IT201900001009A1 - Vettore nanoporoso biomimetico comprendente un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 - Google Patents
Vettore nanoporoso biomimetico comprendente un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 Download PDFInfo
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Description
“Vettore nanoporoso biomimetico comprendente un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2”
DESCRIZIONE
CAMPO TECNICO
La presente invenzione si riferisce al campo delle terapie antitumorali e, in particolare, nell’ambito della nanomedicina, all’utilizzo di nanoparticelle biomimetiche per trasportare almeno un farmaco per effettuare terapia di combinazione in maniera mirata (targeted) ed aumentare l’efficacia di risposta alla terapia nelle principali forme tumorali.
Specificamente, la presente invenzione riguarda un sistema farmacologico in grado di somministrare in modo adeguato almeno uno dei farmaci usati in sinergia e inducenti la letalità sintetica su cellule cancerose.
STATO DELL'ARTE
Negli ultimi anni vi è stato un notevole progresso nel campo delle terapie antitumorali soprattutto grazie all’introduzione di terapie mirate e dell’immunoterapia.
Tuttavia, tutti questi avanzamenti continuano a risentire di problematiche legate all’individualizzazione della terapia, alle reazioni avverse, agli effetti collaterali sulla salute del paziente ed alla resistenza sviluppata dalle cellule tumorali nei confronti dei farmaci impiegati.
Nello specifico di alcune strategie terapeutiche, è noto che il sistema ubiquitinaproteasoma (SUP) abbia un ruolo cruciale nella degradazione delle proteine, regolando processi chiave per la crescita e sopravvivenza cellulare.
Le cellule tumorali sono più suscettibili di quelle sane agli effetti citotossici dati dall’inibizione del SUP, pertanto gli inibitori del proteasoma (IP) sono impiegati come antitumorali.
Ad oggi tre IP - Carfilzomib (CFZ), Bortezomib e Ixazomib - sono usati di routine in protocolli clinici per trattare il mieloma multiplo (MM) e il linfoma mantellare (MCL). Le conseguenze pleiotropiche di inibizione del SUP presentano effetti additivi e sinergici con altri agenti terapeutici, ma le ricadute e le progressioni della malattia sono frequenti in pazienti affetti da MM a causa della resistenza innata o acquisita ai farmaci usati.
Inoltre, nonostante il buon controllo in assetto clinico, gli IP mostrano una tossicità acuta che ne limita il dosaggio di somministrazione e l’applicazione in altri tumori ematologici e solidi.
Questo problema è costantemente affrontato sia in clinica che nella ricerca sperimentale attraverso studi genetici e/o genomici, di diagnosi precoce e con la ricerca di nuovi metodi antineoplastici in grado, per esempio, di associare approcci diversi, di per sé sicuri ma poco efficaci, la cui combinazione possa esercitare un effetto antitumorale.
Nello specifico, la letteratura scientifica ha identificato nuove terapie di combinazione per superare la resistenza agli IP (Robak P, Drozdz I, Szemraj J, Robak T. Drug resistance in multiple myeloma. Cancer Treat Rev. 2018;70:199-208) e ampliarne l’applicazione ad altre neoplasie sia ematologiche sia solide; esempi di tale letteratura scientifica sono Cloos J, Roeten MS, Franke NE, et al. (Immuno)proteasomes as therapeutic target in acute leukemia. Cancer Metastasis Rev. 2017;36:599–615.
Huang Z, Wu Y, Zhou X, et al. Efficacy of therapy with bortezomib in solid tumors: a review based on 32 clinical trials. Future Oncol. 2014;10:1795–807.
In questa prospettiva la letalità sintetica (LS) rappresenta un approccio sofisticato e mirato che sfrutta dipendenze specifiche delle cellule tumorali. La letalità sintetica è l’interazione tra due geni coessenziali la cui singola inibizione mantiene la cellula in vita, ma la cui inibizione congiunta produce morte cellulare. Il fenomeno di letalità sintetica è già sfruttato clinicamente: esempi dello sfruttamento clinico della letalità sintetica sono riportati in O'Neil NJ, Bailey ML, Hieter P. Synthetic lethality and cancer. Nat Rev Genet. 2017 Oct;18(10):613-623 e in Lord CJ, Ashworth A. PARP inhibitors: Synthetic lethality in the clinic. Science. 2017 Mar 17;355(6330):1152-1158.
Tuttavia l’efficacia della combinazione può essere limitata in taluni casi dalla ridotta biodisponibilità e dall’idrofobicità delle molecole usate.
Pertanto, è sentita l’esigenza di individuare terapie mirate (targeted) e veicoli intelligenti e nanometrici per trasportare tali farmaci e aumentare l’efficacia di risposta alla terapia di letalità sintetica.
Ad oggi è possibile realizzare nanoparticelle (NP) per veicolare farmaci poco biodisponibili e direzionare queste NP contro le cellule bersaglio, sfruttando specifiche molecole di riconoscimento. Tali NP possono diventare “proiettili di LS” capaci di incorporare agenti antitumorali, veicolarli al bersaglio e consentirne il rilascio ad elevata efficienza.
Nell’ampia gamma di NP per il rilascio di farmaci (drug-delivery), le silici mesoporose (SM) possiedono un ruolo preponderante grazie alle loro proprietà uniche di altissima area superficiale e porosità, in grado di incorporare in elevata quantità uno o più principi attivi, anche altamente idrofobici.
Le SM, già ampiamente riportate in letteratura da pubblicazioni e brevetti, sono di facile produzione in dimensioni altamente uniformi, presentano eccellente biocompatibilità ed elevata percentuale di internalizzazione in cellula; esempi di tale letteratura sono: 1) Durfee PN, Lin YS, Dunphy DR, Muñiz AJ, Butler KS, Humphrey KR, Lokke AJ, Agola JO, Chou SS, Chen IM, Wharton W, Townson JL, Willman CL, Brinker CJ “Mesoporous Silica Nanoparticle-Supported Lipid Bilayers (Protocells) for Active Targeting and Delivery to Individual Leukemia Cells”ACS Nano 2016 27; 10(9), 8325-8345;
2) J. Shen, et al. “The use of hollow mesoporous silica nanospheres to encapsulate bortezomib and improve efficacy for non-small cell lung cancer therapy” Biomaterials, 2014, 35(1), 316-326;
3) V. Cauda, A. Schlossbauer, J. Kecht, A. Zϋrner, T. Bein “Multiple core-shell functionalized mesoporous silica nanoparticles“ Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(32), 11361-11370
4) V. Cauda, H. Engelke, A. Sauer, D. Arcizet, C. Bräuchle, J. Rädler, T. Bein “Colchicine-loaded lipid bilayer-coated 50 nm mesoporous nanoparticles efficiently induce microtubule depolymerization upon cell uptake” Nano Letters, 2010, 10 (7), 2484–2492.
Le SM possono essere chimicamente modificate con gruppi chimici o macromolecole per favorire una elevata stabilizzazione in fluidi biologici e trattenere il farmaco al loro interno fino al momento del rilascio; in particolare, la domanda di Brevetto Statunitense n. US2017/0232115 (A1) descrive di silici mesoporose (SM) rivestite di doppi strati fosfolipidici (DSL) di origine artificiale (liposomi), dando origine a innovative vescicole liposomali (chiamate dagli inventori “protocells”) ingegnerizzate per il drug-delivery intracellulare e dotate di agenti di targeting.
Inoltre la domanda di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018) descrive ossidi metallici semiconduttori di varia natura rivestiti di doppi strati fosfolipidici (DSL) di origine biologica, derivanti da vescicole extracellulari (VEs), prodotte da cellule o liquidi biologici, e una pluralità di molecole di riconoscimento verso cellule tumorali.
Studi recenti su cellule di MM, anche resistenti a diversi IP, riportati in E. Bergaggio, C. Riganti, G. Garaffo, N. Vitale, E. Mereu, C. Bandini, E. Pellegrino, V. Pullano, P. Omedè, K. Todoerti, L. Cascione, V. Audrito, A. Riccio, A. Rossi, F. Bertoni, Silvia Deaglio, A. Neri, A. Palumbo, R. Piva “IDH2 inhibition enhances proteasome inhibitor responsiveness in hematological malignancies” Blood, 2018 https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-850826 hanno individuato un bersaglio la cui inibizione determina la letalità sintetica. In particolare, un ampio screening genetico tramite short hairpin RNA (shRNA) ha dimostrato la sinergia tra il silenziamento del gene IDH2 (isocitrato deidrogenasi 2), o del suo prodotto proteico tramite il farmaco AGI-6780 (descritto nella domanda di Brevetto Europeo EP2906212A4), e la somministrazione di Carfilzomib (CFZ) quale inibitore del proteasoma (descritto nel Brevetto Statunitense US10098890B2 ed utilizzato in routine clinica).
