KR20140103914A - 운반물 경피 전달을 포함하는 타켓 전달용 다공성 나노입자-지지 지질 이중층(프로토셀) 및 그 방법 - Google Patents

운반물 경피 전달을 포함하는 타켓 전달용 다공성 나노입자-지지 지질 이중층(프로토셀) 및 그 방법 Download PDF

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KR20140103914A
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glycero
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cancer
inhibitor
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칼리 에린 애슐리
씨. 제프리 브린커
에릭 씨. 칸스
모하마드 하우만 페크라자드
린다 에이. 펠턴
오스카 네그레티
데이비드 패트릭 파디야
브라이언 에스. 윌킨슨
댄 씨. 윌킨슨
셰럴 엘. 윌먼
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에스티씨. 유엔엠
샌디아 코포레이션
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Abstract

본 발명은 간세포 및 기타 암 세포를 특이적으로 표적화하기 위한 프로토셀(protocell)에 관한 것으로, 이는 지지된 지질 이중층(lipid bilayer)을 갖고 있는 나노다공성 실리카 코어, 암세포 죽음을 가능케하는 약제 적어도 1종 (예로서, 전통적인 소분자, 거대분자 운반물 (예, siRNA 또는 리신 독소 A-쇄 또는 디프테리아 독소 A-쇄와 같은 단백질 독소) 및/또는 상기 나노다공성 실리카 코어에 배치되어 있는 히스톤-패키징된 플라스미드 DNA (바람직하게는 상기 DNA가 프로토셀 중으로 더욱 효율적으로 패키징되도록 슈퍼코일상이고, 암세포의 핵내에 프로토셀이 위치하는 것과 암세포의 치료(세포자살/세포 죽음)에 관련된 펩타이드를 발현시킬 수 있는 능력을 돕기 위하여 핵 위치 서열을 사용하여 임의로 개질시킨다) 또는 리포터로서, 치료할 조직에서 암세포를 표적화하여 표적화된 세포에 대한 프로토셀의 결합이 특이적이고 증진되도록 하는 표적화 펩타이드 및 프로토셀과 캡슐화된 DNA의 엔도좀 탈출을 촉진시키는 융합성 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따르는 프로토셀은 간세포 조직에 선택적으로 결합하거나 암치료 및 약물 발견을 포함한, 암의 진단에 작용하는 신규한 결합 단백질(c-MET 펩타이드)을 사용하여 암, 특히 간세포(간) 암을 포함한 암의 치료에 사용될 수 있다.

Description

운반물 경피 전달을 포함하는 타켓 전달용 다공성 나노입자-지지 지질 이중층(프로토셀) 및 그 방법{POROUS NANOPARTICLE-SUPPORTED LIPID BILAYERS (PROTOCELLS) FOR TARGETED DELIVERY INCLUDING TRANSDERMAL DELIVERY OF CARGO AND METHODS THEREOF}
관련 출원 및 정부 지원
본 발명은 2011년 10월 14일자로 출원된 발명의 명칭 “경피 운반물 전달용 엔지니어링 나노다공성 입자-담지 지질 이중층(‘프로토셀’)”의 미합중국 가출원 일련번호 제 61/547,402호와, 2011년 12월 21일자로 출원된 발명의 명칭 “경피 운반물 전달용 엔지니어링 나노다공성 입자-담지 지질 이중층(‘프로토셀’)”의 미합중국 가출원 일련번호 제 61/578,463호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
또한, 본 발명은 2011년 12월 19일자로 출원된 발명의 명칭 “타켓 프로토셀에 의한 치료적 거대분자 운반물의 전달”의 미합중국 가출원 일련번호 제 61/577,410의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명은 미국국립보건원(the National Institutes of Health)의 승인번호 PHS 2 PN2 EY016570B; 미국국립암연구소(the National Cancer Institute)에 의해 수여된 승인번호 1U01CA151792-01; 미국공군과학연구소(the Air Force Office of Scientific Research)의 승인번호 FA 9550-07-1-0054/9550-10-1-0054; 미국국립환경보건과학원(NIEHS)의 1U19ES019528-01; 미국국립과학재단(National Science Foundation)의 NSF : EF-0820117 및 미국국립과학재단의 DGE-0504276의 정부지원 하에 이루어졌다. 미합중국 정부는 본 발명에 대한 일정한 권한을 보유한다.
기술분야
본 발명의 일 구현예는 환자 체내의 특정 타켓팅 세포, 특히 간 세포 및 다른 암 세포들을 포함하는 타켓팅 세포용 프로토셀에 관한 것이며, 상기한 프로토셀은 1) 나노 다공성 실리카 또는 금속 산화물 코어와; 2) 담지된 지질 이중층과; 3) 암세포 사멸을 촉진하는 적어도 하나의 약제(전통적인 저분자와 같은), 거대분자 운반물(예컨대, siRNA, shRNA, 다른 마이크로 RNA, 또는 리신 독소 A-사슬 또는 디프테리아 독소 A-사슬과 같은 단백질 독소) 및/또는 이중 사 혹은 선형 DNA를 포함하는 DNA, 초나선형(supercoiled) 및/또는 히스톤으로 패키징될 수 있고 나노 다공성 실리카 코어 내에 배치(프로토셀 내에 DNA를 보다 효율적으로 패키징하기 위한 초나선형이 바람직)되며 선택적으로는 암세포의 치료(세포자살/세포 죽음)와 관련된 펩타이드 또는 리포터로서의 발현능과 암세포의 핵 내에 프로토셀을 위치시키는데 도움이 되도록 핵 위치 서열로 개질된 플라즈미드 DNA, 타켓 암세포에 대한 프로토셀의 특이적이고 향상된 결합으로 조직 내의 타켓 암세포를 치료하는 타켓팅 펩타이드, 프로토셀 및 캡슐화된 DNA를 포함하는 운반물의 엔도솜 이탈을 촉진하는 융합성 펩타이드로 구성된다. 본 발명에 따른 프로토셀은 암 치료, 특히 간세포에 특이적으로 결합하는 신규한 결합 펩타이드(c-MET 펩타이드)를 이용하는 간암 치료에 사용되거나, 또는 암 치료 및 약물 전달을 포함하는 암 진단에 있어 작용하도록 사용될 수 있다.
특정 구현예에 있어서는, 본 발명의 프로토셀은 광범위하게 다양한 활성 유효성분의 전달을 용이하게 한다. 중요하게는, 이들 프로토셀은 피부각질층 투과성을 효과적으로 향상시키고 거대 분자를 포함하는 활성 유효성분의 경피 전달을 가능하게 한다.
또 다른 구현예에 있어서는, 본 발명은 위장과 같은 환경 중에서 광범위한 활성 유효성분의 전달에 유용한 안정하고, 소수성 및 초소수성인 다공성 나노입자를 제공한다.
특정 또 다른 구현예에 있어서는, 본 발명은 광범위한 활성 유효성분의 전달에 유용한 경피 프로토셀과, NIV의 뉴클레오캡시드 단백질(NIV-N) mRNA의 서열 특이적 붕괴를 유도하는 siRNA가 로딩된 다수의 다공성 나노미립자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀과, 위장 내에서 광범위한 활성 유효성분의 전달을 가능하게 하는 위장-부유성 프로토셀을 제공한다.
나노담체 내에 캡슐화된 약물의 타켓 전달은 통상적인 ‘유리(free)’약물의 경우에 나타나는 질환 세포의 박멸에 있어 투여량의 단계적 확대 필요성을 방지하고 정상 세포에 대한 비특이적 독성으로 귀결되는 열등한 용해성, 제한된 안정성, 급속 제거성 및, 특히 선택성 결여를 포함하는 수많은 문제점들을 개선할 잠재적 가능성이 있다. 암 맥관 구조의 향상된 투과성 및 암 부위에 대한 나노담체의 축적에 관한 종양 림프액의 감소된 배출 효능(소위 향상된 투과성 및 보유는, 또는 EPR 효과)에 의존적인 수동적 타켓 설계는, 이러한 많은 문제점을 해소하고 있지만, 나노담체의 내재화를 유도하기에 필요한 세포-특이적 상호 작용의 결여는 치료 효능을 저감시키고 약물 추방 및 다수의 약재 저항성을 유도하는 결과를 초래할 수 있다.
나노의학에 있어서의 도전 과제 중 하나는, 운반물, 예컨대 약제를 고농도로, 세포막을 가로질러, 그리고 예정된 시간 동안 타켓 부위에 제어 가능하게 방출하는 상기한 운반물을 효과적으로 캡슐화할 수 있는 물질 및 나노구조를 설계하는 것이다. 더욱 최근에는, 코우마린, 아조벤젠, 로텍산, 중합체, 또는 나노 입자를 사용하는 게이팅 방법이 입자 내에 운반물을 밀봉하고 광학적 또는 전기화학적 자극에 따라 제어 방출을 허용하도록 개발되어 왔다.
리포좀은 낮은 면역원성과 저독성으로 인하여 약물 전달에 광범위하게 사용되어 왔지만, 여러 관점에서 여전히 개선의 필요성이 있다. 첫째로, 운반물의 로딩은 리포좀이 제조된 조건 하에만 이루어질 수 있다. 따라서 운반물의 범주 및 농도는 제한적일 수 있다. 둘째로, 리포좀의 안정성이 상대적으로 낮다.리포좀의 지질 이중층은 종종 노화되고 융합되는 경향을 나타내며, 이는 리포좀의 크기 및 크기 분포를 변화시키게 된다. 셋째로, 리포좀 내의 운반물의 방출은 방출 제어를 곤란하게 만드는 리포좀의 순간적인 파열에 의해 이루어진다.
나노다공성 실리카 입자에 대한 리포좀의 융합을 통하여 형성되는 다공성 나노입자-담지 지질 이중층(프로토셀)은 암치료 및 암진단의 타켓 전달과 연관된 많은 도전 과제를 제시하는 신규한 유형의 나노담체이다. 리포좀가 유사하게, 프로토셀은 생체적합성, 생분해성 및 비면역원성이나, 다공성 실리카 코어는 유사한 크기의 리포좀 전달 제제와 비교할 때 대폭적으로 향상된 운반물 용량 및 장기간의 이중층 안정성을 부여한다. 더욱이, 코어의 다공성 및 표면 화학은 약물, 핵산, 단백질 독소와 같은 광범위한 치료학적 제제의 캡슐화를 촉진하도록 개질될 수 있다. 운반물 방출율은 포어 크기, 화학적 조성 및 코어의 실리카 축합 전율(overall degree), 파열 또는 제어된 방출 프로파일의 어느 것인가에 요구되는 용도에 있어 유용하게 제작되는 프로토셀에 의해 변화될 수 있다. 마지막으로, 프로토셀의 담지된 지질 이중층(SLB)은 순환 시간 연장을 위하여 PEG로, 그리고 선택적 전달을 촉진하기 위하여 리간드로 다양하게 개질될 수 있다.
화학요법 치료제의 활성을 개선하고 암 치료 요법을 향상시킬 필요성이 여전히 존재한다. 활성 부위에 근접하게 화학요법 치료제를 침착(depositing)시키며 암에 대한 향상된 침략성, 결합성 및 목표 지향성에 대한 선택적 시도와 결부된 프로토셀의 사용은 암 치료요법에 있어 중요한 측면이다. 본 발명은, 암 치료요법제의 투여 개선이던 또는 암진단의 개선이던지 간에, 암을 진단하고 암 치료요법을 모니터링하기 위한 시도를 용이하게 하기 위한 치료요법적 성과에 영향을 미칠 수 있는 제제의 전달을 개선하고 암 치료요법 기술을 개선하기 위하여 착수된 것이다.
또한 종전에 덜 유리한 다른 경로를 통한 투여로 제한되었던 활성 유효성분들의 전달을 최적하게 가능하게 하도록 피부각질층을 투과하도록 디자인된 경피 전달 비이클에 대한 필요성이 존재하고 있다.
본 발명의 목적은 프로토셀 기술, 프로토셀 자체, 이러한 프로토셀을 포함하는 약제학적 조성물 및 프로토셀을 사용하는 방법, 그리고 치료요법 모니터링을 포함하는 치료요법 및 진단을 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 대한 개선점 제공에 관한 것이다.
본 발명의 구현예들에 대한 부가적인 목적은 신규한 MET 결합 펩타이드, 약제학적 조성물에 있어서의 그 사용 및, 본 발명의 다른 구현예들에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및/또는 다른 목적은 본 명세서 중에 제시된 바와 같은 상세한 설명의 리뷰로부터 용이하게 얻어질 수 있다.
본 발명의 구현예들은 세포의 특이적 타켓팅을 위한 프로토셀, 특정 관점에서는 간암세포 또는 다른 암세포의 특이적 타켓팅을 위한 프로토셀에 관한 것이다.
특정 관점에서는, 본 발명은 담지된 지질 이중층을 가지는 나노 다공성 실리카 또는 금속 산화물을 포함하는 코어와,
세포 타켓팅 종(species);
프로토셀과 캡슐화 DNA의 앤도좀 이탈을 촉진하는 융합성 펩타이드 및, 이중 나선 선상 DNA 또는 플라즈미드 DNA로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종의 운반물 성분을 포함하는 다른 운반물;
약물;
조영제,
작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA, 또는 이들의 혼합물로
이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종의 성분으로 구성되는 세포-타켓팅 다공성 프로토셀에 관한 것이며,
여기서, 상기한 운반물 성분의 1종은 선택적으로 핵 위치 서열과 더욱 컨쥬게이션된다.
특정 구현예에 있어서는, 본 발명의 구현예에 따른 프로토셀이, 담지된 지질 이중층을 가지는 나노 다공성 실리카 또는 금속 산화물을 포함하는 코어와; 암세포 죽음을 촉진하는 전통적인 저분자, 거대분자 운반물(예컨대, 그 중에서도 S565, S7824 및/또는 S10234와 같은 siRNA, shRNA, 또는 리신 독소 A-사슬 또는 디프테리아 독소 A-사슬과 같은 단백질 독소) 및/또는 나노 다공성 실리카 코어 내에 배치(본 명세서 중에서 달리 언급되지 않는 한, 운반물 요소로서의 프로토셀 내로 DNA를 더욱 효율적으로 패키징하기 위한 초나선형이 바람직)되고 선택적으로 치료요법(암세포의 자살/세포 죽음)과 관련된 펩타이드 또는 진단용 리포터(본 명세서 중에 달리 언급되지 않는 한 그 중에서도 형광 그린 단백질, 형광 레드 단백질)로서의 발현능과 암세포의 핵 내로 플라즈미드를 국소화/제공함에 있어 도움이 되는 핵 위치 서열로 개질될 수 있는 패키징된 플라즈미드 DNA(특정 구현예에 있어서는 히스톤 패키징된)와 같은 암 세포 사멸을 용이하게 할 수 있는 적어도 1종의 치료요법제를 포함하는 운반물로 구성된다. 본 발명에 따른 프로토셀은 타켓 세포에 대한 프로토셀의 특이적이고 향상된 결합으로 치료 대상 세포(예컨대, 치료 대상 조직 내의 암세포)를 치료하는 타켓팅 펩타이드와, 프로토셀 및 캡슐화된 DNA의 엔도솜 이탈을 촉진하는 융합성 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 프로토셀은 치료 요법 또는 진단에 사용될 수 있으며, 더욱 특정하게는 암치료 및 다른 질병, 예컨대, 특히 간암과 같은 바이러스성 감염증의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 관점에 있어서는, 프로토셀이 치료를 위한 암조직(예컨대, 여러 조직 중에서도 간암, 난소암 및 자궁경부암)에 특이적으로 결합하는 신규한 결합 펩타이드(본 명세서 중에 달리 언급되지 한 MET 결합 펩타이드)를 사용하거나, 및/또는 암치료 및 약물 전달의 모니터링을 포함하는 암의 진단에 사용된다.
어떤 관점에 있어서는, 본 발명의 구현예에 따른 프로토셀이 담지된 지질 이중층을 가지는 나노다공성 실리카 코어를 종종 포함하는 다공성 나노입자 프로토셀을 포함한다. 본 발명의 이러한 관점에 있어서는, 본 명세서 중에서 달리 언급되지 않는 한, 프로토셀이 종종 MET 수용체 결합 펩타이드인 타켓팅 펩타이드를 포함하며, 종종 프로토셀의 표면에 융합성 펩타이드와 결합되어 있다. 상기한 프로토셀은 다양한 치료요법적 및/또는 진단적 운반물을 적재할 수 있으며, 상기한 운반물의 예로서는, 저분자(특히 항암 및/또는 항바이러스성의 예컨대 HBV 및/또는 HCV의 치료를 위한 치료요법제 및/또는 진단제), 치료요법제일 수 있으며, 핵 위치 서열을 포함하는 히스톤-패키징되고 초나선형으로될 수 있는 플라즈미드 DNA 또는 RNA(shRNA 및 siRNA)를 포함하는 뉴클레오티드 및 폴리펩타이드를 포함하는 거대 분자, 및/또는 진단제(예컨대, 그 중에서도 형광 그린 단백질/FGP, 형광 레드 단백질/FRP를 포함하는 형광 펩타이드와 같은 리포터 분자를 포함)를 들 수 있다.
본 발명의 경피 구현예는 (a) 1종 또는 그 이상의 약제학적으로 활성인 제제가 로딩되고 (b) 지질 이중층을 담지하며 그에 의해 캡슐화된 다공성 나노미립자를 포함하는 프로토셀을 포함하고, 본원에서 지질 이중층은 단일 포화 오메가-9 지방산(올레인산, 엘라이딘산, 에이코세노인산, 미드산, 에루인산 및, 너보닌산, 가장 바람직하게는 올레인산), 알코올, 디올(가장 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)), R8 펩타이드, 담즙 염, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 에테르, 단사슬 계면 활성제(예컨대, 소듐 데옥시콜레이트)와 같은 탄성부여성분으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 피부 각질층 투과성-개선제를 포함하며, 프로토셀은 약 50nm에서 약 300nm 사이의 평균 직경, 더욱 바람직하게는 약 55nm 내지 약 270nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 60nm 내지 약 240nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 210㎚ 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 190㎚ 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 160nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 130nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 100nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 90nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 80nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 75nm 사이, 더욱 바람직하게는 약 65nm 내지 약 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75nm 사이의 평균 직경을 가지며, 가장 바람직하게는 약 70nm 부근이다.
따라서 일 양태에 있어서의 본 발명은 (a) 1종 또는 그 이상의 약제학적으로 활성인 제제가 로딩되고 (b) 지질 이중층을 담지하며 그에 의해 캡슐화되어 있는 다수의 다공성 나노미립자를 포함하는 경피 프로토셀이 제공되며, 본원에서, 지질 이중층은 단일 포화 오메가-9 지방산, 알코올, 디올, 용매, 조용매, 투과성 촉진 펩타이드 및 뉴클레오티드, 탄성부여성분으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 피부 각질층 투과성-개선제를 포함하며, 프로토셀은 약 50nm에서 약 300nm 사이의 평균 직경을 가진다. 단일 불포화 오메가-9 지방산은 올레인산, 에라이딘산, 에이코세노인산, 미드산, 에루신산 및 너보닌산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 올레인산 및 그 혼합물이다. 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올과, 그 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있고, 용매 및 조용매는 PEG 400 및 DMSO로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 디올은 에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜, 그 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 탄성부여성분은 담즙염, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 에테르, 단사슬 계면 활성제, 그리고 그 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서는, 탄성부여성분이 소듐 데옥시콜레이트이다.
