JP6426288B2 - 生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途 - Google Patents
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Description
製造例1:気孔拡張された多孔性シリカナノ粒子(mesoporous silica nanoparticle,MSN)の合成
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)3.94gと1Mの水酸化ナトリウム(NaOH)溶液2.28mLとを、メタノールと水の混合溶液800g(メタノール:水=0.4:0.6,w/w)に溶解した。次いで、得られた溶液を激しく攪拌しながら、テトラメトキシシラン(tetramethoxysilane,TMOS)1.3mLを大気条件下で前記溶液に加えた。前記反応混合物を8時間攪拌した後、一晩熟成した。その結果として得られた白色沈殿物を遠心分離し、残っている界面活性剤を除去して精製し、エタノールと水をそれぞれ用いて5回ずつ洗浄した。前記のようにして製造された多孔性シリカナノ粒子を20mLのエタノールに懸濁し、4mLの塩酸を加えた。次いで、前記懸濁液を一晩還流し、白色粉末を得た。前記生成された白色粉末をフィルターでろ過して分離し、エタノールで洗浄した。これにより、2nmの気孔サイズを有する多孔性シリカナノ粒子を得た。
前記製造例1と同様にして製造された、気孔が拡張されたMSNの100mgを10mLのトルエンに懸濁し、アミン機能化のために3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)1mLを加えた。前記懸濁液を一晩還流した後、フィルターを用いてろ過した。残余物をエタノールで10回洗浄し、アミンにより機能化されたMSN(図10a及び図10bの2)を得た。前記アミン−機能化されたMSN30mgを、室温で100mgのDMSO中の3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)[3,3’−dithiodipropionic acid di(N−hydroxysuccinimide ester),DTSP]と一晩反応した。反応混合物をDMSOで3回洗浄した後、10mLのDMSO中のNα,Nα−ビス(カルボキシメチル)−L−リジンハイドレート(アミノブチルNTA,65mg)を加えた。この反応を室温で24時間行った。次いで、エタノールと水で10回ずつ洗浄し、NTA−改質されたMSNを得た。Ni2+をNTA−改質されたMSNに統合するために、前記ナノ粒子を1Mの水性NiSO4に分散した後、室温で24時間攪拌し、エタノールと水で5回ずつ洗浄した。結果として生成された粉末(MSNPN)(図10aの3)を真空下で乾燥し、ヌクレアーゼのない水に分散した。前記懸濁液を使用前まで4℃で保管した。
製造例2と同様にして製造されたアミン−機能化されたMSN(図10a及び図10bの2)30mgをDMSOの1mLに懸濁した。そして、2.5mg/mLの濃度でDMSOに含まれているN−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide,NHS)エステルにより活性化したカルボキシテトラメチルローダミン(carboxytetramethylrhodamine、TAMRA−NHS)溶液10μLを懸濁液に加えた。前記溶液を室温で3時間攪拌した後、遠心分離して粉末(図10bの4)状のTAMRA−結合されたMSNを得た。前記製造例2のような工程により、前記TAMRA−結合されたMSNにNi−NTAを導入し、TAMRA−結合されたMSNPN(図10bの5)を得た。
MSNの表面積、気孔サイズ及び気孔体積の物理的特性を分析するために、窒素の吸着又はロードの実験を行った。窒素の吸着又はロードの等温線は、NOVA吸着装置により測定した。
製造例1と同様にして製造された、気孔拡張された多孔性シリカナノ粒子を、水とエタノールを用いて数回洗浄することにより、表面が陰イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子を得た。
製造例1と同様にして製造された、多孔性シリカナノ粒子をトルエンに懸濁し、アミン機能化のために3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)1mLを加えた。洗浄後、陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子を得た。
