分钟；收集透明的HeLa细胞膜(HM)沉淀物以备后用。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中的离心条件为在4℃；离心速度为13500rpm，离心12分钟。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球，其制备方法包括如下步骤：
步骤一，HeLa细胞膜的分离：用胰蛋白酶消化HeLa细胞，并用预冷的1×PBS溶液洗涤3次；之后，将5x106个HeLa细胞重悬于PBS溶液中并补充蛋白酶抑制剂cocktail防止细胞膜蛋白降解；采用WIGGENS均质器(中国北京)以30s的间隔将细胞破碎20次；将含有细胞膜碎片的均质溶液以3200g离心6分钟；然后将上清液以100000g超速离心30分钟；收集透明的HeLa细胞膜(HM)沉淀物以备后用；
步骤二，HM-BN的制备：首先通过化学气相沉积法制备具有均匀球形结构的BN纳米球；将HeLa细胞膜沉淀物和1mg BN共混于2mL 1×PBS溶液中；将混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出；依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到HeLa细胞膜包覆的氮化硼纳米球HM-BN；
步骤三，将5mg DOX加入含有HeLa细胞膜包覆的氮化硼纳米球的溶液中，摇匀，将HM-BN和DOX的混合物在黑暗中通过微型挤出机连续挤出；然后，将混合物在4℃下以13500rpm离心12分钟，得到DOX@HM-BN。
测量上清液中游离DOX的量并计算负载的DOX，进一步计算出BN的载药量，其中载药量(μg/mg)＝负载的DOX的数量/载体的数量。同时，设置对照组，将5mg DOX加入浓度为1mg/mL的5mL BN溶液中；将BN和DOX的混合物在室温下振摇过夜，然后在13500rpm下离心20分钟；用微孔板分光光度计检测上清液中游离DOX的量，以计算加载到载体上的DOX的量，结果如图5A。
此外，将DOX@HM-BN分别分散在10mL的pH＝7.4和pH＝5.0的PBS溶液中，将溶液在黑暗中轻微摇动。在固定时间点，收集上清液并用等效的新鲜PBS溶液代替，用微孔板分光光度计在480nm下测量DOX释放量，结果如图5B。
足够的负载量和有效的药物释放控制是评估DDS的重要指标。DOX是一种对多种肿瘤有影响的小分子化学治疗药物，已负载在HM-BN上。负载在BN上的DOX量约为7μg/mg，而HM-BN上的DOX量为862μg/mg，明显大于BN(图5A)。这主要是因为增强的HM-BN溶液分散性增加了载体的比表面积，并且机械挤压也促进了药物在HM-BN上的负载。由图5B可知，DOX@HM-BN在pH 7.4(生理pH)下在PBS溶液中显示出缓慢释放行为，而在pH 5.0(癌细胞的内膜pH)下在PBS溶液中观察到明显的快速释放曲线。释放曲线表明，DOX@HM-BN能够在生理条件下保持稳定，并在癌细胞的酸性环境中快速释放药物，这可能有助于减少由不必要的药物泄漏引起的副作用。综上所述，这些结果表明DOX@HM-BN的载药量高，并具有pH响应控制释放行为。
验证实施例
本实施例对实施例1提供的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球进行性能验证，具体的操作方法和结果如下：
1、表征
通过VELETA G3透射电子显微镜(EMSIS，德国)在80KV的加速电压下显示BN和HM-BN的表面形态和内部结构；使用Nano ZS Zetasizer(Malvern，英国)测定Zeta电位、PDI和HM-BN的平均直径；用BCA试剂盒定量分析HM-BN的膜蛋白，并通过SDS-PAGE验证；结果如图2-3。
如图2所示，通过透射电子显微镜清楚地看到，BN表现出具有约100nm的平均粒径的球形结构；用HeLa细胞膜挤压BN所获得的HM-BN的直径约为120nm。HM-BN的放大图像显示，厚度约为10nm的透明膜结构附着在HM-BN的表面，这表明HM膜在机械挤出后成功地包裹在BN上。此外，与未修饰的原始BN相比，这些颗粒更分散。
