KR102017110B1 - 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체는 생체 내 간조직과 유사하게 1구역, 2구역 및 3구역으로 구역화되어 있고, 각 구역에 따라 약물에 대한 간독성을 평가할 수 있으며, 간독성 평가 결과를 이미징 분석을 활용하여 정량적으로 분석할 수 있다는 점에서, 시험관 내에서 구역에 따른 간독성을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법{MICROFABRICATED PLATFORM FOR MIMICKING THE LIVER ZONATION AND EVALUATING METHOD OF ZONAL TOXICITY USING THEREOF}
본 발명은 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법에 관한 것이다.
간 조직은 간소엽이라 불리는 육각형 모양의 단위 구조체로 이루어져 있고, 상기 간소엽은 중심부에 간정맥(CV)을, 주위에 문맥역(portal triads, PT)을 포함한다. 간 조직에서 혈액은 영양분, 호르몬, 노폐물, 기타 신호전달 분자 등을 동양혈관(sinusoid)이라고 불리는 통로를 통해 문맥역으로부터 간정맥으로 운반한다.
혈액이 동양혈관을 흐르는 동안 간세포는 혈액과 상호작용을 통해 영양분을 공급받고, 신호전달 분자를 교환한다. 따라서, 문맥역 근처에 존재하는 간세포가 가장 먼저 영양분, 산소, 호르몬 등의 인자를 소비함으로써, 동양혈관을 따라 상기와 같은 인자의 농도구배가 형성된다. 이와 같은 생체 내 환경의 차이 때문에 간세포는 존재하는 위치에 따라 암모니아 해독작용, 글루코스 및 에너지 대사작용, 또는 외부물질 대사작용과 같이 기능적 이질성을 갖는다.
일반적으로 문맥역을 기준으로 간정맥까지의 구역을 나누어 문맥역의 주변부를 1구역(zone 1, periportal area, PP), 간정맥 주변부를 3구역(zone 3, perivenous area, PV), 중간부를 2구역(zone 2, midzonal area)이라고 하며, 이와 같은 간소엽의 구역 구분을 간 구역화(liver zonation)라고 한다.
산소가 풍부한 혈액이 흐르는 1구역의 간세포는 글루코스 생합성(gluconeogenesis), β-산화(β-oxidation), 콜레스테롤 합성, 요소형성(ureogenesis) 등과 같은 기능이 활성화되어 있다. 이들 1구역의 간세포는 반응성 산소 등에 취약하나 회복이 빠른 특징을 갖는다. 한편, 산소가 적은 혈액이 흐르는 3구역의 간세포는 시토크롬 P450(cytochrome P450)의 활성이 높아 약물 대사능이 우수하고, 지방형성(lipogenesis), 해당작용(glycolysis), 담즙산 합성, 글루타민 합성 등과 같은 기능이 활성화되어 있다. 이로부터 간소엽은 간이 복합적인 기능을 동시에 수행하기 위해 구역화되어 기능을 분담하고 있음을 알 수 있다.