경피 투여 경로는 경구 경로 및 비경구 주사 경로보다 우수한 투여 경로이다. 경구적으로 투여된 약물은 1차 대사되고 소화 경로의 널은 pH 범위 및 음식물과 부정적인 상호작용을 겪게 된다. 비경구 주사 투여는 고통스럽고 생체 유해성 폐기물을 생성하게 되며 자가 투여될 수 없다. 경피 약물 전달은 경구 및 비경구 주사 경로 양자에 관련된 전술한 모든 문제를 다루게 된다. 부가 적으로, 경피 전달 시스템(TDDS)은 수일간에 걸쳐 지속되는 제어된 방출 프로파일을 가능하게 한다. 그러나 경피 약물 전달과 관련된 주된 문제는 피부의 최외곽층인 표피의 각질층에 놓여 있다. 그것은 “브릭 및 모르타르”와 유사한 구조에 의하여 피부 장벽 기능을 부여한다. “브릭”은 단백질, 글리코단백질, 지방산, 콜레스테롤이 풍부한 납작하게 된 죽은 세포로 구성된다. “모르타르”로 구성되는 세포 사이 공간은, 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산으로 구성되는 이중층이 풍부하고, 부탄올과 유사한 극성을 나타낸다. 지난 40 여년간, 3 세대의 TDDS가 개발되어 왔다. 1세대 시스템은 저분자량의 친유성 화합물의 확산을 이용하고 있다. 2세대 및 3세대 시스템은 각질층의 투과성이 실마리라는 사실을 인식하고 있다. 이러한 전략은 각질층을 제거/우회하거나 또는 각질층의 투과성이 증대되도록 만들기 위해 화학적 개선제, 생화학적 개선제 및, 기전력을 이용한다. 다른 개선 전략 중에서도, 리포솜은 고도로 정렬된 각질층 구조를 교란시키고 그에 따라 피부 투과성을 증가시키는 것으로 확인되어 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, TDDS로서 제공되는 나노다공성 입자-담지 지질 이중층(“프로토셀”)의 개발에 대하여 기술하기로 한다. 프로토셀은 나노다공성 실리카 입자 코어에 리포좀을 정전기적으로 융합하여 형성한다. 상기한 프로토셀은 무기 나노입자와 리포좀 양자의 장점을 상승적으로 결합하며, 즉 무기 나노입자는 다공도의 조절이 가능하며 그 큰 표면적은 이질적인 유형의 운반물을 고용량으로 로딩처리 가능하고 담지된 지질 이중층(SLB)은 다양한 분자로 개질될 수 있어 유동성의 조절이 가능하다. 이러한 생물리적 및 생화학적 특성들은 프로토셀을 다른 용도에 개질할 수 있게 해 준다. 유도결합 플라즈마 질량 분석기를 사용한 예비 연구에 있어서, 8.125mg으로 투여된 표준 프로토셀 제형(55% DOPE, 30% 콜레스테롤, 15% PEG-2000)의 0.1-0.5wt%가 환자 유래 복부 피부의 전 두께를 가로질러 통과할 수 있다는 사실이 확인되었다. 이 외에도, 프로토셀의 0.3-2.4wt%가 각질층이 제거된 부분적 두께를 지니는 피부를 가로질러 통과할 수 있다는 것을 입증하였다.
경피 프로토셀의 나노다공성 실리카 입자 코어는 큰 표면적, 용이하게 변경 가능한 다공도 및, 용이하게 개질 가능한 표면 화학을 가진다. 이러한 특성은 프로토셀 코어가 많은 다른 유형의 운반물을 고용량으로 로딩할 수 있게 해준다. 프로토셀의 담지된 지질 이중층(SLB)은 본질적으로 낮은 면역원성을 지닌다. 또한 SLB는 타켓 세포 흡수를 용이하게 하기 위하여 펩티드, 폴리머 및 다른 분자들이 컨쥬게이트될 수 있는 유체 표면을 제공한다. 이러한 생물리학적 및 생화학적 특성은 프로토셀이 특정 환경에 최적화되고, 피부 각질층 내로의 침투를 용이하게 하며, 그에 따라 경피 경로를 통하여 이질적인 유형의 운반물을 전달할 수 있게 해 준다. 암치료 방법은 본 발명의 경피 프로토셀의 치료요법적 사용의 일례이다. 관련된 약제학적 조성물도 기술된다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리 메톡시실란(AEPTMS)와 같은 아민 함유 실란으로 개질되고, (a) siRNA 또는 리신 독소 A-사슬이 로딩되고, (b) 지질 이중층을 담지하며 그에 의해 캡슐화된 다수의 음으로 하전된 나노다공성의 나노미립자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀을 제공하며, 본원에서, 상기한 지질 이중층은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1′-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-S-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 그 혼합물/조합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 지질을 포함하고, 본원에서 상기한 지질 이중층은 양이온성 지질 및 1종 또는 그 이상의 양쪽성 인지질을 포함한다.
전술한 단락의 구현예에서, 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1′-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 그 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 프로토셀은 하기의 특성 중 적어도 하나를 보유한다: 약 600m2/g 보다 큰 BET 표면적, 약 60% 내지 약 70% 사이의 세공 부피 분율, 약 20nm 내지 약 30nm 사이의 평균 직경을 가지는 세공으로 구성되는 다중모드 세공 형태학, 약 5nm 내지 약 15nm 사이의 평균 직경을 가지는 세공에 의해 상호 연통된 표면 접근 가능한 세공. 바람직하게는, 프로토셀이 1010 나노미립자 실리카 코어 당 10 nM siRNA 정도를 캡슐화하는 것이다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 AEPTMS와 같은 아민 함유 실란으로 개질되고, (a) 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 D1 및, 사이클린 E로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 사이클린 수퍼패밀리 멤버를 타켓으로 하는 1종 또는 그 이상의 siRNA가 로딩되며, (b) 지질 이중층을 담지하며 그에 의해 캡슐화된 다수의 음으로 하전된 나노다공성의 나노미립자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀을 제공하되, 상기한 지질 이중층은 1,2-디올레오일-sn-글리세로 -3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1′-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-S-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 그 혼합물/조합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 지질을 포함하고, (1) 상기한 지질 이중층은 SP94 및 엔도조몰리틱 펩타이드가 로딩되며, (2) 상기한 프로토셀이 간세포 암종 세포에 특이적으로 결합한다.
전술한 단락의 구현예에 있어서, 지질 이중층은 DOPC/DOPE/콜레스테롤/PEG-2000이 대략 55:5:30:10의 질량비로 구성되는 것이 바람직하다.
간암과 같은 암치료 방법은 본 발명의 AEPTMS 개질 프로토셀의 치료요법적 사용의 일례이다. 관련된 약제학적 조성물도 기술된다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 (a) 니파 바이러스(NiV) 뉴클레오캡시드 단백질(NiV-N) mRNA의 서열 특이적 붕괴(degadation)를 유도하는 siRNA가 로딩되고, (b) 지질 이중층을 담지하며 그에 의해 캡슐화된 다수의 다공성 나노미립자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀을 제공하며, 본원에서 상기한 지질 이중층은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1′-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-S-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 그 혼합물/조합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 지질을 포함한다.
전술한 단락의 프로토셀의 특정 구현예에 있어서는, 지질 이중층이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 폴리에틸렌 글리콜, 타켓팅 펩타이드 및, R8과, 각각의 미립자가 100nm 부근의 평균 직경과, 1,000m2/g 보다 큰 평균 표면적과, 20nm 내지 25nm 사이의 평균 직경을 가지는 표면 접근 가능한 세공과, 1010 또는 그 이상의 입자 당 1μM 정도의 siRNA가 로딩되는 다공성의 나노미립자 실리카 코어로 구성된다. 타켓팅 펩타이드는 바람직하게는 에프린 B2 (EB2), 가장 바람직하게는 TGAILHP(SEQ ID NO: 18)에 결합하는 펩타이드이다. 가장 바람직하게는, 프로토셀이 0.01 내지 0.02wt% 부근의 TGAILHP와, 10 wt% 부근의 PEG-2000과, 0.500wt% 부근의 R8로 구성된다.
니파 바이러스(NiV) 감염 위험이 있거나 또는 그에 감염된 환자를 치료하는 방법은 니파 바이러스(NiV) 뉴클레오캡시드 단백질(NIV-N) mRNA의 서열 특이적 붕괴를 유도하는 siRNA를 포함하는 본 발명의 프로토셀의 치료요법적 사용의 일례이다. 관련된 약제학적 조성물도 기술된다.
본 발명의 다른 측면의 구현예들은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 첨가제 및, 부형제와 조합하여 제형화되는 동일하거나 상이할 수 있는 프로토셀 집단으로 구성된다. 프로토셀은 단독으로 제형화되거나 또는 치료되는 질병 및 투여 경로(본 명세서 중에서 달리 언급되지 않는 한)에 따라 또 다른 생활성제(bioactive agent)와 조합하여 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 특정 목적(예컨대, 암치료요법을 포함하는 치료요법, 또는 암치료요법의 모니터링을 포함하는 진단)을 위하여 개질된 상태의 프로토셀을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 첨가제 및, 부형제와 조합하여 특정 목적 및 투여 경로를 위한 프로토셀의 효과적인 집단으로 구성될 수 있다.
또한 본 발명의 일 구현예는 본 명세서 중에 기재된 바와 같은 신규한 프로토셀을 이용하는 방법에 관한 것이다. 따라서 선택적인 구현예에 있어서, 본 발명은 본 명세서 중에 달리 언급되지 않는 한, 어려움에 처한 환자나 피험자에게 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병 및/또는 증상의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 특히 암을 포함한 수많은 질병 상태, 그리고 암의 원인이 되거나 암에 의해 2차적으로 발생되는 질병 상태나 증상(특히, HBV 및/또는 HCV 감염증)의 치료에 특히 유용하다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 암진단 방법, 즉 환자에 있어 암을 확진하기 위하여 암세포에 진단 시약이나 리포터 조영제를 선택적으로 전달하도록 개질된 프로토셀 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것으로 구성된다. 이 방법에 있어서는, 본 발명에 따른 프로토셀이 폴리펩타이드 또는 일반적으로 세포막 성분에 대한 표면 수용체를 발현하는 암세포에 결합하는 적어도 1종의 타켓 펩타이드의 포접을 통하여 타켓 암세포에 맞추도록 조정될 수 있으며, 이것이 타켓팅 펩타이드의 목적이고, 암세포를 표적으로 하는 프로토셀의 리포터 성분(조영제를 포함)의 포접을 통하여, 표준과 리포터로부터의 신호를 비교하는 것에 의하여 환자 또는 피험자의 암성 조직의 존재 및 크기를 확진하는데 사용될 수 있다. 표준은, 예컨대, 건강한 환자 집단 또는 진단된 질병을 가지는 것으로 확인된 환자 집단으로부터 얻어질 수 있다.일단 진단되면, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 이용한 적절한 치료요법, 또는 선택적인 치료요법이 시행된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서는, 본 발명에 따른 조성물을 이용한 치료요법을 포함하여, 본 발명에 따른 조성물은 특정 질병 상태 및/또는 증상의 치료 진전 정도를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 있어서, 암세포 결합에 특이적이고 리포터 성분을 포함하는 프로토셀 집단으로 구성되는 조성물을 치료요법이 적용되는 환자 또는 피험자에 투여하는 것으로, 질병 상태의 치료 진전 정도를 모니터링 할 수 있게 된다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 명세서 중에 달리 언급되지 않는, 한 5종의 신규한 MET 결합 펩타이드에 관한 것으로서, 이는 본 발명의 특정 구현예의 프로토셀에 대한 타켓팅 펩타이드로서 사용될 수 있거나, 또는 암성 조직중의 수많은 다른 세포 중에서도 간, 자궁경부 및 난소 세포를 포함하는 광범위한 암세포에 결합하는 MET 단백질의 장점을 지니는 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예는 MET 수용체(또한 주지된 바와 같이, 유전자 c-MET에 의해 발현되는 간세포 성장 인자 수용체)에 대한 신규한 결합 펩타이드로서의 활성을 나타내는 5종의 다른 7 mer 펩타이드에 관한 것이다. 이들 5종의 7 mer 펩타이드는 다음과 같다:
ASVHFPP (Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro) SEQ ID NO: 1
TATFWFQ (Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln) SEQ ID NO: 2
TSPVALL (Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu) SEQ ID NO: 3
IPLKVHP (Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro) SEQ ID NO: 4
WPRLTNM (Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met) SEQ ID NO: 5
이들 펩타이드 각각은 단독으로 사용되거나 또는 상기한 그룹 내의 다른 MET 결합 펩타이드 또는 본 발명의 구현예에 따른 프로토셀을 수많은 다른 암세포 중에서도 간암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포 및, 자궁경부암 세포를 포함하는 암세포에 결합하는데 도움이 될 수 있는 다른 타켓 펩타이드(예컨대, 본 명세서 중에 기재한 바와 같은 SP94 펩타이드)의 스펙트럼과 조합하여 사용될 수 있다. 또한 이들 결합 펩타이드는 암 치료 및 그 외 간세포 성장 인자 결합 수용체의 저해를 위한 MET 결합 펩타이드로서 단독으로 약제학적 조성물 중에 사용될 수 있다. 이들 펩타이드는 단독으로 제형화되거나 또는 의도하는 결과를 얻을 목적으로 다른 생활성제와 조합화여 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 첨가제, 또는 부형제와 조합하여, 그리고 선택적으로 항암제, 항바이러스제 또는 다른 생활성제를 포함할 수 있는 부가적인 생활성제와 조합하여, 상기한 5종의 MET 결합 펩타이드 중 적어도 1종을 유효량 포함한다.
세포의 특이적 타켓팅을 위한 프로토셀, 특정 관점에서는 간암세포 또는 다른 암세포의 특이적 타켓팅을 위한 프로토셀에 도움이 된다.
도 1은 에어로졸-보조식 EISA 공법으로 제조된 본 발명에 사용되는 실시양태 중 하나에 따르는 나노입자가 입자 크기와 분포를 조절하기 위하여 변경될 수 있음을 나타낸다.
도 2는 복수 타입의 운반물에 대해 맞춤식으로 디자인되었으며 에어로졸화된 보조 성분이 하나의 실시양태에 따라서 용이하게 내포되는 세공 크기와 프레임워크를 나타낸다.
도 2A는 도 2의 a, b, c, 및 e는 CTAB, B58, P123 및 PS+B56에 의해 주형화되고, A, B, C, D 및 E는 CTAP+NaCl, 3 중량% P123, 3 중량% P123+폴리(프로필렌 글리콜 아크릴레이트), 미세유액 및 CTAB(NH4)2SO4에 의해 주형화됨을 나타낸다.
도 3은 세공 표면 화학 (즉, 전하 및 소수성)과 세공 크기가 원칙적으로는 오가노-실란과 실릭산의 동시-축합에 의해 하나의 실시양태에 따른 동시-자가-조립 또는 자가-조립후 유도체화에 의해 조절됨을 나타낸다. 하기 문헌을 참조한다: Lin, et al., Chem. Mater. 15, 4247-56 2003; Liu, J. et al., J. Phys. Chem., 104, 8328-2339, 2000; Fan, H. et al., Nature, 405, 56-60, 2000 and Lu, Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 5258-5261, 2000.
도 4는 히스톤 단백질을 갖는 CB1 플라스미드의 패키징을 묘사한 것이다. (A)는 CB1 플라스미드(pCB1), 히스톤 1H, H2A, H2B, H3, 및 H4를 갖는 패키지 슈퍼코일상 pCB1을 슈퍼코일링하고, 생성된 pCB1-히스톤 복합체를 핵의 세공을 통한 전좌를 촉진하는 핵 위치 서열(NLS)로 개질시키는데 사용되는 공번을 도식적으로 설명하는 것이다. (B)와 (D)는 원자력 현미경(AFM)의 화상으로 (B)는 CB1 플라스미드의 화상이고 (D)는 히스톤-패키징된 pCB1의 화상이다. 스케일 막대 = 100 nm. (C)와 (E)는 각각 (B)와 (D)에서 적색선에 상응하는 높이 프로필을 나타낸다.
도 5는 히스톤-패키징된 pCB1이 부하된 MC40-표적화된 메조다공성 실리카 나노입자-지지된 지질 이중층(프로토셀)의 합성을 도식화한 것이다. (A) DNA-부하된, 펩타이드-표적화된 프로토셀을 생성시키는데 사용하는 공법을 도식적으로 묘사한 것이다. pCB1-히스톤 복합체의 용액에 나노입자를 단순히 침지시킴으로써 히스톤-패키징된 pCB1을 프로토셀의 코어를 형성하는 메조다공성 실리카 나노입자중에 부하한다. 이어서, 페길레이트된 리포좀을 DNA-부하된 코어에 융합시켜 지지된 지질 이중층(SLB)를 형성시키고 이 이중층은 HCC와 내재화된 프로토셀의 엔도좀 탈출을 촉진하는 엔도조몰리틱 펩타이드(H5WYG)에 결합하는 표적화 펩타이드(MC40)으로 추가로 개질시킨다. 술프히드릴-대-아민 가교결합기 (스페이서 암 = 9.5 nm)를 사용하여 C-말달 시스테인 잔기로 개질된 펩타이드를, SLB중의 DOPE 부위에 접합시킨다. (B) 프로토셀의 코어로 사용되는 메조다공성 실리카 나노입자의 투과 전자 현미경(TEM) 화상. 스케일 막대 = 200 nm. Inset = 주사 전자 현미경(SEM) 화상, 이는 15-25 nm 세공이 표면-접급성임을 증명한다. Inset 스케일 막대 = 50 nm. (C) 동적 광산란법(DLS)에 의해 측정된 바와 같은, 메조다공성 실리카 나노입자에 대한 크기 분포. (D, 왼쪽 축) Barrett-Joyner-Halenda(BJH)모델을 사용하여 도 S-4A에 나타낸 질소 흡수 등열의 흡착 분기(adsorption branch)로부터 계산된, 메조다공성 실리카 나노입자에 대한 축적식 세공 용적 플롯. (D, 오른쪽 축) DLS에 의해 측정된 바와 같은, pCB1-히스톤 복합체에 대한 크기 분포.
도 6은 메조다공성 실리카 나노입자가 히스톤-패키징된 pCB1에 대해 높은 용약을 갖고 있으며, 생성된 프로토셀은 실시양태 중 하나에 따르는 엔도좀 환경을 모방한 조건하에서만 캡슐화된 DNA를 방출시킴을 보여준다. (A) 개질되지 않은 메조다공성 실리카 나노입자(ξ=-38.5 mV) 또는 APTES, 아민-함유 실란으로 개질된 메조다공성 실리카 나노입자(ξ=+11.5 mV)내에 캡슐화될 수 있는 pCB1 또는 히스톤-패키징된 pCB1('복합체')의 농도. (B) 1x106개의 세포/mL가 1x109 개의 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀과 24시간 동안 37℃에서 배양되었을 때, pCB1에 의해 암호화된 녹색 형광 단백질인, ZsGreen에 대해 포지티브가 되는 Hep3B의 퍼센트. x-축은 프로토셀이 APTES로 개질되었는지 여부와 pCB1이 히스톤과 미리-패키징되었는지 여부를 명시한다. DOTAP와 DOPE의 혼합물(1:1 w/w)과 패키징된 pCB1은 (A)와 (B)에 대조군으로 포함되었다. (C)와 (D) 시뮬레이팅된 체액 (C) 또는 pH 5 완충액(D)에 노출시 개질되지 않은 메조다공성 실리카 나노입자 및 대응하는 프로토셀로부터 히스톤-패키징된 pCB1의 시간-의존적 방출. 프로토셀 SLB는 5 중량%의 DOPE, 30 중량%의 콜레스테롤, 및 10 중량%의 PEG-2000과 함께 DOPC로 이루어져 있으며, (B)의 경우, 0.015 중량%의 MC40 및 0.500 중량%의 H5WYG로 개질시켰다. 모든 에러 막대는 n=3에 대해서 95% 신뢰 구간(1.96 σ)을 나타낸다.