进行动态光散射以确定HM-BN的平均直径和Zeta电位。如图3A所示，由于氮化硼的表面疏水性和溶液中的聚集作用，其流体动力学直径约为722nm；相比之下，HM-BN的流体力学直径小至138nm，这显示了HM修饰降低了BN的疏水性，使其更易分散在PBS中。在被HeLa细胞膜包覆后，HM-BN的表面Zeta电位从-34.2变为-14.6(图3B)；该结果进一步证明BN成功地被细胞膜包覆，因为HM-BN的表面电荷接近于HeLa细胞膜的水平。然后，进行SDS-PAGE电泳分析以确定HM-BN纳米颗粒上的蛋白质谱；HM-BN的蛋白质组成类似于HeLa细胞膜的蛋白质组成，表明制造过程中的挤压不会损坏HM-BN上的膜蛋白(图3C)。由图3D可知，HM-BN的流体动力学直径在测试时间段内保持稳定。此外，HM-BN在PBS中分散14天后的PDI保持在0.086，这表明HM-BN具有出色的长期稳定性(图3E)。
2、细胞毒性试验
HeLa和MCF-7(人乳腺癌细胞系)细胞由美国ATCC提供。将细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中孵育；在37℃，湿润的培养箱中培养细胞。
CCK-8分析试剂盒用于研究BN和HM-BN处理后的细胞活力。将HeLa和MCF-7细胞分别接种于96孔板中，每孔接种100μL，培养24小时。然后将不同浓度的BN和HM-BN加入平板中，每个浓度重复5次，并继续孵育74小时。之后，将每个孔中的细胞用10μL CCK-8溶液处理3小时。用自动酶标仪在450nm下测量并计算培养基的吸光度。细胞活力表示为活细胞相对于未处理细胞的百分比。
由于理想的DDS应该具有适用的生物安全性，因此采用CCK-8方法验证BN和HM-BN的细胞毒性。将HeLa和MCF-7细胞分别用不同浓度的BN和HM-BN培养72小时；将用PBS溶液处理的癌细胞作为对照。如图4所示，即使在共培养72小时后，HM-BN在实验浓度范围内也没有表现出明显的细胞毒性，而用未修饰的BN处理的细胞在高剂量下显示出略低的细胞活力。从该结果可知，HeLa细胞膜包囊降低了BN的毒性，从而使HM-BN在体外更具相容性。
3、细胞摄取
将每个培养皿中浓度为5×104个细胞的HeLa和MCF-7细胞分别接种在1mL DMEM(37℃)中，并培养24小时；随后，将游离DOX、DOX@BN或DOX@HM-BN添加到培养皿中，并继续孵育一定时间；之后，将细胞用PBS洗涤；然后加入200μL 4％(v/v)多聚甲醛使细胞固定10分钟；用PBS洗涤两次后，将细胞在室温下用DAPI染色20分钟；用CLSM观察到荧光。
采用流式细胞术分析对细胞内化的样本量进行定量计算：将密度为5×105细胞/孔的HeLa细胞在6孔板中孵育24小时；然后，将相同浓度的4μg/mL的游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN加入细胞中；处理4小时后，通过胰蛋白酶分离收集细胞，并用冷PBS冲洗；重悬于冷PBS后，用流式细胞仪研究HeLa细胞对DOX@HM-BN的细胞摄取；结果如图6所示。
有效的细胞摄取对于抗癌药物递送系统的治疗功效至关重要。采用共聚焦显微镜研究了DOX@HM-BN在同源肿瘤细胞中的摄取。蓝色荧光表示细胞核，来自DOX的红色荧光表示载药纳米颗粒在细胞中的分布。如图6A所示，游离DOX孵育的HeLa细胞在细胞核中显示红色荧光，表明游离DOX可以迅速定位在细胞核中以结合DNA。此外，可以观察到DOX@HM-BN处理组在HeLa细胞的细胞质和细胞核中显示出很强的荧光强度，而在DOX@BN处理组中，仅在细胞的细胞质中出现零星荧光。这些结果表明HM修饰的BN可以增强HeLa细胞的细胞摄取。如图6B所示，与游离DOX和DOX@BN相比，用DOX@HM-BN处理的细胞的平均荧光强度显著增强，进一步证实了DOX@HM-BN的细胞内化作用增强，HM修饰的BN可以增强HeLa细胞的同源细胞摄取。