本実施例では、製造例4または製造例5と同様にして製造された、表面が陰イオンを帯びる及び/又は表面が陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子の気孔内にタンパク質を吸着又はロードし、前記多孔性シリカ粒子を細胞内に導入することにより、前記タンパク質を細胞内に導入した。具体的には、1xPBSの条件下で蛍光(FITC)表示されたウシ血清アルブミン(bovine serum albumin、BSA)タンパク質と、多孔性シリカナノ粒子とを1:10の重量比で混合した後、これを室温で30分間インキュベートした。その後、前記混合物を細胞培養液に混合して処理することにより、前記タンパク質が吸着又はロードされた前記多孔性シリカナノ粒子を細胞内に導入した。前記処理時間を多様化して観察した後、処理が完了した細胞は、細胞培養液を新たに入れ替えた。図3には、蛍光表示されたウシ血清アルブミンを含む多孔性シリカナノ粒子を処理した細胞の蛍光顕微鏡画像が処理時間ごとに示されている。
本実施例では、β−ガラクトシダーゼ(pI=4.88)を、陽イオンを帯びる多孔性シリカナノ粒子の気孔内に吸着又はロードして細胞内に導入し、細胞内への導入効率及びタンパク質分解酵素の影響を分析した。
本実施例では、多孔性シリカナノ粒子の気孔内に吸着又はロードして細胞内に導入したタンパク質が正常に機能するかどうかを分析してグラフに示した。タンパク質の導入のために、細胞株としてHeLa細胞及びMDA−MB−231細胞を使用した。
様々なモル比で、精製されたプロテアソーム及び製造例2と同様にして製造したMSNPNをPBSに懸濁した後、室温で2時間200rpmで水平的に振とうした。結果として生成されたプロテアソーム−MSNPNの複合体を3000rpmで遠心分離し、3回洗浄した。前記複合体を細胞内伝達のために培養培地に再懸濁した。
ヒトプロテアソームをHTBH−タグされたβ4サブユニットを有する安定なHEK293T細胞株から親和性精製した。前記細胞をプロテアーゼ阻害剤、5mMのATP及び1mMのDTTを含有する溶解バッファー(50mMのNaH2PO4、pH7.5、100mMのNaCl、10%グリセロール、5mMのMgCl2、0.5%NP−40)内にDounce tissue grinders(Wheaton)を用いて均質化した。溶解物を10,000×gで遠心分離し、澄んだ上層液をストレプトアビジンアガロース樹脂(Millipore)とともに4℃で5時間インキュベートした。その後、前記樹脂ビーズをTEVプロテアーゼ含有の溶出バッファー(50mMのTris−HCl、pH7.5、1mMのMgCl2、10%グリセロール、及び1mMのATP)内でインキュベートした。前記精製条件下において、プロテアソーム上で内因性Usp14が発見された(図12)。His−タグされたβ4サブユニットで親和−精製されたヒトプロテアソームは、SDS−PAGE/クーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue、CBB)染色により分析した(図12a)。
TEM画像は、120kVでLIBRA120 EF−TEM(Carl Zeiss、Germany)により取得した。各MSN懸濁液をFormvar−コートされた銅グリッド上に位置させ、蒸発された炭素フィルム(Electron Microscopy Sciences、PA、USA)で安定化した。前記グリッドを観察前に数時間室温で乾燥した。MSNPN及びプロテアソーム−吸着又はロードされたMSNPNのTEM画像を比較するために、各サンプルを前記グリッド上に位置させ、0.5%ウラニルアセテートで染色した。
MSNPN上に吸着又はロードされたプロテアソームの活性を測定するために、PBS内において4℃で30分間、12μgのナノ粒子溶液(10mg/mL)と2.4μgのプロテアソームをインキュベートし、プロテアソーム−MSNPNの複合体を製造した。次いで、検定バッファ(50mMのTris、pH7.5、1mMのEDTA、1mg/mLのアルブミン、1mMの新鮮なATP、1mMの新鮮なDTT)で最終体積が100μLになるように希釈した。その後、検定バッファ中の10μgのプロテアソーム及びプロテアソーム−MSNPNを、検定バッファ中の蛍光性基質suc−LLVY−AMCを含有する96ウェルプレートに加えた。AMC(ex355/em460)の蛍光が結果として測定された。