Tuttavia, né la sola somministrazione di CFZ in vitro su cellule di MM resistenti, né la sola inibizione di IDH2 tramite il farmaco AGI-6780 sono in grado di produrre morte cellulare; al contrario, tale inibizione in compresenza di dosi sub-letali di CFZ produce una citotossicità drammatica (intorno al 90-95%) su cellule MM resistenti all’IP (vedasi https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-850826).
Purtroppo, i farmaci usati (CFZ e AGI-6780) sono altamente idrofobici e poco biodisponibili e, conseguentemente, la loro somministrazione in-vivo su modelli murini o su pazienti risulta estremamente complessa, riducendone gli effetti promettenti fin qui misurati.
Inoltre, come riportato in Brevetto Europeo EP2906212 (A4), finora si è perseguita l’inibizione della forma mutata del gene IDH2, che presenta, come principale inconveniente il poter bersagliare solo quel limitato numero di pazienti tumorali in cui sia accertata la mutazione del gene IDH2 (Molenaar RJ, Maciejewski JP, Wilmink JW, van Noorden CJF. Wild-type and mutated IDH1/2 enzymes and therapy responses. Oncogene. 2018 Apr;37(15):1949-1960)
Un sistema farmacologico in grado di indurre la letalità sintetica su cellule cancerose e ovviare ai problemi di scarsa biodisponibilità dei farmaci usati soddisferebbe le esigenze di numerose applicazioni terapeutiche quali, ad esempio, i trattamenti per il mieloma multiplo, il linfoma mantellare, il linfoma di Burkitt, il linfoma diffuso a grandi cellule B, nonché tumori solidi di varia natura.
La presente invenzione, che riguarda un tale sistema farmacologico, intende rispondere alla suddetta esigenza, risolvendo il problema tecnico di come migliorare la biodisponibilità e la biodistribuzione delle molecole farmacologiche, in modo da ottenere la consegna diretta e mirata del farmaco alle cellule tumorali.
In sintesi dunque, fino al momento attuale, a conoscenza del Richiedente, non sono note soluzioni che permettano di veicolare, tramite un costrutto nanoporoso biomimetico e utilizzare dosaggi minimi di un inibitore di IDH2 in combinazione con un IP, rendendo più preciso, più facile e più efficace il rilascio di farmaco alle cellule tumorali da trattare, senza produrre citotossicità sulle cellule non tumorali dell’organismo.
Pertanto il Richiedente, con il sistema farmacologico secondo la presente invenzione, intende porre rimedio a tale mancanza.
SCOPI E RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
È scopo della presente invenzione superare gli inconvenienti dell’arte nota legati all’impossibilità di utilizzare dosaggi sub-letali di IP in combinazione con inibitori della proteina IHD2.
Inoltre, è scopo della presente invenzione superare gli inconvenienti dell’arte nota legati alle difficoltà di biodisponibilità e di biodistribuzione dei farmaci alle cellule tumorali così da ottenere un trattamento focalizzato.
Tali obiettivi vengono conseguiti con il sistema farmacologico secondo la presente invenzione che, vantaggiosamente e grazie alla presenza di un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 veicolato da un vettore nanoporoso rivestito di strati lipidici autologhi estratti da vescicole extracellulari (VEs) del paziente, consente di usare quantità minime di farmaco in modo efficace, mirato, avvalendosi di un vettore stabile nel tempo e non-immunogenico.
Il sistema farmacologico secondo la presente invenzione per la prima volta, a conoscenza del Richiedente, incorpora almeno uno dei suddetti farmaci CFZ e AGI-6780, ed in particolare AGI-6780, in nanoparticelle altamente porose e biocompatibili rivestite da doppi strati lipidici DSL ottenuti da VEs di origine autologa.
Rispetto alle soluzioni esistenti in cui i due farmaci sono somministrati per vie convenzionali, tali nanocostrutti, qui denominati SM@VEs (Silice Mesoporosa incorporata in Vescicole Extracellulari), possiedono, come vantaggio, il trasporto efficiente senza off-target e perdite incontrollate di farmaco, la protezione e concentrazione del/dei farmaco/i all’interno del nanocostrutto alle dosi minime terapeutiche e il rilascio controllato ed intracellulare di tale/i farmaco/i.
Inoltre, tali nanocostrutti SM@VEs possono essere equipaggiati con anticorpi monoclonali mAb con l’ulteriore vantaggio di poter veicolare e rilasciare il farmaco nel tessuto tumorale di interesse.
Specificamente, i suddetti ed altri scopi e vantaggi dell’invenzione, quali risulteranno dal seguito della descrizione, vengono raggiunti con un sistema farmacologico secondo la rivendicazione l.
Forme di realizzazione preferite e varianti del sistema farmacologico secondo la presente invenzione costituiscono l’oggetto delle rivendicazioni dipendenti.
Resta inteso che tutte le rivendicazioni allegate formano parte integrante della presente descrizione e che ciascuna delle caratteristiche tecniche in esse rivendicata è eventualmente indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione.
Risulterà immediatamente evidente che si potranno apportare a quanto descritto innumerevoli modifiche (per esempio relative a forma, dimensioni, disposizioni e parti con funzionalità equivalenti) senza discostarsi dall’ambito di protezione dell’invenzione come dichiarato nelle rivendicazioni allegate.
Vantaggiosamente, la soluzione tecnica secondo la presente invenzione, che fornisce un sistema farmacologico migliorativo rispetto alle soluzioni note, permette di:
- massimizzare l’efficacia della LS con una formulazione farmacologica veicolata da SM@VEs;
- superare le attuali limitazioni di idrofobicità e bassa biodistribuzione dei due farmaci menzionati;
- aumentare la selettività della LS in caso di nanocostrutti rivestiti (equipaggiati) con mAb o proteine/peptidi idonei;
- procedere verso trial preclinici in vivo con SM@VEs targeted;
- evitare l’insorgenza di aggregazione in fluidi biologici e mancata emocompatibilità dei nanocostrutti, nonché immunogenicità di questi, grazie alla presenza di DSL derivati da VEs autologhe del paziente da trattare;
- utilizzare un nanocostrutto multifunzionale e modulare, nel quale ogni componente sia opportunamente modificabile secondo le esigenze e il tipo di terapia richiesto. Nel dettaglio: le NP porose possono essere modificate nella natura del materiale, dimensioni della NP e diametro dei suoi pori, possono variare i tipi di farmaco incorporati, il tipo di rivestimento lipidico (di derivazione artificiale, naturale o biologica), e l’agente di direzionamento selettivo (proteine, peptidi, anticorpi monoclonali, ecc).
Ulteriori caratteristiche vantaggiose appariranno maggiormente evidenti dalla descrizione seguente di preferite ma non esclusive forme di realizzazione, fornite a puro titolo esemplificativo e non limitativo.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
La presente invenzione verrà descritta qui di seguito mediante alcune forme di realizzazione preferite, fornite a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni allegati. Questi disegni illustrano differenti aspetti ed esempi della presente invenzione e, dove appropriato, strutture, componenti, materiali e/o elementi simili in differenti figure sono indicati da numeri di riferimento simili.
