CN104023711A - 用于靶向递送(包括负载物的透皮递送)的多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)及其方法 - Google Patents

用于靶向递送(包括负载物的透皮递送)的多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)及其方法 Download PDF

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C.E.阿什莉
C.J.布林克尔
E.C.卡恩斯
M.H.菲克拉扎德
L.A.费尔顿
O.内格里特
D.P.帕迪利亚
B.S.威尔金森
D.C.威尔金森
C.L.威尔曼
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UNM Rainforest Innovations
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STC UNM
Sandia Corp
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Abstract

本发明涉及特异性靶向肝细胞和其它癌细胞的原始细胞，其包含：1)具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅核、至少一种促进癌细胞死亡的药剂(例如传统小分子、大分子负载物(例如，siRNA或蛋白质毒素，如蓖麻毒素A链或白喉毒素A链)，和/或在纳米多孔二氧化硅核中处理的(优选超螺旋的以更有效地将DNA封装入原始细胞)的组蛋白封装的质粒DNA，所述纳米多孔二氧化硅核任选地经核定位序列修饰以有助于在癌细胞的细胞核内定位原始细胞和表达以下肽的能力：涉及癌细胞治疗(细胞凋亡/细胞死亡)的肽，或作为报告子，一种靶向待治疗组织中的癌细胞从而使得原始细胞和靶细胞的结合是特异性的和增强的靶向肽和一种促进原始细胞和包封的负载物(包括DNA)的内体逃逸的融合肽)。本发明的原始细胞可用于治疗癌症，尤其包括使用选择性结合肝细胞组织的新型结合肽(c-MET肽)治疗肝细胞(肝)癌，或者用于癌症诊断，包括癌症治疗和药物发现。

Description

用于靶向递送(包括负载物的透皮递送)的多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)及其方法
相关申请和政府支持
本发明要求于2011年10月14日提交的、名为“Engineering NanoporousParticle-Supported Lipid Bilayers(‘Protocells’)for Transdermal Cargo Delivery”的美国临时申请61/547,402；于2011年12月21日提交的名为“EngineeringNanoporous Particle-Supported Lipid Bilayers(‘Protocells’)for TransdermalCargo Delivery”的美国临时申请61/578,463的优先权，其全部内容在此引入作为参考。
本申请还要求于2011年12月19日提交的、名为“Delivery of TherapeuticMacromolecular Cargos by Targeted Protocells”的美国临时申请61/577,410的优先权，其全部内容在此引入作为参考。
本发明是由政府支持在美国国立卫生研究院批准号PHS 2 PN2EY016570B、美国国立癌症研究院批准号1U01CA151792-01、美国空军科学研究室批准号FA 9550-07-1-0054/9550-10-1-0054、美国国家环境卫生科学研究院(NIEHS)的1U19ES019528-01、美国国家科学基金会NSF:EF-0820117和美国国家科学基金会的DGE-0504276下作出的。美国政府对本申请拥有某些权利。
发明领域
本发明的实施方案涉及特异性靶向患者体内细胞的原始细胞，尤其包括含有以下的肝细胞和其它癌细胞：1)纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核；2)受支撑的脂质双层；3)至少一种促进癌细胞死亡的药剂(例如传统小分子、大分子负载物(siRNA、shRNA、其它微RNA，或蛋白质毒素，如蓖麻毒素A链或白喉毒素A链)，和/或DNA，包括双链或线性DNA，质粒DNA，其可以是超螺旋和/或经如组蛋白封装并在纳米多孔二氧化硅核中处理的(优选超螺旋的以更有效地将DNA封装入原始细胞)，所述纳米多孔二氧化硅核任选地经核定位序列修饰以有助于在癌细胞的细胞核内定位原始细胞和表达以下肽的能力：涉及癌细胞治疗(细胞凋亡/细胞死亡)的肽，或作为报告子，一种靶向待治疗组织中的癌细胞从而使得原始细胞和靶细胞的结合更特异性和增强的靶向肽和一种促进原始细胞和包封的负载物(包括DNA)的内体逃逸的融合肽)。本发明的原始细胞可用于治疗癌症，尤其包括使用选择性结合肝细胞组织的新型结合肽(c-MET肽)治疗肝细胞(肝)癌，或者用于癌症诊断，包括癌症治疗和药物发现。
在一些实施方案中，本发明的原始细胞促进多种活性成分的递送。显著地，这些原始细胞有效地增强角质层通透性并使包括大分子的活性成分透皮递送。
在一些实施方案中，本发明提供了稳定的、疏水性的和超疏水性的多孔纳米颗粒，其用于在环境如胃中递送多种活性成分。
在一些其它实施方案中，本发明提供了用于递送多种活性成分的透皮原始细胞，所述原始细胞包含多个装载有siRNA的中孔纳米颗粒二氧化硅核，其中所述siRNA诱导NiV核壳体蛋白(NiV-N)mRNA的序列特异性降解，和促进胃中多种活性成分递送的胃上浮(gastrically-buoyant)原始细胞。
发明背景
包封在纳米载体内的药物的靶向递送可潜在地改善常规“游离”药物所呈现的多种问题，包括不良的溶解性、有限的稳定性、快速的清除，和尤其地缺乏选择性，其导致对正常细胞的非特异性毒性并妨碍清除患病细胞所需的剂量爬升。被动靶向方案(其依赖于增强的肿瘤脉管系统通透性和降低的肿瘤淋巴系统的引流效能以在肿瘤位点直接蓄积纳米载体(所谓的增强的通透性和滞留，或EPR效应))克服了很多上述问题，但诱导纳米载体细胞内摄作用所需的细胞特异性相互作用的缺乏降低了治疗效果并可导致药物排出和诱导多重耐药性。
纳米药物的一个挑战是越过细胞膜在高浓度下操纵可有效包封负载物(例如药物)的纳米结构和材料，并在规定时间内在靶点处可控地释放所述药物。最近，无机纳米颗粒已成为纳米药物中新一代药物或治疗递送载体。更最近，采用香豆素、偶氮苯、轮烷、聚合物或纳米颗粒的门控方法已被开发用于在颗粒内密封负载物并允许根据光学或电化学刺激触发的释放。
尽管脂质体由于其低免疫原性和低毒性已被广泛用于药物递送中，它们仍需要在若干方面进行改善。首先，负载物的装载仅可在制备脂质体的条件下实现。因此，负载物的浓度和种类可能受限制。其次，脂质体的稳定性相对较低。脂质体的脂质双层经常趋向老化和融合，这改变了脂质体的大小和大小分布。第三，在脂质体破裂时，脂质体中负载物的释放是瞬时的，从而使得很难控制释放。
多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)(通过脂质体与纳米多孔二氧化硅颗粒的融合形成)是一种新型的纳米载体，其解决了与癌症治疗和诊断靶向递送相关的多种挑战。与脂质体类似，原始细胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但与类似大小的脂质体递送剂相比，其纳米多孔二氧化硅核赋予了极大增加的负载物容量并延长了双层的稳定性。可进一步调节该核的孔隙率和表面化学以促进多种治疗剂如药物、核酸和蛋白质毒素的包封。可通过该核的孔径、化学组成和二氧化硅的总压缩度来控制负载物的释放率，使得原始细胞可用于需要突然释放或控制释放特点的应用中。最后，该原始细胞的受支撑的脂质双层(SLB)可经不同配体的修饰以促进选择性递送并经PEG修饰以延长循环时间。
改善化疗剂活性和增强癌症治疗的需要一直存在。使用原始细胞与替代方法的结合以靶向、结合、促进癌症的侵袭并使化疗剂在接近其活性位点处滞留是癌症疗法的重要方面。进行本发明以推进癌症治疗领域并且通过增强癌症治疗剂的给药或诊断改善可影响治疗结果的药剂的递送，促进诊断癌症和监测癌症治疗的方法。
还需要透皮递送载体，其经设计最适地穿透角质层以促进此前受限于通过其它较劣势途径给药的活性成分的递送。
发明目的
本发明的目的涉及提供对原始细胞技术，对原始细胞本身，对包含此类原始细胞的药物组合物的改善以及将本发明的原始细胞和药物组合物用于治疗和诊断(包括监测治疗)的方法。
本发明实施方案的另外的目的涉及新型MET结合肽，其用于本发明其它实施方案的药物组合物和方法。
从本说明书呈现的描述的概览，可容易地悉知本发明的这些和/或其它目的。
发明概述
本发明的实施方案涉及特异性靶向细胞(尤其是肝细胞和其它癌细胞)的原始细胞。
在一些方面，本发明涉及靶向细胞的多孔原始细胞，其包含具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核和至少一种选自以下的其它组分：
靶向细胞的物种；
促进原始细胞内体逃逸的融合肽；
和包封的DNA，以及包含至少一种选自以下的负载物组分的其它负载物：
双链线性DNA或质粒DNA；
药物；
显像剂；
小干扰RNA、小发夹RNA、微RNA或其组合；
其中所述负载物组分的一种任选地进一步与核定位序列缀合。
在一些实施方案中，本发明实施方案的原始细胞包含具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅核、包含任选促进癌细胞死亡的至少一种治疗剂的负载物例如传统小分子、大分子负载物(例如siRNA，如S565、S7824和/或s10234，其中，shRNA或蛋白质毒素，如蓖麻毒素A链或白喉毒素A链)和/或在纳米多孔二氧化硅核中处理的(优选超螺旋的以更有效地将DNA封装入原始细胞)封装质粒DNA(在一些实施方案中为组蛋白封装的)，所述纳米多孔二氧化硅核任选地经核定位序列修饰以有助于在癌细胞的细胞核内定位或呈现该质粒和表达涉及癌细胞治疗(例如癌细胞的细胞凋亡/细胞死亡)的肽的能力，或作为报告子(绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白，其中，本文另有描述)用于诊断应用。本发明的原始细胞包含靶向治疗细胞(组织中待治疗的癌细胞)从而使得该原始细胞与靶细胞的结合是特异性的和增强的靶向肽，以及促进原始细胞和包封DNA的内体逃逸的融合肽。本发明的原始细胞可用于治疗和诊断，更具体地用于治疗癌症和其它疾病，包括病毒感染，尤其包括肝细胞(肝)癌。在本发明的其它方面，原始细胞使用选择性结合癌组织(包括肝细胞、卵巢和宫颈癌组织，除外其它组织)的新型结合肽(MET结合肽，本文另有描述)用于癌症的治疗和/或诊断，包括癌症治疗和药物发现的监测。
在一方面，本发明实施方案的原始细胞包括多孔纳米颗粒原始细胞，其常包含具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅核。在本发明的该方面，该原始细胞包含靶向肽，其常为本文另有描述的MET受体结合肽，常与该原始细胞表面上的融合肽结合。该原始细胞可装载有多种治疗性和/或诊断性负载物，包括例如小分子(治疗性和/或诊断性的，尤其包括抗癌和/或抗病毒剂(用于治疗HBV和/或HCV))，大分子包括多肽和核酸(包括RNA(shRNA和siRNA)或包含核定位序列的超螺旋和组蛋白封装的质粒DNA，其可以是治疗性的和/或诊断性的(包括报告子分子，如荧光肽，其中包括绿色荧光蛋白/FGP、红色荧光蛋白/FRP)。
本发明的透皮实施方案包括含有以下多孔纳米颗粒的原始细胞：(a)装载有一种或多种药学活性剂和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，其中所述脂质双层包含一种或多种选自以下的角质层通透性促进剂：单饱和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸(mead acid)、芥酸和神经酸，最优选油酸)、醇、二醇(最优选聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜软化剂(edge activator)如胆盐、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、单链表面活性剂(例如去氧胆酸钠)，且其中该原始细胞具有的平均直径为约50nm至约300nm，更优选约55nm至约270nm，更优选约60nm至约240nm、更优选约65nm至约210nm、更优选约65nm至约190nm、更优选约65nm至约160nm、更优选约65nm至约130nm、更优选约65nm至约100nm、更优选约65nm至约90nm、更优选约65nm至约80nm、更优选约65nm至约75nm、更优选约65nm至约66、67、68、69、70、71、72、73、74或75nm、最优选约70nm。
因此，在一方面，本发明提供了包含大量多孔纳米颗粒的透皮原始细胞，所述多孔纳米颗粒：(a)装载有一种或多种药学活性剂和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，其中所述脂质双层包含一种或多种选自以下的角质层通透性促进剂：单饱和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶剂、共溶剂、渗透促进肽和核苷酸以及膜软化剂(edge activator)，其中该原始细胞的平均直径为约50nm至约300nm。该单饱和ω-9脂肪酸可选自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神经酸，最优选油酸，和其混合物。该醇可选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它们的混合物，且该溶剂和共溶剂可选自PEG400和DMSO。该二醇可选自乙二醇和丙二醇，以及它们的混合物。该膜软化剂可选自胆盐、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、单链表面活性剂，以及它们的混合物。在一项优选实施方案中，该膜软化剂为去氧胆酸钠。
与口服和胃肠外途径相比，透皮给药途径是一种更优途径。口服给予的药物经历首过代谢并可具有与食物和消化道宽pH范围的不良相互作用。胃肠外给药痛苦，产生生物有害性废物并且不能自行给药。透皮药物递送解决了所有与口服和胃肠外途径有关的上述问题。此外，透皮递送系统(TDDS)允许持续数天的可控释放曲线。然而，与透皮药物递送有关的主要挑战存在于皮肤表皮的最外层-角质层。由于角质层的结构类似于“砖泥结构(brick andmortar)”，其赋予了皮肤屏障功能。“砖”由富含蛋白质、糖蛋白、脂肪酸和胆固醇的扁平的角质细胞组成。包含“泥”的细胞间隙富含由神经酰胺、胆固醇、脂肪酸组成的双层，并展现类似于丁醇的极性。在过去40年中，已经开发了3代TDDS。第一代系统利用低分子量亲脂性化合物的扩散。第二代和第三代系统认识到角质层的通透性是关键。这些策略除去/绕过角质层或利用化学促进剂、生化促进剂和电动势来增加角质层的通透性。在不同的促进策略中，已显示脂质体可破坏角质层高度有序的结构并随后增加皮肤的通透性。
在本文的一项实施方案中，描述了纳米多孔颗粒支撑的脂质双层(“原始细胞”)的开发，以用作TDDS。原始细胞通过将脂质体静电融合至纳米多孔二氧化硅颗粒核而形成。它们协同地结合了无机纳米颗粒和脂质体的优点，如可调的孔隙率、能够高容量装载不同类型负载物的高表面积，和具有可调的流动性的受支撑的脂质双层(SLB)(其可经多种分子修饰)。这些生物物理学和生物化学性质使得该原始细胞可被修饰用于不同的应用。在我们的前期研究中，使用电感耦合等离子体质谱，我们表明0.1-0.5重量％我们的标准原始细胞制剂(55％DOPE、30％胆固醇、15％PEG-2000)以8.125mg给药能够穿过患者衍生的全层腹部皮肤。此外，我们证明0.3-2.4重量％原始细胞能够穿过角质层已被除去的断层皮肤。
所述透皮原始细胞的纳米多孔二氧化硅颗粒核具有高表面积、易变的孔隙率和易于修饰的表面化学。这些性质使得原始细胞核能够高容量装载多种不同类型的负载物。所述原始细胞的受支撑的脂质双层(SLB)具有固有的低免疫原性。此外，SLB提供可与肽、聚合物和其它分子缀合的液体表面从而促进靶细胞摄取。这些生物物理学和生物化学性质使得原始细胞对特定环境最优化，促进其穿透进入角质层并随后经透皮途径递送不同类型的负载物。治疗癌症的方法是本发明透皮原始细胞治疗用途的一个实例。还描述了相关的药物组合物。
在一项实施方案中，本发明提供了原始细胞，其包含可经含胺硅烷如N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)修饰的大量带负电荷的、纳米多孔的、纳米颗粒的二氧化硅核，所述二氧化硅核(a)装载有siRNA或蓖麻毒素A链和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBDPC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合，且其中所述脂质双层包含阳离子脂质和一种或多种两性离子磷脂。
在前述章节的实施方案中，所述脂质优选选自1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物，且所述原始细胞具有至少一个以下特征：BET表面积大于约600m2/g、孔体积分数为约60％至约70％、由具有平均直径为约20nm至约30nm的孔组成的多模式孔形态学、通过具有平均直径为5nm至约15nm的孔互相连接的表面可及的孔。优选地，所述原始细胞每1010纳米颗粒二氧化硅核包封约10nM siRNA。
在另一项实施方案中，本发明提供了原始细胞，其包含可经含胺硅烷如AEPTMS修饰的大量带负电荷的、纳米多孔的、纳米颗粒的二氧化硅核，所述二氧化硅核(a)装载有一种或多种靶向周期蛋白超家族成员(其选自细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E)的siRNA；和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合，且其中(1)所述脂质双层装载有SP94和内体裂解肽，和(2)所述原始细胞选择性的与肝细胞癌细胞结合。
在前述章节的实施方案中，所述脂质双层优选包含约为55:5:30:10质量比的DOPC/DOPE/胆固醇/PEG-2000。
治疗癌症如肝癌的方法是本发明AEPTMS修饰的原始细胞治疗用途的一个实例。还描述了相关药物组合物。
在另一项实施方案中，本发明提供包含大量纳米多孔的、纳米颗粒二氧化硅核的原始细胞，所述二氧化硅核：(a)装载有诱导Nipah病毒(Niv)核壳体蛋白(NiV-N)mRNA序列特异性降解的siRNA，和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。
在前述章节的原始细胞的一些实施方案中，所述脂质双层包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、纳米颗粒二氧化硅核各自平均直径为约100nm，平均表面积大于1,000m2/g和平均直径为约20nm至约25nm的表面可及的孔，并且每1010颗粒装载约1μM siRNA或更多。所述靶向肽优选为结合ephrin B2(EB2)的肽，且最优选为TGAILHP(SEQ IDNO:18)。
最优选地，所述原始细胞包含约0.01至约0.02重量的TGAILHP、约10重量％的PEG-2000和约0.500重量％的R8。
治疗被Nipah病毒(NiV)感染或有NiV感染风险的受试者的方法是本发明包含诱导Nipah病毒(NiV)核壳体蛋白(NiV-N)mRNA序列特异性降解的siRNA的原始细胞治疗用途的一个实例。还描述了相关的药物组合物。
本发明实施方案的其它方面涉及药物组合物。本发明的药物组合物包含原始细胞群，其可以是相同或不同的并且与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合配制。所述原始细胞可单独配制或与另一种生物活性剂(如额外的抗癌剂或抗病毒剂)组合配制，取决于所治疗的疾病和给药途径(本文另有描述)。这些组合物包含经修饰用于特定目的(例如，治疗，包括癌症治疗，或诊断，包括癌症治疗的监测)的原始细胞。药物组合物包含有效群体的原始细胞与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合用于特定目的和给药途径。
本发明的实施方案还涉及利用本文所述的新型原始细胞的方法。因此，在替代实施方案中，本发明涉及治疗疾病和/或病症的方法，其包括向有需要的患者或受试者给予有效量的本文另有描述的药物组合物。本发明的药物组合物具体地用于治疗多种疾病状态，尤其包括癌症和继发于癌症或为癌症起因的疾病状态或病症(具体地，HBV和/或HCV感染)。
在其它替代方面，本发明涉及诊断癌症的方法，所述方法包括给予包含原始细胞群的药物组合物，所述原始细胞经修饰以递送对癌细胞具有选择性的诊断剂或报告子显像剂从而确定患者的癌症。在该方法中，本发明的原始细胞可通过包含至少一种与癌细胞结合的靶向肽以适于靶向癌细胞，所述癌细胞表达多肽或更普遍地，表达表面受体或细胞膜组分，其为所述靶向肽的目标，并且通过包含靶向所述癌细胞的原始细胞的报告子组分(包括显像剂)，可用于通过与具有标准信号的报告子比较信号确认患者或受试者中癌性组织的存在和大小。所述标准信号可例如自健康患者或作出诊断的已知具有疾病的患者的群体获得。一旦诊断，可实施含有本发明药物组合物的适当治疗或替代治疗。
在本发明的其它方面，本发明的组合物可用于监测特定疾病状态和/或病症的治疗过程，包括含有本发明组合物的治疗。在本发明的该方面，可向正在进行治疗的患者或受试者给予包含特异性结合癌细胞并含有报告子组分的原始细胞群的组合物从而可监测所述疾病状态治疗的进展。
本发明的替代方面涉及五(5)种新型MET结合肽，本文另有描述，其可因在多种癌细胞(包括肝细胞、宫颈和卵巢细胞，在癌性组织为数众多的其它细胞中)中结合MET蛋白的优势用作本发明一些实施方案的原始细胞上的靶向肽或用于药物组合物中。本发明的一项实施方案涉及五(5)种不同的7肽，其显示作为MET受体(也称为肝细胞生长因子受体，由c-MET基因表达)的新型结合肽活性。这五(5)种7肽如下：
ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)    SEQ ID NO:1
TATFWFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)    SEQ ID NO:2
TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)    SEQ ID NO:3
IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)    SEQ ID NO:4
WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)    SEQ ID NO:5
这些肽的每一种可单独使用或与上述组内的其它MET结合肽或一系列其它靶向肽(例如，如本文所述的SP94肽)(其可协助将本发明实施方案的原始细胞与癌细胞(包括肝细胞癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞，在无数癌细胞中)结合)组合使用。这些结合肽还可单独作为MET结合肽用于药物组合物以治疗癌症和在其它方面抑制肝细胞生长因子结合受体。这些肽可单独配制或与其它生物活性剂组合配制以提供预期结果。药物组合物包含与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合的有效量的上文确认的五(5)种MET结合肽中的至少一种，任选与额外的生物活性剂(其可包括抗癌剂、抗病毒剂或其它生物活性剂)组合。
附图简述
图1显示可改变本发明所用的一项实施方案的纳米颗粒(其通过气溶胶辅助EISA方法制备)以控制颗粒大小和分布。
图2显示根据一项实施方案经设计定制用于多种类型负载物的孔径和框架并且气溶胶化辅助组分易于渗入。
图2A显示图2的a、b、c和e是被CTAB、B58、P123和PS+B56模板化的。A、B、D和E是被CTAP+NaCl、3％重量P123、3％重量P123+聚(丙二醇丙烯酸酯)、微乳剂和CTAB(NH4)2S04模板化的。
图3显示孔表面化学(即，电荷和疏水性)和孔径主要由有机硅烷和硅酸的共缩合通过一项实施方案的共自组装或后自组装衍生控制。参见Lin等人,Chem.Mater.15,4247-56 2003；Liu,J.等人,J.Phys.Chem.,104,8328-2339,2000；Fan,H.等人,Nature,405,56-60,2000和Lu,Y.等人,J.Am.Chem.Soc.,122,5258-5261,2000。
图4描述了使用组蛋白封装CB1质粒。
(A)示意图描述了用于将CB1质粒(pCB1)超螺旋，使用H1、H2A、H2B、H3和H4封装超螺旋pCB1，并使用促进通过核孔易位的核定位序列(NLS)修饰所得pCB1-组蛋白复合物的方法。(B)和(D)CB1质粒(B)和组蛋白封装的pCB1(D)的原子力显微镜(AFM)图像。比例尺＝100nm。(C)和(E)分别对应于(B)和(D)中红线的高度剖面图。
图5描述了装载有组蛋白封装的pCB1的MC40-靶向中孔二氧化硅纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)的合成。(A)示意图描述了用于生成DNA-装载的、肽靶向的原始细胞的方法。通过简单地将颗粒浸入pCB1-组蛋白复合物溶液中将组蛋白-封装的pCB1装载至形成原始细胞核的中孔二氧化硅颗粒中。然后将PEG化的脂质体与DNA-装载的核融合以形成受支撑的脂质双层(SLB)(其进一步经结合HCC的靶向肽(MC40)和促进内化原始细胞内体逃逸的内体裂解肽(H5WYG)修饰)。巯基-胺交联子(间隔臂＝9.5nm)用于将经C-端半胱氨酸残基修饰的肽缀合至SLB的DOPE部分。(B)可用作原始细胞核的中孔二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图像。比例尺＝200nm。插入图＝扫描电子显微镜(SEM)图像，其证明15-25nm孔是表面可及的。插入图比例尺＝50nm。(C)中孔二氧化硅纳米颗粒的大小分布，其由动态光散射(DLS)测定。(D，左轴)中孔二氧化硅纳米颗粒的累积孔体积图，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由图S-4A所示的氮吸附等温线的吸附支计算得到。(D，右轴)pCB1-组蛋白复合物的大小分布，其通过DLS测定。
图6显示中孔二氧化硅纳米颗粒对组蛋白封装的pCB1具有高容量，且根据一项实施方案，所得的原始细胞仅在模拟内体环境的条件下释放包封的DNA。(A)可包封在未经修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒(ζ＝-38.5mV)或经APTES(一种含胺硅烷)修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒(ζ＝+11.5mV)内的pCB1或组蛋白封装的pCB1(“复合物”)的浓度。(B)当1x106细胞/mL与1x109MC40-靶向的、pCB1-装载的原始细胞一起在37℃孵育24小时时，对ZsGreen(一种由pCB1编码的绿色荧光蛋白)变得阳性的Hep3B的百分数。X轴详细说明了原始细胞核是否经APTES修饰和pCB1是否经组蛋白预封装。将经DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封装的pCB1包括在(A)和(B)中作为对照。(C)和(D)暴露于模拟体液(C)或pH5缓冲液(D)后，组蛋白封装的pCB1从未经修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒和相应原始细胞的时间依赖性释放。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000组成，且对于(B)，经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图7提供了描述MC40靶向的原始细胞将组蛋白封装的pCB1递送至HCC的方法的示意图。[1]由于靶向肽向Met(其被多种HCC系过表达)的募集，MC40靶向的原始细胞高亲和性地与Hep3B细胞结合。流体DOPC SLB提高肽的活动性，因此使经低MC40密度修饰的原始细胞保持对Hep3B的高特异性亲和性(见图8A)。[2]MC40靶向的原始细胞经受体介导胞吞作用被Hep3B内化(见图8B和图15A)。[3]内体条件使SLB[插入天然材料参考]去稳定并引起H5WYG内体裂解肽质子化，这两种情况使得组蛋白封装的pCB1在Hep3B细胞质中变得分散(见图16B)。[4]当pCB1-组蛋白复合物经核定位序列(NLS)修饰时，其在～24小时内在Hep3B细胞的细胞核中变得浓缩，这使得分裂和非分裂癌细胞能够有效转染(见图17)。
图8显示MC40靶向的原始细胞高亲和性地与HCC结合并被Hep3B而不是正常的肝细胞内化。(A)当暴露于Hep3B或肝细胞时，MC40靶向的原始细胞的表观解离常数(Kd)；Kd值与特异性亲和性负相关并且从饱和结合曲线(见图S-11)测定。误差棒表示n＝5的95％置信区间(1.96σ)。(B)和(C)在37℃暴露于1000倍过量MC40靶向原始细胞1小时的Hep3B(B)和肝细胞(C)的共聚焦荧光显微镜图像。Met经Alexa488标记的单克隆抗体(绿色)染色，原始细胞核经Alexa594(红色)染色，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)染色。比例尺＝20μm。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修饰。
图9显示MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞在皮摩尔浓度诱导HCC的细胞凋亡但对正常肝细胞的活力具有最小的影响。在37℃ Hep3B持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞后，细胞周期蛋白B1 mRNA和细胞周期蛋白B1蛋白质表达的剂量(A)和时间(B)依赖性降低。将细胞在(A)中暴露于多种pCB1浓度48小时和在(B)中暴露于5pM pCB1多种时间周期。纳入肝细胞中细胞周期蛋白B1和Hep3B中ZsGreen的表达作为对照。分别采用实时PCR和免疫荧光测定细胞周期蛋白B1 mRNA和蛋白质浓度。(C)在37℃持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞([pCB1]＝5pM)多种时间周期后，停留在G2/M期的Hep3B的百分数。G2/M期的肝细胞和S期的Hep3B的百分数纳入用于比较。在细胞周期分析前，细胞经Hoechst 33342染色。(D)在37℃持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞([pCB1]＝5pM)多种时间周期后，凋亡的Hep3B的百分数。对凋亡标记物呈阳性的肝细胞的百分数纳入作为对照。对Alexa647标记的膜联蛋白V呈阳性的细胞被认为处于细胞凋亡的早期，而对膜联蛋白V和碘化丙啶均呈阳性的细胞被认为处于细胞凋亡的晚期。通过添加单-和双阳性细胞的数目测定凋亡细胞的总数。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图10显示MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞较相应的脂质复合物(lipoplex)2500倍更有效地诱导HCC的选择性凋亡。(A)DOPC原始细胞、经10重量％PEG-2000(18:1)修饰的DOPC原始细胞、由pCB1以及DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物组成的脂质复合物，和经10重量％PEG-2000修饰的DOTAP/DOPE脂质复合物的ζ电势值。所有ζ电势测量在0.5X PBS(pH7.4)中进行。(B，左轴)在37℃持续暴露于经MC40靶向的原始细胞或脂质复合物递送的5pM pCB1 48小时后，凋亡的Hep3B和肝细胞的百分数。(B，右轴)在37℃在48小时内诱导90％1x106Hep3B细胞凋亡所需的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞或脂质复合物的数目。对于(B)，细胞经Alexa647标记的膜联蛋白V和碘化丙锭染色；单-和双-阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(当标明时)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质复合物经10重量％的PEG-2000(当标明时)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1经NLS修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图11显示MC40靶向的原始细胞选择性地将高浓度的紫杉醇、Bcl-2-特异性siRNA和pCB1递送至HCC而不影响肝细胞的活力。(A)紫杉醇、使Bcl-2表达沉默的siRNA的浓度，和可包封于1012原始细胞、脂质体或脂质复合物的CB1质粒的浓度。红棒表示当紫杉醇和pCB1均装载于原始细胞内时，紫杉醇和pCB1浓度如何变化。蓝棒表示当紫杉醇、siRNA和pCB1均装载于原始细胞或当siRNA和pCB1装载于脂质复合物内时，紫杉醇、siRNA和pCB1浓度如何变化。(B)共聚焦荧光显微镜图像显示在经MC40靶向的原始细胞递送至Hep3B后，Oregon488标记的紫杉醇(绿色)、Alexa594标记的siRNA(红色)和Cy5标记的pDNA(白色)的细胞内分布。细胞在37℃与1000倍过量的MC40靶向的原始细胞一起孵育24小时，然后经Hoechst 33342(蓝色)固定和染色。比例尺＝10μm。(C)在37℃暴露于10nM紫杉醇和/或5pM pCB1 48小时后，停留G2/M期的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。将分数对G2/M中对数生长细胞的百分数标准化。(D)在37℃暴露于10nM紫杉醇、250pM Bcl-2-特异性siRNA和/或5pM pCB1 48小时后，对Alexa647标记的膜联蛋白和碘化丙锭(PI)变得阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分数。在(C)和(D)中，‘pCB1’指的是使用DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的化合物封装并非特异性地递送至细胞的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。脂质体由DSPC和5重量％DMPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(16:0)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。脂质复合物由DOTAP:DOPE(1:1重量/重量)混合物组成，且经10重量％PEG-2000、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图12提供了CB1质粒的载体图。所述CB1质粒(pCB1)由RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen载体(Clontech Laboratories,Inc.；Mountain View,CA)和pNEB193载体(New England BioLabs,Inc.；Ipswich,MA)构建。pCB1编码细胞周期蛋白B1特异性小发夹RNA(shRNA)和Zoanthus sp.绿色荧光蛋白(ZsGreen)。组成型shRNA表达由RNA pol III-依赖的人U6启动子(PU6)驱动，而组成型ZsGreen表达由巨细胞病毒(PCMV IE)的立即早期启动子驱动。Ori和AmpR元件使得E.coli中的质粒能够传播。编码细胞周期蛋白B1特异性的shRNA的有义和反义链的DNA序列被下划线标出并且侧面有用于将dsDNA寡核苷酸引入pSIREN载体的限制性酶切位点(红色为BamHI，蓝色为EcoRI)。
图13描述了组蛋白封装的pCB1的特征。(A)暴露于升高浓度的组蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4的摩尔比为1:2:2:2:2)的pCB1的电泳迁移率变动分析。给出泳道3-6的pCB1:组蛋白的摩尔比。泳道1包含DNA梯带，而泳道2包含未添加组蛋白的pCB1。(B)组蛋白封装的pCB1(1:50pCB1:组蛋白摩尔比)的TEM图像。比例尺＝50nm。
图14显示去负载和pCB1装载的中孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附分析。(A)装载组蛋白封装的pCB1前后中孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附等温线。(B)装载组蛋白封装的pCB1前后中孔二氧化硅纳米颗粒的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图15显示DOPC原始细胞的中子小角散射(SANS)数据。数据拟合通过使用具有等厚共形壳的多分散多孔二氧化硅球体模型获得，并且显示所述二氧化硅颗粒表面跨越多个孔开口的双层的存在。纳入双层厚度为0、20和的模拟SANS数据用于比较。测量的双层厚度与其它在平面支撑的脂质双层上进行的中子研究一致，且在这些对比条件下，主要表示从所述脂质双层的富氢烃核的散射。
图16显示原始细胞保护包封的DNA免遭核酸酶降解。DNA酶I处理的pCB1(泳道3)、组蛋白封装的pCB1(泳道5)、DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1(泳道7)、装载于具有阳离子核的原始细胞中的pCB1(泳道9)、和装载于具有阴离子核的原始细胞中的组蛋白封装的pCB1(泳道11)的琼脂糖凝胶电泳。纳入裸pCB1(泳道2)、从组蛋白释放的pCB1(泳道4)、从DOTAP/DOPE脂质复合物释放的pCB1(泳道6)、从具有阳离子核的原始细胞释放的pCB1(泳道8)、和从具有阴离子核的原始细胞释放的组蛋白封装的pCB1(泳道10)用于比较。泳道1包含DNA梯带。样品与DNA酶I(每50ng DNA 1单位)在室温一起孵育30分钟，并使用1％SDS刺激pCB1释放。
图17显示中孔二氧化硅纳米颗粒(“未经修饰的核”)、在室温浸泡于20％(体积/体积)APTES中12小时的中孔二氧化硅纳米颗粒(“APTES修饰的核”)、CB1质粒(“pCB1”)、组蛋白封装的pCB1(“pCB1-组蛋白复合物”)、经DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1(“DOTAP/DOPE脂质复合物”)的Zeta(ζ)电势值。ζ电势测量在0.5X PBS(pH7.4)中进行。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图18显示用于测定图6和24中对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分数的代表性前向散射-侧向散射(FSC-SSC)图和FL-1直方图。(A)-(D)门控(A)或非门控(C)排出细胞残骸的ZsGreen阴性细胞的FSC-SSC图(A和C)和相应的FL-1直方图(分别为B和D)。FL-1通道的平均荧光强度(MFI)值在(B)和(D)中给出。(E)-(H)门控(E)或非门控(G)排出细胞残骸的ZsGreen阳性细胞的FSC-SSC图(E和G)和相应的FL-1直方图(分别为F和H)。(F)和(H)上的门对应于具有MFI≤282的细胞的百分数，即100X ZsGreen阴性细胞的MFI(见D图)。