한편, 신약개발에서 약물 유래의 간독성에 대한 연구는 약물의 안전성을 확보하기 위한 필수적인 과정이다. 이를 위해 다양한 분석 방법이 개발되어 왔으며, 1차 배양된 인간 간세포(primary human hepatocyte)는 I형(phase I) 및 II형(phase II) 효소가 발현되어 시험관 내에서 간독성을 평가하는데 유용하게 사용된다. 그러나, 1차 배양된 인간 간세포는 시험관 내에서 불안정한 표현형, 개체차, 조작의 어려움뿐만 아니라 비용이 높다는 점에서 한계가 있다. 따라서, 이를 극복하기 위해 1차 배양된 인간 간세포를 대체할 수 있는 다양한 세포 모델이 연구되었다. 이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2015-0103431호는 인간 줄기세포로부터 간세포를 분화시키고, 분화된 간세포를 이용하여 간독성을 유발하는 물질을 스크리닝하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 독성평가용 간세포 모델은 간세포 자체의 약물 대사능을 높이려는 연구가 주도적으로 이루진 반면, 간 조직의 미세 환경에 따른 간조직 구역별 기능성에 대한 연구는 아직까지 미흡하다. 간 조직의 독성은 복합조건하에서 유발되기 때문에 정확한 간독성의 평가 및 예측을 위해서는 간세포 자체의 기능뿐 아니라 간 조직의 미세 환경이 반영된 간독성 평가 모델의 개발이 필요하다. 특히, 생체 내에서는 간소엽의 구역에 따라 약물의 대사환경이 달라져 약물에 의한 독성이 각 구역에 따라 다르게 나타난다. 따라서, 이와 같은 생체 내 환경을 반영한 간소엽 모사체 및 이를 이용한 간독성 평가 방법의 개발이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 체내의 간 조직과 유사한 환경을 모사한 세포 모델을 개발하기 위해 노력하던 중, 간세포를 아가로스가 포함된 배지와 혼합하여 튜브(tube) 내에서 겔화시키고, 상기 겔화된 세포에 CHIR이 농도구배로 형성되도록 함으로써 구역화된 간소엽 모사체를 제조하고, 상기 구역화된 간소엽 모사체가 구역에 따라 약물대사활성에 차이를 나타내고, 구역화된 간소엽 모사체를 사용한 간독성 평가 결과가 동물 모델을 사용한 간독성 평가 결과와 동일함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2015-0103431호
본 발명의 목적은 구역화된 간세포 모사체를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 구역화된 간세포 모사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 구역화된 간세포 모사체를 이용하여 간독성을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간세포를 겔화제가 포함된 배양 배지와 혼합하여 튜브에 주입하여 겔화시키는 단계; 및 상기 겔화된 세포에 간소엽 구역화 인자 또는 상기 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질의 농도구배를 형성시키고 배양하는 단계를 포함하는 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체를 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체를 절편화하여 세포생존율을 분석하는 단계를 포함하는 구역별 간독성 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체는 생체 내 간조직과 유사하게 1구역, 2구역 및 3구역으로 구역화되어 있고, 각 구역에 따라 약물에 대한 간독성을 평가할 수 있으며, 간독성 평가 결과를 이미징 분석을 활용하여 정량적으로 분석할 수 있다는 점에서, 시험관 내에서 구역에 따른 간독성을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체의 제조 방법에 대한 개념도 및 상기 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체를 이용하여 간독성을 평가하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체에서 구역에 따른 CYP1A, CYP2E 및 CYP3A4의 발현 및 활성 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체에 아세트아미노펜을 처리한 뒤, 구역에 따른 간독성을 세포 염색(세포 추적 딥 레드 형광액, A), CHIR(B) 및 사멸된 세포 염색(EthD-1, C)을 통해 비교한 결과 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체에 아세트아미노펜(A) 또는 타목시펜(B)을 처리한 뒤, 구역에 따른 간독성을 평가한 결과 도면이다.
도 5는 랫트 동물모델에 아세트아미노펜 또는 타목시펜을 처리한 뒤, 간 조직을 관찰하여 간독성을 평가한 결과 그래프이다(노란색: 유사분열 증가, 파란색: 괴사 및 초록색: 염증세포 침투).