도 7은 MC40-표적화된 프로토셀에 의해 히스톤-패키징된 pCB1을 HCC로 운반하는 과정이 도식적으로 묘사되어 있다. [1] MC40-표적화된 프로토셀은 Hep3B에 높은 친화도로 결합하는데 이는 다양한 HCC 세포주에 의해 과-발현되는, Met에 대한 표적화 펩타이드를 사용할 수 있기 때문이다. 유체 DOPC SLB는 펩타이드 이동을 촉진하며, 따라서, 낮은 MC40 밀도로 개질된 프로토셀이 Hep3B에 대해 높은 특이적 친화도를 보유할 수 있도록 한다 (도 8A 참조). [2] MC40-표적화된 프로토셀은 수용체-매개된 내포작용(endocytosis)을 통하여 Hep3B에 의해 내재화된다 (도 8B 및 도 15A를 참조). [3] 엔도좀 상태는 SLB를 불안정하게 만들어 [Nature Materials ref를 삽입] H5WYG 엔도조몰리틱 펩타이드의 양자화를 일으키는데, 이 둘다 히스톤-패키징된 pCB1이 Hep3B 세포에 분산되도록 한다 (도 16B 참조). [4] 핵 위치 서열(NLS)로 개질되었을 때, pCB1-히스톤 복합체는 대략 24시간내에 Hep3B 세포의 핵에 농축되기 시작하는데, 이는 분할 및 비-분할 암세포 둘다의 효율적인 형질감염을 가능케 한다 (도 17 참조).
도 8은 MC40-표적화된 프로토셀이 HCC에 높은 친화도로 결합하며 Hep3B에 의해 내재화되지만 정상적인 간세포에 의해서는 내재화되지 않음을 보여준다. (A) Hep3B 또는 간세포에 노출되었을 때 MC40-표적화된 프로토셀에 대한 겉보기 해리 상수(Kd); Kd 값은 특이적 친화도에 역비례로 관련있으며 포화 결합 곡선으로부터 측정하였다 (도 S-11 참조). 에러 막대는 n=3에 대해서 95% 신뢰 구간(1.96 σ)을 나타낸다. (B) 및 (C) 1000배 과량의 MC40-표적화된 프로토셀에 1시간 동안 37℃에서 노출시킨, Hep3B (B)와 간세포(C)의, 공초점 형광 현미경 화상. Met는 488-표지된 모노클론 항체로 착색되었으며(녹색), 프로토셀 코어는 Alexa Fluor®594(적색)으로 표지시켰고, 세포 핵은 Hoechst 33342(청색)으로 착색되었다. 스케일 막대 = 20 ㎛. 프로토셀 SLBs는 5 중량%의 DOPE, 30 중량%의 콜레스테롤, 및 10 중량%의 PEG-2000(18:1)을 갖는 DOPC로 이루어져 있으며 0.015 중량% (A-C) 또는 0.500 중량%(A)의 MC40 표적화 펩타이드로 개질된 것이다.
도 9는 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀이 HCC의 세포자살을 피코몰 농도에서 유도하지만 정상적인 간세포의 생존성에 대해서는 최소의 영향을 갖고 있음을 보여준다. Hep3B를 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀에 37℃에서 계속 노출시켰을 때 사이클린 B1 mRNA 및 사이클린 B1 단백질 의 발현에 있어서 투여량(A) 및 시간(B) 의존성 감소. 세포를 다양한 pCB1 농도에 48시간 동안 노출시키고(A) 5 pM의 pCB1에 다양한 시간 동안 노출시켰다(B). 간세포중 사이클린 B1 단백질 및 Hep3B중 ZsGreen의 발현을 대조군으로 포함시킨다. 실시간 PCR 및 면역형광을 이용하여 각각 사이클린 B1 mRNA와 단백질 농도를 측정하였다. (C) MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀에 37℃에서 다양한 기간 동안 연속 노출시킨 후 G2/M 상에 정지되기 시작하는 Hep3B의 퍼센트. G2/M 상의 간세포와 S 상의 Hep3B의 퍼센트를 비교용으로 포함시킨다. 세포는 세포 사이클 분석전에 Hoechst 33342로 착색시켰다. (D) MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀([pCB1]=5 pM)에 37℃에서 다양한 기간 동안 연속 노출시켰을 때 세포자살하게 되는 Hep3B의 퍼센트. 세포자살의 마커에 대해 포지티브인 간세포의 퍼센트를 대조군으로 포함시켰다. Alexa Fluor®647-표지된 아넥신 V에 대해 포지티브인 세포는 세포자살의 초기 단계에 있는 것으로 간주되는 반면, 아넥신 V와 요오드화프로피듐 둘다에 대해 포지티브인 세포는 말기 단계의 세포자살의 말기 단계에 있는 것으로 간주된다. 세포자살 세포의 총수는 단독- 및 이중-포지티브 세포의 수를 더하여 결정하였다. 모든 실험에서, 프로토셀 SLBs는 5 중량%의 DOPE, 30 중량%의 콜레스테롤, 및 10 중량%의 PEG-2000(18:1)을 갖는 DOPC로 이루어져 있으며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질된 것이다. 모든 에러 막대는 n=3에 대해서 95% 신뢰 구간(1.96 σ)을 나타낸다.
도 10은 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀이 상응하는 리포플렉스보다 2500배 더 효과적으로 HCC의 선택적 세포자살을 유도함을 보여준다. (A) DOPC 프로토셀, 10 중량%의 PEG-2000(18:1)로 개질된 DOPC 프로토셀, pCB1과 DOTAP 및 DOPE(1:1 w/w)의 혼합물로 이루어진 리포플렉스, 및 10 중량% PEG-2000으로 개질시킨 DOTAP/DOPE 리포플렉스에 대한 제타 전위값. 모든 제타 전위 측정은 0.5XPBS (pH 7.4)에서 수행되었다. (B, 왼쪽 축) MC40-표적화된 프로토셀 또는 리포플렉스를 통하여 운반된, 5 pM의 pCB1에 48시간 동안 37℃에서 연속 노출시 세포자살하게 되는 Hep3B와 간세포의 퍼센트. (B, 오른쪽 축) 37℃에서 48시간내에 1x106개의 Hep3B 세포의 90%가 세포자살하게 유도하는데 필요한 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀 또는 리포플렉스의 수. (B)의 경우, 세포를 Alexa Fluor® 647-표지된 아넥신 V 및 요오드화 프로피듐으로 착색시켰으며; 단일- 및 이중-포지티브 세포는 세포자살인 것으로 간주하였다. 프로토셀 SLBs는 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(표시되었을 때)를 갖는 DOPC로 이루어져 있으며 0.015 중량%의 MC40 및 0.500 중량%의 H5WYG로 개질된 것이다. DOTAP/DOPE 리포플렉스는 10 중량%의 PEG-2000(표지되었을 때), 0.015 중량%의 MC40, 및 0.500 중량%의 H5WYG로 개질시켰다. pCB1은 모든 실험에서 NLS로 개질시켰다. 모든 에러 막대는 n=3에 대해서 95% 신뢰 구간(1.96 σ)을 나타낸다.
도 11은 MC40-표적화된 프로토셀이 고농도의 탁솔, Bcl-2-특이적 siRNA, 및 pCB1을 HCC로 간세포의 생존성에 영향을 주지 않고 운반함을 보여준다. (A) 1012개의 프로토셀, 리포좀, 또는 리포플렉스내에 캡슐화시킬 수 있는, 탁솔, Bcl-2의 발현을 사일런싱시키는 siRNA, 및 CB1 플라스미드의 농도. 적색 막대는 탁솔과 pCB1이 프로토셀내에 부하되었을 때 이들 둘의 농도가 어떻게 변화되는지를 나타낸다. 청색 막대는 탁솔, siRNA, 및 pCB1이 모두 프로토셀내에 부하될 때 또는 siRNA와 pCB1이 리포플렉스내에 부하될 때 이들의 농도가 어떻게 변화되는지를 나타낸다. (B) MC40-표적화된 프로토셀을 통하여 Hep3B로 운반되었을 때 Oregon Green®488-표지된 탁솔(녹색), Alexa Fluor® 594-표지된 siRNA(적색), 및 Cy5-표지된 pDNA(백색)의 세포내 분포를 보여주는 공초점 형광 현미경 화상. 고정시키고 Hoechst 33342(청색)으로 착색시키기 전에 세포를 1000배 과량의 MC40-표적화된 프로토셀과 함께 24시간 동안 37℃에서 배양시켰다. 스케일 막대 = 10 ㎛. (C) 10 nM의 탁솔 및/또는 5 pM의 pCB1에 48시간 동안 37℃에서 노출시 G2/M 상에 정지된, Hep3B, SNU-398, 및 간세포의 분율. 분율은 G2/M에서 로그상으로-성장하는 세포의 퍼센트에 대해 정규화하였다. (D) 10 nM의 탁솔, 250 pM의 Bcl-2-특이적 siRNA, 및/또는 5 pM의 pCB1에 48시간 동안 37℃에서 노출시 Alexa Fluor® 647-표지된 아넥신 V와 요오드화 프로피듐(PI)에 대해 포지티브가 되는, Hep3B, SNU-398, 및 간세포의 퍼센트. (C) 및 (D)에서, 'pCB1'은 DOTAP와 DOPE의 혼합물(1:1 w/w)을 사용하여 패키징되어 있고 세포에 비-특이적으로 전달되는 pCB1을 언급한다. 모든 실험에서, 프로토셀 SLBs는 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량%의 PEG-2000(18:1)을 갖는 DOPC로 이루어져 있으며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시킨 것이다. 리포플렉스는 DOTAP:DOPE(1:1 w/w) 혼합물로 이루어져 있으며 10 중량%의 PEG-2000, 0.015 중량%의 MC40, 및 0.500 중량%의 H5WYG로 개질시킨 것이다. pCB1은 모든 실험에서 NLS로 개질된 것이다. 모든 에러 막대는 n=3에 대해서 95% 신뢰 구간(1.96 σ)을 나타낸다.
도 12는 CB1 플라스미드에 대한 벡터 맵을 제공한다. 상기 CB1 플라스미드(pCB1)는 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 벡터 (Clontech Laboratories, Inc.; Mountain View, CA) 및 pNEB193 벡터(New England BioLabs, Inc.; Ipswich, MA)로부터 작제하였다. pCB1은 사이클린 B1-특이적 소형 헤어핀 RNA (shRNA) 및 조안투스 종(Zoanthus sp) 녹색 형광 단백질(ZsGreen)을 암호화한다. 항상성 shRNA 발현은 RNA Pol III-의존성 사람 U6 프로모터(PU6)에 의해 구동되고, 항상성 ZsGreen 발현은 사이토메갈로바이러스(PCMVIE)의 이메디에이트 어얼리 프로모터에 의해 구동된다. ori 및 AmpR 요소들은 이. 콜리(E. coli) 내에서 플라스미드를 증폭시킬 수 있다. 사이클린 B1-특이적 shRNA의 센스 및 안티센스 가닥을 암호화하는 DNA 서열은 밑줄쳐져 있고, dsDNA 올리고뉴클레오타이드를 pSIREN 벡터에 도입하기 위해 사용된 제한 효소 부위(적색 BamHI 및 청색 EcoRI)에 의해 플랭킹되어 있다.
도 13은 히스톤-팩키징된 pCB1의 특성을 도시한다. (A) 증가하는 농도의 히스톤 (몰비가 1:2:2:2:2인 H1, H2A, H2B, H3, 및 H4)에 노출된 pCB1에 대한 전기영동 이동성 전위 분석. pCB1:히스톤 몰비는 레인 3-6에 대해 주어진다. 레인 1은 DNA 래더를 함유하고, 레인 2는 부가된 히스톤이 없는 pCB1을 함유한다. (B) 히스톤 팩키징된 pCB1(1:50 pCB1:히스톤 몰비)의 TEM 이미지. 스케일 막대 = 50 nm.
도 14는 로딩되지 않은 다공성 실리카 나노입자 및 pCB1-로딩된 다공성 실리카 나노입자의 질소 흡착 분석을 도시한다. (A) 히스톤 팩키징된 pCB1으로 로딩하기 전후 다공성 실리카 나노입자에 대한 질소 흡착 등온선. (B) 히스톤 팩키징된 pCB1으로 로딩하기 전후 다공성 실리카 나노입자의 브루나우어-에멧-텔러(Brunauer-Emmett-Teller) (BET) 표면적. 오차 막대는 n=3에 대해 95% 신뢰 구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 15는 DOPC 프로토셀에 대한 소형 각 중성자 분산(SANS) 데이타를 도시한다. 상기 데이타 피트(fit)는 일정한 두께의 등각 쉘을 갖는 다분산 다공성 실리카 구형에 대한 모델을 사용하여 수득하였고 공극 개방부에 걸쳐 있는 실리카 입자의 표면에 36-이중층이 존재함을 보여준다. 0, 20, 및 60 Å의 이중층 두께에 대한 모방된 SANS 데이타는 비교용으로 포함된다. 36 Å의 측정된 이중층 두께는 평판 지지된 지질 이중층에 대해 수행된 다른 중성자 연구(33-38Å)와 일치하고 이들 대조적인 조건하에서 주로 지질 이중층의 수소 풍부 탄화수소 코어로부터의 분산을 나타낸다.
도 16은 프로토셀이 뉴클레아제 분해로부터 캅셀화된 DNA를 보호함을 보여준다. DNAase I-처리된 pCB1(레인 3), 히스톤-팩키징된 pCB1(레인 5), DOTAP 및 DOPE의 1:1 혼합물과 함께 팩키징된 pCB1(레인 7), 양이온성 코어를 갖는 프로토셀내 로딩된 pCB1(레인 9) 및 음이온성 코어를 갖는 프로토셀에 로딩된 히스톤-팩키징된 pCB1(레인 11), 누출된 pCB1(레인 2), 히스톤으로부터 방출된 pCB1(레인 4), DOTAP/DOPE 지질복합체로부터 방출된 pCB1(레인 6), 양이온성 코어를 갖는 프로토셀로부터 방출된 pCB1(레인 8) 및 음이온성 코어를 갖는 프로토셀로부터 방출된 히스톤-팩키징된 pCB1(도 10)의 아가로스 겔 전기영동은 비교용으로 포함된다. 레인 1은 DNA 래더를 함유한다. 샘플은 30분동안 실온에서 DNase I(DNA 50ng 당 1 유닛)으로 항온처리하고 pCB1 방출은 1% SDS를 사용하여 자극하였다.
도 17은 다공성 실리카 나노입자("비변형된 코어"), 20%(v/v) APTES 중에서 12시간동안 실온에서 적셔진 다공성 실리카 나노입자('APTES-변형된 코어'), CB1 플라스미드('pCB1'), 히스톤-팩키징된 pCB1('pCB1-히스톤 복합체'), 및 DOTAP 및 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물('DOTAP/DOPE 지질복합체')로 팩키징된 pCB1에 대한 제타 전위(ξ) 값을 보여준다. 제타 전위 측정은 0.5 X PBS(pH 7.4) 중에서 수행하였다. 오차 막대는 n=3에 대해 95% 신뢰 구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 18은 도 6 및 24에서 ZsGreen 발현에 대해 양성인 세포의 %를 결정하기 위해 사용되는 대표적인 정배향 스캐터-측면 스캐터(FSC-SSC) 플롯 및 FL-1 히스토그램을 보여준다. (A) - (D) 세포 파쇄물을 배척하기 위해 게이팅되거나(A) 게이팅되지 않은(C) FSC-SSC 플롯 (A 및 C) 및 상응하는 FL-1 히스토그램(각각 B 및 D). FL-1 채널에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값은 (B) 및 (D)에 나타낸다. (E) - (H) 세포 파쇄물을 배척하기 위해 게이팅되거나(E) 게이팅되지 않은(G) ZsGreen-양성 세포에 대한 FSC-SSC 플롯(E 및 G) 및 상응하는 FL-1 히스토그램 (각각 F 및 H). (F) 및 (H) 상에서의 게이트는 MFI=282, 즉 ZsGreen-음성 세포의 100 X MFI를 갖는 세포 %에 상응한다(패널 D 참조).
도 19는 MC40 표적화 펩타이드의 동정을 도시한다. 도면에 제시된 도식은 MC40 표적화 펩타이드를 선택하기 위해 사용되는 과정을 도시한다. 1 x 1011 pfu/mL의 펩타이드는 1시간동안 실온에서 100 nM의 재조합 사람 Met (rhMet)으로 항온처리하고, 사람 IgG의 Fc 도메인에 융합시킨다. 단백질 A 또는 단백질 G-피복된 자기 입자를 사용하여 Met-파아지 복합체를 친화성으로 포획하고 이어서 결합되지 않은 파아지를 제거하기 위해 TBS (150mM NaCl과 함께 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)로 10회 세척하였다. 결합된 파아지 클론은 저-pH 완충액(1 mg/mL BSA과 함께 0.2M 글라이신, pH 2.2)로 용출시키고, 용출물은 숙주 세균 (이. 콜리 ER2738)의 감염을 통해 증폭시켰다.
도 20은 MC40 표적화 펩타이드의 특성을 도시한다. (A) 5회 선별 후 펩타이드 서열 정렬; 우세한 서열, ASVHFPP (서열번호 1)은 이전에 동정된 Met-특이적 12량체 YLFSVHWPPLKA(서열번호 15, Zhao, et al. ClinCancerRes 2007;13(20 6049-6055))의 볼드체 부분과 유사하다. 표적-관련되지 않은 HAIYPRH 펩타이드 (~10%) (서열번호 16, Brammer, et al., Anal.Biochem.373(2008)88-98)를 나타내는 파아지 클론을 서열 정렬로부터 제거하였다. (B) 및 (C) 친화성-선택된 파아지 클론이 rhMet에 결합되는 정도는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 결정하였다. (B)에 도시된 ELISA 도식은 재료 및 방법 섹션에 기재된다. ELISA 결과는 (C)에 나타낸다. (D) Met에 결합하지 않은 펩타이드가 제거된 후 서열 정렬. 도 S-9에 도시된 컨센서스 서열은 상기 정렬로부터 결정하였다. (E) 및 (F) (1) Met 및 비관련 파아지 클론(TPDWLFP)(서열번호 17)에 대한 Alexa Fluor®488-표지된 모노클로날 항체 및 M13 파아지(청색 도트)에 대한 Alexa Fluor®546-표지된 모노클로날 항체 또는 (2) Met 및 MC40 클론에 대한 Alexa Fluor®488-표지된 모노클로날 항체 및 M13 파아지(오렌지 도트)에 대한 Alexa Fluor®546-표지된 모노클로날 항체에 노출된 Hep3B(E) 및 간세포(F)에 대한 유동 세포측정 스캐터 플롯. 비처리된 세포(적색 도트)를 사용하여 FL-1 (Alexa Fluor®488 형광도) 및 FL-2 (Alexa Fluor®546 형광도) 채널에 대한 전압 계수를 설정하였다.