图19显示MC40靶向肽的鉴别。图中所述的示意图描述了用于选择MC40靶向肽的方法。1x1011pfu/mL的肽在室温与100nM融合至人IgG Fc域的重组人Met(rhMet)一起孵育1小时。蛋白质A或蛋白质G包被的磁性颗粒用于亲和捕捉Met-噬菌体复合物并随后用TBS(含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH7.4)洗涤10次以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体克隆经低pH缓冲液(含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2)洗脱，并且洗脱液经宿主细菌(E.coli ER2738)感染而扩增。
图20显示MC40靶向肽的特征。(A)第5轮选择后的肽序列比对；显性序列ASVHFPP(SEQ ID NO:1)与此前鉴定的Met特异性12体YLFSVHWPPLKA，SEQ ID NO:15(Zhao等人，ClinCancerRes 2007；13(206049-6055))的emboldened部分相似。将显示靶不相关的HAIYPRH肽(～10％)(SEQ ID NO:16,Brammer等人，Anal.Biochem.373(2008)88–98)的噬菌体克隆从序列比对中略去。(B)和(C)亲和选择的噬菌体克隆与rhMet结合的程度经酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。(B)中所述的ELISA示意图描述于材料与方法部分。ELISA结果如(C)所示。(D)除去未与Met结合的肽后的序列比对。从该比对测定图S-9中所述的共有序列。(E)和(F)暴露于(1)抗Met和不相关噬菌体克隆(TPDWLFP)(SEQ ID NO:17)的Alexa488标记的单克隆抗体和抗M13噬菌体的Alexa546标记的单克隆抗体(蓝点)或(2)抗Met和MC40克隆的Alexa488标记的单克隆抗体和抗M13噬菌体的Alexa546标记的单克隆抗体(橙点)的Hep3B(E)和肝细胞(F)的流式细胞仪散点图。未处理细胞(红点)用于设置FL-1(Alexa488荧光)和FL-2(Alexa546荧光)通道的电压参数。
图21显示暴露于Hep3B的MC40靶向的原始细胞的样品结合曲线。为测定图5A中的解离常数，1x106Hep3B或肝细胞经细胞松驰素D预处理以抑制胞吞并在37℃与多种浓度的Alexa647标记的、MC40靶向的原始细胞一起孵育1小时。流式细胞仪用于测定所得细胞群的平均荧光强度，其对原始细胞浓度作图以获得总结合曲线。在饱和浓度的未标记的肝细胞生长因子的存在下，通过将细胞与Alexa647标记的、MC40靶向的原始细胞一起孵育来测定非特异性结合。通过从总结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；从特异性结合曲线计算Kd值。在本图所述的实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％(～6肽/颗粒)的MC40靶向肽修饰；相应的Kd值为1050±142pM。所有误差棒表示n＝5的95％置信区间(1.96σ)。
图22显示MC40靶向的原始细胞经受体介导的胞吞作用内化，并且在不存在H5WYG肽的情况下定向至溶酶体。(A)在37℃在1小时内被Hep3B或肝细胞各自内化的MC40靶向原始细胞的平均数。1x106细胞在不存在(-)或存在(+)饱和浓度(100μg/mL)的人肝细胞生长因子(HGF)的情况下与多种浓度的原始细胞一起孵育，而流式细胞仪用于测定与各细胞有关的颗粒的平均数。原始细胞经NBD和pHrodoTM标记以从那些内化至酸性细胞内隔室的颗粒区别表面结合颗粒(分别地)。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。(B)原始细胞和(1)Rab5、(2)Rab7、(3)溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP-1)、或(4)Rab11a之间的皮尔森相关系数(r值)。Hep3B细胞在37℃与1000倍过量的Alexa594标记的原始细胞一起孵育1小时，然后固定，透化，并与Alexa488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1、或Rab11a抗体一起孵育。SlideBook软件用于测定r值，其以n＝3x50细胞的平均值±标准差表示。微分干涉对比(DIC)图像用于定义Hep3B的边界从而当计算r值时可忽视细胞边界外的像素。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
图23显示当经NLS修饰并经MC40靶向的原始细胞递送时，组蛋白封装的pCB1在HCC细胞核中以时间依赖性的方式浓缩。(A)-(C)在37℃暴露于1000倍过量的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞15分钟(A)、12小时(B)、或24小时(C)的Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图像。对于(B)，在～2小时后，原始细胞的内体逃逸和pCB1的胞质分散是明显的；然而直至12-16小时，ZsGreen表达仍然不可检测。在24小时，Cy5标记的pCB1仍然分布于整个细胞；然而在(C)中胞质染色不可见，因为Cy5通道的增益被减小以避免位于细胞核内的像素饱和。二氧化硅核经Alexa594(红色)标记，pCB1经Cy5(白色)标记，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)复染。比例尺＝20μm。(D)对于Cy5标记的pCB1和Hoechst 33342标记的Hep3B细胞核，皮尔森相关系数(r值)对时间的作图。SlideBook软件用于测定r值，其以n＝3x50细胞的平均值±标准差表示。微分干涉对比(DIC)图像用于定义Hep3B的边界从而当计算r值时可忽视细胞边界外的像素。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
图24显示当经NLS修饰并经MC40靶向的原始细胞递送时，组蛋白封装的pCB1以接近100％的有效性，选择性地转染分裂和非分裂的HCC细胞。(A)、(C)和(E)在37℃暴露于1000倍过量的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞24小时的Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图像。在(A)中Hep3B细胞正在分裂而在(C)和(E)中～95％汇合；在所有图像中，pCB1经组蛋白预封装，且在(E)中该pCB1-组蛋白复合物进一步经NLS修饰。二氧化硅核经Alexa594(红色)标记，pCB1经Cy5(白色)标记，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)复染。比例尺＝20μm。(B)、(D)和(F)在37℃持续暴露于1x109MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞(“PC”)24小时后，ZsGreen表达呈阳性的1x106Hep3B和肝细胞的百分数。在(B)中细胞正在分裂而在(D)和(F)中～95％汇合；x轴表示无论CB1质粒(“pCB1”)和pCB1-组蛋白复合物(“复合物”)是否经NLS修饰。单独pCB1，以及经DOTAP和DOPE 1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1用作对照。细胞被暴露于20mg/mL的麦胚凝集素(WGA)以阻断NLS修饰的pCB1通过核孔复合物易位。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。(G)–(I)分别为(A)、(C)和(E)中所采用细胞的细胞周期直方图。给出了各直方图G0/G1期细胞的百分数。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
图25显示在37℃暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞1小时或72小时的Hep3B细胞(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像；在所有实验中pCB1浓度维持在5pM。(B)中的箭头指示有丝分裂细胞。细胞周期蛋白B1经Alexa594标记的单克隆抗体(红色)标记，而细胞核经Hoechst33342(蓝色)染色。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有比例尺＝20μm。
图26显示在37℃暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞1小时或72小时的Hep3B细胞(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像；在所有实验中pCB1浓度维持在5pM。细胞分别经Alexa647标记的膜联蛋白V(白色)和碘化丙锭(红色)染色以分析早期和晚期凋亡，而且细胞核经Hoechst33342(蓝色)复染。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有比例尺＝20μm。
图27显示含有两性离子脂质组成的SLB的原始细胞诱导最小的非特异性细胞毒性。在37℃持续暴露于1x109APTES修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒、含APTES修饰核的DOPC原始细胞、装载有编码乱序shRNA序列的质粒(“乱序pCB1”)的DOPC原始细胞或装载有乱序pCB1的DOTAP/DOPE(1:1重量/重量)脂质复合物48小时后，1x106Hep3B变得细胞凋亡的百分数。原始细胞和脂质复合物经10重量％PEG-2000、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。使用正-和负-电荷聚苯乙烯纳米颗粒(分别为“胺-PS”和“羧基-PS”)作为阳性对照，而使用暴露于10mM抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或1pmol游离pCB1的Hep3B作为阴性对照。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图1X2显示作为pH函数的伊马替尼的水溶解度。由于化学结构上弱碱性官能团的离子化，药物的溶解度随pH降低而升高。
图2X2显示pH7时不同制剂中伊马替尼的溶解度。与其它制剂相比，含有10％乙醇的制剂表现出最高的溶解度。还发现伊马替尼高度溶于DMSO中。
图3X2显示溶剂系统在24小时内对伊马替尼渗透的影响。与对照(水，pH7)相比，所有含有共溶剂的制剂显示对皮肤的更高的穿透性。DMSO显示最高的渗透。(N12-186PCT 2012-032-01 Provisional.PDF)。
图4X2显示溶剂系统对伊马替尼通量(透皮渗透率)的影响。含有DMSO的制剂显示所研究制剂中最高的通量。
图1X3。示意图描述了用于合成siRNA或蛋白质毒素装载的纳米多孔颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)的方法。为形成装载有大分子治疗剂并靶向肝细胞癌(HCC)的原始细胞，首先将经含胺硅烷(AEPTMS)修饰的纳米多孔二氧化硅核浸入小干扰RNA(siRNA)或蛋白质基毒素(蓖麻毒素A链)的溶液中。然后将由DOPC、DOPE、胆固醇和18:1PEG-2000PE(55:5:30:10质量比)组成的脂质体与负载物装载的核融合。所得受支撑的脂质双层(SLB)经与HCC结合的靶向肽(SP94)和促进内化原始细胞的内体/溶酶体逃逸的内体裂解肽(H5WYG)修饰。经甘氨酸-甘氨酸(GG)间隔区和C-端半胱氨酸残基修饰的肽经由含9.5-nm聚乙二醇(PEG)间隔区异双功能交联子(SM(PEG)24)与DOPE中存在的伯胺缀合。实施例3引用了由Lo等人65和Moore等人66报道的SP94和H5WYG序列，以红色标出。
图2X3。形成原始细胞核的纳米多孔二氧化硅颗粒的特征。(A)基于尺寸的分离前后，多形二氧化硅颗粒的动态光散射(DLS)。分离后，颗粒的平均颗粒直径为～165nm。(B)多形颗粒的氮吸附等温线。滞后的存在与由较小孔互相连接的较大孔的网状构造一致。(C)孔直径对由(e)中的吸附等温线计算得到的孔体积作图，表明大(20-30nm)孔和小(6-12nm)孔的存在。
图3X3。原始细胞对siRNA具有高容量，siRNA的释放由酸性pH触发。(A)可装载于1010原始细胞和脂质复合物的siRNA浓度。在0.5X PBS(pH7.4)中未经修饰和AEPTMS修饰的二氧化硅核的ζ电势值分别为-32mV和+12mV。(B)和(C)在37℃暴露于pH7.4模拟体液(B)或pH5.0缓冲液(C)后，siRNA从含AEPTMS修饰的核的DOPC原始细胞、DOPC脂质复合物和DOTAP脂质复合物释放的速率。siRNA装载的原始细胞、DOPC脂质复合物和DOTAP脂质复合物的平均直径分别为178nm、135nm、和144nm。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图4X3。siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞沉默HCC中而不是肝细胞中多种细胞周期蛋白家族成员。(A)和(B)在Hep3B暴露于siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞后，细胞周期蛋白A2、B1、D1、和E蛋白的表达上剂量(A)和时间(B)依赖的降低。1x106细胞在(A)中持续暴露于多种浓度的siRNA 48小时而在(B)中持续暴露于125pM的siRNA不同时期。(C，左轴)在1x106Hep3B或肝细胞暴露于125pM siRNA 48小时后，残余的初始细胞周期蛋白A2蛋白质的百分数。(C，右轴)必须与1x106Hep3B细胞一起孵育以降低细胞周期蛋白A2蛋白至10％初始浓度的siRNA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞、DOPC脂质复合物和DOTAP脂质复合物的数目。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。DOPC(和DOTAP)通过使用55:5:30:10比例的DOPC(或DOTAP):DOPE:胆固醇:PEG-2000PE制备并经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。所有实验均在37℃于完全生长培养基中进行。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图5X3。在37℃暴露于siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞1小时或48小时后，Hep3B(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像。细胞与10倍过量的Alexa Fluor 647标记的原始细胞(白色)一起孵育，然后固定、透化，并经Hoechst 33342(蓝色)和Alexa Fluor 488标记的抗细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1或细胞周期蛋白E(绿色)染色。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。比例尺＝20μm。
图6X3。装载有细胞周期蛋白特异性siRNA混合物的SP94靶向的原始细胞诱导HCC中的细胞凋亡而不影响肝细胞活力。(A)在37℃暴露于装载有细胞周期蛋白特异性siRNA混合物的SP94靶向的原始细胞不同时期后，对Alexa Fluor 488标记的膜联蛋白V和/或碘化丙锭(PI)呈阳性的1x106Hep3B和肝细胞的百分数。对膜联蛋白呈阳性的细胞被视为处于细胞凋亡早期，而对膜联蛋白V和PI均呈阳性的细胞被视为处于细胞凋亡晚期；通过添加早期细胞凋亡和晚期细胞凋亡的细胞数目测定凋亡细胞的总数。总siRNA浓度维持在～125pM。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。(B)和(C)在37℃暴露于siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞1小时或48小时后Hep3B(B)和肝细胞(C)的共聚焦荧光显微镜图像。细胞与10倍过量的Alexa Fluor 647标记的原始细胞(白色)一起孵育，然后经Hoechst 33342(蓝色)、Alexa Fluor 488标记的膜联蛋白V(绿色)和碘化丙锭(红色)染色。微分干涉对比(DIC)图像被纳入以显示细胞形态学。比例尺＝20μm。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。
图7X3。原始细胞包封高浓度的蓖麻毒素A链(RTA)并仅在酸性pH下释放。(A)可包封于1010原始细胞和脂质体的RTA的浓度。在0.5X PBS(pH7.4)中未经修饰和AEPTMS修饰的二氧化硅核的ζ电势值分别为-32mV和+12mV。去糖基化RTA的等电点(PI)为～7。(B)和(C)在37℃含AEPTMS修饰的核的DOPC原始细胞和DOPC脂质体暴露于pH7.4模拟体液(B)或pH5.0缓冲液(C)后RTA的时间依赖性释放。RTA装载的原始细胞和脂质体的平均直径分别为184nm和140nm。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图8X3。RTA装载的、SP94靶向的原始细胞抑制HCC中而不是肝细胞中蛋白质生物合成。(A)和(B)在Hep3B暴露于RTA装载的、SP94靶向的原始细胞后，初生蛋白合成的剂量(A)和时间(B)依赖性降低。1x106细胞在(A)中持续暴露于多种浓度的RTA 48小时和在(B)中持续暴露于25pM RTA不同时期。使用Alexa Fluor 488标记的甲硫氨酸衍生物定量初生蛋白的合成。(C，左轴)在1x106Hep3B或肝细胞暴露于25pM RTA 48小时后，残余的初始初生蛋白浓度的百分数。(C，右轴)必须与1x106Hep3B细胞一起孵育以使蛋白质生物合成降低90％的RTA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞和脂质体的数目。原始细胞和脂质体双层由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。所有实验在37℃于完全生长培养基中进行。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
图9X3。在37℃暴露于RTA装载的、SP94靶向的原始细胞1小时或48小时后，Hep3B(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像。细胞与10倍过量的Alexa Fluor 647标记的原始细胞(白色)一起孵育，然后经Hoechst 33342(蓝色)和Click-iT AHA Alexa Fluor 488蛋白质合成试剂盒(绿色)染色。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。比例尺＝20μm。
图10X3。装载有RTA的SP94靶向的原始细胞诱导HCC选择性细胞凋亡。(A)在37℃暴露于RTA装载的、SP94靶向的原始细胞不同时期后，对半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3活性呈阳性的1x106Hep3B和肝细胞的百分数。总RTA浓度维持在～25pM。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。(B)和(C)在37℃暴露于RTA装载的、SP94靶向的原始细胞1小时或48小时后Hep3B(B)和肝细胞(C)的共聚焦荧光显微镜图像。细胞与10倍过量的AlexaFluor 647标记的原始细胞(白色)一起孵育，然后经Hoechst 33342(蓝色)、CaspGLOW荧光素活性半胱天冬酶-9染色试剂盒(绿色)和CaspGLOW红色活性半胱天冬酶-3染色试剂盒(红色)染色。纳入微分干涉对比(DIC)图像以显示细胞形态学。比例尺＝20μm。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000组成，且经0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修饰。
图1X5示意图描述了SC的“砖和泥”结构以及被动透皮扩散的三条途径。细胞间扩散被广泛的接受为主要途径，然而其通常与跨细胞扩散同时发生，且这两种途径均被所采用的渗透促进策略影响。因为汗腺和毛囊仅占身体表面积的约1％，所以经附件扩散常被忽略。
图2X5示意图图示了原始细胞和对其核的多种代表性修饰，以及为优化用于特定应用所作的SLB。自底部左侧开始，原始细胞由受支撑的脂质双层包封的纳米多孔二氧化硅核组成。该核具有高表面积、可控的颗粒直径、可调的孔径、可修饰的表面化学，并且可被工程化以促进高容量装载不同类型的负载物(即纳米颗粒、蛋白质毒素、治疗性核酸、药物)。该受支撑的脂质双层提供流体表面，可使用异双功能交联子将多种分子(即肽、聚乙二醇-PEG)缀合至该表面以影响特定的结合、内化和渗透。
图3X5。初步结果说明原始细胞可与SC相互作用，穿透SC并扩散穿过皮肤，以及这些相互作用的透皮动力学被SLB组合物和制剂影响。a.)ICP-MS结果显示在经DOPC/Chol/PEG处理的皮肤样品(n＝3)的容器(receptacle)中SiO2的总量(μg)，其中SC是完整的或除去的。b.)示意图图示了使用荧光团的核功能化以及各步后必须作出的必须特征。c.)与DSPC/胆固醇制剂相比，在24小时后，容器中DOPC/胆固醇配制的原始细胞显示接近2X量的SiO2。然而，与非PEG化的制剂相比，经PEG配制的相同原始细胞显示显著降低的动力学。
图1X6。示意图描述了我们计划开发用于将抗病毒剂靶向递送至潜在宿主细胞和已感染细胞的原始细胞。MSNP核以蓝色显示，而SLB以黄色显示。
图2X6。非靶向的、PEG化的原始细胞的初步体内特征。(A)经原始细胞或盐水注射的Balb/c小鼠的时间依赖性重量。(B)经DyLight 633标记的原始细胞或100μL盐水(对照)注射并经IVIS Lumina II成像的Balb/c小鼠。在所有实验中，原始细胞经10重量％PEG-2000修饰并被注射至尾静脉中。
图1X7。原始细胞的体内一般生物分布和毒性。(A)静脉注射后即刻颗粒的系统性循环和(B)注射后48小时对肝和骨的定位。(C)一周三次给予原始细胞无肉眼可见的毒性症状，包括以整个动物体重计的毒性症状。(D)观察到颗粒荧光在经原始细胞注射的小鼠(D1、D3、D4–总共30mg，历时4周)肝脏蓄积而对肝脏解剖无作用。
图2X7。肝脏厚切片中颗粒分布的3D渲染。发现颗粒随时间在肝脏确定的但目前未经确认的区域蓄积。在剂量达到每只小鼠30mg，历时4周时，未观测到肉眼可见或组织学毒性。比例尺＝20μm。
图1X8、2X8、3X8.如实施例8的实验所测定的通过全层和断层皮肤的原始细胞扩散。
图4X8。如实施例8的实验所测定的供体帽样品的ICP质谱。
图5X8。如实施例8的实验所测定的核功能化。
图6X8、7X8、8X8、9X8。如实施例8的实验所测定的用于测定容器流体中SiO2浓度的荧光光谱。
图10X8。阳性对照显示当利用如实施例8的实验所测定的皮肤自发荧光时，可将皮肤中荧光标记的颗粒成像。
图1X9。给予多种原始细胞制剂(500μl，16mg/ml，于0.5X PBS中)，各制剂n＝4。从各实验获得的1块皮肤(S1)经0.5X PBS处理。如实施例9的实验所测定的，使用S1 24小时容器流体的1:2稀释液在浓度范围为0.16mg/ml–1.953125E-5mg/ml内生成标准曲线。
图2X9。如实施例9的实验所测定，结合荧光光谱的线性回归分析。
图3X9。如实施例9的实验所测定，SLB制剂可极大地影响透皮扩散。
图4X9。如实施例9的实验所测定，向DOPC/胆固醇和DSPC/胆固醇制剂中加入PEG显著地降低透皮扩散。
图5X9、6X9。如实施例9的实验所测定，作为时间的函数，校正平均荧光强度的个体增加。
图7X9、8X9和9X9。如实施例9的实验所测定，解释了制剂对动力学的作用。
发明详述
以下术语将在整个说明书中使用以描述本发明。在术语未明确定义的情况中，应当以与本领域的普通技术人员的使用一致的方式理解术语。
在提供数值范围的情况中，应当理解为在所述范围的上限和下限之间的每一居间值(至该下限的最小整数的十分之一，除非文中另有明确规定)，且在该声明范围内的任何其他声明的数值或者居间值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也涵盖于本发明内，适用该声明的范围内任何特别排除的端值。当声明的范围包括一个或两个端值时，排除这些被包括在内的一个或两个端值的范围也包含在发明中。在取代基可能未一个或多个马库什基团的情况中，应当理解仅使用那些形成稳定键的取代基。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的意义相同。尽管在本发明的实践或测试中也可使用与本文所述的那些方法和材料类似或相当的任何方法和材料，但这里描述了优选方法和材料。
必须指出，用于本文和所附权利要求的单数形式的“一个”(“a”、“an”和“the”)包括复数的指代物，除非上下文明确另有指示。
此外，以下术语具有如下定义。
说明书通篇所使用的术语“患者”或“受试者”描述的是动物，通常是哺乳动物，尤其包括家养动物并优选是人，其被提供了使用本发明的化合物或组合物进行的治疗，包括预防性治疗(预防)。对于特定动物如人类患者的特定感染、病症或疾病状态的治疗而言，术语患者指的是该特定的动物。在大多数情况中，本发明的患者或受试者是一种性别或两种性别的人类患者。
本文所用的术语“有效的”，除非另有所指，否则描述的是在其用途范围内使用时产生或影响预期结果(无论该结果与感染和/或疾病状态或本领另有描述的状态的预防和/或治疗是否相关)的化合物或组分的量。术语有效的包括本申请另有描述或使用的所有其它有效量或有效浓度术语(包括术语“治疗有效的”)。
本文所用的术语“化合物”描述的是本文所公开的任何具体化合物或生物活性剂，包括任何和所有立体异构体(包括非对映异构体)、单独的光学异构体(对映异构体)或外消旋混合物、药学上可接受的盐和前药形式。本文的术语化合物指的是稳定化合物。在其使用范围内，术语化合物可指本文另有描述的单个化合物或化合物的混合物。
术语“生物活性剂”指的是可配制用于本发明实施方案中的任何生物学活性化合物或药物。示例性生物活性剂包括用于治疗癌症或继发于癌症的疾病状态或病症的本发明的化合物，且可包括抗病毒剂，尤其是抗HIV、抗HBV和/或抗HCV剂(尤其在将治疗肝细胞癌的情况中)以及其它本文另有描述的化合物或药剂。
术语“治疗”同义地指任何向有疾病风险或罹患疾病的患者提供益处(包括通过减轻、抑制、遏抑或消除至少一种症状、延缓所述疾病进展、预防、延缓或抑制所述疾病发作的可能性等改善病症)的行为。关于病毒感染，这些术语也适用于病毒感染并且在一些特别有利的实施方案中，优选地包括根除或消除作为所述感染致病因子的病毒。
如本文所用的，治疗涵盖预防性和治疗性治疗，主要为癌症的治疗，但也有其它疾病状态包括病毒感染，尤其包括HBV和/或HCV的治疗。例如可在疾病发生前向哺乳动物预防性地给予本发明的化合物以减低该疾病的可能性。预防性给予有效地减低或降低哺乳动物中后续疾病发生的可能性或降低后续发生疾病(尤其包括癌症的转移)的严重性(抑制)。或者，例如可向已罹患疾病的哺乳动物治疗性地给予本发明的化合物。在一项治疗性给予的实施方案中，给予本发明化合物有效地消除该疾病并产生缓解或基本上消除癌症转移的可能性。给予本发明的化合物有效地降低该疾病的严重性或延长罹患该疾病的哺乳动物的寿命(如在癌症病例中)，或者抑制或甚至消除该疾病的致病因子(如在乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)感染的病例中)。
如本文所用的，术语“药学上可接受的”意指适于给予受试者包括人类患者以实现本文所述的治疗而考虑到该疾病的严重性和治疗的需要无过度的有害的副作用的化合物或组合物。
如本文所用的，术语“抑制”指的是潜在作用的部分或完全消除，而抑制剂为具有抑制能力的化合物/组合物。
当用于上下文时，术语“预防”应意指“减低可能性”或作为给予或同时给予本发明的一种化合物或组合物(单独或与其它药剂组合)的结果，预防避免发生疾病、病症或疾病状态。应当注意预防很少100％有效，因此术语预防和减低可能性用于表示在给定的患者或受试者群体中，给予本发明的化合物将减低特定病症或疾病状态(具体地，疾病状态的恶化如癌症的生长或转移)或其它公认的疾病进展指示物发生的可能性或抑制特定病症或疾病状态(具体地，疾病状态的恶化如癌症的生长或转移)或其它公认的疾病进展指示物发生。
术语“原始细胞”用于描述由包括二氧化硅、聚苯乙烯、铝、钛、锆或一般的金属氧化物、有机金属酸盐(organometallates)、有机硅酸盐或它们的混合物的材料制成的多孔纳米颗粒。
本发明的原始细胞所用的多孔纳米颗粒包括中孔二氧化硅纳米颗粒和核-壳纳米颗粒。
所述多孔纳米颗粒还可以是生物可降解的聚合物纳米颗粒，其包括一种或多种选自以下的组合物：脂族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(己内酯)(PCL)、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、藻酸盐和其它多糖、胶原和其化学衍生物、白蛋白(一种亲水性蛋白)、玉米蛋白(一种醇溶蛋白，亲水性蛋白)和共聚物及它们的混合物。
多孔球状二氧化硅纳米颗粒用于优选的原始细胞并被受支撑的脂质或聚合物双层或多层包裹。本发明的多种实施方案提供了纳米结构以及构建和使用所述纳米结构的方法和提供本发明原始细胞的方法。很多最基本形式的原始细胞是本领域已知的。各种大小的多孔二氧化硅颗粒(大小范围(直径)从小于5nm至200nm或500nm或更大)是本领域可容易得到的或可使用本领域已知的方法容易地制备(见实施例部分)，或者可从SkySpring Nanomaterials,Inc.,Houston,Texas,USA或从Discovery Scientific,Inc.,Vancouver,BritishColumbia购得。可使用Carroll等人，Langmuir,25,13540-13544(2009)的操作容易地制备多形二氧化硅纳米颗粒。可使用本领域已知的方法学容易地制备原始细胞。本发明的实施例部分提供了获得用于本发明的原始细胞的一些方法学。可容易地制备本发明的原始细胞，包括含有与二氧化硅纳米颗粒的表面融合的脂质的原始细胞。参见，例如Liu等人，Chem.Comm.,5100-5102(2009),Liu等人，J.Amer.Chem.Soc.,131,1354-1355(2009),Liu等人，J.Amer.Chem.Soc.,131,7567-7569(2009)Lu等人，Nature,398,223-226(1999),根据Ashley等人，Nature Materials,2011,May；10(5):389-97,Lu等人，Nature,398,223-226(1999),Caroll等人，Langmuir,25,13540-13544(2009),和以下实验部分另有呈现的方法制备用于本发明的优选原始细胞。
术语“纳米颗粒”和“多孔纳米颗粒”在本文中可互换使用且这些颗粒可以结晶相、无定形相、半结晶相、半无定形相或它们的混合物存在。
纳米颗粒可具有多种形状和横断层面图形，其可能部分地取决于产生所述颗粒所使用的方法。在一项实施方案中，纳米颗粒可具有以下形状：球状、杆状、管状、薄片状、纤维状、平板状、线状、立方体状、须状(whisker)。纳米颗粒可包括具有两种或多种上述形状的颗粒。在一项实施方案中，颗粒的横断层面图形可以是以下形状的一种或多种：环形、椭圆形、三角形、矩形或多边形。在一项实施方案中，纳米颗粒可基本上由非球状颗粒组成。例如，这些颗粒可具有椭球形，其可能所有三个主轴具有不同长度，或者可以是旋转的扁圆或扁长(prelate)椭球形。或者，非球状纳米颗粒可以是分层形式，其中分层指的是颗粒一个轴的最大长度基本上小于其它两轴各自的最大长度。非球状颗粒还可具有金字塔墩或锥墩形状，或者伸长的杆状。在一项实施方案中，所述纳米颗粒可以是不规则形状的。在一项实施方案中，多数纳米颗粒可主要由球状纳米颗粒组成。
本文所用的描述多颗粒(例如，多孔纳米颗粒)的短语“有效平均粒径”意指其中至少50％的颗粒具有特定大小。因此，“直径的有效粒径小于约2,000nm”意指其中至少50％颗粒的直径小于约2,000nm。在一些实施方案中，纳米颗粒具有的有效平均粒径为小于约2,000nm(即2μm)、小于约1,900nm、小于约1,800nm、小于约1,700nm、小于约1,600nm、小于约1,500nm、小于约1,400nm、小于约1,300nm、小于约1,200nm、小于约1,100nm、小于约1,000nm、小于约900nm、小于约800nm、小于约700nm、小于约600nm、小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约75nm或小于约50nm，通过光散射方法、显微镜法或其它适当的方法测量。“D50”指的是多颗粒中50％的颗粒落在其下的粒径。类似地，“D90”是多颗粒中90％的颗粒落在其下的粒径。
在一些实施方案中，所述多孔纳米颗粒包含选自以下的一种或多种组分：二氧化硅、生物可生物降解的聚合物、溶胶、金属和金属氧化物。
在本发明的一项实施方案中，所述纳米结构包括核-壳结构，其包含由脂质壳优选双层，但可能是单层或多层包裹的多孔颗粒核(参见Liu等人，JACS,2009,Id)。所述多孔颗粒核可包括，例如由被脂质双层包裹的上述有机或无机材料制成的多孔纳米颗粒。在本发明中，这些脂质双层包裹的纳米结构被称为“原始细胞”或“功能性原始细胞”，因为它们具有受支撑的脂质双层膜结构。在本发明的实施方案中，原始细胞的多孔颗粒核可装载多种所需的物种(“负载物”)，包括小分子(例如，本文另有描述的抗癌剂)、大分子(例如，包括大分子如RNA，包括小干扰RNA或siRNA或小发夹RNA或shRNA或多肽(其中可包括多肽毒素，如蓖麻毒素A链或其它毒性多肽，如白喉毒素A链DTx))或报告子多肽(例如，其中，绿色荧光蛋白)或半导体量子点、或金属纳米颗粒、或金属氧化物纳米颗粒或其组合。在本发明的一些优选方面，所述原始细胞装载有超螺旋质粒DNA，其可用于递送一种或多种治疗性和/或诊断性肽或小发夹RNA/shRNA或小干扰RNA/siRNA(其可用于抑制蛋白质(例如，生长因子受体或其它对细胞尤其是癌细胞的生长负责或有助于细胞尤其是癌细胞生长并诱导生长停滞和癌细胞凋亡的受体(其中包括表皮生长因子/EGFR、血管内皮生长因子受体/VEGFR-2或血小板衍生生长因子受体/PDGFR-α))的表达)。
在一些实施方案中，所述负载物组分可包括但不限于，化学小分子(尤其是抗癌剂和抗病毒剂，包括抗HIV、抗HBV和/或抗HCV剂)、核酸(DNA和RNA，包括siRNA和shRNA和质粒(其在递送至细胞后表达一种或多种多肽或RNA分子))以用于特定用途，例如本文另有描述的治疗性应用或诊断性应用。
在实施方案中，所述原始细胞的脂质双层可提供生物相容性并可被修饰以具有靶向物种，包括例如靶向肽(包括抗体、适体和PEG(聚乙二醇))以例如使得所述原始细胞更加稳定和/或靶向递送至生物活性细胞中。
取决于应用，本发明的原始细胞粒径分布可以是单分散的或多分散的。所述二氧化硅核可以是非常单分散的(即直径变化不超过约5％例如200nm直径不超过±10nm的原始细胞的均匀大小群体，尤其是如果它们是使用溶液技术制备的)或非常多分散的(即多分散群体可与平均或中位直径变化巨大，例如达±200nm或更多，如果它们是通过气溶胶制备的)。参见附图1。多分散群体可根据大小分成单分散群体。所有这些均适用于原始细胞形成。在本发明中，优选的原始细胞的直径优选不超过约500nm，直径优选不超过约200nm以能够递送至患者或受试者并产生预期的治疗性作用。
在一些实施方案中，本发明的原始细胞大小范围通常为直径大于约8-10nm至约5μm，优选直径约20nm至3μm，约10nm至约500nm，更优选约20至200nm(包括约150nm，其可以是平均直径或中位直径)。如上文所讨论，基于原始细胞群体的平均直径或中位直径，所述原始细胞群体可被视为单分散或多分散的。大小对于本发明的治疗性和诊断性方面非常重要，因为直径小于约8nm的颗粒会通过肾脏排泄，而大于约200nm的那些颗粒可被肝脏和脾脏截留。因此，本发明的一项实施方案聚焦于用于在患者或受试者中药物递送和诊断的较小的原始细胞。
在一些实施方案中，本发明的原始细胞的特征在于包含中孔中孔(介孔，mesopore)，优选存在于纳米结构材料中的孔。可发现这些孔(至少一个，但经常是很多个)与所述纳米颗粒的表面相交(通过具有所述纳米颗粒表面上显现的孔的一端或两端)或者在纳米结构的内部，其中一个或多个中孔与所述纳米颗粒的表面中孔互相连接。较小的互连孔常存在于所述表面中孔的内部。所述中孔孔径的总体直径范围可为0.03-50nm。优选中孔孔径范围为2-30nm；它们可以是单一大小的或双峰的或分级的-它们可以是有序的或无序的(基本上随机排列的或蠕虫状的(worm-like))。见附图2。
中孔(IUPAC定义直径为2-50nm)是由模板剂包括表面活性剂、嵌段共聚物、分子、大分子、乳剂、乳胶微球或纳米颗粒“模制”而成。此外，方法也可得到微孔(IUPAC定义直径小于2nm)一直向下到约0.03nm，例如如果未使用气溶胶方法中的模板部分。它们也可被扩大成大孔，即直径为50nm。
纳米颗粒材料的孔表面化学可以是非常多样的-所有有机硅烷得到的阳离子性、阴离子性、亲水性、疏水性、反应基团-孔表面化学，尤其是电荷和疏水性(hydrohobicity)，影响装载容量。参见附图3。吸引性静电相互作用或疏水性相互作用控制/增加装载容量并控制释放速率。更高的表面积可通过这些吸引性相互作用达到药物/负载物的更高装载。见下文。
在一些实施方案中，通过N2BET方法测量，纳米颗粒的表面积范围为约100m2/g至>约1200m2/g。通常，孔径越大，表面积越小。见图2A。理论上，如果不除去模板剂或如果孔径小于0.5nm，表面积可减少至基本为0，因此由于动力学作用在77K通过N2吸附无法测量。然而，在这种情况下，它们可通过CO2或水吸附测量，但可能被视为无孔的。这将适用于如果生物分子直接包封在未使用模板制备的二氧化硅核中的情况，在这种情况中，颗粒(内部负载物)将通过在递送至细胞后二氧化硅基质的溶解来释放。
通常，本发明的原始细胞装载有负载物，容量达超过100重量％：定义为(负载物重量/原始细胞重量)x100。负载物的最适装载量常为约0.01至30％，但这取决于掺合入原始细胞作为负载物的药物或药物组合。这通常以μM/1010颗粒的表示，其中取值范围为2000-100μM/1010颗粒。本发明优选的原始细胞显示在pH约5.5时释放负载物，该pH为内体的pH，但在生理pH7或更高(7.4)时稳定。
用于装载的内部空间的表面积为孔体积，其最适值范围为约1.1至0.5立方厘米/克(cc/g)。注意，在本发明一项实施方案的原始细胞中，所述表面积主要为与所述纳米颗粒的外部几何表面积相对的内部表面积。
本发明的一项实施方案的多孔颗粒上支撑的脂质双层具有较低的融化转变温度，即较非多孔载体上支撑的脂质双层或脂质体中的脂质双层更具流动性。这在低肽密度实现靶配体的高亲和性结合中有时是重要的，因为双层的流动性允许侧向扩散和靶细胞表面受体的肽募集。一项实施方案提供了成簇肽，其促进与互补性靶点结合。