癌细胞膜具有同源粘附特性，这可能使HM-BN对同源肿瘤细胞具有选择性亲和力。为了研究对HM-BN的同型肿瘤靶向，分别用DOX@BN和DOX@HM-BN处理HeLa和MCF-7细胞，然后用ICP-AES分析细胞内B元素的含量，具体操作方法为：将细胞以1×106细胞的密度接种在10cm培养皿中，并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时；然后，将两个细胞分别用BN浓度为50μg/mL的两个样品处理4小时；收集细胞并洗涤3次后，加入0.1mL HNO3(65wt％)以使复合物溶解过夜；最后，将9.9mL超纯水添加到溶液中，测量酸性溶液中的硼浓度以量化细胞中BN的质量，结果如图7。在经过4小时孵育时间后，用DOX@HM-BN处理的HeLa细胞均显示出比用DOX@BN处理的HeLa细胞显著增高的B元素含量。对于MCF-7细胞，在用DOX@BN和DOX@HM-BN处理后细胞内硼元素含量仅表现出较少差异。此外，HeLa细胞对DOX@HM-BN的摄取量显著高于MCF-7细胞。以上结果表明，仿生DOX@HM-BN可以通过HeLa细胞膜的同型粘附相互作用选择性地靶向HeLa细胞。
4、DOX@HM-BN体外抗肿瘤效果评价
将癌细胞接种到96孔板中，每孔100μL；孵育24小时后，添加2μg/mL的游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN；每个样品设置五次重复；随后，在每个孔中用10μL CCK-8溶液处理细胞3小时；用自动酶标仪在450nm下测量并计算培养基的吸光度。
此外，还进行了活/死活力/细胞毒性测定：将每个培养皿中浓度为5×104个细胞的HeLa和MCF-7细胞分别接种到1mL DMEM中，在37℃下培养24小时；然后，用5μg/mL的游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN再处理细胞12小时；随后，用冷PBS冲洗细胞，并用钙黄绿素AM和碘化丙啶染色；最后，使用CLSM鉴定荧光；绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。
在同源细胞自我识别内化的良好结果的鼓舞下，通过CCK-8试验验证了DOX@HM-BN对癌细胞的治疗效果。将具有相同DOX浓度的游离DOX、DOX@BN和DOX@HM-BN与HeLa和MCF-7细胞共培养24小时。如图8所示，在所有治疗组中均观察到细胞活力降低；DOX@BN表现出相对较弱的致死作用，而DOX@HM-BN对这两种细胞均具有明显的杀伤作用。这可能是因为HM-BN具有出色的溶液分散性，有助于其被癌细胞摄取。此外，DOX@HM-BN对同型HeLa细胞的抑制作用比MCF-7细胞高得多。它们对HeLa细胞杀伤能力增强的原因可能是由于外层包覆的HeLa细胞膜，使其被同型源细胞有效地内化。
为了进一步证实DOX@HM-BN的抗癌功效，进行了活/死细胞活力测定。钙黄绿素-AM的绿色荧光指示活细胞，而溴乙啡锭二聚体1(EthD-1)的红色荧光指示死细胞。如图9所示，DOX@HM-BN处理的HeLa细胞显示出最强的红色荧光，明显优于其他处理组。该结果与CCK-8结果一致，进一步证实了DOX@HN-BM具有良好的肿瘤治疗效果。以上结果证明了DOX@HM-BN在靶向癌症治疗中的优越性。
5、DOX@HM-BN的体内抑瘤作用
通过将HeLa细胞(5×107个细胞)皮下注射到雌性BALB/c裸鼠(18-20g)中来建立皮下异种移植肿瘤模型；肿瘤体积达到100mm3后，将小鼠随机分为4组(n＝6)；用相同体积的PBS或相同DOX剂量5mg/kg的游离DOX、DOX@BN或DOX@HM-BN处理小鼠；每两天进行三次治疗；测量体重和肿瘤体积，每三天记录一次，持续3周；注射后21天，处死小鼠，切除主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)并用4％福尔马林固定；然后，用苏木精和伊红(H&E)对器官切片进行染色，以评估生物安全性；其中，肿瘤体积(V)的计算公式为：V＝1/2×L×W2(L：肿瘤的长度，W：肿瘤的宽度)。
如图10A所示，PBS治疗组中的肿瘤迅速增加，游离DOX和DOX@BN治疗只能部分延迟肿瘤的生长，肿瘤体积分别减少29.1％和23.3％；相反，在用DOX@HM-BN治疗的小鼠中观察到显著的肿瘤抑制，其中肿瘤抑制率为75.6％。抗肿瘤效果显著增强可能是由于HM包覆可以通过同型靶向延长血液循环和改善DOX在肿瘤部位的积聚。同时，在DOX@HM-BN治疗组中未观察到明显的体重减轻(图10B)。与对照组相比，在治疗组中没有发生明显的组织损伤或发炎病变，这表明DOX@HM-BN具有理想的生物安全性(图10C)。这些结果表明DOX@HM-BN是一种具有生物相容性的肿瘤靶向治疗纳米平台。