도 21은 Hep3B에 노출된 MC40-표적화된 프로토셀에 대한 샘플 결합 곡선을 도시한다. 도 5A에서 해리 상수를 결정하기 위해, 1 x 106 Hep3B 또는 간세포를 사이토칼라신 D로 전처리하여 세포내이입을 억제하고 1시간동안 37℃에서 다양한 농도의 Alexa Fluor®647-표지된, MC40-표적화된 프로토셀로 항온처리하였다. 유동 세포 측정을 사용하여, 총 결합 곡선을 수득하기 위해 프로토셀 농도에 대해 플롯팅된 수득한 세포 집단에 대한 평균 형광 강도를 결정하였다. 비특이적 결합은 세포를 포화 농도의 비표지된 간세포 증식 인자의 존재하에 Alexa Fluor®647-표지된, MC40-표적화된 프로토셀로 항온처리함에 의해 결정하였다. 특이적 결합 곡선은 총 결합 곡선으로부터 비특이적 결합 곡선을 공제함에 의해 수득하였고; Kd 값은 특이적 결합 곡선으로부터 계산하였다. 상기 도면에 도시된 실험에서, 프로토셀 SLB는 5 wt% DOPE, 30 wt% 콜레스테롤 및 10 wt% PEG-2000 (18:1)과 함께 DOPC로 구성되고 0.015 wt% (~6 펩타이드/입자)의 MC40 표적화 펩타이드로 변형시키고; 상응하는 Kd 값은 1050 ± 142 pM이다. 모든 오차 막대는 n=5에 대해 95% 신뢰 구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 22는 MC40 처리된 프로토셀이 수용체 매개된 세포내입을 통해 내재화되고 H5WYG 펩타이드의 부재하에 리소좀으로 이동하도록 지시된다. (A) 37℃에서 1시간 이내에 각각 Hep3B 또는 간세포에 의해 내재화된 MC40 표적화된 프로토셀의 평균 수. 1 x 106의 세포를 포화 농도(100㎍/ml)의 사람 간세포 성장 인자(HGF)의 부재(-) 또는 존재(+)하에 다양한 농도의 프로토셀로 항온처리하였고, 유동 세포 측정을 사용하여 각각의 세포와 연합된 입자의 평균 수를 결정하였다. 프로토셀은 NBD 및 pHrodoTM으로 표지시켜 산성 세포내 구획들(각각)로 내재화된 것들과 표면 결합된 입자를 구별하였다. 오차 막대는 n=3에 대해 95% 신뢰 구간(1.96σ)을 나타낸다. (B) 프로토셀과, (1) Rab5, (2) Rab7, (3) 리소좀-연합된 막 단백질 1 (LAMP-1), 또는 (4) Rab11a간의 피어슨 상관관계 계수(r-값). Hep3B 세포는 Alexa Fluor®488-labeled antibodies against Rab5, Rab7, LAMP-1, 또는 Rab11a에 대한 Alexa Fluor®488-표지된 항체로 고정화시키고, 투과시키고 항온처리하기 전에 37℃에서 1시간동안 1000배 과량의 Alexa Fluor®594-표지된 프로토셀로 항온처리하였다. 슬라이드북 소프트웨어(SlideBook software)를 사용하여 n= 3 x 50 세포에 대한 평균 값 ± 표준 오차로서 표현되는 r-값을 측정하였다. 차등 간섭 조영(DIC) 이미지를 사용하여 Hep3B 세포의 경계선을 한정함으로써 세포 경계선의 픽셀 외부가 r값을 계산하는 경우 무시될 수 있다. 프로토셀 SLB는 5 wt% DOPE, 30 wt% 콜레스테롤, 및 10 wt% PEG-2000 (18:1)과 함께 DOPC로 구성되었고 0.015 wt% MC40 및 0.500 wt% H5WYG로 변형시켰다.
도 23은 NLS로 변형되고 MC40 표적화된 프로토셀을 통해 전달되는 경우 히스톤 팩키징된 pCB1이 시간 의존성 방식으로 HCC 세포의 핵내 농축됨을 보여준다. (A) - (C) 37℃에서 15분(A), 12시간(B) 또는 24시간(C) 동안 1000배 과량의 MC40-표적화된, pCB1-로딩된 프로토셀에 노출된 Hep3B 세포의 공초점 형광 현미경 이미지. (B)에 대해, 프로토셀의 엔도좀 일탈 및 pCB1의 사이토졸 분산은 약 2시간 후 명확하였고; ZsGreen 발현은 그러나 12 내지 16시간때까지 검출가능하지 않았다. 24시간에, Cy5-표지된 pCB1은 세포 전반에 걸쳐 분산된 상태로 유지시켰고; 그러나 Cy5 채널의 획득은 핵내 국소화된 픽셀의 포화를 피하기 위해 감소되었기 때문에 사이토졸 염색은 (C)에서 가시적이지 않았다. 실리카 코어는 Alexa Fluor®594 (적색)으로 표지시켰고, pCB1은 Cy5 (백색)로 표지시켰고, 세포 핵은 Hoechst 33342 (청색)으로 대비염색시켰다. 스케일 막대 = 20㎛. (D) Cy5-표지된 pCB1 및 Hoechst 33342-표지된 Hep3B 핵에 대한 피어슨 상관관계 계수(r값) 대 시간. 슬라이드북 소프트웨어를 사용하여 n = 3 x 50 세포에 대한 평균 값 ± 표준 오차로서 표현되는 r값을 측정하였다. 차등 간섭 조영(DIC) 이미지를 사용하여 Hep3B 세포의 경계선을 한정함으로써 세포 경계선의 픽셀 외부가 r값을 계산하는 경우 무시될 수 있다. 프로토셀 SLB는 5 wt% DOPE, 30 wt% 콜레스테롤, 및 10 wt% PEG-2000 (18:1)과 함께 DOPC로 구성되었고 0.015 wt% MC40 및 0.500 wt% H5WYG로 변형시켰다.
도 24는 NLS로 변형되고 MC40 표적화된 프로토셀을 통해 전달되는 경우 히스톤 팩키징된 pCB1이 거의 100%의 효능으로, 분열하는 HCC 세포 및 비분열하는 HCC 세포를 형질감염시킴을 보여준다. (A), (C), 및 (E) 37℃에서 24시간 동안 1000배 과량의 MC40 표적화된 pCB1 로딩된 포르토셀에 노출된 Hep3B 세포의 공초점 형광 현미경 이미지. Hep3B 세포는 (A)에서 분열하고 약 95%가 (C) 및 (E)에서 컨플루언트하고; pCB1은 모든 이미지에서 히스톤과 이미 팩키징되어 있었고 pCB1-히스톤 복합체는 추가로 (E)에서 NLS로 변형시켰다. 실리카 코어는 Alexa Fluor®594 (적색)으로 표지시키고, pCB1은 Cy5 (백색)으로 표지시키고, 세포 핵은 Hoechst 33342 (청색)으로 대비염색시켰다. 스케일 막대 = 20㎛. (B), (D), 및 (F) 24시간동안 37℃에서 1 x 109 MC40-표적화된, pCB1-로딩된 프로토셀 ('PC')에 대해 계속적인 노출 즉시 ZsGreen 발현에 대해 양성이 되는 1 x 106 Hep3B 및 간세포의 %. 세포는 (B)에서 분열하고 (D) 및 (F)에서 약 95% 컨플루언트하고; x 축은 CB1 플라스미드가 ('pCB1') 및 pCB1-히스톤 복합체('복합체')가 NLS로 변형되었는지를 지적한다. 단독의 pCB1, 및 DOTAP 및 DOPE의 1:1(w/w) 혼합물로 팩키징된 pCB1을 대조군으로서 사용하였다. 세포는 핵 공극 복합체를 통한 NLS-변형된 pCB1의 전좌를 차단하기 위해 20mg/ml의 밀 배아 아글루티닌(WGA)에 노출시켰다. 오차 막대는 n=3에 대해 95% 신뢰 구간(1.96σ)을 나타낸다. (G) - (I) 각각 (A), (C) 및 (E)에서 사용되는 세포에 대한 세포 주기 히스토그램. G0/G1 단계에서 세포 %는 각각의 히스토그램에 대해 주어진다. 모든 실험에서, 프로토셀 SLB는 5 wt% DOPE, 30 wt% 콜레스테롤, 및 10 wt% PEG-2000 (18:1)과 함께 DOPC로 구성되었고 0.015 wt% MC40 및 0.500 wt% H5WYG로 변형시켰다.
도 25는 37℃에서 1시간 또는 72시간 동안 MC40 표적화된 pCB1 로딩된 프로토셀에 노출된 Hep3B(A) 및 간세포(B)의 공초점 형광 현미경 이미지를 보여주고; pCB1 농도는 모든 실험에서 5pM로 유지시켰다. (B)에서 화살표는 유사분열 세포를 지적한다. 사이클린 B1은 Alexa Fluor®594-표지된 모노클로날 항체(적색)로 표지시키고 세포 핵은 Hoechst 33342 (청색)으로 염색시켰다. 프로토셀 SLB는 5 wt% DOPE, 30 wt% 콜레스테롤, 10 wt% PEG-2000 (18:1)과 함께 DOPC로 구성되었고 0.015 wt% MC40 및 0.500 wt% H5WYG로 변형시켰다. 모든 스케일 막대는 = 20㎛.
도 26은 37℃에서 1시간 또는 72시간 동안 MC40-표적화된, pCB1-부하된 프로토셀에 노출된 Hep3B(A) 및 간세포(B)의 공초점 형광 현미경 영상을 도시한 것이다; pCB1 농도는 모든 실험에서 5 pM에서 유지되었다. 세포는 각각 초기 및 후기 아폽토시스(apoptosis)에 대해 검정하기 위해 알렉사 플루오르 647(Alexa Fluor® 647)-표지된 아넥신 V(백색) 및 요오드화 프로피디움(적색)으로 염색시켰고, 세포 핵은 훽스트 33342(청색)으로 대조염색시켰다. 프로토셀 SLB는 5중량% DOPE, 30중량% 콜레스테롤 및 10중량% PEG-2000(18:1)를 갖는 DOPC로 이루어졌으며, 0.015중량% MC40 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. 모든 축척막대는 20㎛이다.
도 27은 쯔비터이온성 지질로 이루어진 SLB를 갖는 프로토셀이 최소한의 비특이적 세포독성을 유도함을 도시한다. 37℃에서 48시간 동안 1 x 109 APTES-변형된 다공성 실리카 나노입자, APTES-변형된 코어를 갖는 DOPC 프로토셀, 스크램블(scrambled) shRNA 서열('스크램블 pCB1')을 암호화하는 플라스미드가 부하된 DOPC 프로토셀 또는 스크램블 pCB1이 부하된 DOTAP/DOPE (1:1 w/w) 리포플렉스에 지속적 노출시 아폽토시스되는 1 x 106 Hep3B의 비율. 프로토셀 및 리포플렉스는 10중량% PEG-2000, 0.015중량% MC40 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. 양 하전된 및 음 하전된 폴리스티렌 나노입자(각각, '아민-PS' 및 '카복실-PS')를 양성 대조군으로서 사용하고, 10 mM의 항산화제, N-아세틸시스테인(NAC) 또는 1 pmol의 유리 pCB1에 노출된 Hep3B를 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 1X2는 작용 pH로서 이마티닙의 수용해도를 도시한 것이다. 약물의 용해도는 화학 구조상의 약염기성 작용기의 이온화로 인해서 pH가 감소함에 따라서 증가하였다.
도 2X2는 pH 7에서 상이한 제형 중의 이마티닙의 용해도를 도시한 것이다. 10% 에탄올을 갖는 제형은 다른 제형들에 비해서 가장 높은 용해도를 나타냈다. 이마티닙은 또한 DMSO 중에서 매우 용해성인 것으로 밝혀졌다.
도 3X2는 24시에 걸쳐서 이마티닙의 투과에 미치는 용매계의 영향을 도시한 것이다. 공용매를 함유하는 모든 제형은 대조군(물, pH 7)과 비교해 피부를 통한 높은 투과를 나타냈다. DMSO는 가장 높은 투과를 나타냈다(N12-186PCT 2012-032-01임시.PDF).
도 4X2는 이마티닙의 유동에 대한 용매계의 효과(경피 투과 속도)를 도시한 것이다. DMSO를 함유하는 제형은 조사된 제형들 중에서 가장 높은 유동을 나타냈다.
도 1X3. siRNA 또는 단백질 독소-부하된 나노다공성 입자-지지된 지질 이중층(프로토셀)를 합성하는데 사용된 과정을 도시하는 도식. 고분자 치료제가 부하되고 간세포 암종(HCC)에 대해 표적화된 프로토셀을 형성하기 위해, 먼저 아민-함유 실란(AEPTMS)로 변형된 나노다공성 실리카 코어를 소형 간섭 RNA(siRNA) 용액 또는 단백질-기본 독소(예: 리신 독소 A-쇄) 중에 침지시켰다. 이어서, DOPC, DOPE, 콜레스테롤 및 18:1 PEG-2000 PE (55:5:30:10 질량비)로 이루어진 리포좀을 화물-부하된 코어에 융합시켰다. 수득된 지지된 지질 이중층(SLB)를 HCC에 결합하는 표적화 펩타이드(SP94) 및 내재화된 프로토셀의 엔도좀성/리소좀성 탈출을 촉진하는 엔도좀분해성(endosomolytic) 펩타이드(H5WYG)로 변형시켰다. 글리신-글리신(GG) 스페이서 및 C-말단 시스테인 잔기로 변형된 펩타이드를 이종이작용성 가교결합제(SM(PEG)24)와 9.5-nm 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서를 통해서 DOPE 잔사 중에 존재하는 1급 아민에 접합시켰다. 실시예 3에 인용된 로(Lo) 등65 및 무어(Moore) 등66에 의해 보고된 SP94 및 H5WYG 서열은 적색으로 기재되어 있다.
도 2X3. 프로토셀 코어를 형성하는 나노다공성 실리카 입자의 특성 규명. (A) 크기-기본 분리 전과 후의 복합 실리카 입자의 동적 광 산란(DLS). 입자는 분리 후 평균 크기 직경이 약 165 nm이다. (B) 복합 입자에 대한 질소 흡착 등온. 히스테레시스의 존재는 작은 기공에 의해 상호연결된 큰 기공의 네트워크와 일치한다. (C) (e)에서 흡착 등온으로부터 계산된 기공 직경 대 기공 용적의 플롯은 큰(20 내지 30 nm) 기공 및 작은(6 내지 12 nm) 기공의 존재를 입증한다.
도 3X3. 프로토셀은 그 방출이 산성 pH에 의해 개시되는 siRNA에 대해 높은 수용력을 갖는다. (A) 1010 프로토셀 및 리포플렉스 내에 부하될 수 있는 siRNA의 농도. 0.5 X PBS (pH 7.4) 중의 비변형된 및 AEPTMS-변형된 실리카 코어에 대한 제타전위는 각각 -32 mV 및 +12 mV이다. (B) 및 (C) 37℃에서 pH 7.4 자극된 체액(B) 또는 pH 5.0 완충액(C)에 노출시 siRNA가 AEPTMS-변형된 코어를 갖는 DOPC 프로토셀, DOPC 리포플렉스 및 DOTAP 리포플렉스로부터 방출되는 속도. siRNA-부하된 프로토셀, DOPC 리포플렉스 및 DOTAP 리포플렉스의 평균 직경은 각각 178-nm, 135-nm 및 144-nm였다. 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 4X3. siRNA-부하된, SP94-표적화된 프로토셀은 HCC에서 각종 사이클린 계열 구성원을 침묵시키지만 간세포에서는 그렇지 않다. (A) 및 (B) Hep3B가 siRNA-부하된, SP94-표적화된 프로토셀에 노출시 사이클린 A2, B1, D1 및 E 단백질의 발현의 용량(A) 및 시간(B) 의존적 감소. 1 x 106 세포를 (A)에서 48시간 동안 다양한 농도의 siRNA에 지속적으로 노출시키고 (B)에서 다양한 시간 동안 125 pM의 siRNA에 지속적으로 노출시켰다. (C, 좌측 축) 1 x 106 Hep3B 또는 간세포가 125 pM의 siRNA에 48시간 동안 노출시 유지되는 초기 사이클린 A2 단백질 농도의 비율. (C, 우측 축) 사이클린 A2 단백질의 발현을 초기 농도의 10%까지 감소시키기 위해 1 x 106 Hep3B 세포와 함께 항온처리되어야 하는 siRNA-부하된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀, DOPC 리포플렉스 및 DOTAP 리포플렉스의 수. 프로토셀 SLB는 5중량% DOPE, 30중량% 콜레스테롤 및 10중량% PEG-2000을 갖는 DOPC로 이루어지며 0.015중량% SP94 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. DOPC(및 DOTAP) 리포플렉스는 DOPC(또는 DOTAP):DOPE:콜레스테롤:PEG-2000 PE의 55:5:30:10 비를 사용하여 제조하였으며 0.015중량% SP94 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. 모든 실험은 37℃에서 완전 성장 배지에서 실시하였다. 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 5X3. 37℃에서 1시간 또는 48시간 동안 siRNA-부하된, SP94-표적화된 프로토셀에 노출 후 Hep3B(A) 및 간세포(B)의 공초점 형광 현미경 영상. 세포를, 고정시키고 투과화시키고 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 D1 또는 사이클린 E(청색)에 대한 훽스트 33342(청색) 및 알렉사 플루오르 488-표지된 항체로 염색하기 전에 10배 과량의 알렉사 플루오르 647-표지된 프로토셀(백색)과 함께 항온처리하였다. 프로토셀 SLB는 5중량% DOPE, 30중량% 콜레스테롤 및 10중량% PEG-2000을 갖는 DOPC로 이루어지며, 0.015중량% SP94 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. 축척막대는 20㎛이다.
도 6X3. 사이클린-특이적 siRNA 칵테일이 부하된 SP94-표적화된 프로토셀은 간세포 생존력에 영향을 주지 않으면서 HCC에서 아폽토시스를 유도한다. (A) 37℃에서 다양한 시간 동안 사이클린-특이적 siRNA 칵테일이 부하된 SP94-표적화된 프로토셀에 노출시 알렉사 플루오르 488-표지된 아넥신 V 및/또는 요오드화 프로피디움(PI)에 대해 양성인 1 x 106 Hep3B 및 간세포의 비율. 아넥신 V에 대해 양성인 세포는 아폽토시스의 초기 단계에 있는 것으로 고려되는 반면에, 아넥신 V와 PI 둘다에 대해 양성인 세포는 아폽토시스의 후기 단계에 있는 것으로 고려되었다; 아폽토시스 세포의 총 수는 초기 및 후기 아폽토시스 중의 세포의 수를 합함으로써 측정하였다. 총 siRNA 농도는 약 125 pM에서 유지되었다. 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다. (B) 및 (C) 37℃에서 1시간 또는 48시간 동안 siRNA-부하된, SP94-표적화된 프로토셀에 노출 후 Hep3B(A) 및 간세포(B)의 공초점 형광 현미경 영상. 세포를, 훽스트 33342(청색), 알렉사 플루오르 488-표지된 아넥신 V(녹색) 및 요오드화 프로피디움(적색)으로 염색하기 전에 10배 과량의 알렉사 플루오르 647-표지된 프로토셀(백색)과 함께 항온처리하였다. 세포 형태를 나타내기 위해 차등간섭대비(DIC) 영상이 포함된다. 축척막대는 20㎛이다. 모든 실험에서, 프로토셀 SLB는 5중량% DOPE, 30중량% 콜레스테롤 및 10중량% PEG-2000을 갖는 DOPC로 이루어졌으며 0.015중량% SP94 및 0.500중량% H5WYG로 변형되었다.