在本发明中，脂质双层在组成上可有显著差异。一般而言，任何可用于脂质体的脂质或聚合物也可用于原始细胞。优选脂质本文另有描述。用于本发明原始细胞中的特别优选的脂质双层包含重量比为5％DOPE、5％PEG、30％胆固醇、60％DOPC或DPPC(以重量计)的脂质混合物(本文另有描述)。
通过ζ电势测量的中孔二氧化硅NP核的电荷经胺硅烷、2-(氨基乙基)丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)或其它有机硅烷修饰可从-50至+50mV单调地变化。这种电荷修饰依次改变了所述原始细胞的负载物内药物的装载。通常，在受支撑的脂质双层融合后，ζ电势降低至-10mV至+5mV，其对于最大化在血液中的循环时间和避免非特异性相互作用是重要的。
取决于表面活性剂模板如何除去，例如在高温(500℃)焙烧vs在酸性乙醇中萃取，以及取决于掺入二氧化硅框架中的AEPTMS的量，二氧化硅的溶解速率可差异巨大。这依次控制了内部负载物的释放速率。这种现象的发生是因为与孔的内表面紧密结合的分子缓慢地扩散到颗粒核外，因此，颗粒核的溶解部分地控制释放速率。
本发明的一项实施方案的原始细胞的其它特征是它们在pH为7时稳定，即它们不会泄漏负载物，但在pH为5.5(该pH为内体的pH)时，脂质或聚合物包衣会变得不稳定开始释放负载物。这种pH触发的释放对于维持原始细胞的稳定直至其通过胞吞作用被内化至细胞内的点(在此点若干pH触发的事件引起释放至内体，并随后至胞质溶胶)是重要的。原始细胞核颗粒和表面也可经修饰以提供在特定、延长时期内负载物的非特异性释放，以及可被重新配制以在其它生物物理变化(如局部发炎区域中活性氧簇和其它因子的存在增加)后释放负载物。定量实验证据显示被靶向的原始细胞仅引起弱免疫应答，因为它们不支持更高亲和性IgG(一个有利的结果)所需的T细胞帮助。
本发明的原始细胞显示至少一个或多个特征(取决于实施方案)使得它们区别于现有技术的原始细胞：
1)与现有技术相反，本发明的实施方案指定平均大小(直径)小于约20nm的纳米颗粒-该大小被工程化以促进通过受体介导的胞吞作用进行的有效细胞摄取并最小化非靶细胞和器官的结合和摄取；
2)本发明的实施方案可指定单分散和/或多分散大小均可控制生物分布；
3)本发明的实施方案涉及诱导受体介导的胞吞作用的靶向纳米颗粒；
4)本发明的实施方案通过融合肽或内体裂解肽的包裹诱导负载物分散至细胞质中；
5)本发明的实施方案提供pH触发负载物释放的颗粒；
6)本发明的实施方案显示受控的时间依赖性负载物释放(通过热诱导的二氧化硅纳米颗粒基质的交联程度)；
7)本发明的一项实施方案可显示时间依赖性pH触发释放；
8)本发明的一项实施方案可包含并提供复合物多种负载物的细胞递送；
9)本发明的一项实施方案显示靶癌细胞的杀死；
10)本发明的一项实施方案显示靶癌细胞的诊断；
11)本发明的一项实施方案显示癌细胞的选择进入；
12)本发明的一项实施方案显示从脱靶细胞的选择排除(选择性)；
13)本发明的一项实施方案显示受支撑的脂质双层增强的流动性；
14)本发明的实施方案显示对靶细胞的亚纳摩尔和受控的结合亲和性；
15)本发明的一项实施方案显示与低于现有技术中浓度的靶向配体密度的亚纳摩尔结合亲和性；
16)本发明的一项实施方案可进一步将现有技术与现有技术中不可得的更精细的细节水平区分。
术语“脂质”用于描述用于在本发明中所使用的纳米颗粒的表面上形成脂质双层的组分。
多种实施方案提供了从支撑一个或多个脂质双层的纳米颗粒构建而来的纳米结构。在本发明的实施方案中，所述纳米结构优选包括，例如，包含被脂质双层壳包裹的多孔颗粒核的核-壳结构。所述纳米结构，优选上文所述的多孔二氧化硅纳米结构，支撑脂质双层膜结构。
在本发明的实施方案中，所述原始细胞的脂质双层可提供生物相容性并可经修饰具有靶向物种(包括，例如靶向肽、融合肽、抗体、适体和PEG(聚乙二醇))从而使得例如所述原始细胞更稳定和/或靶向递送至生物活性细胞，尤其是癌细胞中。当包含于脂质双层中时，PEG的分子量可变化巨大(尽管PEG范围为约10至约100单位乙二醇，但可使用约15至约50单位、约15至约20单位、约15至约25单位、约16至约18单位等)且通常通过胺基与磷脂缀合的PEG组分包括约1％至约20％、优选约5％至约15％、约10％重量的包含于脂质双层中的脂质。
脂质体递送中使用的众多脂质可用于在纳米颗粒上形成脂质双层以提供本发明的原始细胞。实际上，任何用于形成脂质体或多聚体(polymersome)的脂质或聚合物可用于脂质双层中，所述脂质双层包裹纳米颗粒已形成本发明一项实施方案的原始细胞。用于本发明的优选脂质包括，例如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)胺基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)胺基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。胆固醇，技术上不是脂质，但考虑到胆固醇可以是本发明原始细胞的脂质双层的重要组分，胆固醇可作为脂质存在用于本发明的一项实施方案的目的。胆固醇经常掺合至原始细胞的脂质双层中从而增强所述双层的结构完整性。所有这些脂质均可容易地从Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,Alabama,USA)购得。DOPE和DPPE特别用通过脂质上的胺基缀合肽、多肽(包括抗体)、RNA和DNA。
在一些实施方案中，所述多孔纳米颗粒还可是生物可降解的聚合物纳米颗粒，其包括一种或多种选自以下的组合物：脂族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(己内酯)(PCL)、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、藻酸盐和其它多糖、胶原和其化学衍生物、白蛋白(一种亲水性蛋白)、玉米蛋白(一种醇溶蛋白，亲水性蛋白)和共聚物及它们的混合物
在其它实施方案中，所述多孔纳米颗粒各自包含具有基本上无二氧化硅的核表面的核，和与该核表面连接的壳，其中所述核包含选自以下的过渡金属化合物：氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、卤化物、硒化物、碲化物、氧化钽、氧化铁或其组合。
本发明所用的二氧化硅纳米颗粒可以是，例如，中孔二氧化硅纳米颗粒和核-壳纳米颗粒。所述纳米颗粒可掺合吸收分子，例如吸收染料。在适当的条件下，所述纳米颗粒发射源自化学发光的电磁辐射。可包含其它造影剂以便于MRI、CT、PET和/或超声成像中的造影。
中孔二氧化硅纳米颗粒的大小可以是例如约5nm至约500nm，包括其间的所有整数和范围。以颗粒的最长轴测量大小。在多项实施方案中，所述颗粒大小为约10nm至约500nm和约10nm至约100nm。所述中孔二氧化硅纳米颗粒具有多孔结构。这些孔的直径可为约1至约20nm，包括其间的所有整数和范围。在一项实施方案中，这些孔的直径为约1至约10nm。在一项实施方案中，约90％的孔的直径为约1至约20nm。在另一项实施方案中，约95％的孔的直径为约1至约20nm。
可根据本领域已知的方法合成所述中孔纳米颗粒。在一项实施方案中，所述纳米颗粒通过溶胶-凝胶方法学合成，其中一种或多种二氧化硅前体和一种或多种与吸附分子缀合(即共价结合)的二氧化硅前体在胶束形式的模板存在下水解。所述模板可使用表面活性剂例如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)形成。据预期可使用任何可形成胶束的表面活性剂。
核-壳纳米颗粒包含核和壳。所述核包含二氧化硅和吸附分子。所述吸附分子经由所述分子与二氧化硅网络之间的一个或多个共价键并入所述二氧化硅网络中。所述壳包含二氧化硅。
在一项实施方案中，使用已知的溶胶-凝胶化学法，例如通过一种或多种二氧化硅前体的水解独立地合成所述核。所述二氧化硅前体以二氧化硅前体和与吸附分子缀合(例如，通过共价键连接)的二氧化硅前体(本文称为“缀合的二氧化硅前体”)的混合物存在。水解可在碱(碱性)条件下进行以形成二氧化硅核/或二氧化硅壳。例如，水解可通过向包含一种或多种二氧化硅前体和一种或多种缀合的二氧化硅前体的混合物中加入氢氧化铵进行。
二氧化硅前体是在水解条件下可形成二氧化硅的化合物。二氧化硅前体的实例包括但不限于，有机硅烷，例如四乙氧基硅烷(TEOS)、四甲氧基硅烷(TMOS)等。
用于形成所述缀合二氧化硅前体的二氧化硅前体具有能够与所述一种或多种吸附分子反应形成一个或多个共价键的一个或多个官能团。这类二氧化硅前体的实例包括但不限于，异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ICPTS)、氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)、巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)等。
在一项实施方案中，用于形成核的有机硅烷(可缀合的二氧化硅前体)具有通式R4n SiXn，其中X为可水解的基团，如乙氧基、甲氧基、或2-甲氧基-乙氧基；R为具有1至12个碳原子的单价有机基团，其可任选含有，但不限于，功能性有机基团，如巯基、环氧、丙烯酰基、甲基丙烯酰基或氨基；且n为0至4的整数。所述可缀合的二氧化硅前体与吸附分子缀合并随后与二氧化硅前体(例如TEOS和TMOS)共缩合形成核。用于形成二氧化硅壳的硅烷具有n等于4。也已知功能性单-、双-和三-烷氧基硅烷用于共反应性官能团或羟基功能性表面(包括玻璃表面)，参见Kirk-Othmer,Encyclopedia of ChemicalTechnology,Vol.20,3rd Ed.,J.Wiley,N.Y.；还参见E.Pluedemann,SilaneCoupling Agents,Plenum Press,N.Y.1982。有机硅烷可引起凝胶，因此采用醇或其它已知的稳定剂可能是理想的。可在美国专利申请10/306,614和10/536,569中找到使用改良的Stoeber方法合成核-壳纳米颗粒的方法，这类方法的公开内容在此引入作为参考。
“含胺硅烷”包括但不限于，经硅原子功能化的伯胺、仲胺或叔胺，且可以是单胺或多胺，如二胺。优选地，所述含胺硅烷为N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)。含胺硅烷的非限制性实施例还包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，以及氨基功能性三烷氧基硅烷。还可使用质子化仲胺、质子化叔烷基胺、质子化脒、质子化胍、质子化吡啶、质子化嘧啶、质子化吡嗪、质子化嘌呤、质子化咪唑、质子化吡咯、季烷基胺或其组合。
在本发明的原始细胞的一些实施方案中，所述脂质双层由一种或多种选自磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇的脂质组成。
在一些实施方案中，所述脂质双层由一种或多种选自以下的磷脂酰胆碱(PC)组成：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)，卵PC，以及包含约50％至约70％、或约51％至约69％、或约52％至约68％、或约53％至约67％、或约54％至约66％、或约55％至约65％、或约56％至约64％、或约57％至约63％、或约58％至约62％、或约59％至约61％、或约60％的一种或多种不饱和磷脂酰胆碱的脂质混合物，具有碳长度为14并无不饱和键的DMPC[14:0]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)[16:0]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)[18:0]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)[18:1(Δ9-顺式)]、POPC[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1]。
在其它实施方案中：
(a)所述脂质双层由(1)卵PC和(2)一种或多种选自以下的磷脂酰胆碱(PC)组成：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、包含约50％至约70％、或约51％至约69％、或约52％至约68％、或约53％至约67％、或约54％至约66％、或约55％至约65％、或约56％至约64％、或约57％至约63％、或约58％至约62％、或约59％至约61％、或约60％的一种或多种不饱和磷脂酰胆碱的脂质混合物，具有碳长度为14并无不饱和键的DMPC[14:0]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)[16:0]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)[18:0]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)[18:1(Δ9-顺式)]、POPC[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1]；且其中
(b)混合物中卵PC的摩尔浓度为约10％至约50％或约11％至约49％，或约12％至约48％，或约13％至约47％，或约14％至约46％，或约15％至约45％，或约16％至约44％，或约17％至约43％，或约18％至约42％，或约19％至约41％，或约20％至约40％，或约21％至约39％，或约22％至约38％，或约23％至约37％，或约24％至约36％，或约25％至约35％，或约26％至约34％，或约27％至约33％，或约28％至约32％，或约29％至约31％，或约30％。
在一些实施方案中，所述脂质双层由一种或多种选自以下的组合物组成：磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰二乙醇胺、磷脂酰肌醇(phosphatidylinosite)、鞘脂和乙氧基化甾醇，或它们的混合物。在这类实施方案的示例性实施例中，所述磷脂可以是卵磷脂；所述磷脂酰肌醇可衍生自大豆、油菜、棉籽、卵和其混合物；所述鞘脂可以是神经酰胺、脑苷酯、鞘氨醇和鞘磷脂，和其混合物；所述乙氧基化甾醇可以是植物甾醇、PEG-(聚乙二醇)-5-大豆甾醇和PEG-(聚乙二醇)-5-菜籽甾醇。在一些实施方案中，所述植物甾醇包含以下组合物的至少两种的混合物：谷甾醇(sistosterol)、菜油甾醇和豆甾醇。
在其它示例性实施方案中，所述脂质双层由选自以下的一种或多种磷脂酰基组成：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰肌醇。
在其它示例性实施方案中，所述脂质双层由选自单酰基磷酸甘油酯或二酰基磷酸甘油酯的磷脂组成。
在其它示例性实施方案中，所述脂质双层由选自以下的一种或多种磷酸肌醇(phosphoinositides)组成：磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(PI-3-P)、磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI-4-P)、磷脂酰肌醇-5-磷酸酯(PI-5-P)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸酯(PI-3,4-P2)、磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸酯(PI-3,5-P2)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯(PI-4,5-P2)、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PI-3,4,5-P3)、溶血磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(LPI-3-P)、溶血磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(LPI-4-P)、溶血磷脂酰肌醇-5-磷酸酯(LPI-5-P)、溶血磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸酯(LPI-3,4-P2)、溶血磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸酯(LPI-3,5-P2),溶血磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯(LPI-4,5-P2)和溶血磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(LPI-3,4,5-P3)和磷脂酰肌醇(PI)以及溶血磷脂酰肌醇(LPI)。
在其它示例性实施方案中，所述脂质双层由选自以下的一种或多种磷脂组成：PEG-聚(乙二醇)衍生的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚(乙二醇)衍生的神经酰胺(PEG-CER)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、monosialogangolioside、鞘磷脂(spingomyelin)(SPM)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)。
在本发明的原始细胞的一项示例性实施方案中：
(a)所述一种或多种药学活性剂包括至少一种抗癌剂；
(b)在缺乏活性氧簇的条件下，少于约10％至约20％的抗癌剂自所述多孔纳米颗粒释放；和
(c)在由于与活性氧簇接触导致脂质双层破裂后，所述多孔纳米颗粒释放抗癌剂的量大约等于脂质双层经5％(重量/体积)Triton X-100溶解释放的抗癌剂的量的约60％至约80％、或约61％至约79％、或约62％至约78％、或约63％至约77％、或约64％至约77％、或约65％至约76％、或约66％至约75％、或约67％至约74％、或约68％至约73％、或约69％至约72％、或约70％至约71％、或约70％。
本发明的原始细胞的一项示例性实施方案包括大量带负电荷的、纳米多孔的、纳米颗粒二氧化硅核，所述二氧化硅核：
(a)经选自以下的含胺硅烷修饰：(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自经硅原子功能化；(2)单胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)；(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)；(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)质子化仲胺、质子化叔烷基胺、质子化脒、质子化胍、质子化吡啶、质子化嘧啶、质子化吡嗪、质子化嘌呤、质子化咪唑、质子化吡咯、季烷基胺或其组合；
(b)装载有siRNA或蓖麻毒素A链；和
(c)被包含选自以下的脂质的脂质双层包封和支撑包含选自以下的脂质的脂质双层：
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合，且其中所述脂质双层包括阳离子质子和一种或多种两性离子磷脂。
本发明的原始细胞可包括多种药学活性成分。
术语“报告子”用于描述掺入至本发明实施方案的磷脂双层或原始细胞的负载物中并提供可被测量信号的成像剂或部分。该部分可提供荧光信号或者可以是允许放射检测的放射性同位素。用于原始细胞中的示例性荧光标记(优选地经缀合或吸附至脂质双层或二氧化硅核，尽管这些标记也可被掺入至经原始细胞递送至细胞的负载物元件如DNA、RNA、多肽和小分子中)，包括Hoechst 33342(350/461)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,356/451)、Alexa405羧酸、琥珀酰亚胺酯(401/421)、CellTrackerTM Violet BMQC(415/516)、CellTrackerTM Green CMFDA(492/517)、钙黄绿素(495/515)、膜联蛋白V的Alexa488缀合物(495/519)、Alexa488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、AHA Alexa488蛋白质合成HCS分析(495/519)、可固定绿色死细胞染色试剂盒(495/519)、绿色核酸染色(504/523)、MitoSOXTM红色线粒体超氧化物指示剂(510/580)。Alexa532羧酸、琥珀酰亚胺酯(532/554)、pHrodoTM琥珀酰亚胺酯(558/576)、CellTrackerTM Red CMTPX(577/602)、Texas1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TexasDHPE,583/608)、Alexa647酰肼(649/666)、Alexa647羧酸、琥珀酰亚胺酯(650/668)、UlysisTM Alexa647核酸标记试剂盒(650/670)和膜联蛋白V(650/665)的Alexa647缀合物。还可掺入增强荧光信号或使荧光衰减变慢的部分(moities)，其包括Gold抗衰减试剂(含和不含DAPI)和FX信号增强剂。所有这些均为本领域已知的。其它的报告子包括可被质粒(如组蛋白封装的超螺旋DNA质粒)表达的多肽报告子并包括多肽报告子如绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。本发明的报告子主要用于诊断性应用(包括诊断患者中癌症(癌组织)的存在或进展和患者或受试者中治疗的进展)中。
术语“组蛋白封装的超螺旋质粒DNA”用于描述本发明原始细胞(其利用已经“超螺旋化”(即，使用引起质粒在自身上折叠的过饱和盐溶液或其它离子溶液在自身上进行折叠并“超螺旋”以变得更紧凑以有效地封装至原始细胞中)的优选的质粒DNA)的优选组分。实际上，所述质粒可以是表达任意数目的多肽或编码RNA(包括小发夹RNA/shRNA或小干扰RNA/siRNA)的任何质粒，如本文另有描述。一旦超螺旋化(使用浓缩盐或其它阴离子溶液)，所述超螺旋质粒RNA然后与组蛋白复合以产生组蛋白封装的“复合的”超螺旋质粒DNA。
本文“封装的”DNA指的是装载至原始细胞中(或吸附至孔中或直接限制于纳米二氧化硅核自身内)的DNA。为使DNA空间上最小化，DNA经常被封装，其可以若干方式实现，从调整周围介质的电荷到形成DNA和例如脂质、蛋白质或其它纳米颗粒(通常，但不排他为阳离子型)的小复合物。封装DNA通常经由脂质复合物(即将DNA和阳离子型脂质混合物复合)来实现。此外，DNA还被阳离子型蛋白质(包括除组蛋白外的蛋白质)以及金纳米颗粒(例如，NanoFlares-工程化DNA和金属复合物，其中该纳米颗粒的核为金)封装。
任意数目的组蛋白，以及其它将DNA封装至较小体积的手段如标准阳离子型纳米颗粒、脂质或蛋白质，可用于封装超螺旋质粒DNA“组蛋白封装的超螺旋质粒DNA”，但在涉及治疗人类患者的治疗方面，优选使用人类组蛋白。在本发明的一些方面，本领域已知或可根据本发明的教导容易地实施，尽管可使用其它相似比例的其它组蛋白，但人类组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4以优选比例1:2:2:2:2的组合。DNA也可以是双链线性DNA而不是质粒DNA，其也可以任选地为超螺旋和/或经组蛋白或其它封装组分封装的。
可用于本发明该方面的其它组蛋白包括，例如H1F、H1F0、H1FNT、H1FOO、H1FX H1H1HIST1H1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HIST1H1T；H2AF、H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、H2A1、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2AI、HIST1H2AJ、HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、H2A2、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BF、H2BFM、HSBFS、HSBFWT、H2B1、HIST1H2BA、HIST1HSBB、HIST1HSBC、HIST1HSBD、HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2BI、HIST1H2BJ、HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2BO、H2B2、HIST2H2BE、H3A1、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、H3A2、HIST2H3C、H3A3、HIST3H3、H41、HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4G、HIST1H4H、HIST1H4I、HIST1H4J、HIST1H4K、HIST1H4L、H44和HIST4H4。
术语“核定位序列”指的是掺入或者交联至组蛋白的肽序列，其中所述组蛋白包含组蛋白封装的超螺旋质粒DNA。在一些实施方案中，本发明的原始细胞可进一步包含经核定位序列(注意组蛋白可与该核定位序列交联或质粒本身可经修饰以表达核定位序列)修饰(交联)的质粒(常为组蛋白封装的超螺旋质粒DNA)，所述核定位序列增强了组蛋白封装的质粒穿透细胞核并将其内容物放置于那里(以促进表达和最终细胞死亡)的能力。这些肽序列有助于将组蛋白封装的质粒DNA和结合的组蛋白搬运至靶细胞的细胞核中，随后质粒将表达所需的肽和/或核苷酸以递送治疗性和/或诊断性分子(多肽和/或核苷酸)至靶细胞的细胞核中。本领域公知，任意数目的交联剂可用于将核定位序列共价连接至组蛋白(常位于赖氨酸基团或在悬挂(pendant)暴露于多肽的氨基酸的侧链中具有亲核性或亲电性基团的其它基团)，其可用于将组蛋白封装的质粒引入细胞核中。或者，表达核定位序列的核苷酸序列可定位于靠近表达组蛋白的核苷酸序列的质粒中，从而发生缀合至核定位序列的组蛋白的表达，促进质粒转移至靶细胞的细胞核中。
蛋白质通过核被膜进入细胞核。核被膜由同心膜、外层膜和内层膜组成。这些是通往细胞核的入口。被膜由孔或大细胞核复合物组成。经NLS翻译的蛋白质将与输入蛋白(aka karyopherin)强烈地结合，同时该复合物将移动通过核孔。任意数目的核定位序列可用于将组蛋白封装的质粒DNA引入至细胞核中。优选的核定位序列包括H2N-GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH SEQ I.D NO:9、RRMKWKK(SEQ ID NO:10)、PKKKRKV(SEQ ID NO:11)和KR[PAATKKAGQA]KKKK(SEQ ID NO:12)、核质蛋白的NLS、包含两个碱性氨基酸簇、被具有约10个氨基酸的间隔区分隔的原型二分裂信号(prototypical bipartite signal)。数目众多的其它核定位序列是本领域公知的。参见，例如LaCasse等人,Nuclear localization signals overlap DNA-orRNA-binding domains in nucleic acid-binding proteins.Nucl.Acids Res.,23,1647-16561995)；Weis,K.Importins and exportins:how to get in and out of thenucleus[published erratum appears in Trends Biochem Sci 1998 Jul；23(7):235].TIBS,23,185-9(1998)；和Murat Cokol,Raj Nair & Burkhard Rost,“Findingnuclear localization signals”,at the website ubic.bioc.columbia.edu/papers/2000nls/paper.html#tab2。
术语“癌症”用于描述具有失去正常控制的独特特征的肿瘤细胞(新生物)的增殖，其导致不受调控的生长、缺少分化、局部组织侵袭和/或转移。如本文所用，新生物包括但不限于，受试者或宿主组织中细胞形态学不规则以及与相同类型组织的正常增生相比，受试者组织中细胞的病理性增生。此外，新生物包括侵袭性或非侵袭性的良性肿瘤和恶性肿瘤(例如，结肠肿瘤)。恶性新生物与良性新生物区别在于前者显示较大程度的发育异常，或细胞分化和定向的损失，并且具有侵袭和转移的性质。在本文中术语癌症还包括耐药癌症，包括多重耐药癌症。新生物或瘤变(本发明的靶细胞可自其中衍生得到)的实例包括但不限于，癌(例如，鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌和肾细胞癌)，特别是膀胱癌、骨癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌(结肠直肠癌)、食管癌、头部癌症、肾癌、肝癌(肝细胞癌)、肺癌、鼻咽癌、颈部癌症、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病，如急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、急性T细胞成淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、嗜碱细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、粒细胞性白血病、毛细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、中性粒细胞性白血病和干细胞白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤；良性和恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神经上皮样瘤和滑膜肉瘤；中枢神经系统肿瘤(例如，胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节瘤、神经节神经胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体细胞肿瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤)；生殖系肿瘤(例如，肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、混合型小细胞和非小细胞癌、胸膜间皮瘤，包括转移性胸膜间皮瘤小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑色素瘤)；混合型瘤变，特别是癌肉瘤和霍奇金病；以及混合起源的肿瘤，如Wilm肿瘤和畸胎癌。应当注意其中一些肿瘤包括肝细胞癌和宫颈癌显示在癌细胞上特异性地展现升高水平的MET受体，并且是本发明实施方案的组合物和疗法(其包括与原始细胞复合的MET结合肽)的主要靶点。
术语“同服”和“共同给予”同义地用于描述给予与至少一种其它药剂(常为至少一种其它抗癌剂(如本文另有描述))组合的至少一种本发明的原始细胞组合物，本文明确的公开了在同一时间或大约在同一时间被视为有效量的量和浓度。尽管优选同时给予共同给予的组合物/药剂，但可在多个时间给予药剂从而使得两种(或两种以上)组合物/药剂的有效浓度在患者中同时出现至少一段时间。或者，在本发明的一些方面中，可能可以使共同给予的组合物/药剂在不同的时间在患者中展现其抑制作用，且最终结果为癌症(尤其包括肝细胞癌或细胞性癌)的抑制和治疗以及其它疾病状态、病症或并发症的减少或抑制。当然，当不只是疾病状态、感染或其它病症存在时，本发明的化合物可根据需要与其它药剂组合以治疗该其它感染或疾病或病症。
术语“抗癌剂”用于描述可与一种或多种包含本发明的原始细胞的组合物组合配制的化合物，并用于治疗任意类型的癌症，其中尤其是肝细胞癌或宫颈癌。可与本发明的化合物一起配制的抗癌化合物包括，例如，可用于本发明的例示性抗癌剂包括依维莫司、曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼(vandetanib)、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGF trap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗(oregovomab)、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、batabulin、奥法木单抗、扎木单抗(zanolimumab)、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1 KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈(talampanel)、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、多柔比星脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶(piperadine)甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(Bu t)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼(Ionafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib)；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺一羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米(bortezimib)、紫杉醇、无氢化蓖麻油的紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬(Pipendoxifene)、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬(Acolbifene)、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀(darbepoetin)、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b,干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦(casopitant)、奈妥匹坦(netupitant)、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦(aprepitant)、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)和其混合物。
在整个说明书中，术语“抗肝细胞癌剂”用于描述可用于抑制、治疗或降低肝细胞癌可能性或该癌症的转移的抗癌剂。本发明中可使用的抗癌剂包括，例如，多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、贝伐珠单抗、特罗凯(厄洛替尼)、泰立沙(拉帕替尼)和其混合物。此外，本发明还可使用其它抗癌剂，其中这类药剂可抑制癌症(尤其是肝细胞癌)的转移。
术语“抗病毒剂”用于描述生物活性剂/药物，其抑制病毒(包括突变株如耐药病毒株)的生长和/或加工(elaboration)。优选的抗病毒剂包括抗HIV剂、抗HBV剂和抗HCV剂。在本发明的一些方面，尤其是治疗肝细胞癌是治疗目的的方面，考虑到经常发现乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)是与肝细胞癌相关的主要或次要感染或疾病状态，抗丙肝剂或抗乙肝剂的纳入可与其它传统抗癌剂组合以影响治疗。本发明可使用的抗HBV剂，作为原始细胞中的负载物组分或作为包括原始细胞群的药物组合物中的额外的活性剂，包括如下药剂：贺维力(阿德福韦二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨、克来夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韦(pradefovir)、racivir、BAM 205、硝唑尼特、UT 231-B、Bay 41-4109、EHT899、日达仙(胸腺肽α-1)和其混合物。用于本发明的典型的抗HCV剂包括如下药剂：波普瑞韦(boceprevir)、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100、NM 283、VX-950(替拉瑞韦)、SCH 50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI 5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS 9190、GS 9256、GS 9451、GS 5885、GS 6620、GS 9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI 201335、BI 207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PSI-938、PSI-7977、PSI-7851、SCY-635、利巴韦林、PEG化干扰素、PHX1766、SP-30和其混合物。
术语“抗HIV剂”指的是抑制HIV病毒(I和/或II)或其突变株的生长和/或加工的化合物。用于本发明的可作为负载物包含于本发明原始细胞的例示性抗HIV剂包括，例如，其中包括核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、其它非核苷逆转录酶抑制剂(即，那些不是本发明代表的逆转录酶抑制剂)、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂，其例示性化合物可包括，例如3TC(拉米夫定)、AZT(齐多夫定)、(-)-FTC、ddI(地达诺新)、ddC(扎西他滨)、阿巴卡韦(ABC)、替诺福韦(PMPA)、D-D4FC(Reverset)、D4T(司他夫定)、Racivir、L-FddC、L-FD4C、NVP(奈韦拉平)、DLV(地拉韦定)、EFV(依法韦仑)、SQVM(甲磺酸沙奎那韦)、RTV(利托那韦)、IDV(茚地那韦)、SQV(沙奎那韦)、NFV(那非那韦)、APV(安泼那韦)、LPV(洛匹那韦)、其中融合抑制剂如T20、fuseon和其混合物。
术语“靶向活性物种”用于描述与本发明的原始细胞(其与所靶向细胞的表面上的部分结合从而使得该原始细胞可选择性地与该靶细胞的表面结合并将其内容物放置于细胞中)的表面复合或优选地共价键接的化合物或部分。在与靶细胞结合的物种中，用于本发明的靶向活性物种优选为本文另有描述的靶向肽、包含抗体或抗体片段的多肽、适体或碳水化合物。
术语“靶向肽”用于描述一种优选的靶向活性物种，具有特定序列的肽，其与癌细胞中的受体或其它多肽结合并允许本发明的原始细胞靶向表达与该靶向肽结合的肽(为受体或其它功能性多肽)的特定细胞。在本发明中，例示性靶向肽包括，例如，SP94游离肽(H2N-SFSIILTPILPL-COOH,SEQ ID NO:6)、经C端半胱氨酸修饰用于与交联剂缀合的SP94肽(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQ ID.NO:13)或8mer多聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-COOH,SEQ ID NO:14))、经修饰的SP94肽(H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH,SEQ ID NO:8)或MET结合肽，如本文另有描述。其它靶向肽是本领域已知的。靶向肽可通过使用本文另有描述的交联剂与脂质双层复合或优选地共价连接。