La FIG. 1 è una rappresentazione schematica del sistema farmacologico (1) nel suo complesso secondo la presente invenzione;
la FIG. 2A è un’immagine TEM (Transmission Electron Microscopy, microscopia elettronica a trasmissione) delle nanoparticelle di silici mesoporose (SM) secondo la presente invenzione;
la FIG. 2B è un’immagine STEM (Scanning Transmission Electron Microscopy, microscopia elettronica a trasmissione in scansione) delle nanoparticelle di silici mesoporose (SM) secondo la presente invenzione;
la FIG.3A è un grafico che illustra la curva di distribuzione del diametro idrodinamico medio delle nanoparticelle di silici mesoporose (SM) secondo la presente invenzione misurate tramite la tecnica di “Dynamic Light Scattering” (DLS) e analizzate in etanolo (al 96% vol);
la FIG.3B è un grafico che illustra la curva di distribuzione del diametro idrodinamico delle nanoparticelle di SM secondo la presente invenzione misurate tramite la tecnica DLS in una soluzione acquosa (50% vol acqua bi-distillata microfiltrata e 50 % vol soluzione fisiologica allo 0,9% NaCl);
la FIG. 4A è un grafico che illustra la curva di distribuzione del raggio idrodinamico medio misurato tramite la tecnica DLS di VEs estratte da linfociti B di donatore sano in soluzione acquosa (50% vol acqua bi-distillata microfiltrata e 50 % vol soluzione fisiologica allo 0,9% NaCl);
la FIG. 4B è un grafico, ottenuto mediante la tecnica di “Nanoparticle Tracking Analysis” (NTA), della distribuzione dei diametri e della concentrazione in particelle/ml delle VEs in soluzione fisiologica allo 0,9% NaCl ed estratte da mezzo di coltura per coltivare linfociti B;
la FIG. 5 è un grafico che illustra lo spettro di assorbimento nelle regioni ultravioletta e visibile (UV-Vis) della molecola di inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2, ovvero il farmaco AGI-6780, secondo la presente invenzione;
la FIG. 6 è un grafico che illustra il rilascio nel tempo da silici mesoporose (SM) in assenza di rivestimento lipidico dell’inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2, il farmaco AGI-6780, secondo la presente invenzione, misurandone il picco di assorbimento a 295 nm tramite spettroscopia UV-Vis nel tempo;
le FIGG. 7A, 7B e 7C sono immagini che mostrano una prima osservazione con il microscopio a fluorescenza dell’accoppiamento tra le nanoparticelle di silici mesoporose (SM) con vescicole extracellulari (VEs) da siero fetale bovino (FBS); in particolare, la FIG. 7A mostra il canale verde in cui sono si possono osservare le VEs estratte da FBS e colorate con colorante DiO; la FIG.7B è un’immagine del canale rosso che mostra le nanoparticelle di SM colorate, tramite legame covalente, con colorante Atto633; la FIG. 7C è un’immagine che mostra la sovrapposizione delle due figure precedenti FIGG. 7A e 7B a dimostrare che esiste una co-localizzazione delle SM con le VEs e dimostrarne quindi l’avvenuto accoppiamento;
le FIGG. 8A, 8B e 8C sono immagini che mostrano una prima osservazione con il microscopio a fluorescenza dell’accoppiamento tra le nanoparticelle di silici mesoporose (SM) e vescicole extracellulari (VEs) da cellule linfociti B da donatore sano; in particolare, la FIG. 8A mostra il canale verde in cui sono si possono osservare le vescicole extracellulari (VEs), estratte da cellule linfociti B da donatore sano, colorate con colorante DiO; la FIG. 8B è un’immagine del canale rosso che mostra le nanoparticelle di silici mesoporose (SM) colorate con colorante Atto633; la FIG. 8C è un’immagine che mostra la sovrapposizione delle due figure precedenti a dimostrare che esiste una co-localizzazione delle SM con le VEs e dimostrarne quindi l’avvenuto accoppiamento;
la FIG. 9A è un’immagine TEM (Transmission Electron Microscopy, microscopia elettronica a trasmissione) ad 80kV delle SM@VEs, ossia delle nanoparticelle di silice mesoporosa (SM) rivestite dai lipidi delle vescicole extracellulari (VEs) estratte da cellule di linfociti B, secondo la presente invenzione;
la FIG. 9B è un’altra immagine TEM ad 80kV e delle SM@VEs, secondo la presente invenzione;
la FIG. 9C è un’ulteriore immagine TEM ad 80kV delle SM@VEs, secondo la presente invenzione;
la FIG.10A è un grafico che illustra il rilascio dell’inibitore diretto verso la forma nativa del gene IDH2 dalle nanoparticelle di SM rivestite con VEs estratte da cellule di linfociti B (SM@VEs). In particolare, nel periodo da 0 a 50 ore non è presente alcun tipo di rilascio dell’inibitore AGI-6780 in quanto questo è sigillato all’interno dei pori delle SM grazie al rivestimento lipidico derivato da VEs. Dopo 50 ore viene aggiunto alla soluzione un tensioattivo (Triton X-100) in grado di destabilizzare tale doppio strato lipidico di VEs e permettere quindi il rilascio dell’inibitore;
la FIG.10B è un grafico che illustra un ingrandimento della curva riportata in FIG.10A a mostrare il profilo di rilascio dell’inibitore (AGI-6780) dalle nanoparticelle di SM@VEs in seguito all’aggiunta di tensioattivo Triton X-100; tale tensioattivo, distrugge la membrana doppio strato lipidica delle VEs e permette la fuoriuscita rapida dai pori delle nanoparticelle SM dell’inibitore, AGI-6780, diretto verso la forma nativa del gene IDH2;
la FIG. 11A è un istogramma che illustra la vitalità della linea cellulare di mieloma multiplo resistente agli inibitori del proteasoma KMM1<PIR >trattata con 2,5 nM CFZ, 10 μM AGI-6780 o una combinazione dei due farmaci. La vitalità è stata misurata attraverso colorazione con TMRM e analisi al citofluorimetro 96 ore dopo il trattamento (hpt). I dati mostrano la media ± s.d. di 4 esperimenti indipendenti (**P<.01; ***P<.001);
la FIG. 11B è un istogramma che illustra la vitalità della linea cellulare di mieloma multiplo resistente a concentrazioni molto elevate di inibitori del proteasoma U266<PIR50 >trattata con 75 nM CFZ, 10 μM AGI-6780 o una combinazione dei due farmaci. La vitalità è stata misurata attraverso colorazione con TMRM e analisi al citofluorimetro 96 ore dopo il trattamento (hpt). I dati mostrano la media ± s.d. di 4 esperimenti indipendenti (***P<.001);
la FIG. 12 è un istogramma che illustra la vitalità di 8 linee cellulari di mieloma multiplo e della linea di leucemia mieloide cronica K562. Le cellule sono state trattate con DMSO, CFZ (1,67 nM CFZ per la linea cellulare KMS-18; 2,5 nM per le RPMI-8226, KMS-27, SK-MM-1 e CMA-03; 5 nM per le KMM-1, U266 e NCI-H929), 5 μM AGI-6780 (2,5 μM per le RPMI-8226) o una combinazione dei due farmaci. I trattamenti sono stati ripetuti ogni 48h con l’AGI-6780 e solo al giorno 0 con il CFZ. La vitalità è stata misurata attraverso colorazione con TMRM e analisi al citofluorimetro 8 giorni dopo il trattamento (dpt). I dati mostrano la media ± s.d. di 3 esperimenti indipendenti (*P<.05; **P<.01; ***P<.001; #P≥.05); e
la FIG. 13 è un istogramma che illustra la vitalità di cellule ottenute da buffy coat provenienti da aspirati di midollo osseo di pazienti con MM e mantenute ex-vivo su uno stato di cellule stromali (HS-5). Le cellule sono state trattate con CFZ (2,5 nM) in combinazione o non con AGI-6780 (5 μM). La vitalità cellulare è stata valutata al citofluorimetro misurando le cellule annessina V<- >e CD138<+ >96 ore dopo il trattamento. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di cellule vitali normalizzata rispetto alle cellule trattate con il DMSO. I dati mostrano la media ± s.e.m. di 9 pazienti con MM (**P<.01; ***P<.001); e
la FIG. 14 è un grafico che illustra la vitalità a confronto tra cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e KMS-27. Entrambe sono state trattate con DMSO, CFZ (1,25, 2,5, 5, 10 nM), AGI-6780 (5 μM) o la combinazione dei due farmaci. I PBMC sono stati ottenuti da 4 donatori sani. La vitalità cellulare è stata misurata mediante colorazione con TMRM e analisi al citofluorimetro 48 ore dopo il trattamento. I dati mostrano la media ± s.d. (*P<.05).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Mentre l’invenzione è suscettibile di varie modifiche e costruzioni alternative, alcune forme di realizzazione preferite sono mostrate nei disegni e saranno descritte qui di seguito in dettaglio.
Si deve intendere, comunque, che non vi è alcuna intenzione di limitare l’invenzione alle specifiche forme di realizzazione illustrate, ma, al contrario, l’invenzione intende coprire tutte le modifiche, costruzioni alternative, ed equivalenti che ricadano nell’ambito dell’invenzione come definito nelle rivendicazioni.