도 6은 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체에 아세트아미노펜을 처리한 뒤, 구역에 따른 CYP2E1, PARP 또는 β-카테닌 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 간세포를 겔화제가 포함된 배양 배지와 혼합하여 튜브에 주입하여 겔화시키는 단계; 및 상기 겔화된 세포에 간소엽 구역화 인자 또는 상기 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질의 농도구배를 형성시키고 배양하는 단계를 포함하는 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조 방법에서, 간세포는 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 세포를 사용하여도 무방하다. 상기 간세포는 1차 배양된 간세포, 불멸화된 간세포 또는 줄기세포로부터 분화된 간세포일 수 있고, 구체적으로 상기 간세포는 HepG2, HepaRG, Hep3B 및 Huh7으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 간세포는 0.5x102 내지 1x1010 cell/㎖, 1x103 내지 1010 cell/㎖, 1x104 내지 1010 cell/㎖, 1x104 내지 107 cell/㎖, 0.5x102 내지 109 cell/㎖, 0.5x102 내지 108 cell/㎖, 0.5x102 내지 107 cell/㎖, 0.5x102 내지 106 cell/㎖, 1x103 내지 108 cell/㎖ 또는 1x104 내지 107 cell/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "겔화제(gelatinizer)"는 유동성이 있는 액체를 고체로 바꿔주는 물질을 의미하며, 구체적으로, 세포의 배양 배지에 포함되어 고체 형태의 배양 배지를 제조할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 겔화제는 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 물질이면 어떤 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 아가로즈, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 히알루론산 및 마트리겔 등을 포함할 수 있다. 상기 겔화제는 통상의 기술자에 의해 적절량으로 첨가될 수 있으며, 구체적으로, 0.5 내지 10%(w/v), 0.5 내지 8%(w/v), 0.5 내지 6%(w/v), 0.5 내지 4%(w/v), 0.5 내지 2%(w/v), 0.7 내지 10%(w/v), 0.7 내지 8%(w/v), 0.7 내지 6%(w/v), 0.7 내지 4%(w/v) 또는 0.7 내지 2%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
상기 겔화제를 포함하는 배양 배지는 간세포의 배양에 사용될 수 있다고 공지된 모든 종류의 배양 배지를 사용할 수 있으며, 상기 배양 배지에 첨가되는 항생제, 보충제 등은 필요에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에서, 상기 세포 및 겔화제가 포함된 배양 배지는 1:0.1 내지 10, 1:0.1 내지 5, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 3, 1:0.1 내지 2, 1:0.5 내지 10, 1:0.5 내지 5, 1:0.5 내지 4, 1:0.5 내지 3, 1:0.5 내지 2의 부피비로 혼합될 수 있다. 상기 부피비로 혼합된 세포 및 겔화제가 포함된 배양 배지는 튜브에 주입하여 겔화될 수 있다. 상기 튜브(tube)는 생체 적합성 소재, 예를 들면, 폴리올레핀, 폴리디메틸실록산, 실리콘, 유리 및 라텍스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 제조된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "간소엽 구역화 인자"는 생체 내에서 간소엽의 구역화에 관여하는 것으로 알려진 인자들을 의미한다. 예를 들면, 간소엽의 1구역에 존재하는 간세포는 산소가 풍부하고, 3구역에 존재하는 간세포는 산소가 적은 것에 기초하여, 상기 간소엽 구역화 인자는 산소를 증가시키거나 산소를 감소시킴으로써 간세포를 구역화시킬 수 있는 인자일 수 있다. 