도 7X3. 프로토셀은 고농도의 리신 독소 A-쇄(RTA)를 캡슐화하며 오직 산성 pH에서만 이를 방출한다. (A) 1010 프로토셀 및 리포좀 내에 캡슐화될 수 있는 RTA의 농도. 0.5 X PBS (pH 7.4) 중의 비변형된 및 AEPTMS-변형된 실리카 코어에 대한 제타전위 값은 각각 -32 mV 및 +12 mV이다. 탈글리콜화된 RTA의 등전점(pI)는 약 7이다. (B) 및 (C) 37℃에서 AEPTMS-변형된 코어를 갖는 DOPC 프로토셀 및 DOPC 리포좀이 pH 7.4 자극된 체액(B) 또는 pH 5.0 완충액(C)에 노출시 RTA의 시간 의존적 방출. RTA-부하된 프로토셀 및 리포좀의 평균 직경은 각각 184-nm 및 140-nm이었다. 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 8X3. RTA-부하된, SP94-표적화된 프로토셀은 HCC에서 단백질 생합성을 억제하지만 간세포에서는 그렇지 않다. (A) 및 (B) Hep3B가 RTA-부하된 SP94-표적화된 프로토셀에 노출시 신생 단백질(nascent protein) 합성의 용량(A) 및 시간(B) 시간 의존적 감소. 1 x 106 세포를 (A)에서 48시간 동안 다양한 농도의 RTA에 지속적으로 노출시키고 (B)에서 다양한 시간 동안 25 pM의 RTA에 지속적으로 노출시켰다. 신생 단백질 합성을 메티오닌의 알렉사 플루오르 488-표지된 유도체를 사용하여 정량하였다. (C, 좌측 축) 1 x 106 Hep3B 또는 간세포가 25 pM의 RTA에 48시간 동안 노출시 유지되는 초기 신생 단백질 농도의 비율. (C, 우측 축) 단백질 생합성을 90%까지 감소시키기 위해 1 x 106 Hep3B 세포와 함께 항온처리되어야 하는 RTA-부하된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀 및 리포좀의 수. 프로토셀 및 리포좀 이중층은 5중량% DOPE, 30중량% 콜레스테롤 및 10중량% PEG-2000을 갖는 DOPC로 이루어지며, 0.015중량% SP94 및 0.500중량% H5WYG로 변형시켰다. 모든 실험은 37℃에서 완전 성장 배지에서 실시하였다. 오차막대는 n=3에 대해 95% 신뢰구간(1.96σ)을 나타낸다.
도 9X3. 37℃에서 1시간 또는 48시간 동안 RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 노출시킨 후의 Hep3B(A) 및 간세포들(B)의 공초점 형광 현미경 영상들. 세포들을 10-배 과량의 Alexa Fluor 647-표지된 프로토셀들(백색)과 함께 항온처리한 후 Hoechst 33342(청색) 및 Click-iT AHA Alexa Fluor 488 단백질 합성 키트(녹색)로 염색하였다. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000로 구성되며 0.015 중량% SP94 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. 기준자들 = 20㎛.
도 10X3. RTA로 로딩된 SP94-표적화된 프로토셀들은 HCC의 선택적인 세포자살을 유도한다. (A) 37℃에서 다양한 기간들 동안 RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 노출 시 카스파제-9 또는 카스파제-3 활성화에 대해 양성이 되는 1 x 106개의 Hep3B 및 간세포들의 퍼센트. 총 RTA 농도는 ~25 pM에서 유지하였다. 오차 바들은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들(1.96 σ)을 나타낸다. (B) 및 (C) 37℃에서 1시간 또는 48시간 동안 RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 노출 후 Hep3B(B) 및 간세포들(C)의 공초점 형광 현미경 영상들. 세포들을 10-배 과량의 Alexa Fluor 647-표지된 프로토셀들(백색)과 함께 항온처리한 후 Hoechst 33342(청색), CaspGLOW 형광 활성 카스파제-9 염색 키트(녹색), 및 CaspGLOW 적색 활성 카스파제-3 염색 키트(적색)로 염색하였다. 차등 간섭 대비(Differential Interference Contrast: DIC) 영상들을 포함시켜 세포 형태를 나타낸다. 기준자들 = 20㎛. 모든 실험들에서, 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000로 구성되며 0.015 중량% SP94 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다.
도 1X5는 3개의 수동적 경피 확산 경로들과 함께 SC의 "브릭 및 모르타르(brick and mortar)" 구조를 나타내는 개략도이다. 세포간 확산은 주요 경로로서 광범위하게 허용되지만, 이는 일반적으로 경세포 확산(transcellular diffusion)과 병행하여 발생하며 둘 다 사용된 침투 향상 전략에 의해 영향받는다. 경부속물 확산(Transappendageal diffusion)은, 땀샘들과 모낭들이 체 표면적의 약 1% 만을 차지하므로 종종 무시된다.
도 2X5는 프로토셀을 도시하며 이를 특수 적용을 위해 최적화하도록 하기 위해 수행될 수 있는 이의 코어 및 SLB에 대한 각종 개질들을 나타낸다. 좌측 하단에서 출발하여, 프로토셀은 지지된 지질 이층으로 봉입된 나노다공성 실리카 코어로 구성된다. 당해 코어는 고-표면적, 조절가능한 입자 직경, 조정할 수 있는 공극 크기, 개질가능한 표면 화학을 가지며, 가공하여 별개 유형들의 운반물(즉, 나노입자들, 단백질 독소들, 치료학적 핵산들, 약물들)의 고-수용력 로딩을 용이하게 할 수 있다. 지지된 지질 이층은, 이에 대해 각종 분자들(즉, 펩타이드들, 폴리에틸렌 글리콜-PEG)이 이종작용성 가교결합제들을 사용하여 접합시킴으로써 특이적인 결합, 내재화 및 투과를 수행할 수 있는 유체 표면을 제공한다.
도 3X5. 예비 결과들은, 프로토셀들이 SC와 상호작용할 수 있고, SC를 침투할 수 있으며, 피부를 가로질러 확산할 수 있고, 이들 상호작용들의 경피 동역학은 SLB 조성 및 제형에 의해 영향받음을 나타낸다. a.) DOPC/Chol/PEG로 처리된 피부 시료들(n=3)의 용기(receptacle)들에서 SiO2의 총량(㎍)을 나타내는 ICP-MS 결과들. b.) 각각의 단계 후 수행되어야만 하는 필수적인 특성화들과 함께, 형광단들을 사용한 코어 작용성화를 나타내는 개략도. c.) DOPC/Chol 제형화된 프로토셀들은 DSPC/Chol 제형과 관련하여 24시간 후 용기 속에서 SiO2의 양의 거의 2배를 나타내었다. 그러나, PEG와 함께 제형화된 동일한 프로토셀들은 이들의 비-페길화된 제형들(non-pegylated formulations)과 관련하여 유의적으로 감소된 동역학들을 나타낸다.
도 1X6. 잠재적인 숙주 세포들 및 이미 감염된 세포들에 대해 항-바이러스제들의 표적화된 전달을 위해 개발하도록 본 발명자들이 제안한 프로토셀을 나타내는 개략도. MSNP 코어는 청색으로 나타내고, SLB는 황색으로 나타낸다.
도 2X6. 비-표적화된, 페길화된(PEGylated) 프로토셀들의 예비 생체내 특성화. (A) 프로토셀들 또는 염수를 주사한 Balb/c 마우스들의 시간-의존적 중량. (B) Balb/c 마우스들에 DyLight 633-표지된 프로토셀들 또는 100μL의 염수(대조군)을 주사하고 IVIS Lumina II로 영상화하였다. 모든 실험들에서, 프로토셀들은 10 중량%의 PEG-2000로 개질시키고 꼬리 정맥에 주사하였다.
도 1X7. 생체내에서 프로토셀의 일반적인 생분포 및 독성. (A) 정맥내 주사 직 후 입자들의 전신계 순환 및 (B) 주사한 지 48시간 후 간 및 골에 대한 국재화. (C) 3배의 주당 투여량의 프로토셀들은 전체 동물 체중에 의한 것을 포함하는 독성의 전체 신호들(gross signs)을 생성하지 않는다. (D) 입자들로부터의 형광성은 간 해부학적 구조에 영향없이 프로토셀들(D1,D3,D4 - 4주에 걸쳐 총 30 mg)을 주사한 마우스의 간에 축적하는 것으로 관찰된다.
도 2X7. 간의 두꺼운 단면에서 입자 분포를 제공하는 3D. 입자들은 정의된, 그러나 현재는 확인되지 않은 간의 부위들에 시간에 걸쳐 축적되는 것으로 밝혀졌다. 4주에 걸친 마우당 30 mg 이하의 투여량들에서 전체적인 또는 조직학적 독성은 관찰되지 않았다. 기준 20㎛.
도 1X8, 2X8, 3X8. 실시예 8의 실험에서 측정된 바와 같은 완전한 및 부분적인 피부 두께 전체에서 프로토셀 확산.
도 4X8. 실시예 8의 실험에서 측정된 바와 같은 공여자 캡 시료들(donor cap samples)의 ICP 질량 분광법.
도 5X8. 실시예 8의 실험에서 측정한 코어 작용성화.
도 6X8, 7X8, 8X8, 9X8. 실시예 8의 실험에서 측정된 바와 같은 용기 유체 속의 SiO 2 의 농도를 측정하는데 사용된 분광형광법(spectrafluorimetry).
도 10X8. 양성 대조군은, 피부 속의 형광적으로-태그된 입자들이 실시예 8의 실험에서 측정된 바와 같은 피부의 자가형광성의 이점을 취하면서 영상화될 수 있음을 나타내었다.
도 1X9. 각종 프로토셀 제형들을 각각의 제형에 대해 n=4에게 투여하였다(0.5X PBS중 500μl의 16mg/ml). 각각의 실험으로부터 1개 피부(S1)를 0.5X PBS로 처리하였다. 표준 곡선들은, 실시예 9의 실험에서 측정한 바와 같이, 0.16 mg/ml 내지 1.953125E-5 mg/ml의 농도 범위내에서 S1 24 시간 용기 유체로부터의 1:2 희석물을 사용하여 생성시켰다.
도 2X9. 실시예 9의 실험에서 측정한 바와 같은 분광형광법과 연관시킨 선형 회귀 분석.
도 3X9. SLB 제형은 실시예 9의 실험에서 측정한 바와 같이 경피 확산에 현저히 영향을 미칠 수 있다.
도 4X9. DOPC/chol 및 DSPC/chol 제형들에 PEG를 첨가하면 실시예 9의 실험에서 측정된 바와 같이 경피 확산을 유의적으로 감소시켰다.
도 5X9, 6X9. 실시예 9의 실험에서 측정된 바와 같은 시간의 함수로서 교정된 평균 형광 강도에 있어서 개개의 증가.
도 7X9, 8X9 및 9X9는 실시예 9의 실험에서 측정된 바와 같은 동역학에 있어서 제형의 효과를 나타낸다.
본원에서 "패키징된(packaged)" DNA는 프로토셀들내로 로딩된(공극들내로 흡착되거나 나노유공성 실리카 코어 자체내에 직접 국한된) DNA를 말한다. DNA를 공간적으로 최소화하기 위해, 이는 흔히 패키징되며, 이는 주변 매질의 전하를 조절하는 것으로부터 DNA와, 예를 들면, 지질들, 단백질들, 또는 다른 나노입자들(일반적으로, 전적으로는 양이온성이 아니라고 해도)과의 소 복합체들의 생성인 수개의 상이한 방법들로 달성될 수 있다. 패키징된 DNA는 리포플렉스들(즉, 양이온성 지질 혼합물들과의 복합체화 DNA)을 통해 흔히 달성된다. 또한, DNA는 양이온성 단백질들(히스톤들 외의 단백질들 포함) 및 또한 금 나노입자들(예를 들면, 나노섬광들-나노입자의 코어가 금인 가공된 DNA 및 금속 복합체)로 패키징된다.
다수의 히스톤 단백질들 및 또한, DNA를 일반적으로 양이온성 나노입자들, 지질들, 또는 단백질들과 같은 보다 적은 용적으로 패키징하기 위한 다른 수단들을 사용하여 슈퍼코일상 플라스미드 DNA "히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA"를 패키징할 수 있지만, 사람 환자들을 치료하는 것과 관련된 치료학적 국면들에서, 사람 히스톤 단백질들의 용도가 바람직하게 사용된다. 본 발명의 특정 국면들에서, 당해 분야에 공지되어 있거나 본 발명의 교시내용에 따라 용이하게 실시될 수 있는 바와 같이, 비록 다른 히스톤 단백질들이 다른 유사한 비들로 사용될 수 있다고 해도, 사람 히스톤 단백질들 H1, H2A, H2B, H3 및 H4는 1:2:2:2:2의 바람직한 비로 조합된다. DNA는, 플라스미드 DNA 대신에 이중사 선형 DNA일 수 있으며, 이는 또한 임의로 슈코코일상일 수 있고/있거나 히스톤들 또는 다른 패키징 성분들로 패키징된다.
본 발명의 당해 국면에서 사용될 수 있는 다른 히스톤 단백질들은 예를 들면, H1F, H1F0, H1FNT, H1FOO, HIFX H1H1 HIST1H1A, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H1T; H2AF, H2AFB1, H2AFB2, H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2, H2AFZ, H2A1, HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL, HIST1H2AM, H2A2, HIST2H2AA3, HIST2H2AC, H2BF, H2BFM, HSBFS, HSBFWT, H2B1, HIST1H2BA, HIST1HSBB, HISTIHSBC, HIST1HSBD, HIST1H2BE, HIST1H2BF , HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI, HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BN, HIST1H2BO, H2B2, HIST2H2BE, H3A1, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, H3A2, HIST2H3C, H3A3, HIST3H3, H41, HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4J, HIST1H4K, HIST1H4L, H44 및 HIST4H4를 포함한다.
용어 "핵 위치 서열"은 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA를 포함하는 히스톤 단백질들내로 혼입되거나 달리는 가교결합된 펩타이드 서열을 말한다. 특정 양태들에서, 본 발명에 따른 프로토셀들은 세포의 핵을 침투하는 히스톤-패키징된 플라스미드의 능력을 향상시키고 이의 성분들을 핵에 침착시키는(발현을 촉진시켜 궁극적으로 세포 자살을 용이하게 하기 위해) 핵 위치 서열(히스톤 단백질들은 핵 위치 서열과 가교결합될 수 있거나 플라스미드 자체는 개질되어 핵 위치 서열을 발현할 수 있음에 주목한다)로 개질(가교결합)되는 플라스미드(흔히 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 펩타이드 서열들은 히스톤-패키징된 플라스미드 DNA를 수반하고 관련된 히스톤들을 표적화된 세포의 핵 내로 수반하는데 보조하며, 그 결과 플라스미드는 요구되는 펩타이드들 및/또는 뉴클레오타이드들을 발현하여 치료학적 및/또는 진단적 분자들(폴리펩타이드 및/또는 뉴클레오타이드)를 표적화된 세포의 핵 내로 전달한다. 당해 분야에 잘 알려진, 어떠한 수의 가교결합제들도 사용하여 핵 위치 서열을, 히스톤 패키징된 플라스미드를 세포의 핵내로 도입하는데 사용될 수 있는 히스톤 단백질에 공유결합적으로 연결시킬 수 있다(흔히 폴리펩타이드에 대해 펜던트로 노출된 아미노산의 측쇄에서 친핵성 또는 친전자성 그룹을 갖는 다른 그룹 또는 라이신 그룹에서). 달리는, 핵 위치 서열을 발현하는 뉴클레오타이드 서열은, 히스톤 단백질을 발현함으로써 핵 위치 서열에 접합된 히스톤 단백질의 발현이 플라스미드의 표적화된 세포의 핵내로의 전달을 용이하게 하는 것이 따라서 발생하도록 상기 서열에 근접하게 플라스미드 속에서 배치될 수 있다.
단백질들은 핵 엔벨로프(nuclear envelope)를 통해 핵 내로 도입된다. 핵 엔벨로프는 동심원 막들(concentric membranes), 외부 및 내부 막으로 이루어진다. 이들은 핵으로의 관문들이다. 엔벨로프는 공극들 또는 대형 핵 복합체들로 이루어진다. NLS로 해독된 단백질은 임포르틴(importin)(카리오페린으로도 알려짐)에 강하게 결합할 것이며, 함께, 복합체는 핵 공극을 통해 이동할 것이다. 어떠한 수의 핵 위치 서열들도 사용하여 히스톤-패키징된 플라스미드 DNA를 세포의 핵내로 도입시킬 수 있다. 바람직한 핵 위치 서열들은 H2N- GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH 서열 확인 번호 9, RRMKWKK(서열 확인 번호 10), PKKKRKV(서열 확인 번호 11), 및 KR[PAATKKAGQA]KKKK(서열 확인 번호 12), 뉴클레오플라스민의 NLS, 약 10개의 아미노산들의 스페이서에 의해 분리된, 염기성 아미노산들의 2개의 군집들을 포함하는 원형의 양자간 시그날을 포함한다. 다수의 다른 핵 위치 서열들은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, LaCasse, et al., Nuclear localization signals overlap DNA- or RNA-ginding domains in nucleic acid-binding proteins. Nucl. Acids Res., 23, 1647-1656 1995); Weis, K. Importins and exportins: how to get in and out of the nucleus [published erratum appears in Trends Biochem Sci 1998 Jul;23(7):235]. TIBS, 23, 185-9 (1998); 및 웹사이트 ubic.bioc.columbia.edu/papers/2000 nls/paper.html#tab2에서, Murat Cokol, Raj Nair & Burkhard Rost, "Finding nuclear localization signals"를 참조한다.
용어 "암"은 정상의 조절들의 손실의 유일한 특성을 가져서, 조절되지 않은 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침입, 및/또는 전이를 초래하는 종양 세포들(신생물들)의 증식을 기술하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 신생물들은 동일한 형태의 조직에서 정상의 증식과 비교하여, 피검자 또는 숙주의 조직내 세포에 있어서 형태학적 불규칙성, 및 피검자의 조직내 세포들의 병리학적 증식을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 신생물들은 침입성 또는 비침입성인 양성 종양들 및 악성 종양들(예를 들면, 결장 종양들)을 포함한다. 악성 신생물들은 보다 큰 정도의 형성이상, 또는 세포들의 분화 및 성향(orientation)의 손실을 나타내고, 침입 및 전이의 특성들을 갖는다는 점에서 양성 신생물들과 구별된다. 용어 암은 또한 내용안에서, 다중 약물 내성 암들을 포함하는, 약물 내성 암들을 포함한다. 본 발명의 표적 세포가 기원할 수 있는 신생물 또는 종양(neoplasia)은 다른 것들 중에서도, 암종(예를 들면, 평편-세포 암종들, 선암들, 간세포 암종들, 및 신장 세포 암종들), 특히 방광, 골, 장, 유방, 경부, 결장(결장직장), 식도, 두부, 신장, 간(간세포), 폐, 코인두, 목, 난소, 췌장, 전립샘, 및 위의 암종들; 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성백혈병, 급성 전골수구성백혈병(APL), 급성 T-세포 림프구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 호염기성 백혈병, 호산구백혈병, 과립구 백혈병, 모발세포 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프성 백혈병, 거대구성백혈병, 소골수아구 백혈병(micromyeloblastic leukemia), 단구성 백혈병, 호중구성 백혈병 및 줄기 세포 백혈병과 같은 백혈병들; 양성 및 악성 림프종, 특히 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma) 및 B-세포 림프종; 양성 및 악성 흑색종들; 척수증식성 질병들; 육종, 특히 유윙 육종(Ewing's sarcoma), 혈관육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 지방육종, 근육종들, 말초 신경상피종, 및 윤활막육종; 중추신경계의 종양들(예를 들면, 신경교종들, 별아교세포종들, 희소돌기아교세포종들, 뇌실막세포종들, 아교모세포종들, 신경모세포종들, 신경절신경종들, 신경절신경아교종들, 속질모세포종들, 송과선 세포 종양들, 수막종들, 수막육종증들, 수막육종증들, 및 신경집종들); 생식계열(germ-line) 종양들(예를 들면, 창자암, 유방암, 전립샘 암, 경부암, 자궁암), 폐암(예를 들면, 소 세포 폐암, 혼합된 소세포 및 비-소세포 암, 흉막중피종, 예를 들면, 전이성 흉막중피종 소 세포 폐암 및 비-소세포 폐암), 난소 암, 고환암, 갑상샘 암, 별아교세포종, 식도암, 췌장암, 위암, 간암, 결장암, 및 흑색종; 혼합된 유형들의 신생물들, 특히 암육종들 및 호지킨병(Hodgkin's disease); 및 혼합된 기원의 종양들, 예를 들면, 빌름스 종양(Wilms' tumor) 및 기형암종들(teratocarcinomas)을 포함한다. 다른 것들 중에서도 간세포 및 경구 암을 포함하는 특정 종양들은 암 세포들에서 특이적으로 증가된 수준들의 MET 수용체들을 나타내고 프로토셀에 복합체화된 MET 결합 펩타이드를 포함하는 본 발명의 양태들에 따른 조성물들 및 치료제들에 대한 중요한 표적임을 주목한다.