Nella seguente descrizione, pertanto, l’uso di “ad esempio”, “ecc.”, “o / oppure” indica alternative non esclusive senza alcuna limitazione, salvo diversa indicazione; l’uso di “anche” significa “tra cui, ma non limitato a” se non diversamente indicato; l’uso di “include / comprende” significa “include / comprende, ma non limitato a” a meno che non altrimenti indicato.
Il sistema farmacologico (1) della presente invenzione si basa sul concetto innovativo di combinare un inibitore di proteasoma (i.e. il farmaco Carfilzomib o CFZ nella forma di realizzazione preferita dell’invenzione, qui di seguito illustrata dettagliatamente) ed un inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 (i.e. il farmaco AGI-6780 nella forma di realizzazione preferita dell’invenzione, qui di seguito illustrata dettagliatamente), veicolando almeno l’inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 in nanoparticelle altamente porose SM e biocompatibili rivestite da doppi strati lipidici preferibilmente ottenuti da vescicole extracellulari (VEs) di origine autologa, detto nanocostrutto chiamato SM@VEs.
Gli Inventori hanno infatti scoperto che la combinazione dei due farmaci (un inibitore di proteasoma e un inibitore di IDH2) è in grado di indurre la morte di cellule cancerose in modo focalizzato ed efficace attraverso un meccanismo sinergico noto come letalità sintetica. In base a questa idea già di per sé innovativa e pubblicata recentemente in letteratura (E. Bergaggio, C. Riganti, G. Garaffo, N. Vitale, E. Mereu, C. Bandini, E. Pellegrino, V. Pullano, P. Omedè, K. Todoerti, L. Cascione, V. Audrito, “. Riccio, “. Rossi, F. ”ertoni, Silvia Deaglio, “. Neri, “. Palumbo, R. Piva ȃIDHŘ inhibition enhances proteasome inhibitor responsiveness in hematological malignancies" Blood, 2018 https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-850826), gli Inventori rivendicano qui l'idea di veicolare almeno uno di questi due inibitori tramite un innovativo nanocostrutto poroso e biomimetico verso cellule di mieloma multiplo (MM) e di poter estendere tale trattamento ad altre linee di tumori ematologici e solidi, attualmente non considerati dallo stato dell'arte, fino a trial preclinici in-vivo.
Nella presente descrizione, con il termine "inibitore di proteasoma IP" si intendono i farmaci Carfilzomib (CFZ), Bortezomib e Ixazomib.
Nella presente descrizione, con il termine "inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2" si intendono le molecole indicate come AGI-6780, IDH2-C100 o altre similari. Nella presente descrizione, con il termine "letalità sintetica LS" si intende l'efficacia terapeutica dimostrata solo in compresenza di due farmaci (nel presente caso l'inibitore di proteasoma IP e l'inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2), efficacia che al contrario non si presenta con la stessa entità se i due farmaci vengono somministrati separatamente.
Nella presente descrizione, con i termini "mieloma multiplo (MM)", "linfoma mantellare (MCL)", "linfoma di Burkitt (BL) e "linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL)" si intendono delle patologie tumorali ematologiche.
Nella presente descrizione, con il termine "nanoparticelle NP" si intende un nanomateriale di qualsivoglia natura chimica, forma o morfologia con dimensioni comprese tra 1 nm e 500 nm.
Nella presente descrizione, con il termine "silici mesoporose SM" si intende un materiale a base di ossido di silicio (silice) amorfo, non cristallino, ottenuto per via chimica e presentante delle porosità di dimensioni uniformi e mesoscopiche, ovvero con dimensione di pori comprese tra 2 nm e 50 nm (vedasi la definizione data dalla IUPAC nel "Compendium of Chemical Terminology", 2nd ed. (the "Gold Book") 1997, ISBN 0-9678550-9-8.
Nella presente descrizione, con il termine ȃnanoparticelle di silici mesoporose SM" si intende un nanomateriale prevalentemente di forma sferica o ellissoidale a base di silice altamente porosa con pori di dimensioni uniformi e di taglia mesoporosa. Uno schema rappresentativo è riportato in FIG.1.
Nella presente descrizione, con il termine ȃdoppi strati lipidici DSL" si intende un insieme di fosfolipidi (di origine sintetica, naturale o biologica) disposto in maniera ordinata a formare un doppio strato, dove le teste polari puntano verso l’esterno dello strato e le code apolari e idrofobe puntano verso l’interno. Uno schema rappresentativo è riportato in FIG.1.
Nella presente descrizione, con il termine ȃnanocostrutti SM@VEs" si intende nanoparticelle di silice mesoporosa SM, secondo la precedente descrizione, rivestite da un doppio strato lipidico costituito da fosfolipidi di origine sintetica, naturale o biologica. Uno schema rappresentativo è riportato in FIG. 1.
Nella presente descrizione, con il termine ȃVescicole Extracellulari VEs" si intendono quelle vescicole formate da doppi strati lipidici e contenenti al loro interno una soluzione acquosa con proteine e acidi nucleici di varia natura, e nel doppio strato lipidico altre proteine di varia natura, comprendenti ma non esclusive di recettori di membrana, proteine di membrana, antigeni, ecc. Tali VEs sono prodotte naturalmente da quasi tutti i tipi di cellule animali e vegetali e possono essere convenientemente estratte da tessuti liquidi, sangue, plasma, urina, saliva, o da terreni usati per la coltura di cellule in vitro, secondo protocolli di ultracentrifugazione differenziale riportati in letteratura (C. Thery, S. “migorena, G. Raposo, and “. Clayton, "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids,Ȅ Current Protocols in Cell Biology, 2006, 3, 3–22) e menzionati nella proposta di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018).
Con riferimento alla FIG. 1, si osserva che il sistema farmacologico 1 secondo la presente invenzione comprende
- almeno un inibitore di proteasoma 2 e
- almeno un inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 3.
Secondo la presente invenzione, almeno l’inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 (3) è veicolato da un vettore nanoporoso 4 rivestito da almeno uno strato lipidico 5.
In una variante della presente invenzione, anche l’inibitore di proteasoma 2 è veicolato dal vettore nanoporoso 4 rivestito da almeno uno strato lipidico 5.
Preferibilmente, l’inibitore di proteasoma 2 è scelto tra uno dei tre farmaci Carfilzomib CFZ, Bortezomib e Ixazomib.
Preferibilmente, l’inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 3, è la molecola AGI-6780, la molecola IDH2-C100 o altre molecole similari; più preferibilmente è la molecola AGI-6780.
Preferibilmente, il vettore nanoporoso 4 è scelto tra un materiale polimerico organico, un insieme supramolecolare di coordinazione, un metallo, un metallo-organico (esemplificativamente ma non limitatamente: Metal Organic Framework, MOF o un Covalent Organic Framework, COF, o un carbonio mesoporoso), un ossido metallico cristallino, semicristallino, o semiconduttore, o amorfo, tra cui ad esempio una silice mesoporosa SM.
Preferibilmente, l’almeno uno strato lipidico 5 o un doppio strato lipidico comprende lipidi derivati da vescicole extracellulari VEs.
Preferibilmente, l’almeno uno strato lipidico 5 ha spessore variabile tra 1 nm e 5 nm; più preferibilmente ha spessore di 2,5 nm.
Preferibilmente l’almeno uno strato lipidico 5 è un doppio strato lipidico e ha spessore variabile tra 2 nm e 10 nm, preferibilmente ha spessore di 5 nm.
Preferibilmente, l’almeno uno strato lipidico 5 comprende proteine e/o recettori di membrana 6.
Preferibilmente, almeno un inibitore di proteasoma 2 viene somministrato in concentrazione sub-letale a colture di cellule tumorali in vitro, in concentrazione compresa tra 1 nM e 10 nM, preferibilmente alla concentrazione di 2,5 nM.
Più preferibilmente, almeno un inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 3 viene veicolato dal vettore nanoporoso SM o SM@VEs, nella concentrazione compresa tra 1 nM e 100 µM, preferibilmente nella concentrazione compresa tra 2 µM e 10 µM, e ancora più preferibilmente alla concentrazione di 5 µM.