术语“MET结合肽”或“MET受体结合肽”用于五(5)中7-mer肽，已显示其将MET受体结合到癌细胞表面，结合效率增强。根据本发明，鉴定了若干具有可变氨基酸序列的小肽，所述序列以可变水平的特异性和可变能力结合MET受体(a.k.a.肝细胞生长因子受体，由基因c-MET表达)以活化MET受体信号转导通路。使用噬菌体展示生物淘选鉴定7-mer肽，所得序列的实例证明与MET受体以及随后与表达高水平MET受体的细胞如癌细胞(例如肝细胞、卵巢和宫颈)的结合增强，其显示如下。生物淘选方法中若干种最常观测到的序列的结合数据也再本发明的实施例部分呈现。具体地，这些肽可用作细胞特异性疗法的靶向配体。然而，具有活化受体通路能力的肽本身或与其它治疗组合可具有额外的治疗值。已发现很多肽不仅结合肝细胞癌(其为最初预期的靶点)还结合多种其它癌，包括卵巢癌和宫颈癌。据信这些肽可广范围地应用于靶向或治疗多种癌症和其它与MET和相关受体表达有关的生理学问题。
以下五种7-mer肽序列显示大量与MET受体结合并具体地用作用于本发明原始细胞上的靶向肽。
ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)    SEQ ID NO:1
TATFWFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)    SEQ ID NO:2
TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)    SEQ ID NO:3
IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)    SEQ ID NO:4
WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)    SEQ ID NO:5
这些肽可各自单独使用或与上述其它MET肽组合使用或与其它可有助于将本发明的原始细胞与癌细胞(其中，包括肝细胞癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈癌细胞)结合的靶向肽组合使用。这些结合肽也可单独作为MET结合肽用于药物化合物中以治疗癌症和抑制肝细胞生长因子结合。
术语“融合肽”和“内体裂解肽”同义地用于描述任选地并优选地交联至本发明的原始细胞脂质双层表面上的肽。融合肽被掺合至原始细胞上以促进或有助于从内体逃逸并促进原始细胞引入至靶细胞中以影响预期结果(如本文另有描述的治疗性和/或诊断性结果)。在本领域已知的融合肽中，用于本发明原始细胞中的代表性的和优选的融合肽包括H5WYG肽、H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQ ID.NO:13)或8mer聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-COOH,SEQ ID NO:14)。
术语“交联剂”用于描述具有可变长度包含两个不同官能团的双功能化合物，其可用于将多种本发明的组分彼此共价连接。本发明的交联剂可包含两个亲电基团(以与寡核苷酸的肽上的亲核基团反应)、一个亲电基团和一个亲核基团或两个亲核基团。取决于待连接的组分和所需要的相对柔性，所述交联剂的长度可变。交联剂可用于将靶向和/或融合肽锚定于磷脂双层上，用于将核定位序列连接至组蛋白以封装超螺旋质粒DNA，且在一些情况中，用于交联原始细胞的脂质双层中的脂质。存在数量众多的可用于本发明的交联剂，很多可购得或在文献中可得。其中，用于本发明的优选交联剂包括，例如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC),N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)、NHS-(PEG)n-马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)和6-[3′-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)。
如上文所详述，本发明的多孔纳米颗粒核可包括具有至少一个维度(dimension)的多孔纳米颗粒，例如，宽度或直径为约3000nm或更小、约1000nm或更小、约500nm或更小、约200nm或更小。优选地，所述纳米颗粒核为球形，优选直径为约500nm或更小，更优选为约8-10nm至约200nm。在实施方案中，所述多孔颗粒核具有多种横断层形状，包括环形、矩形、正方形或其它形状。在一些实施方案中，所述多孔颗粒核可具有平均孔径范围为约2nm至约30nm的核，尽管所述平均孔径和其它性质(例如，所述多孔颗粒核的孔隙率)不限于本发明教导的多种实施方案。
通常，本发明的原始细胞是生物相容的。药物和其它负载物组分经常通过吸附和/或所述颗粒核的孔的毛细填充至大约最终原始细胞(含所有组分)的50％重量。在本发明的一些实施方案中，所装载的负载物可自颗粒核(中孔)的多孔表面释放，其中释放特点可由例如孔径、多孔颗粒核的表面化学、系统的pH值和/或本文概述的多孔颗粒核与周围脂质双层间的相互作用决定或调整。
在本发明中，用于制备原始细胞的多孔纳米颗粒核可变得亲水或进行性地更加疏水，如本文另有描述，且可进一步经处理以提供更加亲水的表面。例如，中孔二氧化硅颗粒可进一步经氢氧化铵和过氧化氢处理以提供更高的亲水性。在本发明的优选方面中，脂质双层被融合至多孔颗粒核上以形成原始细胞。本发明的原始细胞可包括多种重量比的多种脂质，优选包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。
用于制备本发明的原始细胞的脂质双层可例如通过以下方法制备：使用本领域已知或如本文另有描述的标准方案，将水合脂质薄膜通过孔径为例如约100nm的过滤器挤出。然后可将滤过的脂质双层膜与多孔颗粒核例如通过吸量管混合融合。在一些实施方案中，过量的脂质双层或脂质双层薄膜可用于形成原始细胞以改善该原始细胞的胶体稳定性。
在一些诊断性实施方案中，为了诊断性目的，多种染料或荧光(报告子)分子可包含于原始细胞负载物(如由质粒DNA表达的)中或依附于所述多孔颗粒核和/或脂质双层。例如，所述多孔颗粒核可以是二氧化硅核或脂质双层，并且可以是经FITC(绿色荧光)共价标记的，而脂质双层或颗粒核可以是经FITC Texas red(红色荧光)共价标记的。然后，可通过例如共聚焦荧光观测所述多孔颗粒核、脂质双层和所形成的原始细胞以用于诊断性应用中。此外，如本文所讨论的，质粒DNA可作为负载物用于本发明的原始细胞中从而该质粒可表达一种或多种可用于诊断性应用中的荧光蛋白如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
在多项实施方案中，原始细胞用于协同系统中，其中所述脂质双层融合或脂质体融合(即，在多孔颗粒核上)装载并密封有多种负载物组分和颗粒核的孔，从而形成经装载的原始细胞用于负载物递送穿过脂质双层的细胞膜，或者如果适用，通过多孔纳米颗粒的溶出。在一些实施方案中，除融合单个脂质(例如磷脂)双层外，多个具有相反电荷的双层可被接连融合至多孔颗粒核上以进一步影响负载物的装载和/或密封以及最终原始细胞的释放特征。
负载物递送可包括融合和协同装载机制。例如，负载物可通过多孔颗粒上的脂质体融合协同地装载、包封或密封。所述负载物可包括，例如，小分子药物(例如，尤其包括抗癌药物和/或抗病毒药物如抗HBV或抗HCV药物)、肽、蛋白质、抗体、DNA(尤其是质粒DNA，包括优选的组蛋白封装的超螺旋质粒DNA)、RNA(包括shRNA和siRNA(其也可由作为负载物掺入原始细胞中的质粒DNA表达))、荧光染料(包括荧光染料肽，其可由掺入原始细胞内的质粒DNA表达)。
在本发明的实施方案中，负载物可被装载至多孔颗粒核的孔(中孔)中以形成经装载的原始细胞。在多项实施方案中，任何开发用于基于脂质体的药物递送的常规技术，例如使用PEG化的靶向递送，可被转移并应用于本发明的原始细胞。
如上文所讨论的，静电学和孔径可在负载物装载中发挥作用。例如，多孔二氧化硅纳米颗粒可搬运负电荷，而孔径在约2nm至约10nm或10nm以上是可调的。负电荷纳米颗粒可具有吸附正电荷分子的自然趋势，而正电荷纳米颗粒具有吸附负电荷分子的自然趋势。在多项实施方案中，其它性质如表面润湿性(如，疏水性)也可影响具有不同疏水性的负载物的装载。
在多项实施方案中，负载物装载可以是通过调整脂质组合物进行的协同的脂质辅助的装载。例如，如果负载物组分是负电荷分子，则负载物装载至负电荷二氧化硅可通过脂质辅助的装载实现。在一些实施方案中，例如，当脂质双层融合至二氧化硅表面显示融合和协同装载机制时，带负电荷的物种可作为负载物被装载至负电荷二氧化硅颗粒的孔中。以该方式，带负电荷的中孔颗粒上的非负电荷(即，正电荷或中性)脂质双层或脂质体的融合可用于装载具有负电荷负载物组分的颗粒核。所述负电荷负载物组分可在经装载的原始细胞(与溶液中带电荷的负载物组分相比，其具有超过约100倍的浓度)中浓缩。在其它实施方案中，通过改变中孔颗粒和脂质双层的电荷，正电荷负载物组分可被容易地装载至原始细胞中。
一旦产生，在给予后，所述经装载的原始细胞可具有细胞摄取以将负载物递送至所需位点。例如，可向患者或受试者给予负载物装载的原始细胞并且包含靶向肽的原始细胞可与靶细胞结合并被靶细胞(例如，受试者或患者中的癌细胞)内化或摄取。由于靶细胞中负载物装载的原始细胞的内化，然后负载物组分可被递送至靶细胞中。在一些实施方案中，所述负载物为小分子，其可被直接递送至靶细胞中用于治疗。在其它实施方案中，负电荷DNA或RNA(包括shRNA或siRNA)，尤其包括DNA质粒(其优选配制为组蛋白封装的超螺旋质粒DNA，优选地经核定位序列修饰)可被靶细胞直接递送或内化。因此，DNA或RNA可首先被装载至原始细胞中，然后通过所述经装载的原始细胞的内化递送至靶细胞中。
如所讨论的，被装载至原始细胞并被原始细胞递送至靶细胞中的负载物包括小分子或药物(尤其是抗癌剂或抗HBV剂和/或抗HCV剂)、生物活性大分子(生物活性多肽，如蓖麻毒素A链或白喉毒素A链或RNA分子，如shRNA和/或siRNA，如本文另有描述)或组蛋白封装的超螺旋质粒DNA(其可表达治疗性或诊断性肽或治疗性RNA分子如shRNA或siRNA，其中所述组蛋白封装的超螺旋质粒DNA任选地并优选地经核定位序列(其可定位并浓缩所递送的质粒DNA至靶细胞的细胞核中)修饰)。如此，经装载原始细胞可将它们的负载物递送至靶细胞以用于治疗或诊断。
在本发明的多项实施方案中，原始细胞和/或经装载的原始细胞可提供靶向递送方法学以选择性地将所述原始细胞或负载物组分递送至靶细胞(例如，癌细胞)中。例如，脂质双层的表面可经相应于靶细胞的靶向活性物种修饰。所述靶向活性物种可以是本文另有描述的靶向肽、包含抗体或抗体片段的多肽、适体、碳水化合物或其它与靶细胞结合的部分。在本发明的优选方面中，所述靶向活性物种是本文另有描述的靶向肽。在一些实施方案中，优选的肽靶向物种包括本文另有描述的MET结合肽。
例如，通过在经装载的原始细胞的表面上提供靶向活性物种(优选靶向肽)，所述原始细胞选择性地与本发明的靶细胞结合。在一项实施方案中，通过将靶向癌细胞(包括肝癌细胞)的本文另有描述的示例性靶向肽SP94或类似物或MET结合肽缀合至脂质双层，由于所述示例性SP94或MET结合肽对所述癌(包括肝癌)细胞的特异性靶向，大量的负载物装载的原始细胞可被该特异性癌细胞识别并内化。在大多数情况中，如果所述原始细胞与所述靶向肽缀合，则所述原始细胞选择性地与所述癌细胞结合并且不与非癌性细胞发生明显的结合。
一旦被所述靶细胞结合并摄取，所述经装载的原始细胞可从多孔颗粒释放负载物组分并将所释放的负载物组分转运至靶细胞中。例如，被多孔颗粒核上的脂质体融合的双层密封在原始细胞内的负载物组分可从所述脂质双层的孔中释放，转运穿过所述脂质双层的原始细胞膜并递送至靶细胞内。在本发明的实施方案中，原始细胞中负载物组分的释放特点与仅使用本领域已知的脂质体时的释放特点相比更可控。负载物的释放可通过例如多孔核和脂质双层的相互作用和/或其它参数如系统的pH值来测定。例如，负载物的释放可通过脂质双层、通过多孔二氧化硅的溶解实现；同时负载物从原始细胞中的释放可以是pH依赖的。
在一些实施方案中，负载物的pH值常小于7，优选为约4.5至约6.0，但可以是约pH14或小于pH14。较低的pH与高pH相比倾向于更显著地促进负载物组分的释放。较低的pH是有利的，因为大多数细胞中的内体隔室处于低pH(约5.5)，但细胞的负载物递送速率可被负载物的pH影响。取决于负载物和负载物从原始细胞中释放所处的pH，负载物的释放可以是相对短的(约数小时至一天)或持续数天至约20-30天或更长。因此，本发明可适应于从原始细胞本身的即释和/或缓释应用。
在一些实施方案中，表面活性剂的纳入可使得脂质双层快速的破裂，将负载物组分转运穿过原始细胞以及靶细胞的脂质双层。在一些实施方案中，表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)的应用/释放可使所述原始细胞的磷脂双层破裂，从而促进负载物快速地从原始细胞中释放至靶细胞中。除表面活性剂外，其它材料也可被纳入以使所述双层快速破裂。一个实例是金或磁性纳米颗粒，其可使用光和热以产生热量从而使所述双层破裂。此外，可调节所述双层以在离散的生物物理现象如在响应活性氧簇产生增加的炎症过程中破裂。在一些实施方案中，所述脂质双层的破裂可依次诱导负载物组分从原始细胞的颗粒核的孔中即刻释放和完全释放。以该方式，与本领域的其它递送系统相比，原始细胞平台可提供日益多样的递送系统。例如，当与仅使用纳米颗粒的递送系统相比时，本文所公开的原始细胞平台可提供简单的系统并可利用脂质体或脂质双层的低毒性和免疫原性以及其被PEG化或被缀合以延长循环时间和影响靶向作用的能力。在另一实例中，当与仅使用脂质体的递送系统相比，所述原始细胞平台可提供更稳定的系统并利用中孔核以控制装载和/或释放特点并提供增加的负载物容量。
此外，多孔颗粒核上的脂质双层和其融合可被微调以控制装载、释放和靶向特点并且可包含融合肽和相关的肽以促进原始细胞的递送，达到更大的治疗性和/或诊断性作用。而且，所述原始细胞的脂质双层可为配体展示和多价靶向提供流体界面，由于流体脂质界面上配体重组的容量，其允许相对低表面配体密度的特异性靶向。此外，本文所公开的原始细胞可容易地进入靶细胞而无多孔颗粒支撑的空脂质体不能被所述细胞内化。
本发明的药物组合物包含如本文另有描述与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合配制以产生预期结果(例如，治疗性结果和/或诊断性分析，包括治疗监测)的有效群体的原始细胞。取决于所需要获得的结果，所述组合物群体内的原始细胞可以是相同的或不同的。本发明的药物组合物还可包含额外的生物活性剂或药物，如抗癌剂或抗病毒剂，例如抗HIV剂、抗HBV剂或抗HCV剂。
通常，根据受试者的体格大小和病症，根据标准的药物规范，确定所述化合物的给予剂量和途径。所采用的剂量水平可变化巨大，且可由本领域的技术人员容易地确定。通常，采用毫克(mg)至克(g)的量。可通过多种途径，例如口服、经皮、围神经或胃肠外(即静脉)、皮下、腹膜内、鞘内或肌内注射，向受试者给予所述组合物，其中包括口腔、直肠和经皮给予。本发明的方法治疗的受试者包括人、伴侣动物、实验动物等。本发明涵盖即释和/或缓/控释组合物，包括同时包含即释和缓释制剂的组合物。当不同群体的原始细胞用于药物组合物中时或当一种或多种额外的生物活性剂与一种或多种群体的本文另有描述的原始细胞组合使用时，尤其如此。
包含本发明化合物的制剂可以是液体、固体、半固体或冻干粉末形式，如例如，溶液、混悬液、乳剂、缓释制剂、片剂、胶囊、散剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂、气雾剂、贴剂等，优选适于容易给予精确计量的单位剂量形式。
本发明的药物组合物通常包括常规药物载体或赋形剂且可能额外地包括其它药用剂、载体、佐剂、添加剂等。优选地，所述组合物为约0.1重量％至约85重量％、约0.5重量％至约75重量％为本发明的一种或多种化合物，其余基本上由适宜的药物赋形剂组成。
用于胃肠外给予(例如，静脉、肌内或鞘内)的可注射组合物通常包含于适宜i.v.溶液如灭菌生理盐水溶液中的化合物。所述组合物还可作为混悬剂在水性乳剂中配制。
液体组合物可通过将原始细胞群(约0.5重量％至约20重量％或更多)和任选的药用佐剂溶解或分散于载体例如盐水、水性葡萄糖、甘油或乙醇中以形成溶液或混悬剂。为用于口服液体制剂，可以溶液、混悬剂、乳剂或糖浆剂制备所述组合物，以液体形式或适于在水或生理盐水中水合的干燥形式提供。
为了口服给予，这类赋形剂包括药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。如果需要，所述组合物也可包含少量的非毒性辅助物质如润湿剂、乳化剂或缓冲剂。
当所述组合物以固体制剂的形式用于口服给予时，所述制剂可以是片剂、颗粒剂、散剂、胶囊等。在片剂制剂中，所述组合物通常与添加剂例如赋形剂(如糖类或纤维素制剂)、粘合剂如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂和其它药物制剂制备中通常使用的添加剂一起配制。
制备这类剂型的方法是已知的或者对本领域的技术人员而言是显而易见的；例如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences(17th Ed.,Mack Pub.Co.,1985)。所给予的组合物将包含在生物学系统(包括本发明的患者或受试者)中用于治疗性用途的药学上有效量的所选择的化合物。
治疗有需要的患者或受试者的特定疾病状态或感染(尤其包括癌症和/或HBV、HCV或HIV感染)的方法包括给予有效量的本发明的药物组合物，所述药物组合物包含治疗性原始细胞和任选至少一种额外的生物活性(例如，抗病毒)剂。
本发明的诊断性方法包括向有需要的患者(怀疑患有癌症的患者)给予有效量的诊断性原始细胞群(例如，包含靶物种，如靶向肽(其与癌细胞和报告子组分选择性结合，从而若所述癌细胞存在，则标识原始细胞与癌细胞的结合)的原始细胞)，于是使得由所述报告子组分(部分)证明的原始细胞与癌细胞的结合能够诊断患者中癌症的存在。
本发明替代性的诊断性方法可用于监测患者中癌症或其它疾病状态的治疗，所述方法包括在治疗前向患者或受试者给予有效群体的诊断性原始细胞(例如，包含靶物种，如靶向肽(其与癌细胞和报告子组分选择性结合，从而若所述癌细胞存在，则标识原始细胞与癌细胞的结合)的原始细胞)，测定所述患者中诊断性原始细胞与靶细胞的结合水平，并且在治疗过程中和/或治疗后，测定所述患者中诊断性原始细胞与靶细胞的结合水平，于是治疗开始前和治疗过程中和/或治疗后患者中结合的差异将证明患者中治疗的有效性，包括患者是否完成治疗或疾病状态是否被抑制或消除(包括癌症的缓解)。
以下非限制性实施例是本发明和其有利特性的解释，并不以任何方式限制本发明公开的内容或权利要求。在实施例以及本申请的任意处，除非另外指出，所有份数和百分数均以重量计。
实施例1
配体靶向原始细胞
如以下实施例所提供的，经由脂质体与纳米多孔二氧化硅颗粒融合形成的多孔纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)是一种新型的纳米载体，其解决了与癌症治疗和诊断的靶向递送相关的多种挑战。与脂质体相似，原始细胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但与类似大小的脂质体递送剂相比，其纳米多孔二氧化硅核赋予了极大增加的负载物容量和延长的双层稳定性。而且，可调节该核的孔隙率和表面化学以促进多种治疗剂如药物、核酸和蛋白质毒素的包封。可通过孔径和二氧化硅的总体压缩程度来控制负载物的释放速率，使得原始细胞用于需要爆发性释放或控释特点的应用中。最终，该原始细胞的受支撑的脂质双层(SLB)可经配体修饰以促进选择性递送和经PEG修饰以延长循环时间。在实施例中，发明者报告了使用肽靶向的原始细胞实现编码小发夹RNA(shRNA)的质粒的高度特异性递送，其通过沉默细胞周期蛋白B1诱导转染细胞的生长停滞和细胞凋亡。如以下实施例部分所述，发明者已通过使用双重表面活性剂方法制备了具有足够大孔的合成的二氧化硅纳米颗粒以适应组蛋白封装的质粒。当用于与膨胀剂(1,3,5-三甲基苯)合用时，非离子型表面活性剂(F-127)用作大孔模板，而碳氟化合物表面活性剂(FC-4)促进二氧化硅核的生长。所得的颗粒直径范围为100nm至300nm并包含具有20nm孔和17.3nm孔入口的有序网络。超螺旋质粒DNA经组蛋白封装，并且所得复合物(直径约15nm)在装载至二氧化硅核之前经核定位序列(NLS)修饰。在37℃暴露于模拟体液后，脂质体与纳米多孔核的融合促进了包封DNA的长期滞留(>1个月)。使用噬菌体展示，发明者鉴别出对肝细胞生长因子受体(c-Met)(已知其被多种类型的肝细胞癌(HCC)过表达)具有纳摩尔亲和性的靶向肽。装载有DNA-组蛋白-NLS并经"240份副本(每一靶向肽和融合肽促进原始细胞和包封DNA的内体逃逸)修饰的原始细胞能够转染分裂和未分裂的HCC。此外，靶原始细胞有效地诱导HCC的GJM停滞和细胞凋亡(LC,,＝25nM)而不影响非癌性细胞(包括肝细胞、内皮细胞和免疫细胞(PBMC、B细胞和T细胞))的活力。
方法
如前所述1,2(也参见Ashley等人,Nature Materials,2011,May；10(5):389-97)使用在油包水乳剂液滴1内的气溶胶辅助的蒸发诱导自组装(EISA)或溶剂萃取驱动的自组装从一种或多种水溶性二氧化硅前体和一种或多种两亲性表面活性剂制备形成原始细胞的核的纳米多孔二氧化硅颗粒。溶剂蒸发或萃取浓缩了一种或多种表面活性剂中的气溶胶或乳剂液滴，其指导周期的有序结构(在其周围二氧化硅组装并浓缩)的形成。通过热煅烧除去表面活性剂，得到具有界限清楚、均匀的孔径和拓扑学的多孔纳米颗粒。经由气溶胶辅助的EISA形成的颗粒(“单式”颗粒)具有平均直径为大约120nm(在基于尺寸排阻的分离后)，Brunauer-Emmer-Teller(BET)表面积超过1200m2/g，孔体积分数为约50％，且单式孔直径为2.5nm。在乳剂液滴内形成的颗粒(‘多形’颗粒)具有平均直径为～150nm(在基于尺寸排阻的分离后)，BET表面积>600m2/g，孔体积分数为～65％，且多模式孔形态学由被6-12nm孔互连的大的(20-30nm)、表面可及的孔组成。(分别)与气溶胶或乳剂加工有关的液-汽或液-液界面张力强制形成具有最小表面糙度的球形。此外，氮吸附等温线的分析证明两种类型的颗粒均具有完全可及的三维孔网。
所述纳米多孔二氧化硅核的高孔体积、表面积和可及性赋予了高负载物容量并使得能够快速装载多种类型的治疗性和诊断性药剂。单式纳米多孔核对低分子量的化疗剂具有高容量，而多形核具有包封siRNA、蛋白质毒素和其它高分子量负载物(例如，质粒DNA)所需的大的、表面可及的孔。通过二氧化硅核的浓缩程度可精确地控制负载物的释放速率。将各种量的AEPTMS、含胺硅烷掺入至用于形成纳米多孔二氧化硅核的溶胶中降低了可达到的浓缩水平并促进了所述核在中性pH、高离子强度(即，细胞溶质)条件下更加快速的溶解。不含AEPTMS的颗粒在模拟体液中历时2周时间溶解，而含30mol％AEPTMS的颗粒在24小时内溶解。因此，原始细胞可适应于需要连续或爆发性释放特点的应用。
将AEPTMS掺入至用于形成纳米多孔二氧化硅颗粒的前体溶胶中促进了在细胞溶质条件下的颗粒溶解并促进包封负载物与经简单扩散达到的释放速度相比更加快速的释放。然而，经AEPTMS修饰的颗粒还降低了对弱碱性化疗药物(例如，多柔比星)的容量。因此，为了最大化容量和细胞内释放，我们描述了ζ电势、负载物(例如，药物(多柔比星/DOX)/化疗)容量、二氧化硅溶解速率和负载物释放速率作为AEPTMS浓度的函数。如之前所证明的，未经修饰的单式颗粒(ζ＝-104.5±5.6)对负载物具有高容量(在DOX的情况中，每1010颗粒～1.8mM)但在24小时(即，HCC的典型的倍增时间)内仅释放其20％的包封负载物(药物)。相反的，经30重量％AEPTMS修饰的单式颗粒(ζ＝88.9±5.5)在6小时内释放其所有的包封负载物(药物)，但具有降低的药物(DOX)容量(每1010颗粒～0.15mM)。含15重量％AEPTMS的多形颗粒(ζ＝-21.3±5.1)保留了其对药物(DOX)的高容量(每1010颗粒～1.1mM)并且当暴露于模拟体液时在24小时内释放其几乎所有的包封负载物(药物)；因此这些颗粒被选用于涉及负载物递送的所有实验。应当着重注意，尽管单式二氧化硅颗粒的ζ电势作为AEPTMS浓度的函数增加，但经AEPTMS修饰的颗粒的孔体积分数(对于含30重量％AEPTMS的颗粒，～45％)与未经修饰的颗粒(～50％)基本上没有差异。因此，我们将经AEPTMS修饰的单式颗粒的负载物容量降低归因于静电排斥而不是孔体积降低。多形颗粒被纳入作为对照以证明孔径对负载物容量和负载物释放动力学的影响。
通用试剂
无水乙醇、盐酸(37％)、原硅酸四乙酯(TEOS,98％)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES,≥98％)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS,工业级)、2-氰基乙基三乙氧基硅烷(CETES,≥97.0％)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB,≥99％)、十二烷基硫酸钠(SDS,≥98.5％)、X-100、十六烷(≥99％)、盐酸多柔比星(≥98％)、5-氟尿嘧啶(≥99％)、顺式二胺二氯铂(II)(顺铂,≥99.9％)、从白喉杆菌获得的白喉毒素、从多孔木霉获得的环孢菌素A(CsA,>95％)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,≥99％)、人表皮生长因子、L-α-磷脂酰乙醇胺、胸苷(≥99％)、次黄嘌呤(≥99％)、牛纤连蛋白、牛胶原I型、明胶、大豆胰蛋白酶抑制剂(≥98％)、2-巯基乙醇(≥99.0％)、DL-二硫苏糖醇(≥99.5％)、二甲亚砜(≥99.9％)、pH5柠檬酸缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA,99.995％)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES,≥99.5％)、磷酸氢二胺(≥99.99％)和CL-4B购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。EM 90(鲸蜡基PEG/PPG-10/1二甲硅油)购自Evonik Industries(Essen,Germany)。超纯、EM级甲醛(16％,无甲醇)购自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。II购自(Müllheim,Germany)。
脂质
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBDPC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids、Inc.(Alabaster,AL)。
细胞系和生长基质
人Hep3B(HB-8064)、人肝细胞(CRL-11233)、人外周血单核(CRL-9855)、人脐静脉内皮细胞(CRL-2873)、T淋巴细胞(CRL-8293)、B淋巴细胞(CCL-156)、Eagle最低必需培养基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、和1X胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25％胰蛋白酶)购自美国典型培养物中心(ATCC；Manassas,Virginia)。BEGM Bullet试剂盒购自Lonza Group Limited(Clonetics；Walkersville,MD)。无酚红的DMEM购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
荧光染料和显微镜试剂
Hoechst 33342(350/461)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI、356/451)、Alexa405羧酸、琥珀酰亚胺酯(401/421)、CellTrackerTM Violet BMQC(415/516)、CellTrackerTM Green CMFDA(492/517)、钙黄绿素(495/515)、膜联蛋白V的Alexa488缀合物(495/519)、Alexa488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、AHA Alexa488蛋白质合成HCS A分析(495/519)、可固定绿色死细胞染色试剂盒(495/519)、绿色核酸染色(504/523)、MitoSOXTM红色线粒体超氧化物指示剂(510/580)、Alexa532羧酸、琥珀酰亚胺酯(532/554)、碘化丙啶(535/617)、pHrodoTM琥珀酰亚胺酯(558/576)、CellTrackerTM Red CMTPX(577/602)、Texas1,2-二(十六酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TexasDHPE,583/608)、Alexa647酰肼(649/666)、Alexa647羧酸、琥珀酰亚胺酯(650/668)、UlysisTM Alexa647核酸标记试剂盒(650/670)和膜联蛋白V的Alexa647缀合物(650/665)、Gold抗衰减试剂(含和不含DAPI)和FX信号增强剂、1X Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)、牛血清白蛋白第五组分溶液(BSA,7.5％)和转铁蛋白购自Invitrogen Life Sciences(Carlsbad,CA)。红色荧光蛋白(RFP,557/585)、CaspGLOWTM荧光素活性半胱天冬酶-3染色试剂盒(485/535)和CaspGLOWTM红色活性半胱天冬酶-8染色试剂盒(540/570)购自BioVision,Inc.(Mountain View,CA)。水溶性CdSe/ZnS量子点、CZWD640(640/660)购自NN-Labs(Fayetteville,AR)。
交联剂
1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)、琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)、6-[3′-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)和巯基添加试剂盒(Sulfhydryl Addition Kit)购自Pierce Protein ResearchProducts(Thermo Fisher Scientific LSR；Rockford,IL)。
其它二氧化硅纳米颗粒
亚5nm硅纳米颗粒购自Melorium Technologies,Inc.(Rochester,NY)。10-20nm氧化硅纳米颗粒购自SkySpring Nanomaterials,Inc.(Houston,TX)。30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm和10μm二氧化硅颗粒购自Discovery Scientific,Inc.(Vancouver,British Columbia)。
合成的siRNA和肽
沉默子选择siRNA(对于EGFR、VEGFR-2和PDGFR-α，siRNA ID分别为s565、s7824和s10234)购自Ambion,Inc.(Austin,TX)。具有5’氨基改良剂C12的双链DNA寡核苷酸(5’-AAACATGTGGATTACCCATGTC-3’)购自Integrated DNA Technologies(IDT；Coralville,IA)。“游离的”SP94肽(H2N--COOH,SEQ ID NO:6)、经C端半胱氨酸改良用于缀合的SP94肽(H2N-GGC-COOH,SEQ ID NO:7)和用于图2d募集实验的SP94肽(H2N-EEEGGC-COOH,SEQ ID NO:8)由NewEngland Peptide(Gardner,MA)合成。H5WYG肽(H2N-GGC-COOH)和核定位序列(H2N-GGC-COOH)由Biopeptide Co.,Inc.(San Diego,CA)合成。这些肽的粗体部分是原始序列；其它添加的氨基酸残基是用于缀合或标记目的。所有抗体(CHALV-1、抗Rab11a、抗LAMP-1、抗EGFR、抗VEGFR-2、抗PDGFR-α)购自Abcam,Inc.(Cambridge,MA)。
细胞培养条件
Hep3B、肝细胞、PBMC、T淋巴细胞和B淋巴细胞自ATCC获得，并根据制造商说明书生长。简而言之，Hep3B维持于含有10％FBS的EMEM中。肝细胞生长于涂布有BSA、纤连蛋白和牛胶原I型的烧瓶中；所使用的培养基为含有5ng/mL表皮生长因子、70ng/mL磷脂酰乙醇胺和10％FBS的BEGM(庆大霉素、两性霉素和肾上腺素被从BEGM Bullet试剂盒中弃除)。HUVEC生长于含有20％FBS的DMEM中；明胶涂布的烧瓶用于促进附着。PBMC、T淋巴细胞和B淋巴细胞维持于悬浮烧瓶(Greiner Bio-One；Monroe,NC)中。PBMC生长于补充有0.02mM胸苷、0.1mM次黄嘌呤、0.05mM 2-巯基乙醇和10％FBS的IMDM中。T和B淋巴细胞分别生长于含有20％FBS的IMDM和含有20％FBS的RPMI 1640培养基中。所有细胞维持在37℃，于潮湿气氛(含有5％CO2的空气)中。粘附细胞以亚培养比例1:3使用0.05％胰蛋白酶传代，而非粘附细胞以密度为2x105细胞/mL接种并维持在1-5x106细胞/mL。
纳米多孔二氧化硅颗粒的合成和特征描述
单式二氧化硅纳米颗粒的合成
Lu等人2描述了用于制备具有单式孔隙率的纳米多孔二氧化硅颗粒的气溶胶辅助的蒸发诱导自组装方法。简而言之，使用改良的商业喷雾器(Model9302A；TSI,Inc.；St Paul,MN)将含有二氧化硅前体(TEOS)、结构导向的表面活性剂(CTAB，最初浓度远低于连接胶束浓度，或CMC)以及溶解于水和乙醇溶液的均质溶胶雾化。氮气用作载气，而且所有加热区维持在400℃以蒸发溶剂并提高有效表面活性剂浓度。真空的压将为20psi。在维持于80℃的Durapore膜过滤器(Millipore；Billerica,MA)上收集颗粒。典型的反应混合物含有55.9mL去离子H2O、43mL 200-proof乙醇、1.10mL 1.0N HCl、4.0g CTAB和10.32g TEOS。为制备在细胞内(中性pH，相对高盐浓度)条件下更快速溶解的纳米多孔二氧化硅颗粒，将多种量的TEOS和AEPTMS、含胺硅烷掺合至前体溶胶中，并使用浓HCl将系统的pH调节至2.0。例如，为制备含有15重量％AEPTMS的颗粒，使用9.36g TEOS和1.33g AEPTMS。
多形二氧化硅颗粒的合成
Carroll等人1描述了用于合成具有多式孔隙率的纳米多孔二氧化硅核的乳液处理法。简而言之，将1.82g CTAB(可溶于水性相中)加入至20g去离子水中，在40℃搅拌直至溶解，并允许冷却至25℃。将0.57g 1.0N HCl、5.2gTEOS和0.22g NaCl加入至CTAB溶液，并搅拌所得溶胶1小时。制备由含3重量％Abil EM 90(一种非离子型乳化剂，可溶于油相中)的十六烷组成的油相。将前体溶胶与油相(溶胶:油体积比为1:3)在1000ml圆底烧瓶中混合，剧烈搅拌2分钟以促进油包水乳剂的形成，加至旋转蒸发仪(R-205；BuchiLaboratory Equipment；Switzerland)，并放置于80℃水浴30分钟。然后在120mbar减压下煮沸混合物(35rpm，持续3小时)以除去溶剂。在3000rpm离心(Model Centra MP4R；International Equipment Company；Chattanooga,TN)颗粒20分钟，并倾出上清液。最终，所述颗粒在500℃煅烧5小时以除去表面活性剂和其它过量的有机物质。如Carroll等人所述，溶剂萃取将水相富集于CTAB(>CMC)中，且在二氧化硅颗粒浓缩(在水相中)后，所得胶束模制6-12nm孔。此外，两种表面活性剂(CTAB和Abil EM 90)在水油界面的吸附协同地降低了界面张力，导致模制大的、表面可及孔的20-30nm微乳剂液滴的自发形成。
二氧化硅纳米颗粒的特征描述
使用Zetasizer Nano(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)进行纳米多孔二氧化硅颗粒的动态光散射。通过将48μL二氧化硅颗粒(25mg/mL)稀释于2.4ml的1X D-PBS中制备样品。将溶液转移至1mL聚苯乙烯试管(Sarstedt；Nümbrecht,Germany)用于分析。使用ASAP 2020表面积和孔隙率分析仪(Micromeritics Instrument Corporation；Norcross,GA)进行氮吸附。使用Zetasizer Nano(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)测量ζ电势。在一项典型的实验中，将二氧化硅颗粒、脂质体或原始细胞以1:50稀释于模拟体液(pH7.4)或柠檬酸缓冲液(pH5.0)(两种缓冲液均经调节以包含150mM NaCl)中，并转移至1ml折叠毛细孔(folded capillary cell)(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)用于分析。见DLS和氮吸附数据的附图1和二氧化硅纳米颗粒、脂质体和原始细胞的ζ电势值的附图12。
原始细胞的合成、装载和表面功能化
脂质体与纳米多孔二氧化硅颗粒的融合
Liu等人25-27描述了用于合成原始细胞的操作并将简单地提及。脂质订购自Avanti Polar Lipids，将其预溶解于氯仿中并在-20℃保存。在氮气流下干燥2.5mg脂质并放置于真空烘箱(Model 1450M,VWR International,West Chester,PA)中过夜以除去残余溶剂，然后立即进行原始细胞合成。浓度为2.5mg/mL的脂质在0.5X D-PBS中再水合并使用Mini-Extruder set(Avanti Polar Lipids,Inc.；Alabaster,AL)将脂质通过100nm过滤器至少10次。将DPPC和DSPC溶解于预热至其各自转变温度(41℃和55℃)的0.5X D-PBS中，并在挤出过程中维持在60℃。所得脂质(直径～120nm)在4℃保存不超过一周。在室温将纳米多孔二氧化硅核溶解于0.5X D-PBS(25mg/mL)中并暴露于过量的脂质体(1:2-1:4体积比的脂质:二氧化硅)中30-90分钟。在4℃将原始细胞在过量脂质存在下保存达3个月。为除去过量的脂质，将原始细胞在10,000rpm离心5分钟，洗涤两次并在0.5X D-PBS中再悬浮。
受支撑的脂质双层组合物的优化
优化SLB组合物以最小化非特异性结合和毒性以控制细胞；使用的多种脂质的结构参见附图4。用于所有表面结合、内化和递送实验的原始细胞具有由DOPC(或DPPC)和5重量％DOPE(或DPPE)、30重量％胆固醇、和5重量％18:1(或16:0)PEG-2000PE组成的SLB。如果有必要，可将荧光脂质(18:1-12:0NBD-PC、16:0-12:0NBD-PC、或TexasDHPE)以1-5重量％掺入至SLB中。在再水合和挤出前将脂质一起冻干；例如合并和干燥75μL的DOPC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)、10μL的胆固醇(75mg/mL)、5μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)和5μL的18:1-12:0NBD-PC(5mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、5重量％PEG-2000和1重量％NBD-PC组成的脂质体。