일례로, 상기 간소엽 구역화 인자는 Wnt/β-카테닌 신호전달 조절인자, 산소의 농도구배 조절인자, 물질대사능 조절인자 및 호르몬 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로, β-카테닌, 산소, 과산화수소, 이산화탄소, 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene), CYP 유도인자, CYP 억제인자 및 인슐린을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질"은 상기 서술한 바와 같은 간소엽 구역화 인자를 조절할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질은 상기 서술한 바와 같은 간소엽 구역화 인자를 조절하는 것으로 알려진 물질이면 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, CHIR, Wnt3 단백질, 산소, 과산화수소, 인슐린 및 3-메틸콜란트렌 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에서 상기 간소엽 구역화 인자 또는 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질은 겔화된 세포의 양 말단에 위치할 수 있다. 상기 겔화된 세포의 양 말단에 위치한 간소엽 구역화 인자 또는 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질은 겔화된 세포로 확산됨으로써, 농도구배를 형성할 수 있다. 이와 같이 간소엽 구역화 인자 또는 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질에 의해 농도구배가 형성된, 겔화된 세포를 배양함으로써 구역화된 간소엽 모사체를 제조할 수 있다. 상기 배양은 통상적으로 간소엽이 구역화되는 기간동안 수행될 수 있고, 구체적으로, 상기 배양은 3 내지 20일, 3 내지 15일, 3 내지 10일, 3 내지 8일, 4 내지 20일, 4 내지 15일, 4 내지 10일, 4 내지 8일, 5 내지 20일, 5 내지 15일, 5 내지 10일, 5 내지 8일, 6 내지 20일, 6 내지 15일, 6 내지 10일, 6 내지 8일일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 간세포인 HepaRG 세포를 아가로즈가 포함된 배양 배지와 혼합하여 폴리올레핀 튜브에 주입하고 겔화시켰다. 겔화된 간세포가 포함된 폴리올레핀 튜브의 양 말단에 DMSO 및 CHIR을 각각 위치시켜, 겔화된 간세포에 CHIR의 농도구배를 형성시켰다. 이를 7일 동안 배양하여 간세포로부터 구역화된 간소엽 모사체를 제조하였다(도 1 참조). 상기 제조된 구역화된 간소엽 모사체에서 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 CYP1A, CYP2E 및 CYP3A4의 발현 및 활성이 증가하였다(도 2 참조).
따라서, 상기로부터 겔화된 간세포에 구역화를 유도할 수 있는 인자를 농도구배로 형성시킴으로써 구역화된 간소엽 모사체를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체를 제공한다.
본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체는 상술한 바와 같은 제조 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 상기 구역화된 간소엽 모사체는 간세포를 튜브 내에서 겔화시키고, 겔화된 간세포의 양 말단에 간소엽 구역화 인자 또는 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질의 농도구배를 형성시킨 뒤, 배양함으로써 제조될 수 있다. 상기 겔화제는 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 물질이면 어떤 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 아가로즈, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 히알루론산 및 마트리겔 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 간소엽 구역화 인자는 Wnt/β-카테닌 신호전달 조절인자, 산소의 농도구배 조절인자, 물질대사능 조절인자 및 호르몬 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 한편, 상기 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질은 CHIR, Wnt3 단백질, 산소, 과산화수소, 인슐린 및 3-메틸콜란트렌 등일 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 간소엽이 구역화되는 기간동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 간세포인 HepaRG 세포를 아가로즈가 포함된 배양 배지와 혼합하여 폴리올레핀 튜브에 주입하고 겔화시켰다. 겔화된 간세포가 포함된 폴리올레핀 튜브의 양 말단에 DMSO 및 CHIR을 각각 위치시켜, 겔화된 간세포에 CHIR의 농도구배를 형성시켰다. 이를 7일 동안 배양하여 간세포로부터 구역화된 간소엽 모사체를 제조하였다(도 1 참조). 상기 제조된 구역화된 간소엽 모사체에서 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 CYP1A, CYP2E 및 CYP3A4의 발현 및 활성이 증가하였다(도 2 참조).