実施例6と同様にしてプロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体を製造する一方、プロテアソームを多孔性シリカナノ粒子とともに培養した。その後、培養サンプルをスピン・ダウンさせた。ペレット分画は、SDS−PAGE及び免疫ブロット(immunoblotting,IB)により分析した。比較のために、プロテアソーム−MSNPNの複合体と同じ量のプロテアソームを単独で投入した。
プロテアソーム、多孔性シリカナノ粒子及びプロテアソーム−多孔性シリカナノ粒子の複合体をsuc−LLVY−AMC加水分解分析により測定した。
プロテアソーム−MSNPNの複合体による分解を試験するために、より生理的に関連しているプロテアソーム基質であるポリユビキチン化したSic1PY(Ub−Sic1)を用いて、インビトロ(in vitro)Ub−Sic1分解検定を行った。様々な時間の間、プロテアソーム又はMSNPN−プロテアソーム複合体との反応を、抗T17及び抗USP14抗体を用いてSDS−PAGE/IBで分析した。精製されたヒトプロテアソーム又はプロテアソーム−MSNPNの複合体(5nM)を、プロテアソーム検定バッファ(50mMのTris−HCl、pH7.5、100mMのNaCl、10%グリセロール、2mMのATP)内でポリユビキチン化したSic1PY(Ub−Sic1PY;20nM)と、様々な時間の間インキュベートした。サンプルを2×SDSサンプルバッファーと混合し、75℃で10分間沸かした後、抗T7抗原を用いて免疫ブロットした。USP14を維持する前記精製されたプロテアソームがUb−Sic1に用いられたとき、Ub−Sic1は、培養30分内に完全に分解した(図16)。本実施例において、MSNPNに結合された前記プロテアソームがUb−Sic1を分解したが、プロテアソーム単独のものと非常に区別されるパターンをもって分解したことが判明した。特に、初期の時点でプロテアソーム−MSNPNの複合体は、プロテアソーム単独のものよりもさらに迅速にUb−Sic1を分解し、またUb−鎖トリミング効果は少ないものと観察された。これは、推測すると、前記複合体の形成過程の間に、プロテアソームからの内部USP14の電位を反映する(図16)。前記複合体内のUSP14の不足により増加したプロテアソーム活性は、直接プロテアソーム伝達戦略に有利であり得る。
MSNPN(80μg/mL)が処理された細胞は、0.05Mのカコジル酸ナトリウム(sodium cacodylate)バッファ(pH7.2)内で2%パラホルムアルデヒド及び2%グルタルアルデヒドで4℃で4時間固定された。前記サンプルを0.05Mのカコジル酸ナトリウムバッファ(pH7.2)で3回洗浄し、0.05Mのカコジル酸ナトリウムバッファ(pH7.2)中の1%四酸化オスミウム(OsO4)で4℃で2時間後、固定した。その後、水で洗浄し、蒸留水中の0.5%ウラニルアセテートで一括染色した。次に、サンプルを30%〜100%の一連の等位エタノールで脱水した後、100%の酸化プロピレンにより室温で15分間2回脱水した。Spurr樹脂(ERL4221、DER(登録商標)736エポキシ樹脂、NSA及びDMAEと混合される。)のシリーズを用いて浸透を行った。最終的に、試料をモールド内の新しい100%Spurr樹脂内に位置させ、70℃で一晩重合体化した。超薄型セクション(ultrathin section)は、ultramicrotome MTX(RMC、USA)により用意された。セクションをFormvar−コートされた銅グリッドに吸着又はロードし、80kVでTEM(JEM1010、JEOL、Japan)により観察した。
HELA、HEK293−pre1−HTBH、HEK293−trex−htau40、及びtau−BiFCを含む実施例で用いられた細胞は、4.5g/LのD−グルコース及び補充剤として10%ウシ血清培地(Fetal Bovine Serum、FBS)、100units/mLのペニシリン、及び100g/mLのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium、DMEM)で培養した。細胞は、37℃、5%のCO2下で加湿インキュベーター内に維持された。プロテアソーム−MSNPNの複合体で処理される前日に、細胞をラウンドカバーグラス(φ25mm、No.1、Deckglaser、Germany)上に接種した。前記複合体又はその対照を実験前にカバーグラス上の付着細胞に添加した後、インキュベーション時間後に培地を除去した。PBSで細胞を3回集中洗浄することで、結合されていないナノ粒子を除去後、蛍光画像を取得した。