经多种类型的靶向配体修饰的受支撑的脂质双层
通过将多种密度的多种类型的靶向配体与SLB缀合以优化原始细胞对HCC的特异性亲和性。经由异双功能交联剂NHS-(PEG)n-马来酰亚胺(其对巯基和胺部分具有反应性并具有PEG间隔臂，其长度可改变以优化特异性亲和性)，将SP94和H5WYG肽(与C端半胱氨酸残基合成)与PE的头基中存在的伯胺缀合。在大多数研究中使用SM(PEG)24(间隔臂＝9.52nm)。使用巯基添加试剂盒(根据制造商说明书)将转铁蛋白、抗EGFR和CHALV-1中存在的胺部分转化成游离的巯基。使用SM(PEG)24将功能化的转铁蛋白和抗体与SLB中的PE缀合。通过反应立体化学和孵育时间控制配体密度。例如在室温使用10倍摩尔过量的SP94孵育原始细胞2小时以得到0.015重量％的肽密度(～6肽/原始细胞)，而在4℃使用5000倍摩尔过量的SP94过夜孵育原始细胞以得到5.00重量％的肽密度(～2048肽/原始细胞)通过Tricine-SDS-PAGE(SP94和H5WYG肽)或Laemmli-SDS-PAGE(转铁蛋白、抗EGFR和CHALV-1)28测定平均配体密度。简而言之，在使用LC-SPDP(间隔臂＝1.57nm)，一种与伯胺和巯基反应并经可经由还原消除的异双功能交联剂条件下，使用多种配体密度修饰原始细胞。将原始细胞暴露于10mM二硫苏糖醇(DTT)30分钟并在10,000rpm离心5分钟；所得含有游离配体的上清液的浓度经由SDS-PAGE通过使用Image J Image处理和分析软件(National Institutes of Health；Bethesda,MD)比较各样品的条带强度来测定。20％明胶(含6％双丙烯酰胺和6M尿素)用于分析SP94和H5WYG肽的密度。10％明胶用于分析抗体(抗EGFR和CHALV-1)的密度，而15％明胶用于分析转铁蛋白的密度。
荧光标记的纳米多孔核的制备
通过向900μL含20％APTES的0.5X D-PBS中添加100μL颗粒(25mg/mL)荧光标记纳米多孔核；在室温在APTES中过夜孵育颗粒并离心(10,000rpm,5分钟)以除去未反应的APTES，并再悬浮于1mL 0.5X D-PBS中。添加胺反应性荧光团(fluorophore)(例如Alexa647甲酸琥珀酰亚胺酯；1mg/mL于DMSO中)(每mL颗粒5μL染料)，并将所述颗粒在室温保持2小时，然后离心除去未反应的染料。在4℃将荧光标记的颗粒保存于0.5X D-PBS中。
使用化疗药物装载单式核和脂质体
在脂质体融合前，在室温将经修饰含有15重量％AEPTMS(25mg/mL)的单式纳米多孔核浸泡于多柔比星(5mM)或多柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶(每种药物各5mM)的混合物中1小时。经颗粒在10,000rpm离心5分钟除去过量药物。使用在先描述的磷酸铵梯度法29，使用DOX装载120nm脂质体。简而言之，脂质薄膜经300mM(NH4)2HPO4再水合，并且所述脂质体溶液通过100nm膜挤出至少10次。脂质体经等张性缓冲溶液(140mM NaCl、10mMHEPES、pH7.4)经由渗析(Float-A-Lyzer G2渗析单元、3.5-5kDa MWCO；Spectrum Laboratories,Inc.；Rancho Dominguez,CA)平衡，并在4℃经盐酸多柔比星(1:3药物:脂质摩尔比)过夜孵育。如在先所述30,31使用5-FU或顺铂装载脂质体。
使用多组分混合物、siRNA和白喉毒素A链装载多式核
将经修饰含有20重量％AEPTMS(25mg/mL)的多式纳米多孔核浸泡于钙黄绿素(5mM)、Alexa647标记的dsDNA寡核苷酸(100μM)、RFP(100μM)和CdSe/ZnS量子点(10μM)的溶液中4小时；各负载物的浓度可改变以得到高光谱成像最适的荧光强度。通过将各为1mg的钙黄绿素和NLS溶解于850μL 1X D-PBS中使用NLS修饰钙黄绿素(使用C端半胱氨酸残基合成)；添加100μL EDC(10mg/mL于去离子水中)和50μL BMPH(10mg/mL于DMSO中)，并在室温孵育该混合物2小时。经渗析(Slide-A-Lyzer mini渗析单元,2kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific LSR；Rockford,IL)除去过量的钙黄绿素。使用UlysisTM Alexa647核酸标记试剂盒(根据制造商说明书)标记dsDNA寡核苷酸并通过混合50μL dsDNA(2mM于去离子水中)和50μLNLS(1mM于DMSO中)以及10μL SMCC(10mg/mL于DMSO中)经NLS修饰；在室温孵育该混合物2小时，并经渗析(Slide-A-Lyzer mini渗析单元,7kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific LSR；Rockford,IL)除去过量的NLS。对于附图13-16中所述的递送实验，在4℃将经20重量％AEPTMS(25mg/mL)修饰的多式纳米多孔核浸泡于siRNA(100μM)或白喉毒素A链(100μM)2小时。经10,000rpm离心5分钟除去未包封的负载物，并立即将脂质体与负载物装载的核融合。
使用组蛋白封装CB1质粒。
图4描述了用于使CB1质粒(pCB1)超螺旋的方法。示意图描述了使用高饱和盐溶液使CB1质粒(pCB1)(下文和附图12中所示的CB1质粒载体)超螺旋，使用组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4封装超螺旋的pCB1，并使用通过与组蛋白缀合促进易位通过核孔的核定位序列(NLS)修饰所得的pCB1-组蛋白复合物的方法。图4(B)和(D)显示CB1质粒(B)和组蛋白封装的pCB1(D)的原子力显微镜(AFM)图像。比例尺＝100nm。(C)和(E)分别对应于(B)和(D)中红线的高度剖面图。
装载有组蛋白封装的pCB1的MC40靶向中孔二氧化硅纳米颗粒支撑的脂质双层(原始细胞)的合成。
如图5所述，5(A)提供了描述用于产生DNA装载的、肽靶向的原始细胞的方法。根据该方法，通过简单地将颗粒浸入pCB1-组蛋白复合物溶液中将组蛋白-封装的pCB1装载至形成原始细胞核的中孔二氧化硅颗粒中。然后将PEG化的脂质体与DNA-装载的核融合以形成受支撑的脂质双层(SLB)(其进一步经结合HCC的靶向肽(MC40)和促进内化原始细胞内体逃逸的内体裂解肽(H5WYG)修饰)。巯基-胺交联子(间隔臂＝9.5nm)用于将经C-端半胱氨酸残基修饰的肽缀合至SLB的DOPE部分。图5(B)显示可用作原始细胞核的中孔二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图像。比例尺＝200nm。插入图＝扫描电子显微镜(SEM)图像，其证明15-25nm孔是表面可及的。插入图比例尺＝50nm。5(C)显示中孔二氧化硅纳米颗粒的大小分布，其由动态光散射(DLS)测定。(5D，左轴)中孔二氧化硅纳米颗粒的累积孔体积图，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由图S-4A所示的氮吸附等温线的吸附支计算得到。(5D，右轴)pCB1-组蛋白复合物的大小分布，其通过DLS测定。
中孔二氧化硅纳米颗粒对组蛋白封装的pCB1具有高容量，且所得的原始细胞仅在模拟内体环境的条件下释放包封的DNA。
如图6(A)所述，可包封在未经修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒(ζ＝-38.5mV)或经APTES(一种含胺硅烷)修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒(ζ＝+11.5mV)内的pCB1或组蛋白封装的pCB1(“复合物”)的浓度。图6(B)显示当1x106细胞/mL与1x109MC40-靶向的、pCB1-装载的原始细胞一起在37℃孵育24小时时，对ZsGreen(一种由pCB1编码的绿色荧光蛋白)变得阳性的Hep3B的百分数。x轴指明了原始细胞核是否经AEPTMS修饰和pCB1是否经组蛋白预封装。在(A)和(B)中纳入经DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封装的pCB1作为对照。图6(C)和(D)显示暴露于模拟体液(C)或pH5缓冲液(D)后，组蛋白封装的pCB1从未经修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒和相应原始细胞的时间依赖性释放。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000组成，且对于(B)，经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
MC40靶向的原始细胞递送组蛋白封装pCB1至HCC的方法
如附图7中所示的示意图所述，[1]由于靶向肽向Met(其被多种HCC系过表达)的募集，MC40靶向的原始细胞高亲和性地与Hep3B细胞结合。流体DOPC SLB提高肽的活动性，因此使经低MC40密度修饰的原始细胞保持对Hep3B的高特异性亲和性(见图8A)。[2]MC40靶向的原始细胞经受体介导胞吞作用被Hep3B内化(见图8B和图15A)。[3]内体条件使SLB[插入天然材料参考]去稳定并引起H5WYG内体裂解肽质子化，这两种情况使得组蛋白封装的pCB1在Hep3B细胞质中变得分散(见图15B)。[4]当pCB1-组蛋白复合物经核定位序列(NLS)修饰时，其在～24小时内在Hep3B细胞的细胞核中变得浓缩(见图16C)，这使得分裂和非分裂癌细胞能够有效转染(见图17)。
MC40靶向的原始细胞高亲和性地与HCC结合并被Hep3B而不是正常的肝细胞内化。
图8(A)显示当暴露于Hep3B或肝细胞时，MC40靶向的原始细胞的表观解离常数(Kd)；Kd值与特异性亲和性负相关并且从饱和结合曲线(见图S-11)测定。误差棒表示n＝5的95％置信区间(1.96σ)。图8(B)和(C)显示在37℃暴露于1000倍过量MC40靶向原始细胞1小时的Hep3B(B)和肝细胞(C)的共聚焦荧光显微镜图像。Met经Alexa488标记的单克隆抗体(绿色)染色，原始细胞核经Alexa594(红色)染色，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)染色。比例尺＝20μm。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修饰。
MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞在皮摩尔浓度诱导HCC的细胞凋亡但对正常肝细胞的活力具有最小的影响。
图9(A)和(B)显示在37℃ Hep3B持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞后，细胞周期蛋白B1 mRNA和细胞周期蛋白B1蛋白质表达的剂量(A)和时间(B)依赖性降低。将细胞在(A)中暴露于多种pCB1浓度48小时和在(B)中暴露于5pM pCB1多种时间周期。纳入肝细胞中细胞周期蛋白B1和Hep3B中ZsGreen的表达作为对照。分别采用实时PCR和免疫荧光测定细胞周期蛋白B1 mRNA和蛋白质浓度。图9(C)显示在37℃持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞([pCB1]＝5pM)多种时间周期后，停留在G2/M期的Hep3B的百分数。G2/M期的肝细胞和S期的Hep3B的百分数纳入用于比较。在细胞周期分析前，细胞经Hoechst 33342染色。图9(D)显示在37℃持续暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞([pCB1]＝5pM)多种时间周期后，凋亡的Hep3B的百分数。对凋亡标记物呈阳性的肝细胞的百分数纳入作为对照。对Alexa647标记的膜联蛋白V呈阳性的细胞被认为处于细胞凋亡的早期，而对膜联蛋白V和碘化丙啶均呈阳性的细胞被认为处于细胞凋亡的晚期。通过添加单-和双阳性细胞的数目测定凋亡细胞的总数。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞较相应的脂质复合物(lipoplex)2500倍更有效地诱导HCC的选择性凋亡。
图10(A)显示DOPC原始细胞、经10重量％PEG-2000(18:1)修饰的DOPC原始细胞、由pCB1以及DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物组成的脂质复合物，和经10重量％PEG-2000修饰的DOTAP/DOPE脂质复合物的ζ电势。所有ζ电势测量在0.5X PBS(pH7.4)中进行。图10(B，左轴)显示在37℃持续暴露于经MC40靶向的原始细胞或脂质复合物递送的5pM pCB1 48小时后，凋亡的Hep3B和肝细胞的百分数。图10(B，右轴)显示在37℃在48小时内诱导90％1x106Hep3B细胞凋亡所需的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞或脂质复合物的数目。对于(B)，细胞经Alexa647标记的膜联蛋白V和碘化丙锭染色；单-和双-阳性细胞被认为是凋亡的。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(当标明时)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。DOTAP/DOPE脂质复合物经10重量％的PEG-2000(当标明时)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。在所有实验中，pCB1经NLS修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
MC40靶向的原始细胞选择性地将高浓度的紫杉醇、Bcl-2-特异性siRNA和pCB1递送至HCC而不影响肝细胞的活力。
图11(A)显示使Bcl-2表达沉默的紫杉醇、siRNA的浓度，和可包封于1012原始细胞、脂质体或脂质复合物的CB1质粒的浓度。图11A中的红棒表示当紫杉醇和pCB1均装载于原始细胞内时，紫杉醇和pCB1浓度如何变化。蓝棒表示当紫杉醇、siRNA和pCB1均装载于原始细胞或当siRNA和pCB1装载于脂质复合物内时，紫杉醇、siRNA和pCB1浓度如何变化。图11(B)提供了共聚焦荧光显微镜图像显示在经MC40靶向的原始细胞递送至Hep3B后，Oregon488标记的紫杉醇(绿色)、Alexa594标记的siRNA(红色)和Cy5标记的pDNA(白色)的细胞内分布。细胞在37℃与1000倍过量的MC40靶向的原始细胞一起孵育24小时，然后经Hoechst 33342(蓝色)固定和染色。比例尺＝10μm。图11(C)显示了在37℃暴露于10nM紫杉醇和/或5pM pCB148小时后，停留G2/M期的Hep3B、SNU-398和肝细胞的分数。将分数对G2/M中对数生长细胞的百分数标准化。图11(D)显示了在37℃暴露于10nM紫杉醇、250pM Bcl-2-特异性siRNA和/或5pM pCB1 48小时后，对Alexa647标记的膜联蛋白和碘化丙锭(PI)变得阳性的Hep3B、SNU-398和肝细胞的百分数。在(C)和(D)中，‘pCB1’指的是使用DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的化合物封装并非特异性地递送至细胞的pCB1。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。脂质体由DSPC和5重量％DMPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(16:0)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。脂质复合物由DOTAP:DOPE(1:1重量/重量)混合物组成，且经10重量％PEG-2000、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
CB1质粒的载体地图
如图12所示，CB1质粒(pCB1)由RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体(Clontech Laboratories,Inc.；Mountain View,CA)和pNEB193载体(NewEngland BioLabs,Inc.；Ipswich,MA)构建。pCB1编码细胞周期蛋白B1特异性小发夹RNA(shRNA)[Yuan等人,Oncogene(2006)25,1753–1762]和Zoanthussp.绿色荧光蛋白(ZsGreen)。组成型shRNA表达由RNA pol III-依赖的人U6启动子(PU6)驱动，而组成型ZsGreen表达由巨细胞病毒(PCMV IE)的立即早期启动子驱动。ori和AmpR元件使得E.coli中的质粒能够传播。编码细胞周期蛋白B1特异性的shRNA的有义和反义链的DNA序列被下划线标出并且侧面有用于将dsDNA寡核苷酸引入pSIREN载体的限制性酶切位点(红色为BamHI，蓝色为EcoRI)。
组蛋白封装pCB1的特征描述
图13(A)显示了暴露于升高浓度的组蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4的摩尔比为1:2:2:2:2)的pCB1的电泳迁移率变动分析。给出泳道3-6的pCB1:组蛋白的摩尔比。泳道1包含DNA梯带，而泳道2包含未添加组蛋白的pCB1。图13(B)显示了组蛋白封装的pCB1(1:50pCB1:组蛋白摩尔比)的TEM图像。比例尺＝50nm。
未装载和pCB1装载的中孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附分析。
图14(A)装载组蛋白封装的pCB1前后中孔二氧化硅纳米颗粒的氮吸附等温线。图14(B)显示了装载组蛋白封装的pCB1前后中孔二氧化硅纳米颗粒的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
DOPC原始细胞的中子小角散射(SANS)。
图15显示了DOPC原始细胞的SANS数据。数据拟合通过使用具有等厚共形壳的多分散多孔二氧化硅球体模型获得，并且显示所述二氧化硅颗粒表面跨越多个孔开口的双层的存在。双层厚度为0、20和的模拟SANS数据被纳入用于比较。测量的双层厚度与其它在平面支撑的脂质双层上进行的中子研究[参见Ferrari,M.Cancer nanotechnology:Opportunities and challenges.Nature Reviews Cancer 5,161-171(2005)]一致，且在这些对比条件下，主要表示从所述脂质双层的富氢烃核的散射。实验数据也表明存在孔，其通过将(即,实验数据中峰的q值，其由孔散射引起)除以2π测得。使用100％D2O PBS缓冲液中的5％(体积/体积)原始细胞悬浮液在LQD beam line at LANSCE(Los Alamos National Laboratories)上获得SANS数据。使用NCNR SANS数据分析包(NIST)拟合数据。
原始细胞保护包封的DNA免遭核酸酶降解。
图16显示DNA酶I处理的pCB1(泳道3)、组蛋白封装的pCB1(泳道5)、DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1(泳道7)、装载于具有阳离子核的原始细胞中的pCB1(泳道9)和装载于具有阴离子核的原始细胞中的组蛋白封装的pCB1(泳道11)的琼脂糖凝胶电泳的结果。裸pCB1(泳道2)、从组蛋白释放的pCB1(泳道4)、从DOTAP/DOPE脂质复合物释放的pCB1(泳道6)、从具有阳离子核的原始细胞释放的pCB1(泳道8)和从具有阴离子核的原始细胞释放的组蛋白封装的pCB1(泳道10)被纳入用于比较。泳道1包含DNA梯带。样品与DNA酶I(每50ng DNA 1单位)在室温一起孵育30分钟，并使用1％SDS刺激pCB1释放。
图17显示中孔二氧化硅纳米颗粒(“未经修饰的核”)、在室温浸泡于20％(体积/体积)APTES中12小时的中孔二氧化硅纳米颗粒(“APTES修饰的核”)、CB1质粒(“pCB1”)、组蛋白封装的pCB1(“pCB1-组蛋白复合物”)、经DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1(“DOTAP/DOPE脂质复合物”)的Zeta(ζ)电势值。ζ电势测量在0.5X PBS(pH7.4)中进行。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
用于测定图6和S-16(A)-(D)中对ZsGreen表达呈阳性的细胞的百分数的代表性前向散射-侧向散射(FSC-SSC)图和FL-1直方图。
图18显示门控(A)或非门控(C)排出细胞残骸的ZsGreen阴性细胞的FSC-SSC图(A和C)和相应的FL-1直方图(分别为B和D)。FL-1通道的平均荧光强度(MFI)值在(B)和(D)中给出。(E)-(H)门控(E)或非门控(G)排出细胞残骸的ZsGreen阳性细胞的FSC-SSC图(E和G)和相应的FL-1直方图(分别为F和H)。(F)和(H)上的门对应于具有MFI≤282的细胞的百分数，即100XZsGreen阴性细胞的MFI(见D图)。
MC40靶向肽的鉴别
图19提供了描述用于从Ph.D.TM-7噬菌体展示文库(New England BioLabs,Inc.；Ipswich,MA)选择MC40靶向肽的方法的示意图。1x1011pfu/mL的肽在室温与100nM融合至人IgG Fc域的重组人Met(rhMet)一起孵育1小时。蛋白质A或蛋白质G包被的磁性颗粒用于亲和捕捉Met-噬菌体复合物并随后用TBS(含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH7.4)洗涤10次以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体克隆经低pH缓冲液(含1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸，pH2.2)洗脱，并且洗脱液经宿主细菌(E.coli ER2738)感染而扩增。根据示意图，使用逐渐苛刻的条件：Met浓度从100nM降至50nM再降至10nM，孵育时间从1小时减少至30分钟再减少至15分钟，且添加至洗涤缓冲液的吐温-20从0％(体积/体积)增加至0.1％再增加至0.5％，进行5轮亲和性选择。通过蛋白质A涂布的磁性颗粒和蛋白质G涂布的磁性颗粒间的交替多轮选择避免对蛋白质A和蛋白质G的肽特异性。
在5轮选择后，从50株单独的克隆重新获得DNA并使用与Ph.D.TM-7试剂盒一起提供的-96gIII引物测序。对MET受体具有最大结合活性的序列如下所示：
ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)    SEQ ID NO:1
TATFWFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)    SEQ ID NO:2
TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)    SEQ ID NO:3
IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)    SEQ ID NO:4
WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)    SEQ ID NO:5
MC40靶向肽的特征描述
图20(A)显示第5轮选择后的肽序列比对；优势序列ASVHFPP与此前鉴定的Met特异性12体YLFSVHWPPLKA SEQ ID N0:15的粗体部分相似。将显示靶不相关的HAIYPRH肽(～10％)(SEQ ID NO:16)的噬菌体克隆从序列比对中略去。图20(B)和(C)显示亲和选择的噬菌体克隆与rhMet结合的程度经酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。(B)中所述的ELISA示意图描述于材料与方法部分。ELISA结果如(C)所示。图20(D)显示除去未与Met结合的肽后的序列比对。从该比对测定图20中所述的共有序列。图20(E)和(F)显示暴露于(1)抗Met和不相关噬菌体克隆(TPDWLFP，SEQ ID NO:17)的Alexa488标记的单克隆抗体和抗M13噬菌体的Alexa546标记的单克隆抗体(蓝点)或(2)抗Met和MC40克隆的Alexa488标记的单克隆抗体和抗M13噬菌体的Alexa546标记的单克隆抗体(橙点)的Hep3B(E)和肝细胞(F)的流式细胞仪散点图。未处理细胞(红点)用于设置FL-1(Alexa488荧光)和FL-2(Alexa546荧光)通道的电压参数。
暴露于Hep3B的MC40靶向的原始细胞的样品结合曲线。
为测定图8A中的解离常数，1x106Hep3B或肝细胞经细胞松驰素D预处理以抑制胞吞并在37℃与多种浓度的Alexa647标记的、MC40靶向的原始细胞一起孵育1小时。流式细胞仪用于测定所得细胞群的平均荧光强度，其对原始细胞浓度作图以获得总结合曲线。在饱和浓度的未标记的肝细胞生长因子的存在下，通过将细胞与Alexa647标记的、MC40靶向的原始细胞一起孵育来测定非特异性结合。通过从总结合曲线减去非特异性结合曲线获得特异性结合曲线；从特异性结合曲线计算Kd值。在图21所述的实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％(～6肽/颗粒)的MC40靶向肽修饰；相应的Kd值为1050±142pM。所有误差棒表示n＝5的95％置信区间(1.96σ)。
MC40靶向的原始细胞经受体介导的胞吞作用内化，并且在不存在H5WYG肽的情况下定向至溶酶体。
图22(A)显示在37℃在1小时内被Hep3B或肝细胞各自内化的MC40靶向原始细胞的平均数。1x106细胞在不存在(-)或存在(+)饱和浓度(100μg/mL)的人肝细胞生长因子(HGF)的情况下与多种浓度的原始细胞一起孵育，而流式细胞仪用于测定与各细胞有关的颗粒的平均数，如Ashley等人，NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97所述。原始细胞经NBD和pHrodoTM标记以从那些内化至酸性细胞内隔室的颗粒区别表面结合颗粒(分别地)。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。(B)原始细胞和(1)Rab5、(2)Rab7、(3)溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP-1)、或(4)Rab11a之间的皮尔森相关系数(r值)。Hep3B细胞在37℃与1000倍过量的Alexa594标记的原始细胞一起孵育1小时，然后固定，透化，并与Alexa488标记的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rab11a抗体一起孵育。SlideBook软件用于测定r值，其以n＝3x50细胞的平均值±标准差表示。微分干涉对比(DIC)图像用于定义Hep3B的边界从而当计算r值时可忽视细胞边界外的像素。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
当经NLS修饰并经MC40靶向的原始细胞递送时，组蛋白封装的pCB1在HCC细胞核中以时间依赖性的方式浓缩。
图23(A)-(C)描述了在37℃暴露于1000倍过量的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞15分钟(A)、12小时(B)、或24小时(C)的Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图像。对于(B)，在～2小时后，原始细胞的内体逃逸和pCB1的胞质分散是明显的；然而直至12-16小时，ZsGreen表达仍然不可检测。在24小时，Cy5标记的pCB1仍然分布于整个细胞；然而在(C)中胞质染色不可见，因为Cy5通道的增益被减小以避免位于细胞核内的像素饱和。二氧化硅核经Alexa594(红色)标记，pCB1经Cy5(白色)标记，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)复染。比例尺＝20μm。图23(D)显示对于Cy5标记的pCB1和Hoechst 33342标记的Hep3B细胞核，皮尔森相关系数(r值)对时间的作图。SlideBook软件用于测定r值，其以n＝3x50细胞的平均值±标准差表示。微分干涉对比(DIC)图像用于定义Hep3B的边界从而当计算r值时可忽视细胞边界外的像素。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
当经NLS修饰并经MC40靶向的原始细胞递送时，组蛋白封装的pCB1选择性地转染分裂和非分裂的HCC细胞，接近100％有效性。
图24(A)、(C)和(E)显示了在37℃暴露于1000倍过量的MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞24小时的Hep3B细胞的共聚焦荧光显微镜图像。在(A)中Hep3B细胞正在分裂而在(C)和(E)中～95％汇合；在所有图像中，pCB1经组蛋白预封装，且在(E)中该pCB1-组蛋白复合物进一步经NLS修饰。二氧化硅核经Alexa594(红色)标记，pCB1经Cy5(白色)标记，且细胞核经Hoechst 33342(蓝色)复染。比例尺＝20μm。图24(B)、(D)和(F)显示在37℃持续暴露于1x109MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞(“PC”)24小时后，ZsGreen表达呈阳性的1x106Hep3B和肝细胞的百分数。在(B)中细胞正在分裂而在(D)和(F)中～95％汇合；x轴表示无论CB1质粒(“pCB1”)和pCB1-组蛋白复合物(“复合物”)是否经NLS修饰，。单独pCB1，以及经DOTAP和DOPE 1:1(重量/重量)混合物封装的pCB1用作对照。细胞被暴露于20mg/mL的麦胚凝集素(WGA)以阻断NLS修饰的pCB1通过核孔复合物易位。误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。图24(G)–(I)分别为图(A)、(C)和(E)中所采用细胞的细胞周期直方图。给出了各直方图G0/G1期细胞的百分数。在所有实验中，原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。
图25显示了在37℃暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞1小时或72小时的Hep3B细胞(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像；在所有实验中pCB1浓度维持在5pM。(B)中的箭头指示有丝分裂细胞。细胞周期蛋白B1经Alexa594标记的单克隆抗体(红色)标记，而细胞核经Hoechst33342(蓝色)染色。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有比例尺＝20μm。
图26显示了在37℃暴露于MC40靶向的、pCB1装载的原始细胞1小时或72小时的Hep3B细胞(A)和肝细胞(B)的共聚焦荧光显微镜图像；在所有实验中pCB1浓度维持在5pM。细胞分别经Alexa647标记的膜联蛋白V(白色)和碘化丙锭(红色)染色以分析早期和晚期凋亡，而且细胞核经Hoechst33342(蓝色)复染。原始细胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)组成，且经0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修饰。所有比例尺＝20μm。
含有两性离子脂质组成的SLB的原始细胞诱导非特异性细胞毒性。
如附图27所述，在37℃持续暴露于1x109APTES修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒、含APTES修饰核的DOPC原始细胞、装载有编码乱序shRNA序列的质粒(“乱序pCB1”)的DOPC原始细胞或装载有乱序pCB1的DOTAP/DOPE(1:1重量/重量)脂质复合物48小时后，1x106Hep3B变得细胞凋亡的百分数。使用正-和负-电荷聚苯乙烯纳米颗粒(分别为“胺-PS”和“羧基-PS”)作为阳性对照，而使用暴露于10mM抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或1pmol游离pCB1的Hep3B作为阴性对照。所有误差棒表示n＝3的95％置信区间(1.96σ)。
本文所公开的所有参考文献在其相关处引入作为参考
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实施例2
伊马替尼的透皮递送
表皮是皮肤的最上层，且可进一步分为4层。表皮的最外层是角质层，大约10-20pm厚；其是与透皮递送有关的主要挑战。表皮的另外3层可共同地被分类为有活力的表皮；该有活力的表皮为50-100pm厚。有活力的表皮包含免疫细胞(郎格尔汉细胞)、上皮角质细胞、感觉神经(麦格尔氏细胞)，以及毛细血管床、微静脉和小动脉的网络。真皮为1-2mm厚，并由蜂窝组织组成，所述蜂窝组织包含其它类型的免疫细胞(肥大细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、浆细胞)、成纤维细胞和多种纤维(神经纤维、胶原、弹性纤维)。此外，1a解释了负载物递送穿过角质层可采取的4种主要方法。(a)细胞间途径，(b)滤泡途径，(c)跨细胞途径，和(d)角质层的除去。应当重点指出从角质层至真皮存在逐渐提高的水合梯度。该梯度可提供多种分子扩散进入有活力的表皮和真皮的驱动力。
角质层具有“砖和泥”结构。“砖”为被角蛋白、糖类和脂质填充的死亡的上皮角质细胞。“泥”代表细胞间隙并由神经酰胺、脂肪酸和胆固醇组成。该脂质组合物赋予与丁醇相似的极性。由于该极性和总体的“砖和泥”结构，在无促进措施的情况下，大多数分子不能通过角质层。
因此，简而言之，皮肤由主要的3层，表皮、真皮和皮下组织组成。最外层(角质层)是皮肤中起屏障作用的主要组分。其由填充有结晶化角蛋白、透明角质和多种脂质(其突出至细胞间隙中)的死亡的上皮角质细胞组成。其还由多种赋予与丁醇类似的极性的不同脂质(即神经酰胺、脂肪酸、胆固醇)组成。这种独特极性的结果是，氢键存在于角质层的细胞间隙中，这增加了通过透皮途径递送分子和药物的第二级阻力。目前，有3代透皮递送技术。第一代递送系统利用具有低分子量的亲脂性化合物的被动扩散。第二代和第三代递送系统意识到角质层的通透性是关键。第二代和第三代的促进策略是除去角质层或利用化学促进剂、生化促进剂和电动势来增加角质层的通透性。所有促进策略所面对的问题是寻找充分的角质层通透性和避免模仿更深组织之间的平衡。
透皮途径给予相比于静脉和口服给予提供了若干益处。这些益处包括更少的毒性、更好的耐受性和更好地递送负载物如化学疗法、酪氨酸激酶抑制剂和其它对癌症患者的疗法。外皮循环为药物吸收提供了高面积并绕过首过代谢和不良的(药物-食物，药物-pH)相互作用。
伊马替尼是最常被开具的市购可得的酪氨酸及酶抑制剂。伊马替尼是具有相对低分子量(493Da)和Log P为1.2的弱碱。
我们表明通过降低pH可容易地升高伊马替尼的溶解度。然而降低pH增加化合物的离子化，而离子化状态的分子不能容易地穿过皮肤的脂质双层。为促进固有溶解度(未离子化物种的溶解度)，我们评估了若干溶剂和共溶剂系统(图1X2)。发现所有制剂相比于对照(水，pH7)可增加药物溶解度，10％乙醇和DMSO制剂中溶解度最高。
我们的初步研究调查了通过透皮途径递送的伊马替尼的潜力。目前已进行了许多关键的初步实验。首先，我们测定了作为溶剂pH的函数的伊马替尼的溶解度(图1X2)。药物必须在溶液中以穿透皮肤。然而，离子化物种不能容易地透过角质层(6)。尽管伊马替尼的溶解度随pH降低而增加，但该溶解度是由于该药物化学结构上弱碱性官能团的离子化。
其次，我们筛选了多种共溶剂/溶剂系统以增加伊马替尼和达沙替尼的固有溶解度(未离子化物种的溶解度)。图2X2呈现了伊马替尼的数据。向制剂中添加这类共溶剂广泛地用于增加溶解较差的药物的溶解度(7-9)。在我们此前的工作中，评估了作为溶解度促进剂的乙醇、PEG 400和DMSO。已知这些共溶剂可促进多种药物的固有溶解度。与对照(水，pH7)相比，所有共溶剂制剂和DMSO增加伊马替尼的溶解度。与其它制剂相比，含10％乙醇的制剂展现出最高的溶解度。还发现伊马替尼在DMSO中高度可溶。
最后，评估了这些共溶剂制剂中多种的体外透皮渗透性质。注意，还已知这些共溶剂在一些制剂中起渗透促进剂的作用(10-11)。对于这一系列实验，将从腹壁成形术获得的人皮肤包埋在改良的Franz扩散细胞上并使用高效液相色谱测定作为时间的函数的药物渗透。
该Franz扩散细胞是透皮药物递送领域的基本工具。将患者衍生的皮肤放置于电池帽和溶液室之间。将电池帽暴露于环境以允许角质层也暴露于环境。溶液室填充有等张扩散缓冲液。此外，溶液室具有允许除去扩散缓冲液而不打乱设置的注射口。最终，溶液室被允许温度控制的水套包裹。Franz扩散细胞允许使用生理学条件进行透皮递送的体外研究。注意任何溶质通过患者衍生的皮肤穿透进入扩散缓冲液等同于该溶质到达体内系统的系统循环。原始细胞将装载甲磺酸伊马替尼，并且通过高效液相色谱(HPLC)实现扩散缓冲液中溶质内容物的特征描述。使用酶促组织消化和电感耦合等离子体质谱(ICP质谱)测定皮肤不同层中二氧化硅内容物的测定。可将SLB和纳米多孔颗粒核荧光标记以允许进行共聚焦显微术。此外，在用原始细胞处理和孵育后可将皮肤样品切片从而使用TEM将它们成像。
由图3X2可见，使用水(pH7)作为溶剂系统无伊马替尼渗透通过皮肤。在所评估的其它共溶剂系统下，药物能够有限地渗透通过皮肤。DMSO展现最高的伊马替尼渗透性。从这些数据，计算通量(通过皮肤的渗透率)且图4X2中显示了这些数据。与对照相比，所有制剂的通量均增加，DMSO制剂展现最高的伊马替尼通量(0.225μg/cm2hr)。
因此，透皮原始细胞可由多孔纳米颗粒组成，所述多孔纳米颗粒(a)装载有一种或多种药学活性剂如伊马替尼和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种角质层渗透促进剂，例如单饱和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十烯酸、二十碳三烯酸(Mead acid)、芥酸和神经酸，优选油酸)、醇、二醇(最优选聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜软化剂如胆盐、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、单链表面活性剂(例如，去氧胆酸钠)。原始细胞可具有平均为约50nm至约300nm，优选约65nm至约75nm的直径。
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实施例3
siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞诱导的细胞凋亡
结果