용어 "동시투여하다" 및 "동시투여"는 동의어로 사용되어 동시에 또는 거의 동시에 유효량으로 고려될 수 있는 양들 또는 농도들에서 본원에 구체적으로 기재된, 적어도 하나의 다른 제제, 흔히 적어도 하나의 추가의 항암제(달리는 본원에 기술된 바와 같음)와 함께 본 발명에 따른 프로토셀 조성물들 중 적어도 하나의 투여를 기술한다. 동시투여된 조성물들/동시에 투여될 제제들이 바람직하지만, 제제들은 때로는 조성물들/제제들 둘다(또는 이상)의 효과적인 농도들이 환자내에 동시에 적어도 단기간 동안 나타나도록 투여될 수 있다. 달리는, 볼 발명의 특정 국면들에서, 각각의 동시투여된 조성물/제제가 특히 간세포 또는 세포 암을 포함하는 암의 억제 및 치료, 및 다른 질병 상태들, 조건들 또는 합병증들의 감소 또는 억제의 궁극적인 결과와 함께, 환자에서 상이한 시기들에서 이의 억제 효과를 나타내는 것도 가능할 수 있다. 물론, 질병 상태, 감염 또는 다른 상태 이상이 존재하는 경우, 본 발명의 화합물들은 다른 제제들과 함께 요구되는 다른 감염 또는 질병 또는 조건들을 치료할 수 있다.
용어 "항암제"는 본 발명에 따른 프로토셀들을 포함하는 하나 이상의 조성물들과 함께 제형화될 수 있는 화합물을 기술하고 임의로, 다수의 다른 것들 중에서, 암, 특히 간세포 또는 경부암의 어떠한 유형도 치료하기 위해 사용된다. 본 발명에 따른 화합물들과 함께 제형화될 수 있는 항암 화합물들은 예를 들면, 에버롤리무스, 트라벡테딘, 아브락산, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파니브, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244(ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK 461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타니브, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 아우로라 키나제 억제제, PIK-1 조절인자, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키아제 억제제들, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트(checkpoint)-1 또는 2 억제제, 초점 접착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제(mek) 억제제, VEGF 트랩 항체(trap antibody), 페메트렉세드, 에를로티니브, 다사타니브, 닐로티니브, 데카타니브, 파니투무마브, 암루비신, 오레고보마브, 렙-에투(Lep-etu), 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무마브, 자놀리무마브, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르산, 티실리무마브, 이필리무마브, 고씨폴, Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌기티데, 기마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 LKRX-0402, 루칸톤, LY 317615, 뉴라디아브, 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈라파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티니브, 5-플루오로우라실, 로리노스타트, 에토포시드, 겜시타빈, 독소루비신, 리포좀 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리키클리브; PD0325901 , AZD-6244, 카펙시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-lH-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]-, 이나트륨 염, 헵타하이드레이트, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜, 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 접합된 에스트로겐, 베바키주마브, IMC-1C11, CHIR-258); 3-[5-(메틸설포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 바탈라니브, AG-013736, AVE-0005, [D- Ser(Bu t) 6, Azgly 10]의 아세테이트 염(피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트[C59H84N18014-(C2H402)x(여기서 x는 1 내지 2.4이다)], 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트립토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티니브, 라파타니브, 카네르티니브, ABX-EGF 항체, 에르비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-572016, 이오나파르니브, BMS-214662, 티피파르니브; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날리드 하이드록삼산, 발프로산, 트리코스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페니브, KRN951, 아미노글루테티미드, 아른사크린, 아나그렐리드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-게랭균(BCG) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 사이프로테론, 사이타라빈, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 글리벡, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 6-머캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 리부틱시마브, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레티노산, 페닐알라닌 무스타드, 우라실 무스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록스우리딘, 5-데오옥시우리딘, 시스토신 아라비노사이드, 6-머캅토푸린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터루킨-12, IM862, 안기오스타틴, 빅탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로놀락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주마브, 데니류킨 디피티톡스, 게피티니브, 보르테지미브, 파클리탁셀, 크레모포르-유리된 파클리탁셀, 독세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드록록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK 222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-하이드록시에틸-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RADOOl , ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, 와트만닌, ZM336372, L-779,450, PEG-필라그라스팀, 다르베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시마브, 과립구 대식구 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길화된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길화된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자키티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도미드, 겜투주마브, 하이드로코르티손, 인터루킨-11, 덱스라족산, 알렘투주마브, 모든-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터루킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 무스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모마브 티욱세탄, 안드로겐들, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모마브, 아르세닉 트리옥사이드, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 사이클로스포린, 리포좀 다우노루비신, 에드위나-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제들, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디펜하이드라민, 하이드록시진, 메토클로프라미드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르페라진, 그라니세트론, 온다세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 다르베포에틴 알파 및 이들의 혼합물들을 포함한다.
용어 "항암세포 암 제제"는 명세서 전체에서 간세포 암의 경향, 또는 이러한 암의 전이를 억제하거나, 치료하거나 감소하는데 사용될 수 있는 항암제를 기술하기 위해 사용된다. 본 발명에서 용도를 찾을 수 있는 항암제들은 예를 들면, 넥사바르(소라페니브), 수니티니브, 베바키주마브, 타르케바(에를로티니브), 티케르브(라파티니브) 및 이들의 혼합물들을 포함한다. 또한, 다른 항암제들이 또한 본 발명에서 사용될 수 있으며, 여기서 이러한 제제들은 암, 특히 간세포 암의 전이를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
용어 "항바이러스제"는 약물 내성 바이러스 균주들과 같은 돌연변이체 균주들을 포함하는, 바이러스의 성장 및/또는 생성(elaboration)을 억제하는 생활성제/약물을 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 항바이러스제들은 항-HIV 제제들, 항-HBV 제제들 및 항-HCV 제제들을 포함한다. 본 발멸의 특정 국면들에서, 특히 간세포암의 치료가 치료 목적인 경우, 항-C형 간염제 또는 항-B형 간염제의 포함은, B형 간염 바이러스(HBV) 및/또는 C형 간염 바이러스(HCV)가 간세포 암과 관련된 일차 또는 이차 감염 또는 질병 상태로서 발견된다는 점에서, 치료요법을 실시하기 위한 다른 전통적인 항암제들과 조합될 수 있다. 프로토셀내에서 운반물 성분 또는 프로토셀들의 집단을 포함하는 약제학적 조성물에서 추가의 생활성 제제로서, 본 발명에서 사용될 수 있는 항-HBV 제제들은 헵세라(아데포비르 디피복실), 라미부딘, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르, 엠트리키타빈, 클레부딘, 발토리키타빈, 암독소비르, 프라데포비르, 라키비르, BAM 205, 니타족사니드, UT 231-B, Bay 41-4109, EHT899, 자닥신(티모신 알파-1) 및 이들의 혼합물들과 같은 제제들을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 대표적인 항-HCV 제제들은 보케프레비르, 다클라타스비르, 아수나파비르, INX-189. FV-100, NM 283, VX-950(텔라프레비르), SCH 50304, TMC435, VX-500, BX-813, SCH503034, R1626, ITMN-191(R7227), R7128, PF-868554, TT033, CGH-759, GI 5005, MK-7009, SIRNA-034, MK-0608, A-837093, GS 9190, GS 9256, GS 9451, GS 5885, GS 6620, GS 9620, GS9669, ACH-1095, ACH-2928, GSK625433, TG4040 (MVA-HCV), A-831, F351, NS5A, NS4B, ANA598, A-689, GNI-104, IDX102, ADX184, ALS-2200, ALS-2158, BI 201335, BI 207127, BIT-225, BIT-8020, GL59728, GL60667, PSI-938, PSI-7977, PSI-7851, SCY-635, 리바비린, 페길화된 인터페론, PHX1766, SP-30 및 이들의 혼합물들과 같은 제제들을 포함한다.
용어 "항-HIV 제제"는 HIV 바이러스(I 및/또는 II) 또는 이의 돌연변이체 균주의 성장 및/또는 생성을 억제하는 화합물을 말한다. 본 발명에 따른 프로토셀들에서 운반물로서 포함될 수 있는 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 항-HIV 제제들은 다른 것들 중에서도 예를 들면, 뉴클레오사이드 역 트랜스크립타제 억제제들(NRTI), 다른 비-뉴클레오사이드 역 트랩스크립타제 억제제들(즉, 본 발명을 대표하지 않는 것들), 프로테아제 억제제들, 융합 억제제들을 포함하며, 이들 중 예시적인 화합물들은 예를 들면, 3TC(라미부딘), AZT(지도부딘), (-)-FTC, ddI (디다노신), ddC(잘키타빈), 아바카비르(ABC), 테노포비르(PMPA), D-D4FC(레베르세트), D4T(스타부딘), 라키비르, L-FddC, L-FD4C, NVP(네비라핀), DLV(델라비르딘), EFV(에파비렌즈), SQVM(사퀴나비르 메실레이트), RTV(리토나비르), IDV(인디나비르), SQV(사퀴나비르), NFV(넬파비르), APV(암프레나비르), LPV(로피나비르), 융합 억제제들, 예를 들면, T20, 푸세온 및 이들의 혼합물들을 포함한다.
용어 "표적화 활성화 종들"은 표적화될 세포의 표면 위의 잔기에 결합함으로써 프로토셀이 표적화된 세포의 표면에 선택적으로 결합하여 세포내로 이의 성분들을 침착시킬 수 있는 본 발명에 따른 프로토셀의 표면에 복합체화되거나 바람직하게는 공유결합적으로 결합된 화합물 또는 잔기를 기술하기 위해 사용된다. 본 발명에서 사용하기 위한 표적화 활성화 종들은 표적화된 세포에 결합하는 다른 종들 중에서, 본원에 달리 기술된 바와 같이 바람직하게는 표적화 펩타이드, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 아프타머, 또는 탄수화물이다.
용어 "표적화 펩타이드"는 암 세포들내에서 수용체 또는 다른 폴리펩타이드에 결합하고 표적화 펩타이드가 결합하는 펩타이드(이는 수용체 또는 다른 작용성 폴리펩타이드가 된다)를 발현하는 특수 세포들에 대해 본 발명에 따른 프로토셀들이 표적화하는 것을 허용하는 특수한 서열의 펩타이드인 바람직한 표적화 활성화 종들을 기술하기 위해 사용된다. 본 발명에서, 예시적인 표적화 펩타이드들은 예를 들면, SP94 유리된 펩타이드(H2N-SFSIILTPILPL-COOH, 서열 확인 번호 6), 가교결합제[H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(서열 확인 번호 13) 또는 8머(mer) 폴리아르기닌(H2N-RRRRRRRR-COOH, 서열 확인 번호 14)]와의 접합을 위해 C-말단 시스테인으로 개질된 SP94 펩타이드, 개질된 SP94 펩타이드(H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH, 서열 확인 번호 8) 또는 본원에 달리 기재된 바와 같은 MET 결합 펩타이드를 포함한다. 다른 표적화 펩타이드들은 당해 분야에 공지되어 있다. 표적화 펩타이드들은 본원에 달리 기술된 바와 같이 가교결합제의 사용을 통해 지질 이층(bilayer)에 복합체화되거나 바람직하게는 공유결합적으로 연결될 수 있다.
용어 "MET 결합 펩타이드" 또는 "MET 수용체 결합 펩타이드"는 암 세포들의 표면 위에서 향상된 결합 효율로 MET 수용체들에 결합하는 것으로 밝혀진 5개(5)의 7-머 펩타이드들에 대해 사용된다. 본 발명에 따라서, MET 수용체(a.k.a. 유전자 c-MET에 의해 발현된 간세포 성장 인자 수용체)와 다양한 수준들의 특이성과 MET 수용체 시그날링 경로들을 활성화시기는 다양한 능력으로 아미노산 서열들이 다양한 수개의 작은 펩타이드들이 확인되었다. 7-머 펩타이드들은, MET 수용체에 대한 향상된 결합 및 후속적으로 하기 나타내는, MET 수용체들의 높은 수준들을 발현하는 암 세포들(예를 들면, 간세포, 난소 및 경부)과 같은 세포들에 대해 향상된 결합을 입증하는 수득되는 서열들의 예들과 함께, 파아지 디스플레이 바이오패닝(phage display biopanning)을 사용하여 확인하였다. 바이오패닝 공정 동안 가장 일반적으로 관찰된 서열들 중 수개에 대한 결합 데이타는 또한 본 출원의 실시예들 단락에서 나타낸다. 이들 펩타이드들은 세포 특이적인 치료제들용의 표적화 리간드들로서 특히 유용하다. 그러나, 수용체 경로를 활성화시키는 능력을 지닌 펩타이드들은 자체로서 또는 다른 치료제들과 함께 추가의 치료학적 가치를 가질 수 있다. 많은 펩타이드들이 원래의 의도된 표적이었던 간세포 암종뿐만 아니라, 난소 및 경부암을 포함하는 다양한 다른 암종에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 펩타이드들은 다양한 암들 및 MET 및 관련된 수용체들의 발현과 관련된 다른 생리학적 문제들을 표적화하거나 치료하기 위한 광범위한 적용능을 가진 것으로 여겨진다.
다음의 5개의 7머 펩타이드 서열들은 MET 수용체에 대해 실질적인 결합을 나타내며 본 발명에 따른 프로토셀들에서 사용하기 위한 표적화 펩타이드들로서 특히 유용하다.
ASVHFPP (Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro) 서열 확인 번호 1
TATFWFQ (Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln) 서열 확인 번호 2
TSPVALL (Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu) 서열 확인 번호 3
IPLKVHP (Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro) 서열 확인 번호 4
WPRLTNM (Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met) 서열 확인 번호 5
이들 펩타이드들 중 각각은 단독으로 또는 상기 그룹내 다른 MET 펩타이드과 함께 또는 본 발명에 따른 프로토셀들이 다수의 다른 것들 중에서 간세포 암 세포들, 난소암 세포들 및 경부암 세포들을 포함하는 암 세포들에 결합하는데 있어서 보조할 수 있는 다른 표적화 펩타이들과 함께 사용될 수 있다. 이들 결합 펩타이드들은 또한 MET 결합 펩타이드들로서 약제학적 화합물들 속에서 단독으로 사용되어 암을 치료하고 달리는 간세포 성장 인자 결합을 억제한다.
용어들 "융합성 펩타이드" 및 "엔도조몰리틱 펩타이드"는 본 발명에 따른 프로토셀들의 지질 이층 표면 위에 임의로 및 바람직하게 가교결합된 펩타이드를 기술하기 위해 동의어로 사용된다. 융합성 펩타이드들은 프로토셀들에 혼입되어 엔도솜 체들(endosomal bodies)로부터의 탈출을 촉진시키거나 보조하고 프로토셀들이 표적화된 세포들로 도입하여 의도된 결과(또한 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 및/또는 진단적)를 가져오도록 한다. 본 발명에 따른 프로토셀들에서 사용하기 위한 대표적이고 바람직한 융합성 펩타이드들은 당해 분야에 공지된 다른 것들 중에서, H5 WYG 펩타이드, H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(서열 확인 번호 13) 또는 8머 폴리아르기닌(H2N-RRRRRRRR-COOH, 서열 확인 번호 14)을 포함한다.
용어 "가교결합제"는 본 발명에 따른 각종 성분들을 서로 공유결합적으로 연결하는데 사용될 수 있는 2개의 상이한 작용 그룹들을 함유하는 길이가 상이한 이작용성 화합물을 기술하기 위해 사용된다. 본 발명에 따른 가교결합제들은 2개 이상의 친전자성 그룹들(올리고뉴클레오타이드들의 펩타이드들 상의 친핵성 그룹들, 하나의 친전자성 그룹 및 친핵성 그룹 또는 2개의 친핵성 그룹들과 반응하기 위함)을 함유할 수 있다. 가교결합제들은, 연결될 성분들 및 요구되는 상대적인 굴곡성(FLEXIBILITY)에 따라 길이가 다양할 수 있다. 가교결합제들은 표적화 및/또는 융합성 펩타이드들을 인지질 이층에 정착(anchor)시키고, 핵 위치 서열들을 슈퍼코일상 플라스미드 DNA를 패키징하기 위한 히스톤 단백질들에 연결시키고 특정 예에서 프로토셀들의 지질 이층내 지질들은 가교결합시키기 위해 사용된다. 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 가교결합제들이 존재하며, 많이 시판되거나 문헌에서 이용가능하다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 가교결합제들은 예를 들면, 다른 것들 중에서, l-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-l-카복실레이트(SMCC), N-[β-말레이미도프로피온산]하이드라지드(BMPH), NHS-(PEG)n-말레이미드, 석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라코사에틸렌글리콜]에스테르(SM(PEG)24), 및 석신이미딜 6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트(LC-SPDP)를 포함한다.
위에서 상세히 논의된 바와 같이, 본 발명의 다공성 나노입자 코어는, 예를 들면, 너비 또는 직경이 약 3000 nm 이하, 약 1000 nm 이하, 약 500 nm 이하, 약 200 nm 이하인 적어도 하나의 면적을 갖는 다송성 나노입자들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 나노입자 코어는, 바람직한 면적이 약 500 nm 이하, 보다 바람직하게는 약 8-10 nm 내지 약 200nm인 구체이다. 양태들에서, 다공성 입자 코어는 한형, 직사각형, 정사각형, 또는 어떠한 다른 형태를 포함하는 각종 횡단면 형태들을 가질 수 있다. 특정 양태들에서, 다공성 입자 코어는, 평균 공극 크기 및 다른 특징들(예를 들면, 다공성 입자 코어의 다공성)이 본 교시내용들의 다양한 양태들에 따라 제한되지 않는다고 해도, 평균 공극 크기가 약 2 nm 내지 약 30 nm 범위인 코어들을 가질 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 프로토셀들은 생적합성이다. 약물들 및 다른 운반물 성분들은 흔히 최종의 프로토셀(모든 성분들 함유)의 대략 50중량% 이하의 입자 코어의 공극들의 흡착 및/또는 모세관 충전에 의해 로딩된다. 본 발명에 따른 특정 양태들에서, 로딩된 운반물은 입자 코어(중간공극들)의 다공성 표면으로부터 방출될 수 있으며, 여기서 방출 프로파일은 예를 들면, 코어 크기, 다공성 입자 코어의 표면 화학, 시스템의 pH 값, 및/또는 본원에 일반적으로 기술된 바와 같이 다공성 입자 코어와 주변 지질 이층(들)의 상호작용에 의해 결정되거나 조절될 수 있다.
본 발명에서, 프로토셀들을 제조하는데 사용된 다공성 나노입자 코어는 본원에 달리 기술한 바와 같이 친수성이되거나 점진적으로 보다 소수성이 될 수 있으며 추가로 처리하여 보다 친수성인 표면을 제공할 수 있다. 예를 들어, 중간다공성 실리카 입자들은 수산화암모늄 및 과산화수소로 추가로 처리하여 보다 높은 친수성을 제공할 수 있다. 본 발명의 바람직한 국면들에서, 지질 이층은 다공성 입자 코어 위에 융합시켜 프로토셀을 형성한다. 본 발명에 따른 프로토셀들은 바람직하게는 l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(l'-rac-글리세롤) (DOPG), l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-S-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), l,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), l-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-l,3-벤족사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-OT-글리세로-S-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이의 혼합물/조합물들을 포함하는, 각종 지질들을 다양한 중량비들로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프로토셀들을 제조하기 위해 사용된 지질 이층은 예를 들면, 탈수된 지질 필름들을 공극 크기가 예를 들면, 약 100 nm인 여과기를 통해 당해 분야에 공지된 표준 프로토콜을 사용하거나 달리는 본원에 기술된 바와 같이 압출시켜 제조할 수 있다. 여과된 지질 이층 필름들은 이후에 예를 들면, 피펫팅 혼합(pipette mixing)에 의해 다공성 입자 코어들과 융합시킬 수 있다. 특정 양태들에서, 과량의 지질 이층 또는 지질 이층 필름들을 사용하여 프로토셀을 형성시킴으로써 프로토셀 콜로이드 안정성을 개선시킬 수 있다.