따라서, 상기로부터 겔화된 간세포에 구역화를 유도할 수 있는 인자를 농도구배로 형성시킴으로써 구역화된 간소엽 모사체를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체를 절편화하여 세포생존율을 분석하는 단계를 포함하는 구역별 간독성 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체는 상술한 바와 같은 제조 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 상기 구역화된 간소엽 모사체는 간세포를 튜브 내에서 겔화시키고, 겔화된 간세포의 양 말단에 간소엽 구역화 인자 또는 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질의 농도구배를 형성시킨 뒤, 배양함으로써 제조될 수 있다. 상기 겔화제는 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 물질이면 어떤 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 아가로즈, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 히알루론산 및 마트리겔 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 간소엽 구역화 인자는 Wnt/β-카테닌 신호전달 조절인자, 산소의 농도구배 조절인자, 물질대사능 조절인자 및 호르몬 조절인자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 한편, 상기 간소엽 구역화 인자를 조절하는 물질은 CHIR, Wnt3 단백질, 산소, 과산화수소, 인슐린 및 3-메틸콜란트렌 등일 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 간소엽이 구역화되는 기간동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체는 1 내지 3구역으로 구역화된 특징을 갖고 있어, 이를 절편화함으로써 각 구역에 따른 특성을 갖는 간세포만을 수득할 수 있다. 이에, 수득된 간세포를 96웰에 위치시켜 세포생존율이나 간독성 관련 유전자 또는 단백질을 분석하여 간독성을 평가할 수 있다. 상기 세포생존율, 또는 간독성 관련 유전자나 단백질의 분석은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포생존율 분석은 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드], XTT[소듐 3'-[1-[(페닐아미노)-카보닐]-3,4-테트라졸리움]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠-설포닉에시드 하이드레이트], MTS[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움)], WST(테트라졸리움 염), NRU(neutral red uptake) 및 칼세인 AM(calcein AM)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 한편, 간독성 관련 유전자나 단백질의 분석은 PCR, 웨스턴 블롯 등의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 폴리올레핀 튜브에 주입하여 겔화시킨 간세포에 CHIR의 농도구배를 형성시킴으로써 구역화된 간소엽 모사체를 제조하였다.
한편, 세포 추적 딥 레드를 이용하여 형광 추적 가능한 HepaRG 세포를 이용하여 구역화된 간소엽 모사체를 제조하고, 여기에 아세트아미노펜을 처리함으로써 간독성을 평가한 결과, 세포 및 CHIR은 아세트아미노펜의 노출 여부에 관계없이 분포하였으나, 아세트아미노펜에 의해 사멸된 세포는 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 높았다(도 3 참조).
또한, 구역화된 간소엽 모사체에 구역에 따른 간독성을 나타내지 않는 타목시펜과 3구역 특이적 간독성을 나타내는 아세트아미노펜을 처리하여 간독성을 평가한 결과, 타목시펜은 구역에 관계없이 간독성을 나타내었으나, 아세트아미노펜은 3구역 특이적으로 간독성을 나타내었고, 이는 랫트 동물모델을 사용한 실험 결과과 일관되었다(도 4 및 5 참조).
나아가, 이와 같은 아세트아미노펜에 의한 간독성을 나타낸 간세포에서는 괴사 관련 단백질이 절단된 PARP(cleaved PARP)의 발현이 증가하였다(도 6 참조).
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체를 간독성 물질 스크리닝에 사용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 구역화된 간소엽( liver lobule) 모사체의 제조
간을 구성하는 구조단위인 간소엽 모사체를 구역화된 형태로 다음과 같이 제조하였다(도 1). 이때, 세포 내 β-카테닌의 양을 증가시키고, 그에 따른 약물대사효능을 증가시켜 간의 구역에 따라 다른 약물반응을 나타나게 하는 CHIR[C6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)]을 사용하였다.
먼저, 완전히 분화된 HepaRG 세포(Biopredic Internation)를 0.1% DMSO, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10% 우태아혈청(FBS), 5 ㎍/㎖의 인슐린, 50 μM의 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 포함된 윌리엄' E(Willian' E) 배양 배지(Gibco)로 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 10% FBS 대신 20% FBS를 포함하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 조성이 동일한 윌리엄' E 배양 배지를 이용하여 1x105 cell/㎖이 되도록 현탁하였다.