siRNA装载的原始细胞的特征描述。二氧化硅纳米颗粒如Carroll等人35所述制备，并具有>600m2/g的BET表面积、～65％的孔体积分数和由通过6-12nm孔互连的大的(20-30nm)、表面可及的孔组成的多式孔形态学(见图2BX3-CX3)。如方法部分所述在装载siRNA(或蓖麻毒素A链)前按大小分离二氧化硅纳米颗粒(见图2AX3)。图3AX3显示使用一系列策略构建的原始细胞或脂质复合物的siRNA装载容量。由两性离子磷脂、DOPC组成的脂质复合物每1010颗粒包封～10nM siRNA。由阳离子脂质、DOTAP组成的脂质复合物的构建，使得siRNA负载物增加5倍，推测由于负电荷核苷酸和正电荷脂质组分之间的吸引性静电相互作用。包含负电荷二氧化硅核和两性离子脂质双层的原始细胞具有大约与阳离子脂质复合物相同的容量。经含胺硅烷AEPTMS修饰的二氧化硅核，使ζ电势从-32mV增加至+12mV并得到每1010颗粒～1μM的siRNA容量。使用DOTAP脂质体协同地将siRNA装载至负电荷核中使得原始细胞具有类似的容量，比基于颗粒的治疗应用中常用地两性离子脂质体的容量高大于100倍。图3BX3和3CX3中显示了在分散于替代生物学流体中的DOPC和DOTAP脂质体以及含经AEPTMS修饰的核的DOPC原始细胞的稳定性。在中性和温和的酸性pH条件下DOPC脂质复合物快速释放它们包封的siRNA，使得在4-12小时内完全失去核苷酸内容物。尽管在中性pH条件下DOTAP脂质复合物比DOPC脂质复合物更稳定，但在72小时周期内丢失它们siRNA内容物的大约50％。与上述两种脂质复合物显著相反，当暴露于模拟体液72小时时，含经AEPTMS修饰的核的DOPC原始细胞保留了它们包封的RNA的95％。在温和的酸性条件(其反映了内体/溶酶体通路的条件)下，siRNA装载的、AEPTMS修饰的核和受支撑的脂质双层的PE和PC头基之间降低的经典和偶极相互作用引起膜去稳定并将该核暴露于酸性介质。在膜去稳定后，负载物扩散和核溶解的合并速率导致该释放特点，见图3CX3。因此，关于siRNA装载容量、颗粒稳定性和释放特征，与相应的脂质复合物相比，原始细胞表现出极大的改善。
siRNA装载的原始细胞介导的细胞毒性：我们最近证明了与靶向肽(SP94)(其结合肝细胞癌(HCC)但不控制肝细胞)缀合的原始细胞递送多种化疗剂和选择性诱导表达相关表面标记物的肿瘤细胞的细胞凋亡。此处我们显著地展开描述装载有大分子负载物(包括siRNA和蛋白质毒素)的靶向原始细胞。我们制备了由AEPTMS修饰的二氧化硅核和DOPC/DOPE/胆固醇/PEG-2000(55:5:30:10质量比)支撑的脂质双层组成、与SP94缀合以选择性结合HCC并与内体裂解肽缀合以促进内体/溶酶体释放的原始细胞。原始细胞装载有靶向细胞周期蛋白超家族成员(包括细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E、密切牵涉于整个细胞周期和活力的蛋白质)的siRNA的等摩尔混合物。
图4X3显示通过使用AEPTMS修饰的核构建的、siRNA-装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞，HCC细胞系HepB中基因沉默的浓度和时间依赖性。A图证明了在48小时内，原始细胞的浓度增加，以及从而siRNA浓度的增加诱导各靶基因中蛋白质水平的剂量依赖性降低。对于细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、和细胞周期蛋白E，抑制蛋白质表达90％的siRNA的浓度(IC90)分别为125pM、92pM、149pM和370pM。B组显示在添加125pM装载于靶原始细胞的siRNA后，蛋白质水平如何降低。截至72小时，各靶蛋白水平受抑制超过90％，抑制程度(细胞周期蛋白E略低于其它周期蛋白)反映了IC90值的区别。图4C X3显示使用多种类型的SP94靶向的颗粒可实现基因沉默的选择性。在与Hep3B孵育48小时后，装载有125pM siRNA的DOPC原始细胞几乎诱导细胞周期蛋白A2蛋白质的完全抑制，但对未转化的肝细胞无影响。相反，装载有125pM siRNA的DOPC脂质复合物对各细胞系中的细胞周期蛋白蛋白质水平几乎无影响。装载有125pMsiRNA的SP94靶向的DOPC脂质复合物诱导Hep3B中细胞周期蛋白A2～60％抑制，但也降低肝细胞中细胞周期蛋白A2水平，该作用可能由它们的正电荷(ζ＝+22mV)引起。抑制细胞周期蛋白A2表达90％所需的SP94靶向的DOPC原始细胞、DOPC脂质复合物和DOTAP脂质复合物的数目显示于C图的右轴上。需要的DOPC原始细胞比类似的DOPC脂质复合物少104倍而需要的DOPC原始细胞比DOTAP脂质复合物少300倍。因此，关于活性和特异性，靶向原始细胞相比于基于脂质的纳米颗粒提供显著的优势。
图5X3显示了解释原始细胞分布的时间依赖性和暴露于siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞的细胞中细胞周期蛋白A2、B1、D1和E的表达的共聚焦荧光显微镜图像。如A图中所证明的，向Hep3B添加原始细胞1小时后，各蛋白质的表达仍处于对照水平，且二氧化硅核存在于点状模式(punctuatepattern)，表面内体定位。截至48小时，二氧化硅核均匀地遍布于Hep3B细胞的细胞质中，且各靶向蛋白质的表达被抑制至本底水平。作为对比，未转化肝细胞的相同处理既未导致原始细胞的细胞蓄积也未抑制蛋白质表达(见B图)。
图6X3证明了siRNA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞选择性诱导HCC细胞毒性的能力。原始细胞装载有125pM的siRNA混合物并添加至Hep3B或对照肝细胞中。通过膜联蛋白V结合增加鉴定处于细胞凋亡早期的细胞，而处于细胞凋亡晚期的细胞膜联蛋白V和碘化丙啶染色均为阳性。在添加原始细胞后早在12小时就观测到凋亡Hep3B数目选择性增加(A图)，并且截至72小时超过90％细胞的两种细胞凋亡标记物均呈阳性。相反，在未转化肝细胞中未观测到细胞毒性，通过图6B和6C显示的代表性显微镜图像确认该观测。B图证明在48小时内整个种群的Hep3B对表面结合的膜联蛋白V和细胞核结合的碘化丙啶呈阳性，而C图显示对照肝细胞凋亡的两种标记物仍为阴性。
毒素装载的原始细胞的特征描述。由于大的(20-30nm)、表面可及核的存在，多式二氧化硅纳米颗粒可容易地装载有各种蛋白质毒素，包括白喉毒素、霍乱毒素和蓖麻毒素。此外，经低密度(0.015重量％或～6肽/原始细胞)SP94修饰的DOPC原始细胞所展现的高度差别特异性使得选择性递送尤其是细胞毒性剂至癌细胞成为可能。蓖麻毒素发现于蓖麻油植物(Ricinus communis)的种子中,并由包含被二硫键结合在一起的A和B亚单元的异二聚体组成。B亚单元经由受体介导的胞吞作用介导毒素进入细胞，而A亚单元通过裂解28SrRNA中的特异性糖苷键抑制蛋白质合成。38催化活性的蓖麻毒素A链(RTA)已被用作肿瘤特异性免疫毒素的亚单元以抑制多种模型系统中癌细胞的生长。39,40
图7X3显示了装载有RTA的DOPC原始细胞和脂质细胞的容量和释放特征。如A图所证明，<1nM的蛋白质可被装载于1010DOPC脂质体中。相反，含未修饰的二氧化硅核的DOPC原始细胞包封接近100多倍的RTA，且用AEPTMS修饰所述核使得该容量进一步增加了一个数量级。B和C图中显示了RTA装载的DOPC原始细胞和脂质体的pH依赖性稳定性。当在中性pH在模拟体液中孵育达72小时时，DOPC原始细胞释放它们包封负载物的～5％，而在温和的酸性(即，内体)条件下RTA从该颗粒稳定地释放。相反，在中性和酸性条件下，DOPC脂质体均快速失去它们的RTA内容物。
RTA装载的原始细胞介导的细胞毒性。如图8X3所示，包封于SP94靶向的原始细胞内的RTA引起Hep3B细胞中初生蛋白质合成的浓度(A图)和时间(B图)依赖性降低。在添加RTA装载的、SP94靶向的原始细胞后48小时，在RTA浓度为～5pM处达到蛋白质合成的半最大抑制，且在30pM RTA处观测到完全抑制(A图)。当向Hep3B中添加RTA浓度为25pM的RTA装载的原始细胞时，RTA装载的原始细胞在～24小时内引起蛋白质合成降低50％，并且在60小时内完全抑制。图C所显示的结果证明了当加入至Hep3B时，RTA装载的、SP94靶向的原始细胞有效地抑制初生蛋白合成，但对相同条件下的对照肝细胞几乎无影响。相反，当加入至细胞使得RTA的终浓度为25pM时，SP94靶向的DOPC脂质体不能抑制Hep3B或肝细胞中的初生蛋白合成。此外，如C图右轴所示，需要104倍更多的RTA装载的脂质体(～60pM RTA)以抑制Hep3B细胞中90％的蛋白质生物合成。
如图9X3所示，使用Alexa Fluor 488标记的甲硫氨酸衍生物和AlexaFluor 647标记的二氧化硅核(分别地)定量初生蛋白合成和细胞内原生细胞分布。在向Hep3B添加RTA装载的、SP94靶向的原始细胞后1小时，蛋白质合成是旺盛的，且原始细胞位于细胞质小泡内(A图)。在48小时孵育后，原始细胞分散遍布于细胞质并且蛋白质合成被显著抑制。如B图所示，向未转化的肝细胞添加类似的原始细胞既未导致原始细胞的细胞蓄积也未抑制初生蛋白合成。
图10X3中显示RTA装载的原始细胞选择性诱导HCC细胞而非对照肝细胞的细胞毒性的能力。根据半胱天冬酶-9和/或半胱天冬酶-3的激活测量到，早在8小时，RTA装载的、SP94靶向的原始细胞就诱导Hep3B细胞中的细胞凋亡，截至20-28小时50％的细胞呈阳性。截至49小时看到完全细胞死亡。相等的原始细胞浓度未降低肝细胞活力低于对照水平，即使孵育7天后。图B和C中显示了原始细胞分布和细胞凋亡的显微镜图像。在向Hep3B添加RTA装载的、SP94靶向的原始细胞后48小时，原始细胞分布于细胞质中且细胞对半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3激活呈阳性(B图)。如C图所示，在相同的实验条件下，对照肝细胞对半胱天冬酶染色和颗粒蓄积仍为阴性。
讨论
大分子疗法(包括核酸和毒素)正被广泛研究用于治疗很多由基因表达的异常模式介导的疾病，由于递送系统的显著缺陷，其全部潜能仍未揭示。17,18本文，我们提供的证据表明原始细胞展现了使得有效封装和特异性细胞递送siRNA和蛋白质毒素成为可能的特性。
由于若干原因，未修饰的核酸，包括siRNA，不能被全身性给予。它们对血浆核酸酶高度敏感并且由于有效的肾过滤具有非常短的循环半衰期。3此外，由于核酸的净负电荷和大尺寸，核酸不易于被细胞摄取。41为绕开这些问题，将siRNA与多种聚合物缀合或包封于纳米颗粒如脂质体中。掺入中性脂质体或与阳离子脂质缀合提高了稳定性和循环半衰期，并且在阳离子复合物的情况中，增强了向细胞的静电介导的递送。42,43中性产品，包括壳聚糖(chitosan)44和环糊精(cyclodextran)45已被用于与siRNA形成生物活性的复合物。与聚合物，如聚乙烯亚胺的缀合已显示通过有助于防止降解可增强siRNA的治疗有效性并增强递送。46
全身性给予siRNA的治疗用于需要递送至特定器官或细胞亚类以增强有效性并降低非特异性毒性。在抗癌疗法中尤其如此，其中有必要保护正常细胞免遭细胞毒性siRNA的作用。如果靶向细胞存在于机体的多个位置，并发症也会出现，如血液学肿瘤或转移性疾病的情况，其中新生细胞广泛播散。为解决该问题，已将识别靶向细胞表面上差别表达的抗原的分子直接与siRNA或包封所述核苷酸的颗粒缀合。
受体配体，如叶酸盐/酯47、胆固醇48和转铁蛋白13成功地用于指导siRNA复合物与过表达各自细胞受体的细胞结合。
识别靶细胞上适当分子的抗体也用于指导包含siRNA的颗粒选择性与特异性种类的细胞结合。49此外，已将通过多重筛选操作选择以与所需细胞表位结合的肽或核酸适体，直接与siRNA或多个种类的含siRNA颗粒缀合以增强特异性细胞相互作用。50
尽管在核酸和蛋白质递送系统的一些方面有显著的进展，包括它们化学结构的修饰以免遭降解或与靶向试剂的缀合，但仍存在许多缺陷。
尽管利用阳离子脂质或聚合物以静电地复合、浓缩并递送核酸的许多试剂是市购可得的，但大多数这些制剂导致真核细胞的非特异性转染。此外，已发现阳离子脂质/核酸复合物(脂质复合物)是细胞毒性的,并且在血清存在下,其转染有效性和胶体稳定性是有限的。反之，两性离子脂质不能有效地压缩核酸，即使在二价阳离子存在下。所有这些纳米颗粒递送系统还面临有限的负载物容量。
如我们的实验结果所示，相比于已有的递送策略，原始细胞提供显著的优势。我们此前已描述了其作为小分子治疗剂的靶向纳米载体的效用，并证明了其负载物容量、稳定性和细胞特异性细胞毒性远优于传统脂质体。由于大分子的大尺寸、电荷特性和细胞内负载物释放的电势问题，基于纳米颗粒的大分子递送存在更大的挑战。本文我们已表明原始细胞也再这些应用中提供了独特优势。通过将多式多孔二氧化硅纳米颗粒浸泡于所需的一种或多种负载物的溶液中，多式多孔二氧化硅纳米颗粒可容易地装载有核酸、毒素和大分子混合物。DOPC脂质体与负载物装载的核的融合导致稳定的受支撑的脂质双层(SLB)的形成，所述SLB在中性pH下保留负载物，降低了非特异性结合，改善了胶体稳定性，并缓和了与阳离子脂质体和脂质复合物有关的细胞毒性(详情参见参考文献34)。与流动但稳定的SLB缀合的靶向肽与细胞表面受体多价地相互作用，诱导受体介导的胞吞作用。在酸化的内体环境中，SLB去稳定化连同渗透膨胀和内体破裂(由内体裂解肽的质子海绵体效应引起)，导致细胞质内二氧化硅核的分散。
合并扩散和二氧化硅和溶解使得受控的、持续的负载物释放>12小时。原始细胞合并的容量、稳定性和靶向和内化效率导致对Hep3B格外低得IC90值，且实际上对正常肝细胞无副作用。
含有150nm核的原始细胞每颗粒(每L)包封～6x107siRNA分子或1x107蓖麻毒素A链(RTA)分子并在暴露于模拟体液72小时后保留几乎其负载物的100％。作为对比，脂质和聚合物纳米颗粒具有低10-1000倍的大分子负载物容量，并且在中性pH实质上更不稳定。51,52此外，相比于中孔二氧化硅颗粒，原始细胞具有更高的核酸负载物容量。SIMP，由Tanaka等人研发的用于递送siRNA装载的纳米脂质体至卵巢癌，包封大约与原始细胞相同量的RNA(每颗粒2pg vs.每颗粒1.3pg)，尽管他们的平均直径大10倍(1.6μm vs.150nm)53。
聚乙烯亚胺包被的中孔二氧化硅纳米颗粒，由Xia等人研发，每10μg颗粒复合～1μg siRNA(10重量％)33；作为对比，10μg原始细胞可装载有～6.5μg siRNA(65重量％)。容量和稳定性的增强使得siRNA装载的原始细胞沉默靶基因和在比文献中报道的值低10-10,000倍的浓度诱导HCC细胞凋亡成为可能。51,52,54-58siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞在siRNA浓度范围为90pM至370pM(IC90)时沉默90％的细胞周期蛋白A2、B1、D1和E的表达，并且在siRNA浓度为125pM杀死>90％的HCC(LC90)。作为对比，靶向脂质体具有IC90和LC90值为5-500nM，取决于颗粒的类型和实验进行的条件。54-56,58-60siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞的疗效也超过了聚合物包裹的中孔纳米颗粒的疗效。若干组已使用包封于聚阳离子聚合物内的中孔二氧化硅纳米颗粒以复合siRNA；该颗粒在纳米颗粒:siRNA(重量/重量)比为10-20时导致报告子和内源性基因表达30-60％敲低。33,61由于我们将siRNA装载在经AEPTMS修饰的二氧化硅纳米颗粒的纳米孔内，原始细胞的容量显著的较高，导致在原始细胞:细胞比例为～8时，完全沉默稀薄啊周期蛋白A2、B1、D1和E的表达。结论，我们的发现表明原始细胞可用作多种大分子包括核酸和毒素的通用的靶向纳米载体。纳米多孔核也可装载有其它不同的负载物类型，包括治疗诊断学和个体化用药的新兴领域所需的成像和诊断剂。
材料和方法
材料。抗细胞周期蛋白A2抗体(小鼠mAb)、细胞周期蛋白B1(小鼠mAb)、细胞周期蛋白D1(小鼠mAb)、和细胞周期蛋白E(小鼠mAb)购自Abcam,Inc.(Cambridge,MA)。沉默子选择siRNA(siRNA IDs对于细胞周期蛋白A2、B1、D1和E的siRNA ID分别为s2513、s2515,s229和s2526)由Life TechnologiesCorporation(Carlsbad,CA)购自Applied BiosystemsTM。人Hep3B(HB-8064)、人肝细胞(CRL-11233)、Eagle最低基础培养基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和1X胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25％胰蛋白酶)购自美国典型培养物中心(ATCC；Manassas,Virginia)。1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)。CaspGLOWTM荧光素活性半胱天冬酶-9染色试剂盒(485/535)和CaspGLOWTM红色活性半胱天冬酶-3染色试剂盒(540/570)购自BioVision,Inc.(Mountain View,CA)。
EM 90(鲸蜡基PEG/PPG-10/1二甲硅油)购自Evonik Industries(Essen,Germany)。
Hoechst 33342(350/461)、Alexa488抗体标记试剂盒(495/519)、膜联蛋白V的Alexa488缀合物(495/519)、AHA Alexa488蛋白质合成HCS分析(495/519)、碘化丙啶(535/617)、Alexa647甲酸琥珀酰亚胺酯(650/668)、Gold抗褪色剂、FX信号增强剂、1X Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)和牛白蛋白成分V溶液(BSA,7.5％)购自Invitrogen Life Sciences(Carlsbad,CA)。BEGM Bullet试剂盒购自Lonza GroupLimited(Clonetics；Walkersville,MD)。Ultra-4离心过滤器装置(10kDa MWCO)购自Millipore(Billerica,MA)。所有肽由New England Peptide(Gardner,MA)合成。琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)购自Pierce Protein Research Products(Thermo FisherScientific LSR；Rockford,IL)。超纯、EM级甲醛(16％,无甲醇)购自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。无水乙醇、盐酸(37％)、原硅酸四乙酯(TEOS,98％)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS，工业级)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB,≥99％)、十二烷基硫酸钠(SDS,≥98.5％)、X-100,十六烷(≥99％)、叔丁醇(≥99.5％)、2-巯基乙醇(≥99.0％)、DL-二硫苏糖醇(≥99.5％)、二甲亚砜(≥99.9％)、pH5柠檬酸缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA,99.995％)、人表皮生长因子、L-α-磷脂酰乙醇胺、牛纤连蛋白、牛胶原I型、大豆胰蛋白酶抑制剂(≥98％)、无酚红DMEM、从蓖麻获得的去糖基化A链和G-200购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
细胞培养条件。Hep3B和肝细胞获自ATCC，并根据制造商说明书生长。简而言之，Hep3B维持于含有10％FBS的EMEM中。肝细胞生长于涂布有BSA、纤连蛋白和牛胶原I型的烧瓶中；所使用的培养基为含有5ng/mL表皮生长因子、70ng/mL磷脂酰乙醇胺和10％FBS的BEGM(庆大霉素、两性霉素和肾上腺素被从BEGM Bullet试剂盒中弃除)。在37℃将细胞维持于潮湿气氛(补充有5％CO2的空气)中并用0.05％胰蛋白酶在亚培养比1:3下传代。
多式二氧化硅纳米颗粒的合成。Carroll等人35描述了用于合成具有多式孔隙率的纳米多孔二氧化硅颗粒的乳液处理技术。简而言之，将1.82g CTAB(可溶于水相中)加入至20g去离子水中，在40℃搅拌直至溶解，并允许冷却至25℃。将0.57g 1.0N HCl、5.2g TEOS和0.22g NaCl加入至CTAB溶液，并搅拌所得溶胶1小时。制备由含3重量％EM 90(可溶于油相的非离子型乳化剂)的十六烷组成的油相。前体溶胶与油相(1:3体积比的溶胶:油)在1000mL圆底烧瓶中混合，剧烈搅拌2分钟以促进油包水乳剂的形成，转移至旋转蒸发仪(R-205；Buchi Laboratory Equipment；Switzerland)并放置于80℃水浴中持续30分钟。然后在120mbar减压下煮沸混合物(35rpm，持续3小时)以除去溶剂。然后在3000rpm离心(Model Centra MP4R；InternationalEquipment Company；Chattanooga,TN)颗粒20分钟，并倾出上清液。最后，在500℃将颗粒煅烧5小时以除去表面活性剂和过量的有机物质。
为使得未修饰颗粒更加亲水，它们在80℃经(i)4％(体积/体积)氢氧化铵和4％(体积/体积)过氧化氢和(ii)0.4M HCl和4％(体积/体积)过氧化氢处理15分钟。然后颗粒经水洗涤数次并再悬浮于0.5X D-PBS中，终浓度为25mg/mL。通过向1mL含20％APTES的无水乙醇中添加25mg煅烧过的颗粒(25mg/mL)，纳米多孔核经含胺硅烷AEPTMS修饰；在室温在AEPTMS中过夜孵育所述颗粒，离心(5,000rpm,1分钟)以除去未反应的AEPTMS,并再悬浮于1mL 0.5X D-PBS中。通过向1mL颗粒中添加5μL胺反应性荧光团(fluorophore)(Alexa647甲酸琥珀酰亚胺酯；1mg/mL于DMSO中)(每mL颗粒1μL染料)，荧光标记AEPTMS修饰的颗粒；将所述颗粒在室温保持2小时，然后离心除去未反应的染料。将荧光标记颗粒保存于4℃ 0.5XD-PBS中。在负载物装载和脂质体融合前，经由尺寸排阻色谱或差速离心除去直径大于～200nm的颗粒。
二氧化硅纳米颗粒的特征描述。使用Zetasizer Nano(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)进行纳米多孔二氧化硅颗粒以及负载物装载的原始细胞和脂质体的动态光散射。通过将48μL二氧化硅颗粒(25mg/mL)稀释于2.4ml 0.5X D-PBS中制备样品。将溶液转移至1mL聚苯乙烯试管(Sarstedt；Nümbrecht,Germany)用于分析。使用ASAP 2020表面积和孔隙率分析仪(Micromeritics Instrument Corporation；Norcross,GA)进行氮吸附。使用Zetasizer Nano(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)测量ζ电势。将二氧化硅颗粒以1:50稀释于0.5X D-PBS中并转移至1ml折叠式毛细管样品池(folded capillary cells)(Malvern；Worcestershire,United Kingdom)用于分析。
脂质体与纳米多孔二氧化硅颗粒的融合。此前已描述过用于合成原始细胞的操作34,36,62,63_ENREF_33并将仅作简要提及。脂质订购自Avanti PolarLipids，将其预溶解于氯仿中并在-20℃保存。在氮气流下干燥2.5mg脂质并放置于真空烘箱(Model 1450M,VWR International,West Chester,PA)中过夜以除去残余溶剂，然后立即进行原始细胞合成。浓度为2.5mg/mL的脂质在0.5XD-PBS中再水合并使用Mini-Extruder set(Avanti Polar Lipids,Inc.；Alabaster,AL)将脂质通过100nm过滤器至少10次。所得脂质(直径～120nm)在4℃保存不超过一周。在室温，纳米多孔二氧化硅核(25mg/mL)经2-4倍体积过量的脂质体孵育30-90分钟。在4℃将原始细胞在过量脂质存在下保存达1个月。为除去过量的脂质，将原始细胞在5,000rpm离心1分钟，洗涤两次并在0.5XD-PBS中再悬浮。
在再水合和挤出前将脂质一起冻干；例如合并和干燥75μL的DOPC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)、10μL的胆固醇(75mg/mL)、10μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE、30重量％胆固醇和10重量％PEG-2000NBD-PC组成的脂质体。
质量比为55:5:30:10的DOPC:DOPE:胆固醇:18:1PEG-2000PE用于合成‘DOPC原始细胞’，而质量比为55:5:30:10的DOTAP:DOPE:胆固醇:18:1PEG-2000PE用于合成‘DOTAP原始细胞’。
肽与受支撑的脂质双层的缀合。使用异双功能交联剂SM(PEG)24(其对巯基和胺部分具有反应性并具有9.52nm PEG间隔臂)，将SP94和H5WYG肽(与C端半胱氨酸残基合成)与PE的头基中存在的伯胺缀合。首先，原始细胞在室温经10倍摩尔过量的SM(PEG)24孵育2小时并离心(1分钟,5,000rpm)以除去未反应的交联剂。然后活化的原始细胞在室温经5倍摩尔过量的SP94孵育原始细胞2小时以得到0.015重量％的肽密度(～6肽/原始细胞)，而在室温经500倍摩尔过量的H5WYG孵育4小时以得到0.500重量％的肽密度(～240肽/原始细胞)。
洗涤原始细胞以除去游离态，并使用Tricine-SDS-PAGE测定平均肽密度，如前所述。34
siRNA和蓖麻毒素A链装载的原始细胞的合成。将未修饰的或经AEPTMS修饰的核(25mg/mL)在4℃浸泡于siRNA(250μM，于1X D-PBS中)或去糖基化蓖麻毒素A链(100μM，于1X D-PBS中)2小时。经5,000rpm离心1分钟除去未包封的负载物，并立即将DOPC脂质体与上文所述的负载物装载的核融合。经由我们此前描述的协同机理使用siRNA装载未修饰的核。36简而言之，向75μL二氧化硅纳米颗粒(25mg/mL)中添加25μL siRNA(1mM)。轻轻地涡旋该溶液，并在4℃将其与200μL DOTAP脂质体孵育。经离心除去过量的脂质和未包封的siRNA后立即使用。
siRNA装载的脂质复合物的合成。为制备siRNA装载的DOPC脂质复合物，首先将DOPC、DOPE、cholesterol、和18:1PEG-2000PE以55:5:30:10质量比混合，在氮气流下干燥，并放置于真空烘箱中过夜以除去残余的氯仿。然后将脂质膜溶解于叔丁醇中，并与siRNA溶液以1:1混合(稀释于含0.85％(重量/体积)NaCl和0.25M蔗糖的10mM Tris-HCl(pH7.4)中)使得最终DOPC:siRNA比为10:1(重量/重量)。涡旋该混合物，在丙酮和干冰浴中快速冷冻，并冻干。在使用前，脂质复合物制剂经等张蔗糖溶液(含0.85％(重量/体积)NaCl和0.25M蔗糖的10mM Tris-HCl(pH7.4))水合至最终siRNA浓度为100μg/mL；经离心驱动的过滤(10kDa MWCO)除去未包封的siRNA。
如Wu等人64所述，我们在较小的改良下制备siRNA装载的DOTAP脂质复合物。我们使用18:1PEG-2000PE代替PEG化的神经酰胺并使用DOTAP:DOPE:胆固醇:PEG-2000PE比为55:5:30:10。此外，我们将冻干的脂质复合物溶解于含0.85％(重量/体积)NaCl和0.25M蔗糖的10mM Tris-HCl(pH7.4)中以使得最终siRNA浓度为100μg/mL，并使用离心过滤装置(10kDaMWCO)除去未包封的siRNA。将脂质复合物溶解于0.5X D-PBS中以用于ζ电势分析。
为使用SP94和H5WYG修饰DOPC和DOTAP，首先将它们与10倍摩尔过量的SM(PEG)24在室温孵育2小时；在经离心驱动的过滤(10kDa MWCO)除去未反应的交联剂后，将它们与5倍摩尔过量的SP94和1000倍摩尔过量的H5WYG在室温孵育2小时。使用离心过滤装置(10kDa MWCO)除去游离态。
RTA装载的脂质体的合成。为制备RTA装载的DOPC脂质体，在氮气流下干燥2.5mg脂质(55:5:30:10质量比的DOPC:DOPE:胆固醇:18:1PEG-2000PE)并将其放置于真空烘箱(Model 1450M,VWR International,WestChester,PA)中过夜以除去残余溶剂。将脂质在浓度为2.5mg/mL于0.5XD-PBS中再水合，简单超声，并与等体积的RTA(100μM，于0.5X D-PBS中)混合。涡旋该混合物，在丙酮和干冰浴中快速冷冻，并冻干。在使用前，所述脂质体制剂经上文所述的等张蔗糖溶液再水合，剧烈涡旋，并允许其在室温静置2-4小时。然后使用Mini-Extruder set(Avanti Polar Lipids,Inc.；Alabaster,AL)将脂质体通过100nm过滤器至少10次，并通过G-200柱以除去未包封的RTA。RTA装载的脂质体经上文所述的SP94和H5WYG修饰。
负载物容量和释放速率的测定。通过将1x1010颗粒在1重量％SDS(溶解于D-PBS)中孵育24小时并离心所述溶液以除去原始细胞核和其它碎片测定原始细胞、脂质复合物和脂质体的siRNA和蓖麻毒素A链(RTA)容量。通过与标准曲线比较260nm处的吸光度测定上清液中siRNA的浓度。经由SDS-PAGE使用Image J Image Processing and Analysis software(NationalInstitutes of Health；Bethesda,MD)通过与标准曲线比较条带强度测定上清液中RTA的浓度。
通过在37℃将1x1010颗粒悬浮于1mL模拟体液(含150mM和10％血清的EMEM，pH7.4)或柠檬酸缓冲液(pH5.0)中持续多个时期测定siRNA和RTA在中性和酸性pH条件下的释放速率。经离心(对于原始细胞，5,000x g，5分钟；对于脂质体，15,000x g，30分钟；16 Centrifuge；Beckman-Coulter；Brea,CA)将颗粒制成丸状。使用UV可见光谱法和SDS-PAGE测定上清液中siRNA和RTA浓度。将释放的负载物的浓度转化成最初包封于1010颗粒内的负载物浓度的百分数。
细胞周期蛋白A2、B1、D1和E蛋白质表达的定量。为测定沉默90％细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1或细胞周期蛋白E表所需的siRNA的浓度(IC90,见图4AX3)，将1x106Hep3B细胞在37℃暴露于多种浓度的装载于SP94靶向的DOPC原始细胞中的siRNA，持续48小时。将细胞离心(1000rpm，1分钟)以除去过量的颗粒，用3.7％甲醛固定(室温，15分钟)，并用0.2％Triton X-100透化(室温，15分钟)；然后将细胞暴露于抗细胞周期蛋白A2、抗细胞周期蛋白B1、抗细胞周期蛋白D1或抗细胞周期蛋白E的1:500稀释液，使用Alexa488抗体标记试剂盒在37℃标记1小时。洗涤细胞3次并再悬浮于D-PBS中以用于流式细胞术分析(FACSCalibur)。GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.；La Jolla,CA)用于从log(siRNA浓度)对平均荧光强度的作图计算IC90值；初始蛋白质浓度具有暴露于siRNA装载的原始细胞5分钟的抗体标记的细胞的平均荧光强度。
为测定细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E表达的时间依赖性降低(见图4BX3)，将siRNA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞与1x106Hep3B细胞混合从而使得最终siRNA浓度为125pM；在37℃孵育细胞和原始细胞，持续不同的时期，并经上文所述的免疫荧光测定所得的蛋白质水平。
为收集图4CX3(左轴)所述的数据，向1x106Hep3B或肝细胞中添加充足体积的siRNA装载的SP94靶向的DOPC原始细胞、DOPC脂质复合物或DOTAP脂质复合物使得最终siRNA浓度为125pM。在37℃孵育样品48小时，并如上所述定量细胞周期蛋白A2表达的降低。为测定图4C X3(右轴)中所绘制的值，将1x106Hep3B细胞在37℃暴露于多种浓度(颗粒/mL)的siRNA装载的SP94靶向的DOPC原始细胞、DOPC脂质复合物或DOTAP脂质复合物48小时；使用免疫荧光法定量细胞周期蛋白A2表达，且从颗粒浓度对细胞周期蛋白A2浓度的作图计算使细胞周期蛋白A2表达降低90％所需的颗粒数。
将图5X3中所述的细胞在37℃暴露于10倍过量含Alexa647标记的核的siRNA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞1小时或48小时。细胞经D-PBS洗涤3次，根据制造商说明书经Hoechst 33342标记，经3.7％甲醛(室温，15分钟)固定，经0.2％ Triton X-100透化(室温，5分钟)，并经FX信号增强剂阻断(室温，30分钟)。
然后将细胞在4℃暴露于Alexa488标记的抗细胞周期蛋白A2、B1、D1或E的抗体(以1:500稀释于1％BSA中)过夜，在D-PBS中洗涤3次，并用Gold封闭。
siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞诱导的细胞凋亡的定量。通过将1x106细胞在37℃与125pM的siRNA孵育不同时期，测定暴露于siRNA装载的、SP94靶向的原始细胞的Hep3B和肝细胞(见图6AX3)的时间依赖性活力。细胞经离心(1000rpm，1分钟)以除去过量的原始细胞并经Alexa Fluor标记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色。经流式细胞术(FACSCalibur)测定活力的(双阴性)和非活力的(单或双阳性)细胞的数目。
将图6BX3和6CX3所示的细胞在37℃暴露于10倍过量的siRNA装载的、SP94靶向的含Alexa647标记的核的原始细胞1小时或48小时。然后细胞经D-PBS洗涤3次，根据制造商说明书经Hoechst 33342、Alexa488标记的膜联蛋白V和碘化丙啶染色，固定(室温，3.7％甲醛，10分钟)，并用Gold封闭。
初生蛋白质合成的定量。通过将1x106Hep3B细胞在37℃与多种浓度的原始细胞包封的RTA孵育48小时测定RTA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞的IC90值(见图8A X3)。使用AHA Alexa488蛋白质合成HCS分析(根据制造商说明书)检测初生蛋白质合成的降低，并经流式细胞术(FACSCalibur)定量。将各样品的平均荧光强度对log(毒素浓度)作图，并使用GraphPad Prism测定IC90值。
通过将RTA装载的、SP94靶向的原始细胞([RTA]＝25pM)在37℃与1x106Hep3B细胞孵育不同的时期测量初生蛋白质合成中的时间依赖性下降(见图8B X3)；如上所述分析初生蛋白质合成。
为收集图8CX3(左轴)所示的数据，向1x106Hep3B或肝细胞中添加充足体积的RTA装载的SP94靶向的DOPC原始细胞或脂质体使得最终RTA浓度为25pM。在37℃孵育样品48小时，并如上所述定量初生蛋白合成的降低。为测定图8C(右轴)中所绘制的值，将1x106Hep3B细胞在37℃暴露于多种浓度(颗粒/mL)的RTA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞或脂质体48小时；使用AHA Alexa488蛋白质合成HCS分析定量蛋白质生物合成，且从颗粒浓度对初生蛋白浓度的作图计算使初生蛋白表达降低90％所需的颗粒数。
将图9X3中所示的细胞在37℃暴露于10倍过量含Alexa647标记的核的RTA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞1小时或48小时。使用AHA Alexa488蛋白质合成HCS分析(根据制造商说明书)标记新合成的蛋白质。然后根据制造商说明书使用Hoechst 33342将细胞染色，用3.7％甲醛固定(室温，10分钟)，并使用Gold封闭。
RTA装载的、SP94靶向的原始细胞诱导的细胞凋亡的定量。通过将1x106Hep3B和肝细胞在37℃暴露于RTA装载的、SP94靶向的DOPC原始细胞([RTA]＝25pM)不同时期测定半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的时间依赖性活化(见图10AX3)。使用CaspGLOWTM荧光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOWTM红色活性半胱天冬酶-3染色试剂盒定量半胱天冬酶活化程度；流式细胞术(FACSCalibur)用于测定表达高于本底水平(活力Hep3B细胞)100倍的绿色荧光(FL1)和/或红色荧光(FL2)的细胞数。凋亡细胞被定义为对半胱天冬酶-9和/或半胱天冬酶-3呈阳性的那些细胞。
将途10BX3和10CX3所示的细胞在37℃暴露于10倍过量的RTA装载的、SP94靶向的含Alexa647标记的核的原始细胞48小时。使用CaspGLOWTM荧光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOWTM红色活性半胱天冬酶-3染色试剂盒(分别)标记活性半胱天冬酶-9和活性半胱天冬酶-3。然后细胞在D-PBS中洗涤3次，并根据制造商说明书使用Hoechst 33342染色，固定(3.7％甲醛，室温，10分钟)，并使用Gold封闭。
流式细胞术仪器和设置。对于图4AX3-4CX3、6DX3、8AX3-8CX3和10AX3，细胞样品经配备有BD CellQuestTM软件5.2.1版的FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson；Franklin Lakes,NJ)分析。使用线性模式的fsc通道和对数模式的所有其它通道获得样品。基于前向光散射触发事件，并将门放置于除外细胞碎片的前向散射和侧向散射图上。使用488nm激光源激发Alexa488和荧光素，并在FL1通道(530/30过滤器/带通)中收集发射强度。使用488nm激光源激发碘化丙啶和硫代罗丹明(CaspGLOWTM红色活性半胱天冬酶-3染色试剂盒)，并在FL2通道(585/42)中采集发射强度。使用FlowJo软件6.4版(Tree Star,Inc.；Ashland,OR)测定平均荧光强度。使用Sigma Plot11.0版(Systat Software,Inc.；San Jose,CA)生成所有作图。
共聚焦荧光显微镜仪器和设置。使用Zeiss LSM510 META(Carl ZeissMicroImaging,Inc.；Thornwood,NY)以LSM510软件的通道模式操作获得三色和四色图像；在所有成像中使用63X、1.4-NA油浸物镜。
典型的激光功率设置如下：对于405nm二极管激光，30％传输；对于488nm氩激光，5％传输(60％输出)；对于543nm氦氖激光，100％传输，和对于633nm氦氖激光85％传输。对于各通道可调整增益和偏移量以避免饱和，且通常分别维持在500-700和-0.1。使用0.7-0.9μm光学薄片获得具有1024x1024分辨率的8位Z堆栈(8-bit z-stacks)。LSM510软件用于叠加各通道和用于形成Z堆栈图像的折叠投影(collapsed projections)。所有荧光图像均为折叠投影。
对所有显微镜实验,细胞在培养瓶中生长至70-80％汇集，收获(0.05％胰蛋白酶，10分钟)，在4000rpm离心2分钟，并再悬浮于完全生长培养基中。将1x104–1x106细胞/mL在37℃接种于涂布有0.01％聚-L-赖氨酸(150-300kDa)的无菌盖玻片(25-mm，No.1.5)上并允许其附着4-24小时，然后暴露于原始细胞。使用离心机，7620型(Wescor,Inc.；Logan,UT)将48小时样品纺(spun)回至载玻片上。
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实施例4
治疗性RNA和DNA经由中孔二氧化硅纳米颗粒支撑的脂质双层(MSN-SLB)向‘感染’有Nipah病毒的宿主细胞的靶向递送。