특정의 진단학적 양태들에서, 다양한 염료들 또는 형광성(리포터) 분자들을 프로토셀 운반물(플라스미드 DNA로 표현된 바와 같이)내에 포함시키거나 진단 목적들용의 다공성 입자 코어 및/또는 지질 이층에 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 다공성 입자 코어는 실리카 코어 또는 지질 이층일 수 있으며 FITC(녹색 형광성)으로 공유결합적으로 표지시킬 수 있는 반면, 지질 이층 또는 입자 코어는 FITC 텍사스 레드(적색 형광성)로 공유결합적으로 표지시킬 수 있다. 다공성 입자 코어, 지질 이층 및 형성된 프로토셀은 이후에 예를 들면, 진단 적용들에서 사용하기 위한 공초점 형광성에 의해 관측될 수 있다. 또한, 본원에 논의된 바와 같이, 플라스미드 DNA는 볼 발명에 따른 프로토셀들 속에서 운반물로서 사용됨으로써 플라스미드가 진단 적용들에 사용될 수 있는 형광성 녹색 단백질 또는 형광성 적색 단백질과 같은 하나 이상의 형광성 단백질들을 발현할 수 있도록 할 수 있다.
각종 양태들에서, 프로토셀은 상승적 시스템에서 사용되며, 여기서 지질 이층 융합물 또는 리포좀 융합물(즉, 다공성 입자 코어 위에서)이 로딩되어 입자 코어의 코어들(중간공극들)을 지닌 각종 운반물 성분들로 밀봉됨으로써, 경우에 따라 지질 이층의 세포 막을 가로지르는 또는 다공성 나노입자의 용해를 통한 운반물 전달에 유용한 로딩된 프로토셀을 생성할 수 있다. 특정 양태들에서, 단일 지질(예를 들면, 인지질들)을 융합시키는 것 외에, 반대 전하들을 갖는 다중 이층들을 다공성 입자 코어에 연속적으로 융합시켜 운반물 로딩 및/또는 밀봉 및 또한 최종 프로토셀의 방출 특성들에 추가로 영향을 미칠 수 있다.
융합 및 상승작용성 로딩 메카니즘은 운반물 전달을 위해 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 운반물은 다공성 입자들 위의 리포좀 융합을 통해 상승적으로 로딩되거나, 봉입(encapsulation)되거나, 밀봉될 수 있다. 운반물은 예를 들면, 소 분자 약물들(예를 들면, 항암 약물들 및/또는 항바이러스 약물들, 예를 들면, 항-HBV 또는 항-HCV 약물들을 포함), 펩타이드들, 단백질들, 항체들, DNA(특히, 바람직한 히스톤-패키징된 슈퍼 코일드(super coiled) 플라스미드 DNA를 포함하는, 플라스미드 DNA), RNAs[shRNA 및 siRNA(이는 프로토셀들내에 운반물로서 혼입된 플라스미드 DNA로서 또한 표현될 수 있다)], 프로토셀내에 혼입된 플라스미드 DNA에 의해 발현될 수 있는 형광성 염료 펩타이드들을 포함하는, 형광성 염료들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 양태들에서, 운반물은 다공성 입자 코어들의 코어(중간공극들)내로 로딩되어 로딩된 프로토셀을 형성할 수 있다. 각종 양태들에서, 리포좀-계 약물 전달, 예를 들면, 페길화(PEGylation)를 사용한 표적화된 전달을 위해 개발된 어떠한 통상의 기술도 본 발명의 프로토셀들을 전달하여 적용시킬 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 정전기들 및 공극 크기는 운반물 로딩에서 중요한 역활을 할 수 있다. 예를 들면, 다공성 실리카 나노입자들은 음성 전하를 수반할 수 있으며 공극 크기는 약 2 nm 내지 약 10 nm 이상으로 변할 수 있다. 음으로 하전된 나노입자들은 양으로 하전된 분자들을 흡수하는 천연의 경향성을 가질 수 있고, 양으로 하전된 나노입자들은 음으로 하전된 분자들을 흡수하는 천연의 경향성을 가질 수 있다. 각종 양태들에서, 표면 습윤성(예를 들면, 소수성)과 같은 다른 특성들도 또한 소수성이 상이한 운반물을 로딩하는데 영향을 미칠 수 있다.
각종 양태들에서, 운반물 로딩은 액체 조성물을 조율함에 의한 상승적인 액체-보조된 로딩일 수 있다. 예를 들어, 운반물 성분이 음으로 하전된 분자인 경우, 음으로 하전된 실리카내로 운반물 로딩은 액체 보조된 로딩으로 달성할 수 있다. 특정 양태들에서, 예를 들면, 음성 종들은, 지질 이층이 실리카 표면 위에 융합되어 융합 및 상승적 로딩 메카니즘을 나타내는 경우 음으로 하전된 실리카 입자의 공극들내로 운반물로서 로딩될 수 있다. 이러한 방식으로, 비-음으로 하전된(즉, 양으로 하전되거나 중성인) 지질 이층 또는 음으로 하전된 중간공극성 입자 위의 리포좀의 융합은 음으로 하전된 운반물 성분들을 지닌 입자 코어를 로딩하는데 제공될 수 있다. 음으로 하전된 운반물 성분들은, 용액 속의 하전된 운반물 성분들과 비교하여 약 100배를 초과하는 농도를 갖는 로딩된 프로토셀내에서 농축될 수 있다. 다른 양태들에서, 중간공극성 입자 및 액체 이층의 전하를 변화시킴으로써, 양으로 하전된 운반물 성분들을 프로토셀들 내로 용이하게 로딩할 수 있다.
일단 생산되면, 로딩된 프로토셀들은 투여 후 바람직한 부위 내로 운반물 전달을 위해 세포 흡수될 수 있다. 예를 들면, 운반물-로딩된 프로토셀들은 환자 또는 대상체에게 투여될 수 있으며 표적화 펩타이드를 포함하는 프로토셀은 표적 세포에 결합하여 예를 들면, 대상체 또는 환자내에서 표적 세포, 예를 들면, 암 세포에 의해 내재화되거나 흡수될 수 있다. 표적 세포내에서 운반물-로딩된 프로토셀들의 내재화로 인하여, 운반물 성분들은 표적 세포들내로 전달될 수 있다. 특정 양태들에서 운반물은 소 분자이며, 이는 치료요법을 위해 표적 세포내로 직접 전달될 수 있다. 다른 양태들에서, 특히 핵 위치 서열로 바람직하게 개질된 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA로서 바람직하게 제형화된 DNA 플라스미드를 포함하는, 음으로 하전된 DNA 또는 RNA(shRNA 또는 siRNA 포함)는 표적화된 세포들에 의해 직접 전달되거나 내재화될 수 있다. 따라서, DNA 또는 RNA는 우선 프로토셀내로 로딩된 후 로딩된 프로토셀들의 내재화를 통해 표적 세포들을 통해 로딩될 수 있다.
논의된 바와 같이, 프로토셀에 의해 표적 세포들로 로딩되거나 전달된 운반물은 소 분자들 또는 약물들(특히 항암 또는 항-HBV 및/또는 항-HCV 제제들), 생활성 거대분자들(본원에 달리 기술된 바와 같은 리신 독소 A-쇄 또는 디프테리아 독소 A-쇄와 같은 생 활성 폴리펩타이드들 또는 shRNA 및/또는 siRNA와 같은 RNA 분자들) 또는 shRNA 또는 siRNA와 같이 치료학적 RNA 분자 또는 치료학적 또는 진단학적 펩타이드를 발현할 수 있는 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA를 포함하며, 여기서 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA는 표적 세포의 핵내로 전달된 플라스미드 DNA를 국재화하여 농축시킬 수 있는 핵 국재화 서열로 임의로 및 바람직하게는 개질된다. 이와 같이, 로딩된 프로토셀들은 이들의 운반물을 치료요법 또는 진단들을 위해 표적화된 세포들내로 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 각종 양태들에서, 프로토셀들 및/또는 로딩된 프로토셀들은 프로토셀들 또는 운반물 성분들을 표적화된 세포들(예를 들면, 암 세포들)내로 선택적으로 전달하기 위한 표적화된 전달 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 지질 이층의 표면은 표적화된 세포에 상응하는활성 종들을 표적화시켜 개질시킬 수 있다. 표적화 활성 종들은 본원에 달리 기술된 바와 같은 표적화 펩타이드, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 아프타머, 탄수화물 또는 다른 잔기일 수 있다. 본 발명의 바람직한 국면들에서, 표적화 활성화 종들은 본원에 달리 기술된 바와 같은 표적화 펩타이드이다. 특정 양태들에서, 바람직한 펩타이드 표적화 종은 본원에 달리 기술된 바와 같은 MET 결합 펩타이드를 포함한다.
예를 들면, 표적화 활성화 종들(바람직하게는 표적화 펩타이드)을 로딩된 프로토셀의 표면 위에 제공함으로써, 프로토셀은 본 발명의 교시에 따라 표적화된 세포에 선택적으로 결합한다. 하나의 양태에서, 예시적인 표적화 펩타이드 SP94 또는 유사체 또는 간암 세포들을 포함하는 암 세포들을 표적화하는, 본원에 달리 기술된 바와 같은 MET 결합 펩타이드를 지질 이층에 접합시킴으로써, 다수의 운반물-로딩된 프로토셀들은 암(간 포함) 세포들과의 예시적인 SP94 또는 MET 결합 펩타이드의 특이적인 표적화로 인하여 이러한 특이적인 암 세포들에 의해 인식되고 내재화될 수 있다. 대부분의 예들에서, 프로토셀들이 표적화 펩타이드와 접합되는 경우, 프로토셀들은 암 세포들에 선택적으로 결합할 것이며 비-암 세포들에 대한 적절한 결합은 발생하지 않을 것이다.
일단 결합되어 표적 세포들에 의해 흡수되면, 로딩된 프로토셀들은 다공성 입자들로부터 운반물 성분들을 방출하고 방출된 운반물 성분들을 표적 세포내로 수송할 수 있다. 예를 들면, 프로토셀내에서 다공성 입자 코어 상에 리포좀 융합된 이층에 의해 밀봉되면, 운반물 성분들은 지질 이층의 공극들로부터 방출되어, 지질 이층의 프로토셀 막을 통해 수송되어 표적화된 세포내로 전달될 수 있다. 본 발명에 따른 양태들에서, 프로토셀들 중 운반물 성분들의 방출 프로파일은 당해 분야에 공지된 바와 같은 리포좀들 만을 사용하는 경우와 비교하여 보다 조절가능할 수 있다. 운반물 방출은 예를 들면, 다공성 코어와 지질 이층 및/또는 시스템의 pH 값과 같은 다른 매개변수들 사이의 상호작용에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 운반물의 방출은 다공성 실리카의 용해를 통해, 지질 이층을 통해 달성될 수 있는 반면; 프로토셀들로부터의 운반물의 방출은 pH-의존적이다.
특정 양태들에서, 운반물에 대한 pH 값은 흔히 7 미만, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 6.0이지만, 약 pH 14 이하일 수 있다. 낮은 pH들은 고 pH들과 비교하여 보다 유의적으로 운반물 성분들의 방출을 용이하게하는 경향이 있다. 보다 낮은 pH들은, 대부분의 세포들내의 엔도솜 구획들이 낮은 pH들(약 5.5)이어서 유리하지만, 세포에서 운반물의 전달율은 운반물의 pH에 의해 영향받을 수 있다. 운반물 및 운반물리 프로토셀로부터 방출되는 pH에 따라, 운반물이 방출은 비교적 단기간(수시간 내지 수일 등)일 수 있거나 수일 내지 약 20 내지 30일 이상으로 더 길어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 프로토셀들 자체들로부터 즉시 방출 및/또는 지속된 방출 적용들을 제공한다.
특정 양태들에서, 표면활성제들의 혼입은 지질 이층을 신속하게 파괴하여, 프로토셀 및 표적화된 세포의 지질 이층을 통해 운반물 성분들을 수송하기 위해 제공될 수 있다. 특정 양태들에서, 프로토셀들의 인지질 이층은 다른 것들 중에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS)와 같은 표면활성제의 적용/방출에 의해 파괴되어 프로토셀로부터 표적화된 세포내로 운반물의 신속한 방출을 촉진시킬 수 있다. 표면활성제들 이외에, 다른 물질들도 이층을 신속히 파괴하기 위해 포함될 수 있다. 하나의 예는 금 또는 광 또는 열을 사용하여 열을 생성함으로써 이층을 파괴하는 자기 나노입자들일 수 있다. 또한, 이층은 증가된 반응성 산소 종들 생산에 대한 반응 시 염증 동안과 같은, 생물물리학적 현상들의 존재하에서 파괴될 수 있다. 특정 양태들에서, 지질 이층의 파괴는 궁극적으로 프로토셀들의 입자 코어의 공극들로부터 운반물 성분들의 즉각적이고 완전한 방출을 유도할 수 있다. 이러한 방식으로, 프로토셀 플랫포옴(프로토셀 platform)은 당해 분야의 다른 전달 시스템들과 비교하여 증가하는 다목적 전달 시스템(versatile delivery system)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 나노입자들만을 사용하는 전달 시스템들과 비교하여, 기재된 프로토셀 플랫포옴은 단순한 시스템을 제공할 수 있으며 페길화되거나 접합하여 순환 시간을 연장시키고 표적화를 수행하는 이들의 능력과 함께, 리포좀들 또는 지질 이층의 저 독성 및 면역원성의 장점을 취할 수 있다. 다른 예에서, 리포좀 만을 상요한 전달 시스템들과 비교하는 경우, 프로토셀 플랫포옴은 보다 안정한 시스템을 제공할 수 있으며 중간공극 코어의 장점을 취하여 로딩 및/또는 방출 프로파일을 조절하고 증가된 운반물 능력을 제공할 수 있다.
또한, 지질 이층 및 다공성 입자 코어 위에서 이의 융합은 로딩, 방출 및 표적화 프로파일들을 위하여 미세-조율될 수 있으며 융합성 펩타이드들 및 관련된 펩타이드들을 추가로 포함함으로써 보다 큰 치료학적 및/또는 진단적 효과를 위해 프로토셀들의 전달을 용이하게 할 수 있다. 또한, 프로토셀들의 지질 이층은 리간드 디스플레이(ligand display) 및 다가 표적화를 위한 유동성 계면을 제공할 수 있으며, 이는 유동성 지질 계면위의 리간드 재구조화의 능력으로 인하여 비교적 낮은 표면 리간드 밀도로 특이적인 표적화를 허용한다. 또한, 기재된 프로토셀들은 표적화된 세포들로 용이하게 도입될 수 있는 반면, 다공성 입자들의 지지가 없는 빈 리포좀들은 세포들에 의해 내재화될 수 없다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물들은 제형화되어 의도된 결과(예를 들면, 치료학적 결과 및/또는 진단 분석, 예를 들면 치료요법의 모니터링)를 수행하기 위한 본원에 달리 기술된 바와 같은 프로토셀들의 유효 집단을 포함하며 약제학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 부형제와 함께 제형화된다. 조성물의 집단내 프로토셀들은 수득된 바람직한 결과에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물들은 항암제 또는 항 바이러스제, 예를 들면, 항-HIV, 항-HBV 또는 항-HCV 제제와 같은, 첨가 생활성제 또는 약물을 포함할 수 있다.
일반적으로, 화합물의 투여 용량들 및 경로들은 표준 약제학적 실시들에 따라, 대상체의 체격 및 상태에 따라 결정된다. 사용된 투여량 수준들은 광범위하게 변할 수 있으며, 당해 분야의 숙련가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 밀리그람 내지 그람 양들의 양들이 사용된다. 조성물은 대상체에게 다양한 경로들, 예를 들면, 다른 것들 중에서 볼내, 직장 및 경피 투여를 포함하는, 경구적으로, 경피적으로, 신경주위에 또는 비경구적으로, 즉 정맥내, 피하, 복강내, 척추강내 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 치료를 위해 고려되는 대상체들은 사람들, 반려동물들, 실험실 동물들 등을 포함한다. 본 발명은 즉시 방출 및 서방출 제형들 둘다를 포함하는 조성물들을 포함하는, 즉시 및/또는 지연된/조절된 방출 조성물들을 고려한다. 이는, 프로토셀들의 상이한 집단들을 약제학적 조성물들 속에 사용하거나 추가의 생활성제(들)을 본원에 달리 기술된 바와 같은 프로토셀들의 하나 이상의 집단들과 함께 사용하는 경우 특히 그러하다.
본 발명에 따른 화합물들을 함유하는 제형들은 바람직하게는 정밀한 용량들의 단순한 투여를 위해 적합한 단위 용량 형태들인, 예를 들면, 액제, 현탁제, 유제, 서방성 제형들, 정제들, 캅셀제들, 산제들, 좌제들, 크림제들, 연고제들, 로션제들, 에어로졸들, 패취들 등과 같은 액체, 고체, 반-고체 또는 동결건조된 분말형들의 형태를 취할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물들은 전형적으로 통상의 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하며 다른 의약제들, 담체들, 부형제들, 첨가제들 등을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 약 0.1% 내지 약 85 중량%, 약 0.5% 내지 약 75 중량%의 본 발명의 화합물 또는 화합물들과, 적합한 약제학적 부형제들로 필수적으로 이루어진 다른 것들이다.
비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 척추강내)용의 주사가능한 조성물은 전형적으로 적합한 정맥내 용액, 예를 들면, 멸균 생리학적 염 용액 속에 화합물을 함유할 것이다. 조성물은 또한 수성 유액 속에 현탁액으로 제형화될 수 있다.
액제 조성물들은 프로토셀들의 집단(약 0.5 중량% 내지 약 20 중량% 이상), 및 임의의 약제학적 부형제들을 예를 들면, 수성 염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 또는 에탄올과 같은 담체 속에서 용해하거나 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 경구용 액체 제제에서 사용하기 위해, 조성물은 용액, 현탁액, 유액 또는 시럽으로 제조될 수 있으며 물 또는 정상의 염수 속에서 수화시키기에 적합한 액체형 또는 무수형으로 공급된다.
경구 투여를 위해, 이러한 부형제들은 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 젤라틴, 슈크로즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 경우에 따라, 조성물은 또한 미량의 무-독성 보조 물질들, 예를 들면, 습윤제들, 유화제들, 완충제들을 함유할 수 있다.
조성물이 경구 투여용의 고체 제제들의 형태로 사용되는 경우, 당해 제제들은 정제들, 입제들, 산제들, 캅셀제들 등일 수 있다. 정제 제형에서, 조성물은 첨가제들, 예를 들면, 사카린 또는 셀룰로즈 제제와 같은 부형제, 전분 페이스트 또는 메틸 셀룰로즈와 같은 결합제, 충전제, 붕해제, 및 의학 제제들의 제조에 전형적으로 사용된 다른 첨가제들과 함게 전형적으로 제형화된다.
이러한 용량형들을 제조하는 방법들은 공지되어 있거나 당해 분야의 숙련가들에게 익숙하며; 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., 1985)]을 참조한다. 투여될 조성물은 본 발명에 따른 환자 또는 대상체를 포함하는 생물학적 시스템에서 치료학적 용도를 위해 약제학적유효량인 선택된 화합물의 양을 함유할 것이다.