Nella forma preferita dell’invenzione, almeno uno dei due farmaci usati (CFZ e AGI-6780) è incorporato, concentrato, trattenuto efficacemente e veicolato in nanoparticelle di silice mesoporosa SM rivestita da un doppio strato lipidico DSL derivante preferenzialmente da vescicole extracellulari VEs del paziente e prodotte da cellule prevenienti da un suo tessuto sano; inoltre, tale nanocostrutto - definito come SM@VEs - reso così biomimetico e non-immunogenico, può ulteriormente essere equipaggiato con proteine, e più nello specifico da anticorpi monoclonali mAb per un targeting efficace delle cellule bersaglio, noto ovviamente il profilo antigenico delle cellule bersaglio.
Il sistema farmacologico secondo la presente invenzione viene di seguito descritto in maggiore dettaglio mediante dati sperimentali, che sono da intendersi come illustrativi ma non limitativi della presente invenzione.
Preparazione delle nanoparticelle di SM
Le nanoparticelle di SM sono state preparate tramite sintesi chimica sol-gel assistita da tensioattivi, ottenendo strutture altamente porose. A titolo esemplificativo ed illustrativo della presente invenzione, si riporta che le SM sono sintetizzate in modo da ottenere NP di forma sferica o leggermente allungata con diametro compreso tra i 40-50 nm, pori con distribuzione a simmetria esagonale o disordinata (“worm-like”) e diametro di 2-3 nm. La superficie più esterna di tali nanoparticelle di SM viene ulteriormente decorata con gruppi chimici funzionali (in particolare gruppi amino -NH2 o gruppi tiolo -SH) utile per legare le nanoparticelle di SM a coloranti al fine di una loro analisi in citofluorimetria a flusso (FACS) e in fluorescenza. Inoltre, nel caso si utilizzino gruppi amino, la superficie esterna rimane protonata (-NH<3+>) in ambiente fisiologico a pH tra 4.5 e 7.4 così da avere un potenziale zeta di superficie positivo e una buona dispersione colloidale, nonché un’interazione elettrostatica preferenziale con le vescicole lipidiche extracellulari, tipicamente presentanti un potenziale zeta di superficie negativo.
Le procedure di sintesi non verranno qui descritte in dettaglio in quanto ampiamente documentate dalla letteratura scientifica e brevettuale.
La caratterizzazione delle SM è stata effettuata con vari metodi, quali Microscopia Elettronica a Trasmissione (FIGG. 2A e 2B) e Dynamic Light Scattering (FIGG. 3A e 3B).
Con riferimento alla FIG. 2A, si osserva un insieme di nanoparticelle di SM caratterizzate da un diametro di circa 35-50 nm e altamente porose, con mesopori altamente uniformi in diametro e delle dimensioni di 3 nm.
Con riferimento alla FIG. 2B, si osserva anche con la tecnica STEM un insieme di nanoparticelle mesoporose sferiche, con le caratteristiche già citate per la FIG.2A.
Con riferimento alla FIG.3A, si osserva che il grafico del diametro idrodinamico medio presenta due picchi in etanolo (96% vol): il più elevato a 91 nm, che indica una monodispersione di nanoparticelle di silice mesoporosa, ed il secondo a 295 nm. Tale picco è probabilmente dovuto alla formazione di aggregati di NP.
Con riferimento alla FIG. 3B, si osserva il grafico del raggio idrodinamico medio in soluzione acquosa (50%vol acqua bi-distillata microfiltrata e 50%vol soluzione fisiologica allo 0,9% NaCl). Tale distribuzione di diametro idrodinamico medio presenta due picchi molto allagati, il primo a 190 nm e il secondo a 342 nm. Trattandosi delle stesse nanoparticelle di SM misurate in FIG.3A, il presente grafico dimostra una spiccata tendenza di questo materiale ad aggregarsi in soluzione acquosa e, pertanto, la necessità di migliorarne la distribuzione colloidale.
Il potenziale zeta ha un valore medio di 45 mV in acqua neutra e di 11,3 mV in soluzione 50% acqua e 50% fisiologica (0,9% NaCl), confermando la presenza di gruppi amino-protonati sulla superficie in entrambe le soluzioni.
Mediante un’analisi di adsorbimento e desorbimento di azoto e applicando il modello BET è stato valutato il diametro medio dei pori, pari a circa 3 nm, nonché l’area superficiale delle nanoparticelle, pari a 913 m²/g.
Valutazione delle vescicole extracellulari (VEs)
Le vescicole extracellulari sono estratte da liquidi biologici derivati da paziente o dai mezzi di coltura di cellule derivate da paziente o da banca cellulare. Vengono applicati i protocolli di estrazione delle VEs di ultracentrifugazione differenziale riportati in letteratura (C. Thery, S. Amigorena, G. Raposo, and A. Clayton, “Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids,” Current Protocols in Cell Biology, 2006, 3, 3–22) e menzionati nella proposta di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018). Le VEs così estratte e risospese in buffer fisiologico sterile (buffer fosfato salino -PBS-o soluzione fisiologica – 0,9 %peso di NaCl in acqua distillata) sono poi caratterizzate, come già riportato nel Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018).
Con riferimento alla FIG. 4A, si osserva che il grafico del diametro idrodinamico, valutato tramite tecnica di “Dynamic Light Scattering”, medio di VES estratte da linfociti B di donatore sano presenta un picco in soluzione acquosa (50%vol acqua bidistillata microfiltrata e 50 %vol soluzione fisiologica allo 0,9% NaCl), da 106 nm. Tale risultato è alla buona distribuzione e monodispersione di VEs in tale soluzione.
Il potenziale zeta ha un valore medio di -5.2mV in soluzione 50% acqua e 50% fisiologica (0,9% NaCl), confermando la presenza di fosfolipidi o proteine caricati negativamente sulla superficie delle VEs.
Con riferimento alla FIG. 4B, si osserva la distribuzione dei diametri (con un picco prevalente a 119 nm di diametro medio, conforme a quanto misurato con la tecnica riportata in FIG. 4A) e la concentrazione in particelle/ml (con una quantità totale di 3.7 10<11 >particelle/ml), ottenute mediante la tecnica di “Nanoparticle Tracking Analysis” (NTA), delle VEs estratte da mezzo di coltura per coltivare linfociti B.
Caricamento del/i farmaco/i
Almeno uno dei due farmaci (CFZ e AGI-6780) è caricato nelle SM monitorando l’esito a concentrazioni e tempi diversi tramite spettrometria UV-Vis; in particolare, secondo la presente invenzione, il farmaco AGI-6780, o suoi similari, viene caricato nella SM e concentrato al suo interno.
Viene usata una soluzione madre di farmaco AGI-6780 con concentrazioni di farmaco da 1nM a 1M, preferibilmente una concentrazione fissata a 10 mM in solvente dimetilsulfossido (DMSO) ed aggiungendo alla soluzione 100 μg di nanoparticelle di SM.
La soluzione è posta in agitazione magnetica con magnete a 200 rpm per un tempo variabile da 1 a 48 ore, preferibilmente da 1 a 4 ore, e nello specifico per 1 ora.
Per determinare la concentrazione di farmaco assorbita, è stata valutata la variazione di assorbanza UV-Vis del surnatante, mediante un lettore di micropiastre, valutando il picco di assorbimento nell’UV a 295 nm, come visibile in FIG. 5.
È stato osservato che una quantità di farmaco sufficiente, pari a 50 µM, viene adsorbita nelle SM dopo una sola ora di immersione in soluzione madre di farmaco AGI-6780; per questo motivo, per tutti i successivi esperimenti di rilascio, le SM sono state caricate con un’ora di immersione.
Per meglio caratterizzare il sistema è anche stato valutato il rilascio di farmaco dal nanovettore di SM (non rivestito di doppi strato lipidici) in mezzo di coltura cellulare, nello specifico il terreno di coltura RPMI (Roswell Park Memorial Institute), e i campioni sono stati inseriti in agitatore orbitale a 37 °C e 200 rpm.
È stata poi valutata la variazione di assorbanza del surnatante nel tempo tramite lettore di micropiastre e assorbanza nell’UV a 295 nm ed è stata ottenuta la curva di rilascio visibile in FIG. 6.
In questo caso, per calcolare la concentrazione di farmaco rilasciato a partire dall’assorbanza, è stata costruita una curva di taratura del farmaco in RPMI.
Osservando la FIG.6 si può notare che la quantità di farmaco rilasciata aumenta nelle prime 24 ore, per poi a uno stato stazionario fino alle 72 ore; successivamente, la curva ha un andamento crescente fino alle 168 ore (7 giorni), senza raggiungere un valore asintotico per il tempo di monitoraggio qui effettuato. Si può dunque ipotizzare che le SM rilascino completamente il farmaco solo in tempi più lunghi, garantendo un rilascio controllato nel tempo.