한편, 2% L-글루타민, 2% 페니실린/스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖의 인슐린, 100 μM의 하이드로코르티손이 포함된 윌리엄' E 배양 배지 1 ㎖에 20 ㎎의 저융점(low melting temperature) 아가로즈(Sigma Aldrich, 미국)를 첨가하고, 이를 90℃에서 2시간 동안 녹여 고형 배지를 준비하였다. 이때, 일반적으로 사용되는 아가로즈는 융점이 높아 세포를 회수하는 과정에서 열에 의해 세포를 손상시킬 수 있어 저융점 아가로즈를 사용하였다. 준비된 고형 배지에, 상기 현탁된 세포를 부피비로 동량을 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 지름 3 ㎜, 길이 9 ㎝의 폴리올레핀(polyolefin) 튜브에 주입하여, 상기 혼합액이 튜브의 가운데 위치하도록 하였다. 상기 튜브가 휘어지지 않도록 고정하고, 37℃의 온도하에서 겔화시켰다. 겔화된 세포를 포함하는 튜브의 양끝에 비히클(vehicle)인 0.1% DMSO만 포함된 HepaRG 배양 배지와 0.1% DMSO에 β-카테닌 억제제인 9 μM의 CHIR이 용해된 윌리엄' E 배양 배지를 각각 위치시켰다. 즉, 상기와 같이 튜브의 양끝에 0.1% DMSO 및 CHIR이 용해된 0.1% DMSO를 위치시킴으로써, 확산에 의해 CHIR이 이동하도록 하였다. 상기 튜브를 37℃의 온도하에서 7일 동안 배양하여, 구역화된 간소엽 모사체를 제조하였다.
실시예 2. 간 구역화 인자인 CHIR이 처리된 HepaRG 세포에서의 약물대사활성 차이 확인
간 구역화 인자인 CHIR을 처리한 HepaRG 세포가 약물대사활성에서 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, CYP1A 및 CYP3A4 약물대사효소는 루시페린-1A2(luciferin-1A2, Promega, 미국) 및 루시페린-IPA(luciferin-IPA, Promega, 미국)를 실시예 1에서 제조된 구역화된 간소엽 모사체에 처리한 뒤, 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 한편, CYP2E는 CYP2E에 특이적으로 대사하는 300 μM의 클로르족사존(chlorzoxazone)을 처리한 뒤, LC/MC를 사용하여 대사체인 6-하이드록시 클로르족사존(6-hydroxy chlorzoxazone)을 측정함으로써 평가하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 상대적으로 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 CYP1A, CYP2E 및 CYP3A4의 발현 및 활성이 증가하였다(도 2).
이로부터 구역화된 간소엽 모사체의 제조시에 처리된 CHIR에 의해 세포 내부에서 β-카테닌을 분해하는 GSK-3B 효소의 발현이 억제됨으로써, β-카테닌에 의해 CYP1A, CYP2E 및 CYP3A4의 발현 및 활성이 증가한 것을 알 수 있었다. 증가된 약물대사효소능은 체내의 약물 대사를 촉진시켜 유독한 대사체를 과량 생성하게 한다.
실험예 1. 구역화된 간소엽 모사체를 이용한 간독성 평가-(1)
제조된 구역화된 간소엽 모사체에 아세트아미노펜을 처리한 뒤, 다음과 같은 방법으로 간독성을 평가하였다.
먼저, 세포 추적 딥 레드(cell tracker deep red) 형광액을 이용하여 HepaRG 세포의 내부에 불투과성 형광물질을 형성시킴으로써, 상기 HepaRG 세포의 위치를 추적할 수 있도록 제조하였다. 제조된 HepaRG 세포를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 구역화된 간소엽 모사체를 제조하였다. 상기 구역화된 간소엽 모사체를 10 mM의 아세트아미노펜(APAP)이 포함된 배양 배지에 넣어 48시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로서는 아세트아미노펜이 포함되지 않은 배양 배지를 사용하였다. 배양 후, 배지를 제거하고, EthD-1(ethdium homodimer-1) 염색약을 이용하여 죽은 세포를 염색하였다. 염색된 세포는 chemi-Doc(Bio-Rad)을 이용하여 650 내지 657 ㎚, 302 ㎚, 및 625 내지 650 ㎚의 파장에서 각각 형광을 측정함으로써, 딥 레드 형광액, CHIR 또는 EthD-1로 염색된 세포를 확인하였다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 세포 추적 딥 레드 형광액은 아세트아미노펜의 노출 여부에 관계없이 세포 전반적으로 고른 분포를 보였고, 3B에 나타난 바와 같이 CHIR도 확산에 의해 균일한 기울기로 분포하였다. 한편, 도 3C에 나타난 바와 같이, 죽은 세포를 염색한 EthD-1은 상대적으로 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 높은 형광강도를 나타내었다(도 3).