プロテアソームが細胞内に内在化することをMSNPNが可能にするかどうかを測定するために、TAMRA−標識されたMSNPN−プロテアソームの複合体(図10bの5)を血清含有培養培地に加えた。その後、TAMRA−標識されたMSNPN単独で、又はプロテアソーム−MSNPNの複合体(1:50)で24時間処理した。激しく洗浄後、HeLa細胞を蛍光、共焦点及び透過電子顕微鏡により検査した(図17a及び図17b)。複合体は、細胞質内で主に発見されたが、これはエンドサイトーシス小胞に蓄積されることを示す。様々な濃度及びモル比で、前記複合体は、培養後2時間内に細胞に進入し、96時間以上(データは不記載)の間、サイトゾル(cytosol)内で維持された。MSNPN又はプロテアソーム−MSNPN複合体の細胞生存力に関する効果は、300μg/mL未満の濃度において少し観察された(図18)。
細胞をゲニステイン、クロルプロマジン及びノコダゾールなどの様々なエンドサイトーシス阻害剤の存在下で、プロテアソーム−MSNPNの複合体により処理した後、蛍光顕微鏡及び流細胞分析器により測定した。HeLa細胞を12−ウェルプレートに接種し、インキュベーター内で培養した。24時間後、細胞を37℃で、又は無血清培地で4℃で1時間インキュベートしながら、クロルプロマジン(10g/mL)で処理することで、クラトリン依存のエンドサイトーシスを抑制し、ゲニステイン(200M)を処理することで、カベオラ(caveolae)依存のエンドサイトーシスを抑制し、又はアミロライド(50μM)及びノコダゾール(20μM)を処理することで、マクロ飲作用(macropinocytosis)を阻害した。その後、細胞を20g/mLのMSNPNと同一の条件下で1時間インキュベートし、2mLのPBSにより3回洗浄した。ナノ粒子の吸収を定量するために、細胞をトリプシン化して収集し、4℃で遠心分離した後、冷PBSで洗浄した。細胞を1%FBSを含有するPBSに再懸濁し、ろ過した。蛍光強度を、アルゴンレーザーが備えられたAriaIII流細胞分析器(Becton Dickinson、USA)を用いて測定した。実験は3回行い、データは平均±SDとして示した。
MSNPN−媒介されたプロテアソームの伝達が細胞内の総プロテアソームの活性に影響するかどうかをテストした。HeLa細胞を製造例6と同様にして製造したプロテアソーム−MSNPNの複合体により24時間処理した。その後、細胞を100mMのNaCl、5mMのMgCl2、10%グリセロール、0.2%NP4O、1mMのATP、1mMのDTT、及びプロテアーゼ阻害剤を含有する50mMのNaH2PO4(pH7.5)内に溶解した。溶解物を26G3/8”注射器を用いて均質化し、12,000rpmで10分間遠心分離した。結果として生成されたナノ粒子の存在しない上清液を、LLVY−AMC加水分解活性の測定に用いた。プロテアソーム−MSNPNの複合体を含むペレットを検定バッファ(50mMのTris、pH7.5、1mMのEDTA、1mg/mLのアルブミン、1mMのfresh ATP、1mMの新鮮なDTT)に再懸濁し、40μMのLLVY−AMCを用いてプロテアソーム活性を測定した。前記測定は、2分間隔で37サイクルが行われた。前記溶解物からLLVY−AMC加水分解活性からプロテアソーム活性が10μMのMG132により阻害されることが確認された。
外部プロテアソームの伝達が生細胞(living cell)内におけるタンパク質の分解に影響を与えるかどうかを研究するために、ドキシサイクリン誘導(doxycycline induction、誘導可能なタウ細胞株)上で、ヒトタウの最長異性体(htau40)を発現させる、HEK293−誘導された細胞株を使用した。タンパク質サンプルは、還元剤、β−メルカプトエタノール(βME)の存在及び不存在下で製造した。凝集されたタウタンパク質及びこれらの切断された形態は、表示された時間の間Dox処理(0.5μg/mL)後に誘導可能な細胞株から感知された。これらの細胞は、高容量−依存方式によりhtau40を発現させ、SDS−抵抗性タウ凝集体の形成と一致する、培養2日後に徐々にタウ種を移動させた(図20a及び図20b)。タウは、特に、タウ病及びアルツハイマー病(AD)の進行初期段階において、ユビキチン−プロテアソームシステムにより分解されるものと考えられる。