Accoppiamento del/i farmaco/i con strati lipidici
Per poter migliorare la stabilità colloidale delle SM, che tendono a formare aggregati in mezzi acquosi e biologici, e la loro bio- e immuno-compatibilità, nonché per ritardare il rilascio del farmaco e migliorarne la biodistribuzione, si effettua l’accoppiamento delle SM caricate di farmaco con vescicole extracellulari (VEs) estratte da colture di cellule sane in vitro o da paziente.
Partendo dalle conoscenze della domanda di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018), relativa a nanocristalli semiconduttori e non porosi, nella presente invenzione si è sfruttata la silice mesoporosa, materiale di per sé amorfo, non semiconduttore ma isolante e altamente poroso.
L’accoppiamento tra SM e vescicole extracellulari per ottenere SM@VEs è stato effettuato tramite incubazione delle nanoparticelle con le vescicole extracellulari in modo analogo a quanto riportato nella domanda di Brevetto Italiano n.
102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018).
In alternativa è possibile impiegare un campo pressorio sonoro (ossia ultrasuoni, tipicamente in un intervallo da 40 kHz a 2 MHz, intensità 0,1 W/cm<2 >a 100 W/cm<2>) per un intervallo di tempo da pochi secondi (10 s) a pochi minuti (10 min), anche ripetuto per più volte e anche in combinazione con la metodica di agitazione riportata nella domanda di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018). È inoltre possibile anche usare metodologie riportate in letteratura per combinare vescicole extracellulari con farmaci, tramite azione di:
• un campo elettrico (elettroforesi);
• cicli di congelamento/scongelamento (portando i campioni da temperature di -80°C ÷ -20°C a temperatura ambiente anche in più cicli).
Si è effettuata una prima tipologia di accoppiamento con vescicole extracellulari estratte da siero fetale bovino (FBS) e SM, in rapporto 1:1 in numero in una soluzione da 100 µl costituita dal 50% volume di acqua H2O bidistillata e microfiltrata e 50% volume di soluzione fisiologica (0,9 %vol cloruro di sodio, NaCl) o PBS (buffer salino fosfato); la soluzione è stata inserita in un agitatore orbitale per 90 minuti a 37 °C. Al termine dell’accoppiamento il campione è stato osservato con il microscopio a fluorescenza per poter valutare la percentuale di SM accoppiate con vescicole extracellulari; i risultati sono visibili nelle FIGG. 7A, 7B e 7C.
Con riferimento alla FIG. 7A, si osserva il canale verde in cui sono state localizzate le vescicole extracellulari VEs da FBS colorate opportunamente con colorante DiO, che fluoresce nel canale verde. Con riferimento alla FIG. 7B, si osserva il canale rosso che mostra le nanoparticelle di silici mesoporose (SM) e gruppi amino sulla superficie esterna legate, tramite legame covalente, al colorante Atto633-NHS estere;
Con riferimento alla FIG. 7C, si osserva un’immagine che mostra la sovrapposizione delle due figure precedenti FIGG. 7A e 7B a dimostrare che esiste una co-localizzazione delle SM con le VEs e dimostrarne quindi l’avvenuto accoppiamento.
Si è effettuata una seconda tipologia di accoppiamento con VEs da cellule di linfociti B ottenute da un donatore sano; le nanoparticelle e le vescicole sono state incubate con concentrazione 1:1 in numero in una soluzione da 100 µL costituita dal 50% volume di acqua H2O bidistillata e microfiltrata e 50% volume di soluzione fisiologica (0,9 % vol cloruro di sodio, NaCl); la soluzione è stata inserita in un agitatore orbitale per 60 minuti a 37 °C e poi trattata con ultrasuoni a 40 kHz per 10 secondi ed infine il prodotto è stato centrifugato a 10'000 g per 5 minuti e risospeso in 100 µl di soluzione 1:1 in volume di acqua e fisiologica.
L’esperimento di visualizzazione al microscopio in fluorescenza è stato poi eseguito con le stesse modalità descritte precedentemente ed i risultati sono visibili nelle FIGG.
8A, 8B e 8C.
Con riferimento alla FIG.8A, si osserva il canale verde in cui sono mostrate le vescicole extracellulari (VEs), estratte da cellule linfociti B da donatore sano, contrastate con DiO.
Con riferimento alla FIG. 8B, si osserva un’immagine del canale rosso che mostra le nanoparticelle di silici mesoporose (SM) e gruppi amino sulla superficie esterna legate, tramite legame covalente, al colorante Atto633-NHS estere.
Con riferimento alla FIG. 8C, si osserva la sovrapposizione delle due figure precedenti a dimostrare che esiste una co-localizzazione delle SM con le VEs e dimostrarne quindi l’accoppiamento.
Dai risultati sperimentali, pertanto, si desume che è possibile utilizzare VEs estratte sia da siero animale, sia dal mezzo di coltura usato per coltivare i linfociti B di un donatore, sia da cellule tumorali di tipo KB (tumore epiteliale della bocca), come riportato nella domanda di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018) a dimostrare l’elevata versatilità dell’approccio di accoppiamento presentato.
Con riferimento alle FIGG. 9A, 9B e 9C sono mostrate le immagini TEM (Transmission Electron Microscopy, microscopia elettronica a trasmissione) ad 80kV delle SM@VEs, ossia delle nanoparticelle di silice mesoporosa (SM) rivestite dai lipidi delle vescicole extracellulari (VEs) estratte da cellule di linfociti B, e ottenute secondo la seconda tipologia di accoppiamento oggetto della presente invenzione.
Le figure 9.A, 9B e 9C mostrano diversi campioni analizzati e a diversi ingrandimenti usati per il microscopio. Tali immagini mostrano delle particelle di forma sferica con un diametro all’incirca di 100 nm o inferiore. Non è possibile riconoscere la tessitura mesoporosa delle silici in quanto completamente rivestite dai lipidi derivati dalle vescicole extracellulari. L’accoppiamento tra silici SM e VEs è pertanto avvenuto con successo, portando a una buona dispersione e uniformità del campione e completo rivestimento delle silici con i lipidi derivati da VES.
Successivamente, è stato eseguito un accoppiamento di SM caricate con farmaco inibitore di IDH2, AGI-6780, e vescicole extracellulari VEs estratte da mezzi di coltura per coltivare cellule di linfociti B (SM@VEs) con cui è stato effettuato un esperimento di rilascio, seguendo lo stesso procedimento descritto precedentemente.
Dopo 50 ore di rilascio è stato aggiunto il tensioattivo Triton-X 100 in quantità 10% volume rispetto al volume della soluzione di rilascio ed utile per destabilizzare e distruggere il doppio strato lipidico delle vescicole extracellulari che rivestono le nanoparticelle di silice mesoporosa. L’andamento del rilascio è mostrato nelle FIGG.
10A e 11B.
Con riferimento alla FIG. 10A, si osserva che per le prime 50 ore non c’è rilascio dell’inibitore diretto verso la forma nativa del gene IDH2 (la molecola di farmaco AGI-6780) dalle nanoparticelle di silici mesoporose (SM) rivestite con VEs estratti da cellule di linfociti B (SM@VEs). In particolare, nel periodo da 0 a 50 ore le molecole di farmaco AGI-6780 restano sigillate all’interno dei mesopori delle SM grazie al rivestimento lipidico derivato da vescicole extracellulari (VEs). Dopo 50 ore, viene aggiunto alla soluzione un tensioattivo (Triton X-100) in quantità 10 % vol rispetto al volume totale della soluzione in cui si sta monitorando il rilascio. Il Triton X-100 è in grado di destabilizzare il doppio strato lipidico di VEs e permettere quindi di liberare i mesopori e avviare il rilascio dell’inibitore;
la FIG.10B è un grafico che illustra un ingrandimento della curva riportata in FIG.10A a mostrare il profilo di rilascio dell’inibitore (AGI-6780) dalle nanoparticelle di SM@VEs in seguito all’aggiunta di tensioattivo Triton X-100. Tale tensioattivo, distrugge la membrana doppio strato lipidica delle VEs e permette la fuoriuscita rapida dell’inibitore diretto verso la forma nativa del gene IDH2, AGI-6780, dai pori delle nanoparticelle di SM.