Nipah病毒(NiV)，副粘病毒科的一种高度致病成员，由于其数目众多的传播途径和与感染相关的高死亡率，已被分类为BSL-4选择剂。尽管最近在理解NiV的细胞趋向性中取得了进展，然而，治疗仍主要为支持治疗。为此，我们研发了中孔二氧化硅纳米颗粒支撑的脂质双层(MSN-SLBs；见NatureMaterials(2011)10:389-397)，其特异性地将高浓度的治疗性RNA和DNA递送至经NiV基因转染的模型宿主细胞。通过脂质体(对于肽，含有5重量％DOPE的DOPC和PEG缀合)与100nm中孔二氧化硅纳米颗粒的融合形成MSN-SLB。由于其高表面积(>1000m2/g)和大的(20-25nm)、表面可及的孔，该中孔二氧化硅核可迅速地装载高浓度(每1010颗粒～1μM)的siRNA，该siRNA诱导NiV核壳体蛋白(NiV-N)mRNA的序列特异性降解。脂质体与siRNA装载的核的融合形成受支撑的脂质双层(SLB)，其促进长期(>3个月)负载物驻留并提供配体展示的流动性界面。MSN-SLB双层经靶向肽(诱导巨胞饮的肽(R8))的多个副本和PEG修饰以使得细胞溶质递送siRNA至模型宿主细胞成为可能。
使用噬菌体展示，我们已鉴别结合ephrin B2(EB2)的肽，一种EphB2、EphB3和EphB4酪氨酸激酶的跨膜锚定配体，其由人内皮细胞和神经元表达，并作为NiV经巨胞饮进入的主要受体；在5轮针对经转染以表达人EB2的CHO-K1细胞的亲和性选择和针对亲代CHO-K1和经转染以表达人ephrin B1的CHO-K1细胞的反选择后，TGAILHP(SEQ ID NO:18)为优势序列。使用流式细胞仪，我们发现TGAILHP-靶向的MSN-SLB在高(1.5重量％或～500肽/颗粒)和低(0.015重量％或～5肽/颗粒)肽价对EB2阳性细胞(HEK 293)均具有纳摩尔亲和性。
重要地，经0.015重量％的TGAILHP(SEQ ID NO:18)和10重量％的PEG-2000修饰的MSN-SLB，其促进胶体稳定性并减少非特异性相互作用，对HEK 293细胞比对EB2阴性细胞(亲代CHO-K1)具有高103倍的亲和性。使用共聚焦荧光显微镜，我们测得经0.015重量％的TGAILHP(SEQ ID NO:18)和0.500重量％的R8修饰的MSN-SLB被HEK 293迅速地(t1/2＝5分钟)内化，而且经多种巨胞饮抑制剂预处理细胞使摄取降低了60-80％。巨胞饮体的酸化作用(1)使SLB不稳定，其触发包封的siRNA的释放并且(2)使R8肽质子化，其通过质子-海绵机理破坏巨胞饮体的膜，这两种情况均使得siRNA的细胞溶质分布成为可能。
选择性结合和内化，随后的巨胞饮体逃逸使得TGAILHP靶向的、siRNA-装载的MSN-SLB在siRNA浓度为～5pM时沉默HEK 293中90％的NiV-NmRNA成为可能，而不影响亲代CHO-K1细胞中NiV-N水平。然而，siRNA介导的RNAi是暂时的，并且在治疗后5天，NiV-N mRNA水平开始升高。因此，我们设计了编码对NiV-N特异性的小发夹RNA(shRNA)的质粒，用组蛋白封装该质粒，并用核定位序列修饰所得的18nm复合物，然后将其装载于二氧化硅核内。对于组蛋白封装质粒(4.5kbp)，MSN-SLB具有较相应的从50:50摩尔比的DOTAP和DOPE形成的脂质复合物高100倍的容量。而且，经0.015重量％的TGAILHP(SEQ ID NO:18)和0.500重量％的R8修饰的质粒装载的MSN-SLB以颗粒:细胞比为～1:20(～1750质粒/细胞cell)沉默HEK293中90％的NiV-N mRNA，并诱导长期RNAi；NiV-N mRNA的浓度仍保持在其初始值的<10％，持续4周。由于其巨大的负载物容量，以及其稳定性和特异性，MSN-SLB作为能够预防病毒复制和传播的治疗剂的递送载体显示了希望。
实施例5
透皮原始细胞
进行了两项实验以测试原始细胞是否能被工程化以促进SC渗透增强和透皮递送。在第一项实验中，目的是测定原始细胞的标准制剂是否可能通过被动扩散穿过角质层或通过绕过皮肤而穿过皮肤。为实现该目的，使用了垂直Franz扩散装置、从腹壁成形术获得的全层皮肤和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。以下部分描述了全部的实验方法，但简而言之，使用胶带剥离方法(tape stripping method)从半数样品除去SC，而其余样品保持完整。使用平均直径为90nm和孔径直径为2.5nm的二氧化硅颗粒，和平均直径为120nm的脂质体以及由55重量％DOPC、30重量％胆固醇和15重量％DOPE-PEG-2000配制成的双层组合物制备原始细胞。
表1显示了所有脂质的名称、简写和相关的物理性质。通过填充容器，将皮肤样品置于其上和将供体帽夹下，修饰的Franz扩散细胞用于扩散实验。各组对照(SC完整，SC去除)经0.5X PBS处理，而其余样品经8.125mg的原始细胞处理24小时。然后收集供体帽、皮肤样品和容器流体中的其余样品。由于高成本/样品，仅使用ICP-MS分析了容器流体。图3aX5显示了根据ICP-MS报告，每组(n＝3)容器流体中SiO2的总量，证明原始细胞能够穿透SC并扩散穿过皮肤。与具有完整SC的皮肤样品相比，接近4X原始细胞的量能够扩散穿过SC去除的皮肤样品，然而，由于各组内的高度误差，这些值统计学上不显著，因此这些数据仅确认了所提议工作的可行性。
下一项实验有两个目的，首先，由于ICP-MS的高成本/样品，为了开发定量透皮通量的成本有效方法；其次，为了测定原始细胞的SLB组合物和制剂对透皮动力学的影响。由于荧光光谱法具有高敏感性、方便使用荧光计和核可被容易地荧光标记，因此选择荧光光谱法用于定量通量，图3bX5为解释如何使用1°-含胺有机硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，随后与胺反应性荧光团一起孵育通过核的功能化荧光标记原始细胞的核。在所有可见波长下，皮肤本身是高度自发荧光的，但红外波长展示了荧光光谱法和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)所证明的最少量的自发荧光。因此，选择AlexaFlour 633(激发：632，发射：647)用于该实验，并将用于所有后续实验中。取决于皮肤自发荧光的程度，对于容器缓冲液中633标记的核，荧光计的敏感性范围为～195ng/ml-500ng/ml。在该实验中,使用以下物质构建含有荧光标记的核的原始细胞：三种碱性SLB组合物和总共六种制剂，所述制剂基于脂质转变温度的差异、饱和度和不饱和度，以及头基：1.)70重量％DOPC/30重量％胆固醇，2.)55重量％DOPC/30重量％胆固醇/15重量％DOPE-PEG-2000，3.)70重量％DSPC/30重量％胆固醇，4.)55重量％DSPC/30重量％胆固醇/15重量％DSPE-PEG-2000，5.)45重量％DOPC/30重量％胆固醇/25重量％DOPE，和6.)30重量％DOPC/30重量％胆固醇/25重量％DOPE/15重量％DOPE。所有样品SC保持完整，并且对照经0.5X PBS处理，同时各样品经8mg原始细胞处理24小时。图3cX5总结了结果并解释SLB组合物和制剂极大地影响了原始细胞的透皮动力学。这与文献一致，该文献表明具有较低转变温度的脂质较深的扩散进入全层皮肤，而具有较高转变温度的脂质仍局限于角质层。初步数据共同地证明所提议工作的可行性及其成功的高可能性。此外，已开发了成本有效的荧光分析法方案定量原始细胞的透皮动力学。
方法
原始细胞合成和特征描述：使用不同的挥发诱导自组装(EISA)方法在胶体溶液或经雾化合成纳米多孔颗粒核。EISA使用两亲性表面活性剂和嵌段共聚物作为与可溶性溶胶-凝胶前体(即酸或碱、H2O或EtOH和一些有机硅烷)结合的结构导向剂以通过简单溶剂蒸发促进具有高度有序/均匀孔径的球形纳米尺寸的二氧化硅(SiO2)颗粒的自组装。56,57一旦完成颗粒合成，则使用溶剂萃取或500℃煅烧除去该结构导向剂。可通过定制浓度和通过选择结构导向剂控制颗粒大小(30-1000nm)、孔隙率、孔径(2.5-20nm)、溶解动力学和表面化学。此外，使用上文所述的操作可进行合成后功能化(图3bX5)。通过挤出法形成SLB，在该方法中水性脂质溶液多次通过具有均匀孔的多孔聚碳酸酯膜以生成单分散脂质体溶液。购买的脂质为保存于氯仿中的25mg/ml储备液，所以在挤出前必须将其萃取和干燥。以不同比例配置，将脂质分配于单闪烁瓶中，从而使得最终质量为2.5mg。脂质组合物和制剂的选择允许对SLB物理和化学性质的精确控制水平，一个额外水平的控制来自后续SLB。一旦与该核融合后，则进行修饰(表1)。在真空下除去氯仿，并脂质经0.5X PBS再水合至终浓度为2.5mg/ml，并挤出，或即刻保存于-20℃<6个月。
表1显示所用脂质的名称和物理性质。数据来自：www.avantilipids.com
注意刚好在制剂的最高Tm之上挤出脂质体以确保所有脂质体为流体，因此常需要将挤出机放置于热板上。
通过使用3:1(体积/体积)比例将体积过量脂质体添加至核并将它们在室温于搅拌下孵育30-60分钟。其次，使用异双功能交联剂进行进一步的双层修饰(即肽的缀合)，然后将原始细胞溶液浓缩至所需的工作浓度(<20mg/ml)。原始细胞和其组分的特征描述包括透射电子显微镜(TEM)以定性地评价孔和颗粒结构和目测或统计学上定量颗粒直径和分布，动态光散射(DLS)以获得流体动力学半径，氮吸附(NS)以定量Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积和Barret-Joyner-Halenda(BJH)孔径分布，ζ电势以评价胶体稳定性和表面电荷，和吸光度或荧光以评价负载物装载容量。9-11在任何修饰前后，原始细胞经受前述的所有检测。在任何修饰前后，脂质体和原始细胞仅经受ζ电势和DLS。
皮肤制备物和Franz扩散装置：皮肤制备物和适当的处理很重要，因为其直接影响皮肤的结构。自腹壁成形术获得的全层人皮肤是根据地方性法规捐赠的。在接收皮肤后，将其双套袋并保存于-20℃<6个月。已显示皮肤的屏障功能经多个冻融循环后仍完整。根据需要，冷冻的皮肤在30℃烘箱中融解，并使用解剖刀将皮下脂肪除去，然后将皮肤样品切片成1cm2片。然后样品经DI H2O冲洗且将SC侧吸干。在一些情况中，将需要除去或分离SC；这可分别通过使用胶带剥离或酶促组织消化来实现。当完成实验时，皮肤样品应当在10ml 0.5X PBS中洗涤、吸干，分别双套袋装，用箔纸包住，并冷冻直至对其进行分析。Linda Felton教授的实验室，位于多学科中心(Multidisciplinary Research Facility，MRF)放置了一台垂直的、改良的Franz扩散装置，其配备有9个水套扩散池、加热/冷却循环器，建于搅拌盘中，进样口和，供体表面积为0.64cm2，容器体积为5.1mL。为准备实验，将容器充满0.5X PBS(或一些其它的等张缓冲液)并将温度设置为37℃。其次，将皮肤小心地展开在容器上，以避免形成任何气泡，并将供体帽夹至位置，并盖上以预防脱水。然后允许皮肤平衡1小时，然后置换容器流体并将皮肤再平衡额外的30分钟。在实验开始前，从进样口除去400μl的容器流体并保留作为其来源容器的0小时空白。在所需的时间点从进样口取出400μl样品，然后再补充400μl扩散缓冲液以维持恒定体积并避免在皮肤流体界面形成气泡。
荧光光谱法：使用配备有FelixGX软件、2个PMT检测器、光学过滤器和可容纳4个比色池的样品盘的PTI QuantaMaster-40分光荧光剂定量所有透皮原始细胞扩散实验的定量。皮肤是高度异质和高度自发荧光的，该特性常转移至容器流体。开发本方案从而使得这些组织可在分析中被计数。使用半稀释法(half dilutions)从浓度范围0.16–1.95x10-5mg/ml的对照样品(24小时时间点)的容器流体制得标准曲线。此外，从对照取出380μl并放置于比色池中作为空白。在实验过程中，该空白一直在样品盘中，这使得每次只能分析3份样品。标准是运行3次，平均并报告95％置信区间，并绘制在log-log尺度上以获得线性方程。所有样品最少分析3次，并最大使用9份样品以得到统计相关性。一旦已分析完所有样品，则保存文件，输出作为文本文件并手动加入excel表格。平均所有空白值的均值并计算95％置信区间。在所有时间点单独计算所有样品的平均荧光强度(MFI)。使用线性回归分析计算未知浓度。通过将各0小时MFI与空白MFI相加或从空白MFI减去各0小时MFI以将一切标准化至标准曲线来测定8份样品每份的校正值。然后将各时间点的MFI加上/减去该校正值以得到校正的MFI。取各MFI的对数并使用该标准曲线所获得的方程计算浓度。最后，从其它各时间点的浓度值减去各0时间点所计算的浓度值以得到绝对浓度。注意所有标准曲线趋于整个浓度范围上的多项式；为获得线性曲线，仅绘制相关的浓度/强度范围，并将其拟合至线性趋势线(R2>0.9300)。
特定目的1–研究影响体外透皮穿透动力学的原始细胞受支撑的脂质双层(SLB)和纳米多孔二氧化硅颗粒核的参数并测定SLB是否从该核解离。为实现该特定目的，对原始细胞生物物理和生物化学的每种性质进行系统性处理。首先，研究SLB各项单独的性质，随后独立地评价该核的各项性质。荧光光谱法用于定量通量，将皮肤植入石蜡中，组织学32切片并使用双通道CLSM23评价分配至皮肤中的原始细胞。如果CLSM不足以实现该目的，则使用TEM51或多光子显微镜42(SNL-CINT)。对于涉及SLB的实验，所有核均经Alexa Fluor633荧光标记并经雾化合成，使用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)模制，优化的标准核用于靶向的原始细胞。这些颗粒具有ζ＝-20mV，均匀BJH孔径＝2.5nm，粒径分布＝90±60，BET表面积＝1000g/m2。对于涉及核的实验，将使用经测定导致最大总通量的SLB制剂并维持恒定。最后，一旦优化完SLB和核性质，则测定SLB的结果。第一组实验将确认在24小时内哪种中性电荷磷脂(DOPC、DPPC、和DSPC)可单独得到最大的总通量，基于转变温度/流动性。Van den Bergh等人已显示流体脂质(Tm<37℃)能更深地扩散至皮肤中，而非流体脂质(Tm>37℃)仍局限于SC。51结果支持那些发现，然而由于该核赋予的纳米多孔支撑和通过温度依赖性FRAP确认的SLB脂质表观转变温度的相应降低，原始细胞的创新性质同时促进了SLB流动性和稳定性。该性质在DPPC情况(其中表观Tm从41℃下降至37℃)中尤其有趣。9如果DPPC原始细胞的通量降至DOPC和DSPC原始细胞的通量之间，则原始细胞的后续碱基组成仅使用DOPC和DSPC以得到具有流体SLB和非流体SLB的原始细胞之间的对比，因为这些结果将与脂质体文献一致。然而，如果DPPC原始细胞的总通量在DOPC和DSPC原始细胞的通量范围之外，由于SLB-核相互作用，则所有三种SLB碱基组成将用于后续实验从而进一步研究这些相互作用的影响。第二项实验将观察在24小时内胆固醇、胆固醇硫酸酯和神经酰胺对总通量的影响。SC由胆固醇、胆固醇硫酸酯、脂肪酸和神经酰胺组成。1,33,60,61因此，为试图增加原始细胞在皮肤中的溶解度，将这些SC脂质掺入SLB中以阐明对渗透的任何影响。将独立地和全体地研究这些脂质各自的影响。初步结果表明PEG-2000对通量具有最大的影响。此外，PEG-400是很多市售可得的局部和透皮药物制剂的一种常用渗透促进剂。62-64PEG-2000的浓度首先是可变的从而测定最佳的PEG制剂；随后进行恒定PEG浓度和可变PEG长度的实验。第四组实验将使用富含精氨酸的肽(即R8)修饰所优化的SLB制剂。富含精氨酸的肽已显示可增加细胞内化65，而七精氨酸肽与环孢菌素A的缀合表明增强的透皮动力学。28下一项任务是测定核性质如何影响透皮动力学。保持SLB制剂不变，测定核大小和表面功能化的影响。Alvarez-Román等人证明聚苯乙烯珠粒优先地以尺寸依赖性的方式蓄积在皮肤的不同位置。23此外，Rancan等人表明中孔stober二氧化硅颗粒被皮肤细胞占据并能够扩散穿过具有修饰的SC的皮肤，该占据和扩散均为尺寸依赖性方式。66Verma等人报道了显著增强穿透的脂质体，其可变形，直径为120nm，并且使用直径为70nm的脂质体最大地增强穿透角质层。20这些研究阐释了除化学和物理表面性质外粒径对透皮动力学的重要性。除通过气溶胶辅助的EISA形成的广泛分布外，使用胶体合成法合成并描述三种单分散大小的颗粒(30nm、100nm和200nm)。第六组实验将研究核功能化/核电荷的影响。未修饰的二氧化硅具有强负ζ电势(-40至-15mV)并且可被功能化以改变ζ电势。56使用优化的核大小，颗粒被功能化以具有强正电荷(>10mV)或被甲基化以赋予疏水性。第七组实验将荧光标记SLB并进行荧光共定位实验以测定SLB结果。最后，使用优化的透皮PC，测定时间依赖性通量。
特定目的2-阐释SLB制剂、组合物和功能化影响透皮动力学的机理。Fick第一扩散定律的简单重述基于容器浓度(cR)和供体浓度(cD)之间的差异和SC的厚度将透皮通量(J)与SC渗透性(P)关联1,17，通过总通量和渗透性的变化，允许原始细胞SLB制剂之间的直接相关。从实验数据计算渗透系数，然而，通量和渗透性的实验测定仅揭示了透皮扩散动力学的信息，而未揭示关于渗透促进的机理(其为理解透皮-PC负载物递送的重要参数)17,30。药剂学中描述SC渗透的标准平均值是经由DSC通过分析SC脂质的TM降低得到的。17,26,29-32,35存在典型地与人SC脂质相关的三种TM峰。32,59第一个为75℃，其由于脂质结构从层状向无序变化；90℃，其与蛋白质相关的脂质从凝胶向液体状态转变有关；和120℃，表明蛋白质相关的脂质已经变性。在已经多种渗透促进剂处理的SC样品中，已广泛地报道了TM的显著降低和降低的峰强度。32然而，DSC仅给出了SC大结构的信息，因此需要进一步特征描述以完全理解SLB如何促进渗透。XRD是一种材料科学特征描述技术，其基于固定角度的X射线衍射图给出了晶体结构信息。Kim等人和很多其他人此前已使用小角和广角XRD以描述SC的结构。26,32,33对于小角XRD，由于神经酰胺(d＝6.13nm)和结晶胆固醇(d＝3.38nm)，两个峰与散射相关。对于广角XRD，位于处的一个峰与结晶胆固醇相关。32FTIR光谱法还可用于通过测量与SC脂质伸缩(2850cm-1&2920cm-1)有关的碳-氢和碳-氧伸缩频率的变化和SC角蛋白分子的机构变化(1650cm-1)来描述SC结构的变化。32,35,67将进行的最后的特征描述方法是组织学/显微镜法。标准H&E染色用于研究SC结构中的任何肉眼可见的变化，而荧光显微镜法用于评价皮肤中颗粒分布。该特定目的的最大挑战为分离用于DSC、XRD和FTIR的SC样品而不损伤其结构。一旦实现了上述样品分离，则描述特定目的1生成的皮肤样品以使得各SLB制剂如何改变SC结构相关联。
特定目的3-使用烟碱和布洛芬(具有有利于或不利于透皮扩散的物理和化学性质的药物)，评价体外透PC的递送效率。烟碱贴剂是本领域最常用的一种透皮贴剂。烟碱的化学和物理性质(Ko/w＝15.85，可混溶于H2O中，162.234Da，Tm＝-7.9℃)使得其成为透皮递送的理想物质。另一方面，布洛芬的化学和物理性质为Ko/w＝9332.54，不溶于H2O中，206.28Da，Tm＝74-77℃。如其较差的水可溶性和极度亲脂的Ko/w所证明的，由于其优先分配于SC中且不扩散至更深的组织中，布洛芬的透皮动力学较不利的。17第一项实验将使用优化的核颗粒测定对两种药物的装载容量，然后装载并融合该优化的SLB以用于透皮递送。使用UV光谱法测定装载容量和药物释放动力学。此外，需要测定布洛芬装载的核的水可溶性和Ko/w以评价原始细胞如何能够掩蔽药物的表观化学行为。第二项实验将透皮递送烟碱和布洛芬，作为游离药物和使用原始细胞进行。然后使用HPLC计算药物通量从而测定使用原始细胞的透皮递送的效率并洞察皮肤中原始细胞药物释放特点。58,59最后的实验将测定是否可能递送具有不同化学和物理性质的药物的组合。这可通过装载不同比例的这两种药物至原始细胞核中来实现。使用纳米颗粒穿过皮肤递送个体化药物组合的能力，(其有利于不同的透皮行为)是一种创新，尚未有所证明。潜在的难题是大多数HPLC柱使用二氧化硅颗粒的事实，因此在HPLC分析前必须滴定样品pH直至溶解该颗粒。
特定目的4-使用NU/NU裸鼠模型体内测定装载有烟碱或布洛芬的透PC的基本药理学性质。该小鼠模型无毛、无胸腺，因此缺乏功能性自适应免疫系统，然而，它们具有功能性的NK先天性免疫系统，使它们很好的相配。在这些初步的体内研究中，我们通过胶带辅助局部地使用透PC以预防泄漏和水蒸发。在应用后，我们监测烟碱和布洛芬的血清水平作为时间的函数，并评价生物分布、药动学和透pC的排泄。此外，我们检查皮肤的任何刺激或损伤征象。使用HPLC、荧光光谱成像、组织学和ICP-MS进行分析。
实施例5的参考文献
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实施例6
用于治疗出现的病毒病原体的模块纳米颗粒平台。
1.总览/摘要
1.1  问题陈述：通常，抗病毒药物必须大剂量频繁给药以有效地治疗病毒感染，包括那些由新兴和工程病毒引起的感染。
然而，高剂量对宿主而言可引起毒副作用，并且如果不当服用，可加速耐药病原体的进化。因此，有必要研发生物相容的纳米颗粒递送载体从而减少治疗的数量、频率、时程和剂量，延缓治疗超出目前限度，并且预防疾病复发。然而，大多数最新型的纳米载体，包括脂质体和聚合物纳米载体，存在低容量、较差的稳定性和被靶细胞最低限度的摄取等问题。本计划通过设计模块、高度适应性的纳米载体，称之为“原始细胞”，7-9其协同地结合了脂质体和中孔二氧化硅纳米颗粒的优势。
1.2  原始细胞由包封在受支撑的脂质双层内的中孔二氧化硅纳米颗粒核组成，并同时展示出极高的不同的化学治疗性和诊断性药剂的装载容量(比可比的脂质体高>1000倍)、在复合生物流体中的长期稳定性和在低配体密度对靶细胞的亚纳摩尔亲和性。我们精确控制装载、释放、稳定性和靶向特异性的能力和我们设计颗粒大小、形状、电荷和表面修饰的能力使得我们可以极大地降低剂量和脱靶作用，减轻免疫原性，最大化生物相容性和生物降解性，并控制生物分布和持久性。
如我们在2011年5月Nature Materials的封面文章8所报道的，由于它们独特的生物物理性质，其比最新型的脂质体在治疗人肝癌方面更有效100万倍。在本计划中，我们寻求将原始细胞的效用延伸至新兴病毒，所述新兴病毒作为潜在的生物威胁具有相关性并且将评价装载有传统和新型抗病毒剂和靶向潜在的宿主细胞和已感染细胞的原始细胞的预防和治疗潜力。
2.实验方法
2.1  技术方法：使用抑制进入、融合、复制或出芽过程的小分子药物治疗病毒感染1，而最近使用治疗性核酸，如沉默特异性病毒基因表达或者如果被宿主耐受，沉默病毒进入的细胞受体的表达的小干扰RNA(siRNA)。2-3然而，很多抗病毒剂存在限制了它们治疗有效性的过多的缺点，包括：(1)超敏感型和变态反应，以及多种其它有害的副作用；(2)逐渐增加的耐药病原体的流行和工程耐药的可能性；和(3)需要大剂量和频繁给药从而促进在感染位点足够蓄积，这依次由较差的生物利用度、快速清除、有限的溶解度、不完全的吸收和脱靶蓄积引起。4治疗性siRNA可经设计以减少脱靶作用，但在血清中具有有限的稳定性、短的半衰期、对组织和细胞穿透不良，并诱导先天性免疫应答。5因此，需要能够改善传统和新型抗病毒剂的药动学和药效学的生物相容的纳米颗粒递送系统(“纳米载体”)。已研发了数目众多的纳米载体，包括脂质体、聚合物纳米载体、树枝状聚合物、碳纳米管和多孔无机纳米颗粒，用于多种体内诊断性和治疗性应用。6尽管在改善生物相容性、增加循环时间、降低免疫原性和最小化脱靶相互作用方面已作出了重大进展，然而大多数最新型的纳米载体的治疗有效性仍然受限于低装载容量、较差的靶向特异性和在生理条件下有限的稳定性。为此目的，我们研发了中孔二氧化硅纳米颗粒支撑的脂质双层(“原始细胞”)7-9，其协同地结合了两种有希望的纳米颗粒递送载体：脂质体和中孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)的优势。
原始细胞结合了脂质体和中孔二氧化硅纳米颗粒两者的优势。
原始细胞(见图1X6)由包封在受支撑的脂质双层(SLB)内的球形MSNP核组成。MSNP具有极高的表面积(>1200m2/g),因此可通过将它们简单浸泡于感兴趣的一种或多种负载物的溶液中装载有高浓度的各种治疗性和诊断性药剂。而且，由于我们用于合成MSNP的气溶胶辅助的蒸发诱导的自组装(EISA)方法10与大范围的结构导向表面活性剂和所得颗粒的合成后处理相容，孔径可在2.5nm至25nm内变化，而且孔壁可经阳离子型或疏水性硅烷修饰，这两种情况均使得容易地包封多种不同的化学负载物成为可能，这些负载物包括小分子药物(酸性、碱性和疏水性)和药物混合物、siRNA、蛋白质和编码小发夹RNA(shRNA)的DNA载体，以及诊断剂如量子点和氧化铁纳米颗粒，如果需要。我们已表明对于小分子药物，原始细胞具有高达50重量％的装载容量，其比其它基于MSNP的递送载体高5倍11并且比类似尺寸的脂质体高1000倍。8可通过控制核的二氧化硅压缩程度来调整释放速率，因此调整其在生理条件下的溶解速率；热煅烧最大化压缩并使得颗粒具有缓释特点(每天释放7-10％，持续达2周)，同时使用酸化乙醇萃取表面活性剂增加了颗粒的溶解度并使得包封药物爆发性释放(12小时内100％释放)。脂质体与负载物装载的MSNP的融合形成了紧凑的SLB，其为展示功能性分子，如聚乙二醇(PEG)和靶向配体提供稳定的、流动的、生物相容的界面。我们已证明当分散于复合生物流体中(例如，完全的生长培养基和血液)时，原始细胞稳定地包封小分子药物达4周，无论SLB是否由在体温时流动或不流动的脂质组成；相反，即使当它们的双层由完全饱和的脂质(其具有高封装密度，因此应当限制药物扩散穿过所述双层)组成，脂质体快速的泄漏其包封的药物。8所述流动但稳定的SLB使得我们能够在低配体密度达到敏锐地高靶向特异性，这依次降低了免疫原性和非特异性相互作用；我们已表明当SLB由流动的、两性离子脂质1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)组成时，每个颗粒经平均仅5种靶向肽修饰的原始细胞对靶细胞比对非靶细胞的亲和性高10,000倍。8而且，我们表明在原始细胞SLB上掺入触发胞吞作用和内体逃逸的肽使得被包封负载物的细胞溶质分散成为可能，通过使用靶向部分如核定位序列(NLS)修饰负载物分子，我们能够影响负载物在细胞内特定细胞器内的蓄积。8由于它们对不同负载物的高容量，在低配体密度下地高靶向特异性和长期双层稳定性。装载有化疗药物混合物并靶向人肝癌的原始细胞比可比的脂质体更有效100万倍。8在所计划的研发中，我们将工程制造原始细胞用于将治疗剂靶向递送至被细胞内病原体感染的细胞，目标是实现同样地优于游离药物和药物装载的脂质体的治疗有效性。
原始细胞的柔韧性、模块性质使解决多种体内挑战成为可能。为促进抗病毒剂在可能感染或已感染的宿主细胞内的蓄积，原始细胞必须：
(1)在循环中持续足够时间而不引起对宿主的毒性；(2)在一个或多个靶组织内蓄积；(3)选择性结合一个或多个靶细胞并被一个或多个靶细胞内化；(4)以需要的动力学并在一个或多个适当的细胞内隔室内释放它们包封的药物；和(5)降解成可容易被排泄的生物相容的单体。如上文所讨论的，我们已表明经低密度靶向配体修饰的PEG化的原始细胞容易与靶细胞结合并被靶细胞内化，而且稳定地包封药物直至内体酸化使SLB不稳定，从而将核暴露并持续释放或爆发性释放所包封的药物(上文步骤3和4)。8在所计划的研发过程中，我们重新评价了靶向病毒感染的细胞并装载有如下所述的抗病毒剂的原始细胞的体外性能，但还描述了原始细胞在小鼠和鸟类胚胎模型中的生物分布、生物相容性和生物降解性(上文的步骤1、2和5)。我们初步的体内研究表明原始细胞是高度生物相容的并且可被工程改造从而在靶组织内广泛分布并持续存在。如图2AX6所示，经200mg/kg剂量的PEG化原始细胞每周注射3次，持续3周的Balb/c小鼠显示无肉眼可见的毒性或体重减轻征象；考虑到它们的高装载容量，该结果表明原始细胞可以以爆发性或持续性释放动力学递送至少900mg/kg的小分子药物。而且，如图2BX6所证明的，当以剂量为200mg/kg在Balb/c小鼠中注射时，直径为20-200nm的PEG化原始细胞仍广泛地分布48小时，这为靶向的原始细胞在靶组织内蓄积提供了足够的时间。我们还表明通过控制尺寸和表面修饰，我们可促进原始细胞在Balb/c和Nu/Nu小鼠的骨和肝内的蓄积以分别治疗急性成淋巴细胞性白血病和肝细胞癌，和即使当装载有治疗上相关剂量的化疗药多柔比星时，原始细胞在靶组织持续达4周并无肉眼可见的或组织学毒性征象，分别通过器官重量和病理测定(未公布的数据)。此外，我们在UCLA纳米技术的环境影响中心(UCLACenter for Environmental Implications of Nanotechnology)的合作者表明MSNP是生物可降解的，并且最终在尿和粪便中作为硅酸排泄。12最后，我们表明当以总剂量400mg/kg在C57B1/6小鼠中注射时，经高密度(达10重量％)的肽(长度为7-12氨基酸)修饰的原始细胞既未诱导IgG也未诱导IgM应答(未公布的数据)。取决于特定应用所需的生物分布，我们可控制MSNP尺寸和形状(球状、圆盘状和杆状13)和SLB电荷和以及表面修饰，使得原始细胞成为高度模块、柔韧性的纳米颗粒递送系统。
装载有抗病毒剂和靶向未感染的和感染的宿主细胞的原始细胞的合成。在所计划的研发中，我们将工程制造原始细胞用于将siRNA和小分子抗病毒剂靶向递送至被Nipah病毒(NiV)(所述NiV是一种BSL-4副粘病毒，尚无批准的疫苗或有效的治疗存在)感染的细胞，最终目标是与有利药物或脂质体药物可实现的水平相比，最小化治疗的数量、频率、时程和剂量，延缓治疗超过目前的限度，并预防疾病复发。我们选择NiV作为模型新兴病毒是由于其熟知的结构和细胞趋向性，以及其作为生物威胁的关联性。14我们此前已报道了原始细胞在将siRNA递送至靶细胞的细胞溶胶中的效用；7然而，在这些研究中，我们使用的MSNP是通过油包水乳剂技术合成的15，其存在粒径、尺寸分布和收率的高批次间变异性。因此，我们将通过调整气溶胶辅助的EISA方法开始，这使得生产具有可重现性质的大量颗粒成为可能，从而生成适于siRNA包封和递送的MSNP。这些MSNP必须具有足够大地正电荷核以接纳负电荷siRNA(13-15kDa)并且直径应当<200nm以最小化在肝脏和脾脏的蓄积并减少网状内皮系统(RES)的单核细胞/巨噬细胞的摄取；6对于最大化装载容量，最大化表面积和孔连接性也很重要。为生成具有这些性质的颗粒，我们将研究两种合成策略。在第一种策略中，我们将使用二元表面活性剂系统以生成单相颗粒；具体地，我们使用大孔形成表面活性剂，如F127，与正常形成具有高度连接性的高表面积中间相的表面活性剂如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)结合。如果我们可在二氧化硅前体溶胶中形成这些表面活性剂的稳定的、三相混合物，应当能够生成具有>5nm孔的颗粒。在第二种策略中，我们通过将大孔形成表面活性剂(例如，F127)与苯甲酸聚合预形成稳定的、蠕虫样中孔；然后将杂合表面活性剂和聚合膨胀剂(例如，聚丙二醇)一起添加至二氧化硅前体溶胶以获得尺寸达20nm的表面可及的孔。一旦已优化完孔径和几何学，我们将颗粒与胺化硅烷如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应以极大的增加颗粒的ζ电势而最低限度的影响孔结构。最后，我们将研究方法以改良气溶胶辅助的EISA方法，其一般导致颗粒广泛分布(50nm至>1μm)，从而减少粒径和粒径分布；通过使用乙醇稀释前体溶胶或在雾化前将前体溶胶加热来降低其粘度应当使所得颗粒的分布变为<200nm。使用动态光散射(DLS)、电子显微镜和氮吸附描述所有MSNP的大小和大小分布、ζ电势、表面积和孔径分布。一旦我们已生成具有适当性质的MSNP，我们将使用此前报道的技术测试其siRNA装载容量和pH依赖性释放速率；7尽管我们将初次使用能够爆发性释放的颗粒，我们可根据如下所述的ex ovo研究的结果调整释放速率。然后我们将由65重量％DOPC、5重量％1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和30重量％胆固醇组成的脂质体与siRNA装载的核融合并使用单链抗体片段(scFv)或肽(使用C端半胱氨酸残基合成以促进缀合)使用市购可得的与DOPE中的伯胺部分和半胱氨酸中的巯基部分反应的交联剂修饰所得的SLB。我们还将使用10重量％PEG-2000修饰SLB，已显示所述PEG-2000可减少体内血清蛋白质对纳米载体表面的吸附并最小化RES的摄取6而且使用质谱描述平均配体和PEG密度。图1X6显示我们计划研发的原始细胞的示意图。
靶向的、药物装载的原始细胞的结合、内化和负载物递送性质的体外优 化。我们已使用噬菌体展示通过经转染以表达人ephrin B2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的淘选和进行亲代CHO细胞和经转染以表达人ephrin B1的CHO细胞的减法淘选来鉴别结合ephrin B2(NiV的进入受体)的肽16。在5轮选择后，优势序列为7-mer，TGAILHP(SEQ ID NO:18)，根据酶联免疫吸附分析，其很好的与数种ephrin B2阳性的细胞系结合(未公布数据)。我们将使用流式细胞仪或表面等离子体共振测量经高密度和低密度TGAILHP肽修饰的原始细胞对各种ephrin B2阳性和阴性细胞的解离常数(Kd)并将这些数值与展示ephrin B2特异性的scFV的原始细胞的亲和性比较；17考虑到经高达10重量％七肽修饰的原始细胞是非免疫原性的，因此靶向肽对于scFV是优选的。我们还使用与NiV连接糖蛋白(G)18(其在被感染的细胞的表面上表达)结合的scFv修饰原始细胞，从而靶向宿主细胞(即表达ephrin B2的细胞)和被感染的细胞(即在初始研究中经转染表达NiV-G的细胞)。
如果与ephrin B2或NiV-G结合的配体不足以实现所需的亲和性，我们将进行噬菌体展示以鉴别额外的配体。然后我们将使用共聚焦荧光显微镜以测定肽和scFv靶向的原始细胞是否被靶细胞内化，而且如果是，则评价其在细胞内结果。如果靶向配体不自然地触发内化，我们将进一步使用已知当以高密度展示于纳米颗粒上时可触发巨胞饮和巨胞饮体逃逸的肽(八精氨酸或R8)修饰SLB。19-20为评价siRNA装载的原始细胞的治疗有效性，我们将首先设计并验证具有红外荧光报告蛋白(mKATE)、NiV核壳体蛋白(N)和NiV基质蛋白(M)特异性的siRNA。然后我们将使用实时PCR在以下细胞中测定表达水平：(1)Vero和/或人胚胎肾(HEK)细胞，其经编码mKATE的NiV-G/F假型水泡性口膜炎病毒(NiVpp18)预感染并暴露于经一种或多种mKATE特异性siRNA装载的ephrin B2靶向的原始细胞；(2)Vero和/或HEK细胞，其经NiV-N和NiV-M预转染并暴露于经一种或多种NiV-N和M特异性siRNA装载的ephrin B2靶向的原始细胞；和(3)Vero和/或HEK细胞，其经编码mKATE和NiV-G表面表达的NiVpp预感染并暴露于经mKATE特异性siRNA装载的G-靶向的原始细胞。平行地，我们向University of Texas Medical Branch(UTMB)的A.Freiberg提供NiV-N和NiV-M siRNA以验证对抗活得NiV；如果任何N或M特异性siRNA抑制体内病毒复制，我们也将测试siRNA装载的、ephrinB2靶向的原始细胞的有效性。如果siRNA不足以沉默靶基因持续的时间(>72小时),我们将设计/装载并递送编码对mKATE、NiV-N和/或NiV-M特异的shRNA的微环DNA载体21。我们还将测定光敏感通道蛋白22和其它光门控离子通道是否能够经工程改造以传递小分子抗病毒剂并且掺入至原始细胞的SLB内以使得触发递送成为可能。
使用鸟类胚胎评价原始细胞的体内治疗能力。一旦我们已优化完肽或scFv靶向的原始细胞在体外的结合、内化和负载物递送性质，我们将评价其在体内的治疗能力。为完成该目标，我们将使用鸟类胚胎作为体内系统模型，因为NiV不会在常见的小型动物模型(即小鼠和大鼠)中引起疾病。14而且，鸟类胚胎已被用于研究NiV发病机制23并且可进行具有单细胞分辨率的活体成像技术。最后，鸟类胚胎仅有常见小型动物模型成本的十分之一至百分之一，并且不实验动物护理和使用委员会(IACUC)规则的约束，使得它们完美地用于纳米颗粒的成本有效的、高通量筛选。我们将首先优化胚胎年龄和NiVpp浓度从而最大化NiVpp编码的蛋白质的表达同时最小化对胚胎的毒性。然后，我们将使用经编码mKATE和诱导感染细胞上NiV-G表面表达的NiVpp预感染的胚胎测定装载有mKATE特异性siRNA并靶向NiV-G的原始细胞的沉默有效性。最后，我们将评价原始细胞递送抗病毒剂(包括siRNA(或如果适当，微环DNA)、传统抗病毒剂(例如，利巴韦林)和新型广谱抗病毒剂(例如，LJ00124))至胚胎的能力，所述胚胎被转染以表达人ephrin B2并被编码mKATE和NiV-G的NiVpp感染。
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实施例7
非靶向原始细胞的生物分布和毒性
已评估了非靶向原始细胞的初步生物分布和毒性。使用Bulb/c或Nu/Nu小鼠的活体动物荧光成像，发现在每只小鼠IV注射最大剂量4mg(200mg/kg)后经荧光核修饰的非靶向原始细胞全身性分布[图1X7A]。全身循环的周期将为靶向原始细胞在具体细胞(独立于所述细胞的位置)内蓄积提供时间。在24-48小时过程中，可以看见其余的原始细胞在肝脏和脾脏中蓄积。在3个200mg/kg剂量后，相当大地颗粒浓度仍在肝脏中持续至少2周(图1X7B和D)。根据病理学和肝脏重量的测定，这种在肝脏中的蓄积和保留不产生任何肉眼可见的肝脏毒性(图2X7)。因此，除它们可能用于靶向递送外，非靶向原始细胞可用作递送大的、持续剂量的抗病毒和siRNA的理想贮器。而且，在3周每周三次200mg/kg剂量(每只小鼠总二氧化硅剂量为36mg)后，未观察到毒性或体重增加下降(图1X7C)。即使在此极高的剂量下，原始细胞似乎具有最低限度的毒性至无毒性。
实施例8
透皮原始细胞扩散
方法：使用标准原始细胞制剂(DOPC(Tm＝-20℃)55重量％、胆固醇30重量％、DOPE-PEG15重量％)并将它们暴露于皮肤样品，所述皮肤样品中角质层保持完整和角质层被除去。使用ICP质谱分析。
从皮肤除去脂肪组织，并将它们切成0.64cm x0.64cm正方形。然后将皮肤放置于Fraz扩散池上并允许平衡45分钟。在平衡后，除去扩散缓冲液并使用干净的扩散缓冲液置换。再次允许皮肤平衡45分钟。将8.125mg(650ul)原始细胞添加至电池帽中。24小时后，收集电池帽中的流体。然后将皮肤吸干并洗涤。也收集受体流体。使用ICP质谱分析皮肤和受体。三份样品的SC保持完整并且使用胶带除去另外三份样品的SC。对照为SC除去和完整、经0.5X PBS处理的皮肤样品。上文的数据显示从各样品获得的容器流体的ICP质谱结果。在2011.10.27对容器流体进行ICP。平均该数据并测定标准差。
图1X8、2X8、3X8。测定供体帽样品的ICP质谱。图4X8。
初步数据表明小部分的原始细胞能够扩散通过全层和断层皮肤两者，表明原始细胞表面修饰可影响皮肤的渗透性和随后的原始细胞通过皮肤扩散。
为了确认一种快速定量扩散通过皮肤的原始细胞的量的方法，制得经Alexa Fluor 633荧光标记的SiO2核。荧光光谱法用于测定容器流体中SiO2的浓度。这也可延伸用于测定电池供体帽中剩余的SiO2的量。参见图6X8、7X8、8X8、9X8。
图5X8中显示了核功能化。
阳性对照显示当利用皮肤自发荧光时，可将皮肤中荧光标记的颗粒成像。图10X8。
实施例9
透皮SiO2纳米颗粒
荧光计设置
强度单位＝计数/秒
激发：632nm
发射扫描：644nm-650nm；*647nm计算所有值*
步长＝1nm
狭缝＝2nm
积分时间＝1秒
ASOC进样频率＝0.2kHz
假设和已知变量：
-使用含有染料:NH2-二氧化硅为10ug:1mg的Dylight 633荧光标记所有颗粒
-Dylight 633的最大发射为647nm，最大激发为632nm
-所有空白取自由容器流体组成的相同的储备液，因此值为平均值
-各样品最少运行3次,最大运行9次。
-在每次运行前混合样品。
·所有误差棒表示95％置信区间；然后计算标准平均偏差用于计算标准误差并乘以1.96得到95％置信度。
·从对照容器使用24小时容器流体生成标准曲线(S1表示)
·标准曲线自0.16mg/ml起始，以1:2稀释至1.953125E-5mg/ml