生細胞においてタウオリゴマー化を可視化及び定量化するために、生体分子の蛍光相補性(BiFC)を有するタウ細胞を活用した。htau40に独立して融合されたビーナス(Venus)タンパク質のN−末端部及びC−末端部の両方を本質的に発現するHEK293−誘導された安定な細胞株(Tau−BiFC)を先行技術に基づいて製造した[Zhang, X., etal. The proteasome:A target of oxidative damage in cultured human retina pigment epithelial cells.IOVS49、3622−3630(2008)]。Tau−BiFC細胞を105cells/wellの密度で96ウェルに接種し、DMSO又は30nMのオカダ酸(okadaic acid、OA)で24時間培養してタウオリゴマー化の過程を促進した。蛍光画像を取得し、Operetta(PerkinElmer)で定量して分析した。
Doxによるタウ誘導下で、細胞の生存及びROSの誘導剤であるパラR(paraquat)による還元ストレスを測定するために、誘導可能なタウ細胞ラインは、250pg/mLのDox及び1mMのパラRで3時間の間事前培養された。その後、MSNPNまたはプロテアソーム−MSNPNの複合体で12時間処理した。
グルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子(GSH−MSN)の合成は、図24に示すように行われる。まず、ep−tubeを用いて、気孔が拡張され、かつ陽電荷で表面改質された多孔性シリカ粒子50mgを1mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して十分に分散した。その後、平均分子量312.37、スペーサーアーム(spacer arm)の長さが0.68nmであるスクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)リンカー20mgをep−チューブに入れた。両物質が均一に混合しながら反応が起こるように、24時間の間オービタルシェーカーを用いて常温で十分に反応させた。反応が終了すると、遠心分離機を用いて生成物質を沈め、反応せずに残っているSPDPを除去するためにDMSOとエタノールを用いて洗浄した。この過程を各溶液で3回繰り返し、最後エタノールで洗浄した後、遠心分離機を回し、得られた沈んだ生成物を1mLの3次蒸留水に分散した。その後、平均分子量307.33のグルタチオンを入れ、24時間の間オービタルシェーカーを用いて常温で反応させた。遠心分離機を用いて生成物質を沈めた後、蒸留水とエタノールでそれぞれ5回以上洗浄した。その後、真空ポンプを用いて、残りの溶媒を完全に除去した。グルタチオンの定量は、上層液中に溶けているピリジン−2−チオンの吸光度(A343nm)を紫外線−可視光線分光分析装置により測定することで分かる。以後の実施例への適用のために、合成された粒子は、蒸留水に分散して4℃で保管した。
合成されたナノ粒子の有効成分の効果的な伝達及び作用有無を分析するために、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(Glutathione S−transferase、GST)タグされたタンパク質をロードした。このために、GSTタグされたリボヌクレアーゼ(RNase)を用いて、製造例8のように、グルタチオンで表面改質された多孔性シリカナノ粒子の内部のGSHとRNaseのGSTとのGSH−GST相互作用を用いてロードを試みた。ロード前後の紫外線−可視光線吸光分析法により粒子を分析した。GSTタグされたRNaseをロードした粒子の場合、遠心分離後、上層液に溶解しているロードされていないGSTタグされたRNaseの吸光度を用いてタンパク質のローディング率を測定し、測定された吸光強度を基準とし、278nmにおける吸光値と、従来に報告されている吸光係数(ε=9,800M−1cm−1)を用いたBeer−Lambert式を用いて算出した。
[A:測定された吸光強度、ε:吸光係数、b:測定容器のパスの長さ(1cm)、c:物質のモル濃度]