따라서, 상기로부터 CHIR에 의해 간소엽 모사체의 구역화가 일어났으며, 구역에 따라 아세트아미노펜에 대한 독성이 다르게 나타남을 확인하였다.
실험예 2. 구역화된 간소엽 모사체를 이용한 간독성 평가-(2)
구역화된 간소엽 모사체를 이용하여 아세트아미노펜 및 타목시펜에 대한 간독성을 다음과 같은 방법으로 평가하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 구역화된 간소엽 모사체가 포함된 튜브 6개를 각각 정확하게 6등분 하였다. 96웰 플레이트에 상기 각각의 튜브에서 얻어진 첫 번째 구역화된 간소엽 모사체 조각을 첫 번째 줄에 웰당 하나씩 배치하였다. 두 번째 내지 여섯 번째 조각 역시 96웰 플레이트의 두 번째 내지 여섯 번째 줄에 각각 배치하였고, 이때 배양 배지로서 0.1%의 DMSO가 포함된 배지를 사용하였다. 한편, 간독성을 평가하기 위한 약물로서 3구역(zone 3) 특이적 간독성을 나타내는 약물인 아세트아미노펜과, 구역 특이적 간독성을 나타내지 않는 타목시펜을 사용하였다. 구체적으로, DMSO에 아세트아미노펜을 2 M의 농도가 되도록 원액을 제조하고, 이를 다시 12.5, 25, 50, 100 또는 200 mM의 농도가 되도록 0.1% DMSO가 포함된 배양 배지에 희석하였다. 한편, 타목시펜은 DMSO에 1 M의 농도가 되도록 원액을 제조하고, 이를 다시 31.2, 62.5, 125, 250 또는 500 μM의 농도가 되도록 0.1% DMSO가 포함된 배양 배지에 희석하였다. 상기 희석된 200 mM의 아세트아미노펜 및 500 μM의 타목시펜을 96웰 플레이트의 1열에 각각 200 ㎕씩 첨가하고, 100 mM의 아세트아미노펜 및 250 μM의 타목시펜을 2열에 각각 200 ㎕씩 첨가하였다. 이와 같은 방식으로 96웰의 6열에는 아세트아미노펜 및 타목시펜이 포함되지 않은 배지를 첨가하였다. 상기 96웰 플레이트를 37℃의 온도하에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포를 PBS로 세척하고, 셀 카운팅 키트-8(cell counting kit-8, Dojindo Molecular Technologies)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값으로부터 세포 생존율을 계산한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 구역화된 간소엽 모사체를 제조하는 과정에서 상대적으로 고농도의 CHIR에 노출된 간세포에서 아세트아미노펜에 대한 독성이 더욱 민감하였다(도 4A). 한편, 타목시펜의 경우 간세포에 노출된 CHIR의 농도와 관계없이 낮은 세포활성을 나타내었다(도 4B).
이로부터, CHIR이 고농도로 분포하는 구역에 위치하는 간세포에서 아세트아미노펜의 약물대사가 많이 일어나 독성 중간 대사체가 많이 생성되고, 이로 인해 CHIR이 저농도로 분포하는 구역보다 세포독성에 민감한 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 구역화된 간소엽 모사체를 이용한 간독성 평가-(3)
구역화된 간소엽 모사체를 이용한 간독성 평가 결과를 동물모델을 사용하여 수행된 결과와 비교하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 스프라그 다우니 레트(Sprague Dawley rat)에 1,000 ㎎/㎏의 아세트아미노펜 또는 60 ㎎/㎏의 타목시펜을 하루에 1회씩 3일 동안 경구투여하였다. 투여 후, 마우스를 희생시켜 수득된 간조직을 H&E 염색약으로 염색하여 현미경으로 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 구역화된 간소엽 모사체를 이용한 결과와 동일하게 아세트아미노펜은 3구역인 간의 중심정맥에서 독성에 의한 유사분열 증가(노란색 삼각형), 괴사(파란색 삼각형) 및 염증세포 침투(초록색 삼각형) 등이 관찰된 반면, 타목시펜은 구역에 상관없이 간 전반적으로 간세포 비대(hypertropy)가 유발되었다(도 5).