Si può notare che il rilascio assume un andamento crescente solo a seguito dell’aggiunta del tensioattivo; di conseguenza, si può ipotizzare che le VEs impediscano la fuoriuscita del farmaco e permettono di evitare un rilascio prematuro ed indesiderato di questo. Si ipotizza che tale rilascio avvenga solo in seguito all’internalizzazione delle SM@VEs nelle cellule tumorali di interesse, dove il doppio strato lipidico verrà opportunamente destabilizzato nell’interazione o con la membrana cellulare della cellula bersaglio o con i comparti endosomali di tale cellula. Trattamento di cellule tumorali
Dopo aver caricato le SM con almeno un farmaco inibitore (l’altro farmaco, se non veicolato, viene somministrato in modo convenzionale) e dopo aver effettuato il rivestimento con il DSL, si incubano le SM@VEs con le cellule tumorali, ad esempio di mieloma multiplo (MM) per un tempo indicativo di 24 ore.
L’internalizzazione e la citotossicità delle SM tal quali in assenza di farmaci e doppio strato lipidico, delle SM@VEs senza farmaco, ed infine delle SM@VEs caricate con farmaci sono state monitorate con citofluorimetria a flusso (FACS), microscopia in fluorescenza in live-cell imaging, test bioluminescenti, test enzimatici per IDH2 e per l’attività del proteasoma.
Sono poi state effettuate prove per dimostrare la sinergia di letalità sintetica dei due farmaci CFZ e AGI-6780, somministrati alle cellule in coltura tramite via convenzionale, ovvero in assenza di veicolo delle nanoparticelle, come riportato già in letteratura (https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-850826).
Le FIGG. 11A, 11B e 12 riportano gli istogrammi relativi alla vitalità cellulare di varie linee di cellule di mieloma multiplo, trattate con solo inibitore del proteasoma (CFZ), con solo inibitore di IDH2 (AGI-6780) e con la combinazione dei due farmaci. In particolare, per definire se l'inibizione farmacologica di IDH2 ricapitolasse il fenotipo letale sintetico, il trattamento con CFZ è stato associato ad AGI-6780, un inibitore allosterico del mutante IDH2, in grado di ridurre anche l'attività di IDH2 nativo (Wang F, Travins J, DeLaBarre B, et al. Targeted Inhibition of Mutant IDH2 in Leukemia Cells Induces Cellular Differentiation. Science. 2013;340(6132)). Abbiamo infatti dimostrato che AGI-6780 (5 �M) selettivamente inibisce l’attività enzimatica di IDH2 in cellule MM, come riportato in https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-850826.
Successivamente, le linee cellulari di MM KMM-1PIR e U266PIR, resistenti agli IP, sono state trattate con CFZ, AGI-6780, o con la combinazione dei due farmaci. Con riferimento alle FIGG. 11A e 11B, si osserva che i trattamenti combinati di CFZ e AGI-6780 aumentano significativamente la morte cellulare rispetto ai singoli farmaci. Come risulta dai suddetti istogrammi, il trattamento in combinazione dimostra una elevata mortalità cellulare, e quindi l’efficace letalità sintetica rispetto ai trattamenti con i singoli farmaci.
Per dimostrare che la citotossicità combinata di AGI-6780 e CFZ non fosse limitata alle cellule resistenti agli IP, otto linee cellulari di MM con diversi gradi di sensibilità agli IP sono state trattate con CFZ in combinazione o non con AGI-6780. In tutte le linee cellulari di MM è stata osservata una maggiore sensibilità al trattamento combinato rispetto ai singoli agenti (FIG. 12). Al contrario, la linea cellulare di leucemia mieloide cronica K-562 non rispondeva né ai singoli farmaci né alla loro combinazione.
Come risulta dal suddetto istogramma, il trattamento in combinazione dimostra una elevata mortalità cellulare, e quindi l’efficace letalità sintetica rispetto ai trattamenti con i singoli farmaci.
Come dimostrato dalle prove i cui esiti sono riportati in FIG.12, l’elevata flessibilità e modularità del presente nanocostrutto SM@VEs permetterebbe la sua applicazione nel MM, ma anche in altri svariati tipi di patologie tumorali, dai vari tumori del sangue ai tumori solidi, previo l’utilizzo dell’opportuno anticorpo monoclonale o, più in generale, dell’opportuno agente di targeting che garantisca il direzionamento selettivo verso le cellule di interesse.
Accoppiamento con anticorpo monoclonale
Opzionalmente, è possibile associare una proteina di riconoscimento, preferibilmente un anticorpo monoclonale mAb al guscio lipidico sia esso di derivazione artificiale, sia naturale, sia biologica da VEs.
Nel caso di cellule di MM, l’mAb anti-CD138 (intero o sua frazione) viene ancorato alle SM@VEs per interazione chimica tramite i gruppi amino presenti o immunoriconoscimento grazie ad antigeni presenti sulla superficie dei DSL se di origine biologica ((1) T. Smyth, et al. “Surface Functionalization of Exosomes Using Click Chemistry” Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1777−1784; (2) J. L. Hood “Post isolation modification of exosomes for nanomedicine applications” Nanomedicine (Lond.) (2016) 11(13), 1745–1756). Per i DSL di origine sintetica o naturale, l’anticorpo monoclonale può essere opportunamente modificato per via chimica attuando un legame covalente con opportuni lipidi PEG-ilati presenti sul DSL (S. A. Mackowiak, et al. “Targeted Drug Delivery in Cancer Cells with Red-Light Photoactivated Mesoporous Silica Nanoparticles” Nano Lett. 2013, 13, 2576−2583).
Le SM@VEs-mAb caricate con uno o due farmaci, sono incubate con cellule di MM CD138<+ >o con PBMC (Peripheral blood mononuclear cell, cellule mononucleari del sangue periferico) derivate da donatori sani. L’internalizzazione del nanocostrutto e l’apoptosi cellulare provocata dall’azione combinata dei due farmaci viene monitorata nel tempo utilizzando le tecniche sopradescritte.
Il vantaggio specifico di questa forma di realizzazione alternativa del sistema farmacologico secondo la presente invenzione risiede principalmente nel fatto di veicolare selettivamente le SM@VEs-mAb verso le cellule CD138<+>, risparmiando le cellule sane CD138-. In tale modo, si predilige un’internalizzazione specifica e un rilascio intracellulare mirato del nanocostrutto SM@VEs-mAb caricato con almeno un farmaco. Solo in compresenza del secondo farmaco, anche se non veicolato in maniera selettiva e anche se presente in dosi sub-letali, avverrà la sinergia di letalità sintetica verso le cellule tumorali bersaglio.
In FIG. 13 è riportata la vitalità cellulare di cellule esprimenti CD138 (CD138<+>) e originate da nove pazienti affetti da mieloma multiplo; le cellule sono state aspirate dal midollo osseo e coltivate su una linea di cellule stromali HS5 a simulare il microambiente tumorale, ovvero per supportarne la vitalità, promuoverne la crescita, sopravvivenza, la resistenza ai farmaci, e la migrazione.
Ciononostante, dopo 96 ore dal trattamento con le soluzioni di controllo, i singoli farmaci, o la combinazione dei due farmaci, viene dimostrata l’elevata mortalità cellulare solo in presenza delle due molecole.
Con riferimento alla FIG.14, viene dimostrata l’esistenza di una finestra terapeutica di somministrazione del farmaco CFZ (concentrazione somministrata variabile da 0 a 10 nM) in combinazione con il farmaco AGI-6780 (somministrato alla concentrazione di 5 µM), che permette la sopravvivenza delle cellule PBMC derivate da donatori sani, ma è in grado di indurre la morte di cellule tumorali di MM (KMS-27). In particolare, la finestra terapeutica è stata riscontrata per dosi di farmaco CFZ variabili da 1,25 and 2,5 nM, mantenendo costante la dose di farmaco inibitore di IDH2 (AGI-6780) pari a 5 µM.
Come già descritto in precedenza, una forma particolarmente vantaggiosa della presente invenzione sfrutta come SM@VEs quanto descritto nella domanda di Brevetto Italiano n. 102017000129243 depositata il 13 novembre 2017 (a cui corrisponde la domanda internazionale n. PCT/IB2018/058476 depositata il 30 ottobre 2018).