合成されたGSH−MSNが有効物質であるタンパク質を正しくロードした状態で細胞内に導入後、細胞質に放出することにより、DNAやRNAのような核酸の発現量の調節を検証しようとした。ロードされているRNaseが効果的なロード及び安定な放出が可能な場合、標的する一本鎖核酸を分解することにより、核酸が持っている潜在的疾病を抑制する治療目的への適用が可能となる。この効能を検証するために、THP−1に細胞株で発現される特定のRNAを標的とし、これを分解するRNaseを候補タンパク質として定め、1X PBS緩衝溶液と10mMのMgCl2の存在下でin vitro実験を行った。Ep−tubeでRNase@MSNを用意し、一本鎖RNA(ssRNA)を入れた後、30分間、37℃の環境で反応を進行した。その後、ゲル電気泳動によりRNAの分解有無を確認した。図26に示すように、ナノ粒子にロードされたRNaseの機能が効果的に作動することを確認した。その後、細胞レベルにおける治療機能の潜在力を検証しようとした。50,000個のTHP−1細胞株を12ウェル培養プレートに分注し、24時間後にホルボール 12−ミリステート 13−アセテート(PMA)を入れて分化した。その後、4μgのGSTタグされたRNaseをGSH−MSNにロードし、血清のない細胞培地とともに4時間処理した。その後、1X PBSで残りの物質を2回洗浄し、血清を含む新しい培地に入れ替え、12時間の間、5%CO2、37℃の環境でさらに細胞成長を進めた。その後、qRT−PCRにより、特定のRNAの発現量をゲル電気泳動により比較した。図26は、本願の多孔性シリカナノ粒子をタンパク質伝達体として活用して特定のRNAの発現を抑制するRNase伝達と機能的な有効性を分析した結果を示すものである。(a)は、ep−tube段階におけるin vitro RNase活性分析であり、ゲル電気泳動によるRNA分解有無を分析した結果を示す画像であり、(b)は、qRT−PCRによるTHP−1細胞株における特定のRNA発現量を分析したグラフである。図26に示すように、MSNを用いるRNaseの伝達では、約5〜60%のRNA発現抑制効率が得られた。また、本発明者らが合成したナノ粒子は、外部物質の細胞内導入が比較的困難な細胞株に対しても、タンパク質を始めとする目的に合う薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能なものと判断された。
前記細胞レベルにおける効果的なタンパク質伝達の結果をもとに、動物レベルにおける薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルの伝達体としての役割が可能なことを検証しようとした。そのために、マウス(ラット)を実験対象とし、Balb/c nude雄マウスを(株)オリエントバイオから購入し、RNase(シグマアルドリッチコリア社)を1xPBS(pH7.4)の条件で陰イオンを有するMSNに静電気的引力でロードして、マウスに注入しようとした。5週齢のマウスにHeLa細胞を植えて異種移植(xenograft)腫瘍を成長させ、RNase伝達による腫瘍治療の効果を観察した。滅菌された1xPBSに3,000,000個のHeLaを分散し、マウスに皮下投与した。70mm3まで腫瘍が成長したとき、PBS、MSN及びRNaseをロードしたMSNをそれぞれマウスの腫瘍内に注射投与した。図27に示すように、PBS又はMSNのみを注入したマウスでは、腫瘍の成長抑制効果が示されなかったが、RNaseをロードしたMSNを注入したときに、腫瘍の大きさが約3倍〜約4倍減少したことを確認できる。前記動物実験の結果から、本願に係るMSNは、薬剤学的有効物質の伝達及び治療研究に適したレベルの伝達体としての役割が可能なことを確認した。
前記細胞レベルにおける効果的なタンパク質伝達の結果をもとに、動物レベルにおける安定的かつ効果的なタンパク質伝達体としての役割が可能であるかを検証しようとした。そのために、マウス(ラット)を実験対象とし、Balb/c nude雄マウスを(株)オリエントバイオから購入し、Cy5蛍光が接合された陽イオンを有するMSN(Cy5−MSN)を準備した。FITC蛍光染料が接合されたイムノグロブリンG(FITC−IgG、シグマアルドリッチコリア社)を1xPBS(pH7.4)の条件で静電気的引力でロードして、マウスに注入しようとした。5週齢のマウスにHeLa細胞を植えて異種移植(xenograft)腫瘍を成長させた。その後、FITC−IgGとCy5−MSNの伝達による蛍光強度及び分布をOptix Mx3(GE Healthcare、USA)装置により観察した。滅菌された1xPBSに3,000,000個のHeLaを分散し、マウスに皮下投与した。70mm3まで腫瘍が成長したとき、PBS、Cy5−MSN、FITC−IgG、FITC−IgGがロードされたCy5−MSNをマウス腫瘍内に注射投与した。図28a及び28bに示すように、MSNとIgGは、腫瘍組織によく伝達された。MSNにロードしていない状態のIgGは、MSNにロードしたIgGと比較して、腫瘍に注入後、比較的早く蛍光信号が消えることを確認することができる。前記動物実験の結果から、本願に係るMSNは、薬剤学的有効物質の高い安定性とその機能を効果的に維持することにより、治療研究に適したレベルにおける伝達体としての役割が可能なことを確認した。