따라서, 상기로부터 본 발명에서 제조된 구역화된 간소엽 모사체는 동물 모델과 동일하게 구역에 따른 간독성을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 3. 구역화된 간소엽 모사체에서의 단백질 발현 변화 확인
독성이 유발되거나, 유발되지 않은 구역화된 간소엽 모사체에서 간독성과 관련된 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 구역화된 간소엽 모사체가 포함된 튜브 3개를 각각 정확하게 3등분 하였다. 6웰 플레이트에 상기 각각의 튜브에서 얻어진 첫 번째 구역화된 간소엽 모사체 조각을 한 줄에 웰당 하나씩 배치하였다. 두 번째 및 세 번째 조각 역시 6웰 플레이트의 두 번째 및 세 번째 줄에 각각 배치하였고, 이때 배양 배지로서 0.1%의 DMSO가 포함된 배지를 사용하였다. 여기에 10 mM의 아세트아미노펜을 첨가하여 48시간 동안 세포를 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 각각의 웰에 5x RIPA 완충액 및 4x 샘플 완충액을 첨가하고 90℃에서 10분 동안 가열하여 아가로스 젤을 녹였다. 여기에 3 내지 5 unit의 아가레이즈(agarase)를 첨가하고 42℃에서 90분 동안 교반하였다. 교반이 끝난 뒤, 수득된 단백질을 10-웰 농도구배 젤(10-well gradient gel)에 로딩하고 80 V의 전압에서 약 2시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동된 단백질을 셀룰로오스 시트(cellulose sheet)에 옮긴 뒤, 상기 셀룰로오스 시트를 10% 탈지유로 전처리하였다. 여기에 1차 항체로서 β-카테닌, CYP2E1 또는 PARP 항체를 첨가하여 반응시켜서 단백질 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 간세포의 구역화에 의해 1구역에 비해 3구역에 존재하는 간세포에서 β-카테닌 및 CYP2E1 단백질의 발현이 증가하였으며, 아세트아미노펜을 처리한 구역화된 간소엽 모사체에서 3구역에 존재하는 간세포에서 괴사(necrosis)와 관련된 단백질인 절단된 PARP(cleaved PARP)가 확인되었다(도 6).
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 구역화된 간소엽 모사체는 간의 구역에 따른 간독성을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

1) 간세포를 겔화제가 포함된 배양 배지와 혼합하여 튜브에 주입하여 겔화시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 겔화된 간세포에 CHIR[C6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)]의 농도구배를 형성시키고 배양하는 단계를 포함하는 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 겔화제가 0.5 내지 10%(w/v)의 농도로 포함되는, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 간세포가 0.5x102 내지 1x1010 cell/㎖의 농도인, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 및 겔화제가 포함된 배양 배지가 1:0.1 내지 10의 부피비로 혼합된, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 겔화제가 아가로즈, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 히알루론산 및 마트리겔로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
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제1항에 있어서, 상기 농도구배가 CHIR이 튜브의 양 말단에 위치하여 확산됨으로써 형성되는, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양이 3 내지 20일 동안 수행되는, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 튜브가 폴리올레핀, 폴리디메틸실록산, 실리콘, 유리 및 라텍스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 제조된, 구역화된 간소엽 모사체 제조 방법.
제1항의 방법으로 제조된 구역화된 간소엽 모사체.
제11항의 구역화된 간소엽 모사체를 절편화하여 세포생존율을 분석하는 단계를 포함하는 구역별 간독성 스크리닝 방법.
KR1020180027627A 2018-03-08 2018-03-08 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법 KR102017110B1 (ko)

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