Il vantaggio specifico conseguito dalla suddetta forma di realizzazione consiste nel poter sfruttare le metodologie di accoppiamento tra VEs (in particolare esosomi, come ivi descritte) e NP, e la tipologia di nanoparticelle utilizzate, in particolare nanocristalli di ossido metallico semiconduttore, in particolare ossido di zinco. Anche se non poroso, questo materiale può essere opportunamente funzionalizzato chimicamente per adsorbire le molecole di farmaco inibitore del proteasoma e inibitore di IDH2 della forma nativa, ed essere sfruttato esso stesso come agente citotossico per il rilascio di ioni Zn<2+>, o ancora in aggiunta, essere usato come agente di immagine diagnostico per la sua capacità di essere eccitato nella regione dell’ultravioletto e riemettere fotoni nella regione della luce visibile verde.
Costituisce, inoltre, un aspetto indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione un vettore nanoporoso 4 comprendente un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 3, in cui il vettore nanoporoso 4 è biomimetico ed è adatto ad essere utilizzato in un sistema farmacologico 1 come sopra descritto.
La caratteristica di biomimetismo si manifesta in termini di biocompatibilità, assenza di reazioni infiammatorie e risposte immunitarie avverse dell’organismo ospitante ed è garantita in termini costruttivi da: uno strato proteico (albumina, o altre proteine) o uno strato polimerico (polietilenglicole -PEG, chitosano, eparina, o altri polimeri noti) oppure uno strato lipidico, o un doppio strato lipidico, derivato da lipidi di origine sintetica, naturale o biologica, e più preferibilmente da lipidi di vescicole extracellulari di origine biologica e preferibilmente prelevati da un tessuto sano del paziente da trattare con tale vettore nanoporoso.
Il vettore nanoporoso 4 è scelto tra un materiale polimerico organico, un insieme supramolecolare di coordinazione, un metallo, un metallo-organico, un ossido metallico cristallino, un ossido metallico semicristallino, un ossido metallico semiconduttore e un ossido metallico amorfo.
Come si deduce da quanto sopra esposto, la soluzione tecnica innovativa qui descritta presenta le seguenti caratteristiche vantaggiose:
- massimizzare l’efficacia di LS con una formulazione farmacologica veicolata da SM@VEs;
- superare le attuali limitazioni di idrofobicità e bassa biodistribuzione dei due farmaci menzionati;
- aumentare la selettività della LS in caso di nanocostrutti targeted con mAb o proteine/peptidi idonei;
- procedere verso trial preclinici in vivo con SM@VEs targeted;
- evitare l’insorgenza di aggregazione in fluidi biologici e mancata emocompatibilità dei nanocostrutti, nonchè immunogenicità di questi, grazie alla presenza di DSL derivati da vescicole extracellulari VEs autologhe del paziente da trattare.
- utilizzare un nanocostrutto multifunzionale e modulare, nel quale ogni componente è opportunamente modificabile secondo le esigenze e il tipo di terapia richiesto, ovvero: le nanoparticelle porose in natura del materiale, dimensioni della NP e diametro dei pori, i tipi di farmaco incorporati, il tipo di rivestimento lipidico (di derivazione artificiale, naturale o biologica), l’agente di direzionamento selettivo (proteine, peptidi, anticorpi monoclonali, ecc).
In sintesi, la soluzione tecnica innovativa qui descritta presenta le seguenti caratteristiche innovative:
a. l’impacchettamento di uno o più farmaci poco biodisponibili e altamente idrofobici in un veicolo nanoporoso, che lo/i protegge, lo/i concentra e lo/i consegna in modo mirato alle cellule tumorali;
b. il veicolo è costituito da una silice mesoporosa, con caratteristiche di elevatissima area superficiale e volume poroso, con superfici modificabili chimicamente, e atta ad ospitare una notevole quantità di farmaco, anche ed eventualmente superiore a quanto possibile somministrare in assenza del veicolo nanoporoso;
c. il veicolo è composto da un rivestimento biomimetico e non-immunogenico, ossia da doppio strato lipidico di origine biologica derivante da vescicole extracellulari, autologhe del paziente e prodotte da un suo tessuto sano; d. l’accoppiamento delle nanoparticelle di silice mesoporosa con le biovescicole extracellulari crea un nanocostrutto ibrido, multifunzionale e nonimmunogenico per la terapia oncologica;
e. l’utilizzo di due farmaci in grado di produrre letalità sintetica, avendone almeno uno dei due veicolato tramite vettore nanoporoso, superando l’effetto tossico e la loro limitata efficacia di somministrazione, su cellule cancerose, in particolare
f. l’utilizzo di due farmaci, tra cui un inibitore di IDH2 diretto verso la forma nativa di IDH2, e non solo quella mutata come presentato in letteratura scientifica e brevettuale;
g. l’utilizzo di due farmaci, tra cui un inibitore di IDH2 diretto verso la forma nativa di IDH2 e un inibitore di proteasoma, capaci di creare sinergia e dimostranti una finestra terapeutica che risparmi le cellule sane rispetto a quelle tumorali.
Dalla descrizione qui sopra riportata è evidente, quindi, come il sistema farmacologico secondo la presente invenzione permetta di raggiungere gli scopi proposti.
È altrettanto evidente, ad un tecnico del ramo, che è possibile apportare modifiche e ulteriori varianti alla soluzione descritta con riferimento alle figure allegate, senza per questo fuoriuscire dall’insegnamento della presente invenzione e dall’ambito di protezione come definito dalle rivendicazioni allegate.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Sistema farmacologico (1) comprendente - almeno un inibitore di proteasoma (2) e - almeno un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 (3), caratterizzato dal fatto che detto inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 (3) è veicolato da un vettore nanoporoso (4) rivestito da almeno uno strato lipidico (5), preferibilmente un doppio strato lipidico.
- 2. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 1, in cui anche detto inibitore di proteasoma (2) è veicolato da detto vettore nanoporoso (4) rivestito da almeno uno strato lipidico (5), preferibilmente un doppio strato lipidico.
- 3. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto inibitore di proteasoma (2) è scelto tra Carfilzomib (CFZ), Bortezomib e Ixazomib.
- 4. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 1 o 2 o 3, in cui detto inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 (3) è scelto tra la molecola denominata AGI-6780 e molecole similari.
- 5. Sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto vettore nanoporoso (4) è scelto tra un materiale polimerico organico, un insieme supramolecolare di coordinazione, un metallo, un metallo-organico, un ossido metallico cristallino, un ossido metallico semicristallino, un ossido metallico semiconduttore e un ossido metallico amorfo.
- 6. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 5, in cui detto vettore nanoporoso (4) è silice mesoporosa (SM).
- 7. Sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto almeno uno strato lipidico (5), preferibilmente un doppio strato lipidico, comprende lipidi derivati da vescicole extracellulari (VEs).
- 8. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 7, in cui detto almeno uno strato lipidico (5) ha spessore variabile tra 1 nm e 5 nm, più preferibilmente ha spessore di 2,5 nm.
- 9. Sistema farmacologico (1) secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui detto almeno uno strato lipidico (5) è un doppio strato lipidico e ha spessore variabile tra 2 nm e 10 nm, preferibilmente ha spessore di 5 nm.
- 10. Sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto almeno un inibitore di proteasoma (2) viene somministrato in concentrazione sub-letale compresa tra 1 nM e 10 nM, preferibilmente alla concentrazione di 2,5 nM.
- 11. Sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto almeno un inibitore diretto verso la forma nativa di IDH2 (3) viene veicolato dal vettore nanoporoso (4) in concentrazione compresa tra 1 nM e 10 µM, preferibilmente in concentrazione compresa tra 2 µM e 10 µM, più preferibilmente alla concentrazione di 5 µM.
- 12. Sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, per il trattamento di patologie oncologiche quali mieloma multiplo, linfoma mantellare, linfoma di Burkitt, linfoma diffuso a grandi cellule B e tumori solidi di varia natura.
- 13. Vettore nanoporoso (4) comprendente un inibitore diretto verso la forma nativa della proteina IDH2 (3), detto vettore nanoporoso (4) essendo biomimetico ed adatto ad essere utilizzato in un sistema farmacologico (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12.
- 14. Vettore nanoporoso (4) secondo la rivendicazione 13, in cui detto vettore nanoporoso (4) è scelto tra un materiale polimerico organico, un insieme supramolecolare di coordinazione, un metallo, un metallo-organico, un ossido metallico cristallino, un ossido metallico semicristallino, un ossido metallico semiconduttore e un ossido metallico amorfo.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020152559A1 (en) | 2020-07-30 |
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