Claims (11)
- 平均気孔径が1nm以上〜100nm以下の気孔を有し、前記気孔を形成する気孔表面と外部表面とを含む多孔性シリカナノ粒子と、
前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔表面に結合し、i)前記気孔表面に陰電荷又は陽電荷を付与する官能基、ii)生理活性物質に特異的に結合するリガンド及びiii)前記官能基及び前記リガンドの組み合わせの少なくとも一つと、
前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔の内部に収容されるサイズを有し、前記官能基と前記リガンドの少なくとも一つに結合され、前記多孔性シリカナノ粒子の前記気孔に吸着またはロードされる生理活性物質と、を含み、
前記生理活性物質は、13.7kDa〜2,000kDaの前記サイズを有するタンパク質であることを特徴とする、生理活性物質伝達用組成物。 - 前記生理活性物質は、44kDa〜2,000kDaの前記サイズを有するタンパク質である、請求項1に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、リボヌクレアーゼ(RNase)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ウシ血清アルブミン(BSA)、イムノグロブリンG(IgG)、β−ガラクトシダーゼ、26Sヒトプロテアソーム及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- ニッケル、ニッケル−ニトリロ三酢酸、グルタチオン、デキストリン、ビオチン又はストレプトアビジンを含むリガンドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記多孔性シリカナノ粒子の前記外部表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチド及びアプタマーの少なくとも一つをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、(i)プロテアソームを含むタンパク質複合体、(ii)カスパーゼ(caspase)、キナーゼ(kinase)及びホスファターゼ(phosphatase)からなる群より選択される酵素、及び(iii)抗体からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、全身ホルモン、サイトカイン、成長因子及び細胞の分化と増殖を調節するタンパク質、治療過程に関連する調節因子及び傷を治療できる能力を有する成長因子、サイトカイン及びホルモンからなる群より選択されたものを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、形質変換成長因子−βスーパーファミリー(TGF−β)タンパク質または大食細胞−コロニー形成刺激因子(M−CSF)である請求項1に記載の組成物。
- 前記生理活性物質は、薬物、miRNA、siRNA、又はビタミンを含むものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記多孔性シリカナノ粒子の前記外部表面に結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチド、及びアプタマーの少なくとも一つをさらに含む、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1の組成物を目的の細胞内に導入する工程を含み、
前記組成物を目的の細胞内に導入する工程は、前記組成物を細胞培養液に加えて前記目的の細胞内に導入する工程を含む生理活性物質の伝達方法。
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