综上所述，该基于癌细胞膜仿生氮化硼纳米球的药物输送平台具有出色的可分散性、高负载能力和同型癌细胞的自我选择摄取能力，在靶向肿瘤治疗方面显示出强大的潜力。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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Claims (10)
1.一种肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球，其特征在于，包括氮化硼纳米球和肿瘤细胞膜；其中，所述肿瘤细胞膜包覆所述氮化硼纳米球。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球，其特征在于，由氮化硼纳米球、肿瘤细胞膜和抗肿瘤药物组成；其中，所述氮化硼纳米球上负载所述抗肿瘤药物，所述肿瘤细胞膜包覆负载抗肿瘤药物的氮化硼纳米球。
3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球，其特征在于，所述抗肿瘤药物为DOX。
4.一种如权利要求3所述的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将肿瘤细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球；
步骤三，将DOX加入含有肿瘤细胞膜包覆的氮化硼纳米球的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到所述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将HeLa细胞膜悬浮液与氮化硼纳米球溶液按照比例混合；
步骤二，将步骤一得到的混合物加入Avanti微型挤出机中进行挤出，依次使用孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜，连续过膜挤压20次，离心，得到HeLa细胞膜包覆的氮化硼纳米球HM-BN；
步骤三，将DOX加入含有HM-BN的溶液中，摇匀，然后在黑暗中通过微型挤出机连续过膜挤压；最后离心得到所述肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球DOX@HM-BN。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氮化硼纳米微球是通过化学气相沉积法制备的，具有均匀球形结构。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述HeLa细胞膜的制备方法如下：
(1)用胰蛋白酶消化HeLa细胞，并用预冷的PBS洗涤3次；
(2)将HeLa细胞重悬于PBS溶液中，补充蛋白酶抑制剂防止细胞膜蛋白降解；
(3)采用均质器以30秒的间隔将所述HeLa细胞破碎20次；将含有细胞膜碎片的均质溶液以3200g离心6分钟；然后将上清液以100000g超速离心30分钟；收集透明的HeLa细胞膜沉淀物以备后用。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤三中的离心条件为在4℃；离心速度为13500rpm，离心12分钟。
9.如权利要求1-3任一项所述的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的肿瘤细胞膜仿生氮化硼纳米球。
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- 2021-03-04 CN CN202110240972.8A patent/CN112972422A/zh active Pending
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