·标准曲线遵循2次多项式方式(R2>0.99)，然后可使用该曲线在相关浓度范围的线性部分应用线性回归分析(R2>0.93)；以Log FI均值vs.Log[SiO2]绘制标准曲线
·皮肤在自发荧光中展示高度异质性，因此在于供体帽中施用原始细胞前取0小时样品，并在24小时空白(S1)之间确立自发荧光的差异。
·然后将该差异从0小时样品加上或减去得到校正值从而将所有其余容器流体(S2-S9)标准化至对照(S1)。
·在0、4和24小时时间点，从校正的平均荧光强度，使用曲线线性部分的方程计算未知浓度。
·从4和24小时时间点减去0小时时间点获得的浓度以测定容器中实际的SiO2含量。
在所有实验中使用改良的Franz扩散池。在除去皮下组织后，将所捐赠的腹部皮肤切成～2cm2片，并放置于5.1ml容器上，同时避免气泡的形成并允许平衡60分钟。将容器流体保持于37℃。在60分钟后，除去皮肤，替换容器流体并允许皮肤再平衡30分钟。在30分钟后，取0小时样品(～400ul)并用新鲜扩散缓冲液替换。施用多种原始细胞制剂(500μl，16mg/ml，于0.5XPBS中)，各制剂n＝4。从各实验获得的1块皮肤(S1)经0.5X PBS处理。使用S1 24小时容器流体的1:2稀释液在浓度范围为0.16mg/ml–1.953125E-5mg/ml内生成标准曲线。所有标准曲线遵循相同的一般的2次多项式趋势，并以Log vs.Log尺度绘图。红线表示95％置信度的平均空白值(S124小时)。图1X9。
结合荧光光谱法进行的线性回归分析用于辨别在4小时和24小时时间点各容器中的未知浓度。将线性趋势线应用至相关浓度/强度范围以获得具有y＝mx+b；所有R2>0.9300形式的方程。溶解10x以获得0、4和24小时时间点的各浓度。然后将该值乘以5.1以得到各时间点SiO2的总mg。通过减去0小时样品所获得的值得到最终量。图2X9。
研究具有9种不同双层制剂的PC和具有无支撑的脂质双层(SLB)的SiO2核。SLB油包水型SiO2核显示具有最大方差的最高荧光强度，然而，因为这些是在0.5X PBS中施用的，所看见的强度很可能是由于溶解事件而不是完整的核。含有30重量％胆固醇的DOPC原始细胞显示具有最小变异的最一致的扩散，随后是含有30重量％的DSPC原始细胞。含有25重量％DOPE、30重量％胆固醇和45重量％DOPC的原始细胞显示在24小时时间点μg量的SiO2。最后，含有25重量％DOPE、30重量％胆固醇、30重量％DOPC和15重量％PEG的原始细胞显示较DOPC/胆固醇配制的PC透皮扩散显著增加，但各样品的统计方差较高。结果表明SLB制剂可极大地影响透皮扩散。此外，关于含有PEG的制剂，观测到有趣的趋势。图3X9。
与DSPC(Tm＝55)/胆固醇原始细胞相比，在24小时时间点，DOPC(Tm＝-20)/胆固醇原始细胞显示约双倍量的SiO2。这与脂质体文献一致，该文献表明具有较低转变温度的脂质较深的扩散进入全层皮肤，而具有较高转变温度的脂质仍局限于角质层。向DOPC/胆固醇和DSPC/胆固醇制剂添加PEG显著地降低了透皮扩散。PEG，一种亲水聚合物，此前已被用作穿透促进剂。我猜测降低的扩散是由于细胞间片层的水性部分的相互作用不会破坏细胞间结构并因此妨碍扩散所致。将DOPE引入DOPC PC制剂显示较其它测试制剂增加的扩散(宝贵的玻片)。添加DOPE和PEG显示透皮扩散显著增加(具有高统计方差)，表明乙醇胺和PEG的组合可有利地增加透皮扩散。将使用DSC、小角XRD、共聚焦显微镜和可能的FTIR进一步研究该趋势。图4X9。
图5X9和6X9显示在校正的平均荧光强度单独的增加为时间的函数。在所有图中，S1表示在0、4和24小时时间点的空白值。在板上空白的自发荧光可变，并且仍～相同或随着时间增加至“24小时空白值”。一些文献表明容器流体中所见的自发荧光降低是时间的函数，但在此处未观测到。在一些情况中，强度vs.时间的斜率在第一个4小时内更陡，并随时间降低；在其它情况中，第一个4小时的斜率较不显著，并且随时间进展变得更陡，而在一些情况中斜率随时间保持不变。由于皮肤的异质性，这并不令人惊讶。图7X9、8X9和9X9说明了制剂对动力学的影响。
序列
ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)    SEQ ID NO:1
TATFWFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)    SEQ ID NO:2
TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)    SEQ ID NO:3
IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)    SEQ ID NO:4
WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)    SEQ ID NO:5
H2N-SFSIILTPILPL-COOH,SEQ ID NO:6
H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH,SEQ ID NO:7
H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH,SEQ ID NO:8
GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQ-
GGYGGC-COOH,SEQ I.D NO:9,
RRMKWKK,SEQ ID NO:10
PKKKRKV,SEQ ID NO:11
KR[PAATKKAGQA]KKKK,SEQ ID NO:12
H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH,SEQ ID.NO:13
H2N-RRRRRRRR-COOH,SEQ ID NO:14
YLFSVHWPPLKA,SEQ ID NO:15
HAIYPRH肽,SEQ ID NO:16
TPDWLFP,SEQ ID NO:17
TGAILHP,SEQ ID NO:18

Claims (145)

1.靶向细胞的多孔原始细胞，其包含：
具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅或金属氧化物核和至少一种选自以下的其它组分：
靶向细胞的物种；
促进原始细胞内体逃逸的融合肽；和包封的DNA，以及包含至少一种选自以下的负载物组分的其它负载物：双链线性DNA；
质粒DNA；
药物；
显像剂；
小干扰RNA、小发夹RNA、微RNA或它们的混合物；
其中任选地所述负载物组分的一种进一步与核定位序列缀合。
2.权利要求1的原始细胞，其中所述二氧化硅核为球状且直径范围为约10nm至约250nm。
3.权利要求2的原始细胞，其中所述二氧化硅核的平均直径为约150nm。
4.权利要求2或3的原始细胞，其中所述二氧化硅核的粒径分布为单分散或多分散的。
5.权利要求2或3的原始细胞，其中所述二氧化硅核为单分散的。
6.权利要求2或3的原始细胞，其中所述二氧化硅核为多分散的。
7.权利要求1-6任一项的原始细胞，其中所述脂质双层由选自以下的脂质组成：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和它们的混合物。
8.权利要求1-7任一项的原始细胞，其中所述脂质双层包括DOPC和DOPE的组合。
9.权利要求1-7任一项的原始细胞，其中所述脂质双层包括DOTAP、DOPG、DOPC或它们的混合物。
10.权利要求1-7任一项的原始细胞，其中所述脂质双层包括DOPG和DOPC。
11.权利要求8-10任一项的原始细胞，其中所述脂质双层还包括胆固醇。
12.权利要求1-7任一项的原始细胞，其中所述脂质双层包括DOPC与约5重量％DOPE、约30重量％胆固醇和约10重量％PEG-2000PE(18:1)的组合。
13.权利要求1-7任一项的原始细胞，其中脂质双层包括约5重量％DOPE、约5重量％PEG、约30重量％胆固醇、约60重量％DOPC和/或DPPC。
14.权利要求13的原始细胞，其中所述PEG与所述DOPE缀合。
15.权利要求1-14任一项的原始细胞，其中所述靶向物种为靶向肽。
16.权利要求15的原始细胞，其中所述靶向肽为SP94肽。
17.权利要求16的原始细胞，其中所述靶向肽为SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8。
18.权利要求15的原始细胞，其中所述靶向肽为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ I.D.NO:3、SEQ I.D.No.4或SEQ ID NO:5的MET结合肽。
19.权利要求1-18任一项的原始细胞，其中所述促融合蛋白为H5WYG肽(SEQ ID NO:13)或八体聚精氨酸(SEQ ID NO:14)。
20.权利要求19的原始细胞，其中所述融合肽为SEQ ID NO:13。
21.权利要求1-20的原始细胞，其包含质粒DNA，其中所述质粒DNA任选经修饰以表达核定位序列。
22.权利要求21的原始细胞，其中所述质粒DNA为超螺旋的或封装的质粒DNA。
23.权利要求22的原始细胞，其中所述DNA为超螺旋的且封装的质粒DNA。
24.权利要求20-23任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA任选经修饰以表达核定位序列。
25.权利要求21-24任一项的原始细胞，其中所述DNA为组蛋白封装的超螺旋质粒DNA，其包括人组蛋白的混合物。
26.权利要求25的原始细胞，其中所述组蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4组成。
27.权利要求25的原始细胞，其中所述组蛋白混合物为重量比为1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。
28.权利要求1-27任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达多肽毒素、小发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
29.权利要求28的原始细胞，其中所述多肽毒素选自蓖麻毒素A链或白喉毒素A链。
30.权利要求1或28的原始细胞，其中所述shRNA或所述siRNA诱导细胞凋亡。
31.权利要求1-30任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达报告蛋白。
32.权利要求31的原始细胞，其中所述报告蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
33.权利要求1-32任一项的原始细胞，其中所述核定位序列为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的肽。
34.权利要求1-33任一项的原始细胞，其中所述核定位序列为SEQ IDNO:9的肽。
35.权利要求1-34任一项的原始细胞，其还包含抗癌剂作为药物。
36.权利要求35的原始细胞，其中所述抗癌剂为依维莫司、曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林)、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGFtrap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、batabulin、奥法木单抗、扎木单抗、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(Bu t)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼(Ionafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib)；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺一羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、无氢化蓖麻油的紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀、阿法达贝泊汀或它们的混合物。
37.权利要求1-36任一项的原始细胞，其中所述药物包括抗病毒剂。
38.权利要求37的原始细胞，其中所述抗病毒剂为抗HIV剂、抗HBV剂或抗HCV剂。
39.原始细胞，其包括具有受支撑的脂质双层的纳米多孔二氧化硅核和SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID.NO:4或SEQ ID NO:5的MET结合肽。
40.权利要求31的原始细胞，其中所述MET结合肽为SEQ ID NO:1的肽。
41.权利要求39或40的原始细胞，其中所述MET结合肽与所述脂质双层缀合。
42.权利要求39-41任一项的原始细胞，其中所述原始细胞还包括至少一种选自以下的组分：促进原始细胞内体逃逸的融合肽和包封的DNA；质粒DNA；双链线性DNA、药物；显像剂、小干扰RNA、小发夹RNA和微RNA，其中所述质粒DNA、所述药物、所述显像剂和/或所述RNA进一步与核定位序列缀合。
43.权利要求42的原始细胞，其中所述药物包括至少一种抗癌剂。
44.权利要求43的原始细胞，其中所述抗癌剂选自：依维莫司、曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGF trap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、batabulin、奥法木单抗、扎木单抗、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1 KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(Bu t)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺一羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、无氢化蓖麻油的紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀、阿法达贝泊汀或它们的混合物。
45.权利要求39-45任一项的原始细胞，其中所述药物包括至少一种抗病毒剂。
46.权利要求45的原始细胞，其中所述抗病毒剂为抗HIV剂、抗HBV剂、抗HCV剂或它们的混合物。
47.权利要求39-46任一项的原始细胞，其中所述DNA能够表达至少一种报告分子。
48.权利要求39-47的原始细胞包含质粒DNA，其中所述质粒DNA任选经修饰以表达核定位序列。
49.权利要求48的原始细胞，其中所述DNA为超螺旋的或封装的质粒DNA。
50.权利要求49的原始细胞，其中所述DNA为超螺旋的且封装的质粒DNA。
51.权利要求48-51任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA任选经修饰以表达核定位序列。
52.权利要求47-51任一项的原始细胞，其中所述DNA为组蛋白封装的超螺旋质粒DNA，其包括人组蛋白的混合物。
53.权利要求52的原始细胞，其中所述组蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4组成。
54.权利要求53的原始细胞，其中所述组蛋白混合物为重量比为1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。
55.权利要求48-54任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达多肽毒素、小发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
56.权利要求55的原始细胞，其中所述多肽毒素选自蓖麻毒素A链或白喉毒素A链。
57.权利要求55的原始细胞，其中所述shRNA或所述siRNA诱导细胞凋亡。
58.权利要求48-57任一项的原始细胞，其中所述质粒DNA能够表达报告蛋白。
59.权利要求58的原始细胞，其中所述报告蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
60.权利要求39-59任一项的原始细胞，其中所述核定位序列为SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的肽。
61.权利要求60的原始细胞，其中所述核定位序列为SEQ ID NO:9的肽。
62.药物组合物，其包含有效引起治疗作用的量的原始细胞群体和药学上可接受的载体/添加剂或赋形剂。
63.权利要求62的组合物，其还包含不被处理为原始细胞内的负载物的药物。
64.权利要求63的组合物，其中所述抗药物为抗癌剂或抗病毒剂。
65.权利要求64的组合物，其中所述抗病毒剂为抗HIV剂、抗HBV剂、抗HCV剂或它们的混合物。
66.权利要求62-65任一项的组合物为胃肠外剂型。
67.权利要求66的组合物，其中所述剂型为皮内剂型、肌肉内剂型、骨内剂型、腹膜内剂型、静脉内剂型、皮下剂型或鞘内剂型。
68.权利要求62-65任一项的组合物为局部或透皮剂型。
69.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID.NO:4或SEQID NO:5的MET结合肽。
70.权利要求69的MET结合肽为SEQ ID NO:1。
71.药物组合物，其包含权利要求69或70的MET结合肽。
72.药物组合物，其包含原始细胞群体，所述原始细胞群体包含靶向肽从而所述原始细胞与抗癌剂和抗HBV剂和抗HCV剂或它们的混合物的组合选择性地结合肝细胞癌细胞。
73.权利要求72的组合物，其中所述靶向肽选自SP94肽、MET结合肽或它们的混合物。
74.权利要求72的组合物，其中所述抗癌剂为多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、贝伐珠单抗、特罗凯(厄洛替尼)、泰克泊(拉帕替尼)或它们的混合物。
75.权利要求72至74任一项的组合物，其中所述抗HBV剂为贺维力(阿德福韦二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨、克来夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韦、racivir、BAM 205、硝唑尼特、UT 231-B、Bay 41-4109、EHT899、日达仙(胸腺肽α-1)或它们的混合物。
76.权利要求72至75任一项的组合物，其中所述抗HCV剂为波普瑞韦、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100、NM 283、VX-950(替拉瑞韦)、SCH 50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI 5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS 9190、GS 9256、GS 9451、GS 5885、GS 6620、GS 9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI 201335、BI 207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PSI-938、PSI-7977、PSI-7851、SCY-635、利巴韦林、PEG化干扰素、PHX1766、SP-30或它们的混合物。
77.治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的包含权利要求1-61任一项的原始细胞群体的组合物，所述原始细胞适应于递送抗癌剂至所述患者的癌细胞。
78.治疗肝细胞癌的方法，其包括向所述患者给予有效量的权利要求72-76任一项的组合物。
79.治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的权利要求1-61任一项的原始细胞群体，其中所述DNA质粒为超螺旋的并且适应于表达抗癌多肽和/或RNA，任选与有效量的被配制作为所述原始细胞内的负载物的其它抗癌剂组合。
80.权利要求79的方法，其中所述抗癌多肽选自蓖麻毒素A链或白喉毒素A链。
81.权利要求79或80的方法，其中所述RNA为诱导细胞凋亡的shRNA或siRNA。
82.权利要求79-81任一项的方法，其中所述siRNA选自s565、s7824或s10234。
83.权利要求81的方法，其中所述shRNA为诱导细胞死亡的细胞周期蛋白B1特异性shRNA。
84.权利要求79-84任一项的方法，其中所述抗癌剂选自：依维莫司、曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGFtrap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、batabulin、奥法木单抗、扎木单抗、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1 KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、多柔比星脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(Bu t)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺一羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、无氢化蓖麻油的紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀、阿法达贝泊汀和它们的混合物。
85.权利要求74-84任一项的方法，其中所述原始细胞或所述原始细胞外的组合物还包含抗病毒剂。
86.权利要求85的方法，其中所述抗病毒剂为抗HBV剂或抗HCV剂。
87.治疗患者癌症的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的权利要求62-76任一项的组合物。
88.权利要求87任一项的方法，其中所述癌症为鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌(结肠直肠癌)、食管癌、头部癌症、肾癌、肝癌(肝细胞癌)、肺癌、鼻咽癌、颈部癌症、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神经上皮样瘤、滑膜肉瘤；胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节瘤、神经节神经胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体细胞肿瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、混合型小细胞和非小细胞癌、胸膜间皮瘤、胸膜间皮瘤、睾丸癌、甲状腺癌和星形细胞瘤。
89.在有癌症风险的患者中诊断癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予包含权利要求1-61任一项的原始细胞群体的药物组合物，所述原始细胞包含适应于选择性结合癌细胞并递送所述原始细胞至所述细胞的靶向肽，其中所述原始细胞包含适应于表达报告分子并任选地包含其它报告分子的质粒DNA，如果存在癌细胞，所述原始细胞与癌细胞在所述患者中结合后释放所述报告分子至所述癌细胞，并且所述报告分子将诱出可与标准相比的信号以测定所述患者是否患有癌症，和如果患有癌症，所述癌症的程度和/或癌性肿瘤的大小。
90.在患者中监测癌症治疗的方法，所述方法包括向所述患者给予权利要求1-61任一项的原始细胞群体，所述原始细胞包含适应于选择性结合癌细胞并递送所述原始细胞至所述细胞的靶向肽，其中所述原始细胞包含适应于表达报告分子并任选地包含其它报告分子的质粒DNA，所述原始细胞与癌细胞在所述患者中结合后将释放所述报告分子至所述癌细胞中，并且所述报告分子将在治疗开始时和治疗过程中的不同间隔诱出可与标准相比的信号以测定所述患者是否对治疗应答，并且如果应答，测定对治疗的应答程度。
91.透皮原始细胞，其包含以下大量多孔纳米颗粒，所述多孔纳米颗粒：(a)装载有一种或多种药学活性剂和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，其中所述脂质双层包含一种或多种选自以下的角质层通透性促进剂：单饱和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶剂、共溶剂、R8肽和膜软化剂，其中所述原始细胞的平均直径为约50nm至约300nm。
92.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述单饱和ω-9脂肪酸选自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神经酸，最优选油酸，和它们的混合物。
93.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它们的混合物，且所述溶剂和共溶剂选自PEG400和DMSO。
94.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述二醇选自乙二醇和聚乙二醇和其混合物。
95.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述膜软化剂可选自胆盐、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、单链表面活性剂，以及它们的混合物。
96.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述膜软化剂为去氧胆酸钠。
97.权利要求92的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约50nm至约300nm。
98.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约55nm至约270nm。
99.权利要求92的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约60nm至约240nm。
100.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约210nm。
101.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约190nm。
102.权利要求92的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约160nm。
103.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约130nm。
104.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约100nm。
105.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约90nm。
106.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径更优选地为约65nm至约80nm。
107.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约75nm。
108.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约66、67、68、69、70、71、72、73、74或75nm。
109.权利要求91的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的平均直径为约70nm。
110.权利要求91-109的透皮原始细胞，其中(a)所述纳米颗粒由一种或多种选自以下的组分组成：二氧化硅、可生物降解的聚合物、溶胶、金属和金属氧化物；和(b)所述原始细胞包含至少一种抗癌剂。
111.权利要求91-109的透皮原始细胞，其中(a)所述纳米颗粒由一种或多种选自以下的组分组成：二氧化硅、可生物降解的聚合物、溶胶、金属和金属氧化物；和(b)所述原始细胞包含至少一种选自以下的抗癌剂：依维莫司、曲贝替定、白蛋白结合型紫杉醇、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGFtrap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、batabulin、奥法木单抗、扎木单抗、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、多柔比星脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(Bu t)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺一羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、无氢化蓖麻油的紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀、阿法达贝泊汀和其混合物。
112.透皮原始细胞，其包含大量多孔纳米颗粒，所述多孔纳米颗粒为：(a)装载有药学有效量的伊马替尼的多孔纳米颗粒和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层的多孔纳米颗粒，其中所述脂质双层包含一种或多种选自以下的角质层通透性促进剂：PEG 400、DMSO和乙醇，以及它们的混合物，且其中所述原始细胞的平均直径为约65nm至约66、67、68、69、70、71、72、73、74或75nm。
113.权利要求112的透皮原始细胞，其中所述原始细胞的伊马替尼的平均通量为约0.20至约0.30μg/cm2hr。
114.权利要求113的原始细胞，其中所述脂质双层由选自以下的脂质组成：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物。
115.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者透皮给予药学有效量的权利要求110-114的原始细胞。
116.治疗患有一种或多种选自慢性髓细胞性白血病、胃肠道间质瘤和急性淋巴细胞性白血病嗜酸粒细胞增多症(HES)的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者透皮给予药学有效量的权利要求112-114的原始细胞。
117.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者透皮给予药学有效量的权利要求111的原始细胞。
118.透皮药物组合物，其包含药学有效量的权利要求91-109、112、113和114的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
119.透皮药物组合物，其包含药学有效量的权利要求110的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
120.透皮药物组合物，其包含药学有效量的权利要求111的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
121.原始细胞，其包含大量经含胺的硅烷(AEPTMS)修饰的带负电荷的、纳米多孔、纳米颗粒的二氧化硅核，并且所述二氧化硅核(a)装载有siRNA或蓖麻毒素A链和(b)被脂质双层包封并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBDPC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合，其中所述脂质双层包含阳离子脂质和一种或多种两性离子磷脂。
122.权利要求121的原始细胞，其中所述脂质选自1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。
123.权利要求122的原始细胞，其中所述原始细胞具有至少一个以下特征：BET表面积大于约600m2/g、孔体积分数为约60％至约70％、由具有平均直径为约20nm至约30nm的孔组成的多模式孔形态学、通过具有平均直径为5nm至约15nm的孔互相连接的表面可及的孔。
124.权利要求121或122的原始细胞，其中所述原始细胞每1010纳米颗粒二氧化硅核包封约10nM siRNA。
125.原始细胞，其包含大量经含胺硅烷(AEPTMS)修饰的带负电荷的、纳米多孔、纳米颗粒的二氧化硅核，并且所述二氧化硅核
(a)装载有一种或多种靶向周期蛋白超家族成员的siRNA，所述周期蛋白超家族成员选自细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E；且
(b)其被由选自以下的脂质组成的脂质双层包封并支撑由选自以下的脂质组成的脂质双层：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。
且其中(1)所述脂质双层装载有SP94和内体裂解肽，和
(2)所述原始细胞选择性地与肝细胞癌细胞结合。
126.权利要求123的原始细胞，其中所述脂质双层包含大约55:5:30:10质量比的DOPC/DOPE/胆固醇/PEG-2000。
127.治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者给予药学有效量的权利要求121-126的原始细胞。
128.权利要求127的方法，其中所述受试者患有肝癌，并被给予药学有效量的权利要求123-125的原始细胞。
129.药物组合物，其包含药学有效量的权利要求121-126的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
130.原始细胞，其包含大量纳米多孔的、纳米颗粒二氧化硅核，所述二氧化硅核：(a)装载有诱导Niv核壳体蛋白(NiV-N)mRNA序列特异性降解的siRNA，和(b)包封于脂质双层并支撑脂质双层，所述脂质双层包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBDPC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。
131.权利要求130的原始细胞，其中所述脂质双层包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、纳米颗粒二氧化硅核(1)各自平均直径为约100nm，平均表面积大于1,000m2/g和平均直径为约20nm至约25nm的表面可及的孔，并且(2)每1010颗粒装载约1μM siRNA或更多。
132.权利要求131的原始细胞，其中所述靶向肽为与ephrin B2(EB2)结合的肽。
133.权利要求132的原始细胞，其中所述靶向肽为TGAILHP(SEQ IDNO:18)。
134.权利要求133的原始细胞，其中所述原始细胞包含约0.01至约0.02重量的TGAILHP(SEQ ID NO:18)、约10重量％的PEG-2000和约0.500重量％的R8。
135.治疗已经被Nipah病毒(NiV)感染或具有被Nipah病毒(NiV)感染风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予药学有效量的权利要求130-134的原始细胞。
136.药物组合物，其包含药学有效量的权利要求130-134的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
137.原始细胞，其包含大量带负电荷的、纳米多孔、纳米颗粒二氧化硅核，所述二氧化硅核：
(a)经选自以下的含胺硅烷修饰：(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自经硅原子功能化；(2)单胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)；(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)；(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)质子化仲胺、质子化叔烷基胺、质子化脒、质子化胍、质子化吡啶、质子化嘧啶、质子化吡嗪、质子化嘌呤、质子化咪唑、质子化吡咯、季烷基胺或其组合；
(b)装载有siRNA或蓖麻毒素A链；和
(c)被包含选自以下的脂质的脂质双层包封并支撑包含选自以下的脂质的脂质双层：
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合，且其中所述脂质双层包括阳离子质子和一种或多种两性离子磷脂。
138.权利要求137的原始细胞，其中所述脂质选自1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。
139.权利要求138的原始细胞，其中所述原始细胞具有至少一个以下特征：BET表面积大于约600m2/g、孔体积分数为约60％至约70％、由具有平均直径为约20nm至约30nm的孔组成的多模式孔形态学、通过具有平均直径为5nm至约15nm的孔互相连接的表面可及的孔。
140.权利要求138或139的原始细胞，其中所述原始细胞每1010纳米颗粒二氧化硅核包封约10nM siRNA。
141.原始细胞，其包含大量带负电荷的、纳米多孔、纳米颗粒二氧化硅核，所述二氧化硅核：
(a)经选自以下的含胺硅烷修饰：(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自经硅原子功能化；(2)单胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)；(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)；(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)质子化仲胺、质子化叔烷基胺、质子化脒、质子化胍、质子化吡啶、质子化嘧啶、质子化吡嗪、质子化嘌呤、质子化咪唑、质子化吡咯、季烷基胺或其组合；
(b)装载有一种或多种靶向周期蛋白超家族成员的siRNA，所述周期蛋白超家族成员选自细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E；且
(c)其被由选自以下的脂质组成的脂质双层包封并支撑由选自以下的脂质组成的脂质双层：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)、胆固醇和其混合物/组合。
且其中(1)所述脂质双层装载有SP94和内体裂解肽；和(2)所述原始细胞选择性地与肝细胞癌细胞结合。
142.权利要求141的原始细胞，其中所述脂质双层包含大约55:5:30:10质量比的DOPC/DOPE/胆固醇/PEG-2000。
143.治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者给予药学有效量的权利要求137-142的原始细胞。
144.权利要求143的方法，其中所述受试者患有肝癌，并被给予药学有效量的权利要求141或142的原始细胞。
145.药物组合物，其包含药学有效量的权利要求137-142的原始细胞，和任选地药学上可接受的赋形剂。
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