특수한 질병 상태 또는 감염(특히 암 및/또는 HBV, HCV 또는 HIV 감염 포함)을 위해 요구되는 환자들 또는 대상체들을 치료하는 방법들은 치료학적 프로토셀들 및 임의로 적어도 하나의 본 발명에 따른 추가의 생활성(예를 들면, 항바이러스) 제제를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 진단 방법들은, 필요로 하는 환자(암에 걸린 것으로 추측되는 환자)에게 유효량의 진단 프로토셀들(예를 들면, 암 세포들에 선택적으로 결합하는 표적화 펩타이드와 같은 표적 종들 및 암 세포들이 존재하는 경우 암 세포들에 대한 프로토셀들의 결합을 나타내는 리포터 성분을 포함하는 프로토셀들)의 집단을 투여함을 포함하며, 여기서 리포터 성분(잔기)에 의해 입증된 바와 같이 암 세포들에 대한 프로토셀들의 결합은 환자에서 암세포의 존재의 진단을 가능하도록 할 것이다.
본 발명의 진단 방법의 대안을 사용하여 환자에서 암 또는 다른 질병 상태의 치료요법을 모니터할 수 있으며, 당해 방법은 유효 집단의 진단 프로토셀들(예를 들면, 암 세포들에 선택적으로 결합하는 표적화 펩타이드와 같은 표적 종들 및 암 세포들이 존재하는 경우 암 세포들에 대한 프로토셀들의 결합을 나타내기 위한 리포터 성분을 포함하는 프로토셀들)을 치료 전에 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계, 당해 환자에서 및 치료요법 동안 및/또는 후에 표적 세포들에 대한 진단 프로토셀들의 결합 수준을 측정하는 단계, 당해 환자에서 표적 세포들에 대한 진단 프로토셀들의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 환자에서 및 치료요법 동안 및/또는 후에 결합에 있어서의 차이는, 환자가 완전한 치료요법을 가지고 있는지 또는 질병 상태가 억제되거나 제거되는지(암의 차도)의 여부를 포함하여, 환자에서 치료요법의 효능을 입증할 것이다.
다음의 비-제한적인 실시예들은 본 발명 및 이의 유리한 특성들을 나열하며, 어떠한 방식으로도 기재내용 또는 특허청구범위를 제한하는 것으로서 고려되지 않아야 한다. 당해 실시예들, 및 본 출원의 어느 곳에서도, 모든 부들 및 퍼센트들은 달리 나타내지 않는 한 중량 기준이다.
실시예 1
리간드-표적화 프로토셀들
이후의 실시예들에서 제공되는 바와 같이, 리포좀들의 나노다공성 실리카 입자들의 융합을 통해 형성된, 다공성 나노입자-지지된 지질 이층(프로토셀)은 암 치료제들 및 진단제들의 표적화된 전달과 관련된 다수의 과제(challenge)에 초점을 맞춘 나노담체(nanocarrier)의 신규 유형이다. 리포좀들과 유사하게, 프로토셀들은 생적합성이고, 생분해성이며, 비-면역원성이지만, 이들의 나노다공성 실리카 코어는 유사한 크기의 리포좀 전달제들과 비교하여 현저히 향상된 운반물 능력 및 연장된 이층 안정성을 부여한다. 코어의 다공성 및 표면 화학은 또한 조절되어 약물들, 핵산들, 및 단백질 독소들과 같은 다양한 치료제들의 봉입(encapsulation)을 촉진할 수 있다. 운반물 방출 속도는 공극 크기 및 실리카 압축의 전체적인 정도에 의해 조절됨으로써, 프로토셀들이 버스트(burst) 또는 조절된 방출 프로파일들을 필요로 하는 적용들에서 유용하도록 한다. 최종적으로, 프로토셀의 지지된 지질 이층(SLB)은 리간드들로 개질시켜 선택적인 전달을 촉진시키고 PEG로 개실시켜 순환 시간들을 연장시킬 수 있다. 당해 예들에서, 본 발명자들은 펩타이드 표적화된 프로토셀들을 사용하여 사이클린 B1을 사일런싱(silencing)시킴으로써 형질감염된 세포들의 세포자살 및 성장 정지를 유도하는, 소 헤어핀(small hairpin) RNA(shRNA)을 암호화하는 플라스미드의 매우 특이적인 전달을 달성함을 보고한다. 하기 실시예 단락에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 이중 표면활성제 시도를 사용하여 히스톤-패키징된 플라스미드들을 수용하기에 충분한 공극들 크기를 갖는 합성된 실리카 나노입자들을 제조하였다. 비-이온성 표면활성제(Pluronic® F-127)은, 팽윤제(1,3,5-트리메틸벤젠)와 함께 사용되는 경우, 거대 공극들용의 주형으로서 제공되지만, 플루오로카본 표면활성제(FC-4)는 실리카 코어의 성장을 촉진하였다. 수득되는 입자들은, 직경들이 100-nm 내지 300-nm의 범위이고 공극 입구들이 17.3-nm인 20-nm의 공극들의 정돈된 네트워크(ordered network)를 함유하였다. 슈퍼코일상 플라스미드 DNA는 히스톤들로 패키징되었으며, 수득되는 복합체(직경 약 15-nm)은 실리카 코어내로 로딩하기 전에 핵 위치 서열(NLS)로 개질시켰다. 나노다공성 코어내로 리포좀들의 융합은 37℃에서 모의된 체액들에 노출시 봉입된 DNA의 장기간 보유(>1 개월)를 촉진시켰다. 파아지 디스플레이를 사용하여, 본 발명자들은 다양한 유형들의 간세포 암종(HCC)에 의해 과발현되는 것으로 알려진, 간세포 성장 인자 수용체(c-Met)에 대한 나노몰 친화성을 지닌 표적화 펩타이드를 확인하였다. 프로토셀들을 DNA-히스톤-NLS 복합체와 함께 로딩하고 "240 카피들의, 프로토셀들의 엔도솜 탈출을 촉진하는 표적화 펩타이드 및 융합성 펩타이드 각각으로 개질시켰으며 봉입된 DNA는 분할된 HCC 및 분할되지 않은 HCC 둘다로 형질감염시킬 수 있었다. 또한, 표적화된 프로토셀들은 간 세포들, 내피 세포들, 및 면역세포들(PBMCs, B 세포들, 및 T 세포들)을 포함하는 비-암 세포들의 생존능에 영향을 미치지 않고, GJM 정지 및 HCC의 세포자살(LC = 25 nM)을 효과적으로 유도하였다.
방법들
프로토셀의 코어를 형성하는 나노다공성 실리카 입자들을 앞서 기술한 바와 같이1,2[또한 참조: Ashley, et al, Nature Materials, 2011, May;10(5):389-97] 수용성 실리카 전구체(들) 및 양친매성 표면활성제(들)의 균질한 혼합물로부터 에어로졸-보조된 증발-유도된 자가-조립(aerosol-assisted evaporation-induced self-assembly: EISA) 또는 용매 추출-기원한 자가-조립을 사용하여 유중수 유액(water-in-oil emulsion) 소적들1 내에서 제조한다. 용매 증발 또는 추출은 표면활성제(들) 속에서 에어로졸 또는 유액 소적들을 농축시키며, 이는 주변에 실리카가 조립되어 농축되는, 주기적인, 정돈된 구조들의 형성을 지시한다. 표면활성제들은 열 하소를 통해 제거되며, 이는 잘-정의되고, 균일한 공극 크기들 및 위상들을 갖는 다공성 나노입자들을 생성한다. 에어로졸-보조된 EISA('단일모드' 입자들)를 통해 형성된 입자들은 대략 120-nm(크기 배출-계 분리 후)의 평균 직경, 1200m2/g의 과량의 브루나우어-엠머-텔러(Brunauer-Emmer-Teller: BET) 표면적, 약 50%의 용적 분율, 및 2.5-nm의 단일모드 공극 직경을 지닌다. 유액 소적들 내에서 형성된 입자들('다중모드' 입자들)은, 평균 직경이 ~150 nm(크기-배출-계 분리 후)이고, BET 표면적이 > 600 m2/g이며, 세공 부피 분율이 ~65%, 다중모드 세공 형태학이 6 내지 12nm 공극들로 서로 연결된 큰(20 내지 30 nm), 표면-접근성 세공들로 구성되어 있다. 에어로졸 또는 유액 가공(각각)과 관련된 액체-증기 또는 액체-액체 계면 장력들은 최소한의 표면 조도의 구체형을 강요한다. 2개 유형의 입자들은 질소 흡습 등온들의 분석으로 입증되는 바와 같이, 완전히 허용되는 3-차원 공극 네트워크들을 추가로 갖는다.
나노다공성 실리카 코어들의 고 공극 용적, 표면적, 및 접근성은 높은 운반물 수용력을 부여하며 다중 유형들의 치료제 및 진단제의 신속한 로딩을 가능하도록 한다. 단일모드 나노다공성 코어들은 저 분자량 화학치료제들에 대해 고 수용력을 가지는 반면, 다중모드 코어들은 siRNA, 단백질 독소들, 및 다른 고 분자량 운반물들(예를 들면, 플라스미드 DNA)의 봉입에 필수적인 크고, 표면-접근가능한 공극들을 지닌다. 운반물 방출 속도는, 실리카 코어가 농축된 정도에 의해 정밀하게 조절될 수 있다. 다양한 양들의 AEPTMS, 아민-함유 실란의, 나노다공성 실리카 코어들을 형성하기 위해 사용된 졸내로의 혼입은 달성가능한 농축 수준을 감소시키고 중성 pH, 고 이온 강도(즉, 세포질) 조건들 하에서 보다 신속한 분해를 촉진한다. AEPTMS를 함유하지 않는 입자들은 모의된 체액 속에서 2주의 기간에 걸쳐 분해되지만, 30 몰%의 AEPTMS를 함유하는 입자들은 24시간내에 분해된다. 따라서, 프로토셀들은 연속적이거나 버스트(burst) 방출 프로파일들을 필요로 하는 적용들을 위해 조정될 수 있다.
나노다공성 실리카 입자들을 형성하기 위해 사용된 전구체 졸내로의 AEPTMS의 혼입은 세포질 조건들 하에서 입자 분해를 가속화시키고 단순한 확산을 통해 달성될 수 있는 것보다 봉입된 운반물의 보다 신속한 방출을 촉진한다. 그러나, AEPTMS-개질된 입자들은 또한 약 염기성 화학치료 약물들(예를 들면, 독소루비신)에 대해 감소된 수용력을 갖는다. 따라서, 수용력 및 세포내 방출 둘 다를 최대화하기 위해, 본 발명자들은 제타 전위(zeta potential), 운반물(예를 들면, 약물(독소루비신/DOX)/화학치료요법) 수용력, 실리카 분해 속도들, 및 AEPTMS 농도의 함수로서 운반물 방출 속도들을 특성화하였다. 앞서 입증된 바와 같이, 개질되지 않은 단일모드 입자들(ζ = -104.5 ± 5.6)은 운반물에 대해 높은 수용력을 가지는 반면(DOX의 경우 1010개 입자당 ~1.8 mM), 이들의 봉입된 운반물(약물)의 20% 만을 24시간내(즉, HCC의 전형적인 2배의 시간)에 방출한다. 역으로, 30 중량%의 AEPTMS을 함유한 단일모드 입자들(ζ = 88.9 ± 5.5)은 6시간내에 이들의 봉입된 운반물(약물) 모두를 방출하지만 감소된 약물(DOX) 수용력(1010개 입자들당 ~0.15 mM)을 가진다. 15 중량%의 AEPTMS(ζ = -21.3 ± 5.1)을 함유하는 단일모드 입자들은 약물(DOX)에 대해 자체의 높은 수용력(1010개 입자들당 ~1.1 mM)을 보유하며 모의된 체액에 노출되는 경우 24시간 내에 이들의 봉입된(약물)의 거의 모두를 방출하므로; 이들 입자들은 운반물의 전달을 포함하는 모든 실험들을 위해 선택된다. 단일모드 실리카 입자들의 제타 전위는 AEPTMS 농도의 함수로서 증가하지만, AEPTMS-개질된 입자들의 세공 부피 분율(30 중량%의 AEPTMS를 함유하는 입자들에 대해 ~45%)은 개질되지 않은 입자들의 것(~50%)과는 실질적으로 상이하지 않음을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 감소된 공극 용적보다는 오히려 정전기 척력에 대한 AEPTMS-개질된 단일모드 입자들의 감소된 운반물 수용력에 기여한다. 다중형대 입자들은 대조군으로서 포함되어 운반물 수용력 및 운반물 방출의 역학들에 있어서 공극 크기의 효과를 입증한다.
일반적인 시약들
무수 에탄올, 염산(37%), 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS, 98%), 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, ≥ 98%), 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필트리메톡시실란(AEPTMS, 기술 등급), 2-시아노에틸 트리에톡시실란(CETES, ≥ 97.0%), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB, ≥ 99%), Brij®-56, 나트륨 도데실 설페이트(SDS, ≥ 98.5%), Triton® X-100, 헥사데칸(≥ 99%), 독소루비신 하이드로클로라이드(≥ 98%), 5-플루오로우라실(≥ 99%), 시스-디아민플라티늄(II) 디클로라이드(시스플라틴, ≥ 99.9%), 코리네박테리운 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae)로부터의 디프테리아 독소, 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum)으로부터의 사이클로스포린 A(CsA, ≥ 95%), N-아세틸-L-시스테인(NAC, ≥99%), 사람 내피 성장 인자, L-α-포스파티딜에탄올아민, 티미딘(≥ 99%), 하이포크산틴(≥ 99%), 소 피브로넥틴, 소 콜라겐 제I형, 젤라틴, 대두 트립신 억제제(≥ 98%), 2-머캅토에탄올(≥ 99.0%), DL-디티오트레이톨(≥ 99.5%), 디메틸 설폭사이드(≥ 99.9%), pH 5 시트르산 완충액, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 99.995%)), 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-l-에탄설폰산(HEPES, ≥ 99.5%), 이염기성 인산암모늄(≥ 99.99%), 및 Sepharose® CL-4B은 업자[Sigma-Aldrich(미주리주 세인트 루이스 소재)]로부터 구입하였다. 초 순수, EM-등급의 포름알데하이드(16%, 메탄올-유리됨)은 업자[Polysciences, Inc.(펜실바니아주 와링톤 소재)]로부터 구입하였다. Hellmanex® II는 업자[Hellma(독일 뮐하임 소재)]로부터 구입하였다.
지질들
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), l,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), l-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), l-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-l,3-벤족사디아졸-4-yl)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포클리올린(16:0-12:0 NBD PC), 및 콜레스테롤은 업자[Avanti Polar Lipids, Inc.(알라바마주 알라바스터 소재)]로부터 구입하였다.
세포주들 및 성장 배지들
사람 Hep3B(HB-8064), 사람 간세포들(CRL-11233), 사람 말초 혈액 단핵 세포들(CRL-9855), 사람 제대 정맥 내피 세포들(CRL-2873), T 림프세포들(CRL-8293), B 림프세포들(CCL-156), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium: EMEM), 둘베코 변형 이클 배지(Dulbecco's 개질된 Eagle's Medium: DMEM), 이소코브 변형 둘베코 배지(Iscove's 개질된 Dulbecco's Medium: IMDM), RPMI 1640 배지, 태아 송아지 혈청(FBS), 및 1X 트립신-EDTA 용액(0.53 mM EDTA가 들어있는 0.25% 트립신)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC; 버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수하였다. BEGM 발렛 키트들(Bullet Kits)은 업자[Lonza Group Limited(Clonetics; 메릴랜드주 워커스빌 소재)]로부터 구입하였다. 페놀 레드가 들어있지 않은 DMEM은 업자[Sigma-Aldrich(미주리주 세인트 루이스 소재)]로부터 구입하였다.
형광성 염료들(stains) 및 현미경 시약들
Hoechst 33342 (350/461), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 356/451), Alexa Fluor® 405 카복실산, 석신이미딜 에스테르(401/421), CellTracker™ 보라색 BMQC(415/516), CellTracker™ 녹색 CMFDA(492/517), 칼세인(495/515), 안넥신 V의 Alexa Fluor® 488 접합체(495/519), Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스 IgG(H+L) (495/519), Click-iT® AHA Alexa Fluor® 488 단백질 합성 HCS 검정(495/519), LIVE/DEAD® 굴곡성 녹색 사멸 세포 염료 키트(Fixable Green Dead Cell Stain Kit)(495/519), SYTOX® 녹색 핵산 염료(504/523), MitoSOX™ Red 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 지시제(510/580), Alexa Fluor® 532 카복실산, 석신이미딜 에스테르(532/554), 프로피듐 요오다이드(535/617), pHrodo™ 석신이미딜 에스테르 (558/576), CellTracker™ Red CMTPX(577/602), Texas Red® 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(Texas Red® DHPE, 583/608), Alexa Fluor® 647 하이드라지드(649/666), Alexa Fluor® 647 카복실산, 석신이미딜 에스테르 (650/668), Ulysis™ Alexa Fluor 647 핵산 표지화 키트(Nucleic Acid Labeling Kit)(650/670), 안넥신 V의 Alexa Fluor® 647 접합체(650/665), SlowFade® 금 안티페이드 시약(Gold antifade reagent)(DAPI가 들어있거나 들어있지 않은), Image-iT® FX 시그날 인핸서(enhancer), 1X 둘베코 인산염 완충 염수(D-PBS), 소 알부민 분획 V 용액(BSA, 7.5%), 및 프랜스페린은 업자[Invitrogen Life Sciences(캘리포니아주 칼스바드 소재)]로부터 구입하였다. 적색 형광성 단백질(RFP, 557/585), CaspGLOW™ 플루오레세인 활성 카스파제-3 염색 키트(485/535), 및 CaspGLOW™ 적색 활성 카스파제-8 염색 키트(540/570)는 업자[BioVision, Inc.(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)]로부터 구입하였다. 수용성 CdSe/ZnS 양자점들, CZWD640(640/660)은 업자[NN-Labs(아칸소주 파예트빌 소재)]로부터 구입하였다.
가교결합제들
1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), N-[β-말레이미도프로피온산]하이드라지드(BMPH), 석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라코사에틸렌글리콜]에스테르(SM(PEG)24), 석신이미딜 6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트(LC-SPDP), 및 설프하이드릴 첨가 키트는 업자[Pierce 단백질 Research Products(Thermo Fisher Scientific LSR; 일리노이주 록포드 소재)]로부터 구입하였다.
다른 실리카 나노입자들
Sub-5-nm 규소 나노입자들은 업자[Melorium Technologies, Inc.(뉴욕주 로체스터 소재)]로부터 구입하였다. 10 내지 20 nm의 산화규소 나노입자들은 업자[SkySpring Nanomaterials, Inc.(텍사스주 휴스턴 소재)]로부터 구입하였다. 30-nm, 40-nm, 50-nm, 60-nm, 70-nm, 80-nm, 90-nm, 100-nm, 150-nm, 200-nm, 및 10-㎛ 실리카 입자들은 업자[Discovery Scientific, Inc.(브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버 소재)]로부터 구입하였다.
합성 siRNA 및 펩타이드들
사일런서(Silencer) 선택 siRNAs(EGFR, VEGFR-2, 및 PDGFR-α에 대한 siRNA 확인번호들은 각각 s565, s7824, 및 s10234이다)는 업자[Ambion, Inc.(텍사스주 오스틴 소재)]로부터 구입하였다. 5' 아미노 변형인자 C12를 갖는 이본쇄-DNA 올리고뉴클레오타이드 (5'-AAACATGTGGATTACCCATGTC-3')는 업자[Integrated DNA Technologies(IDT; 아이오와주 코랄빌 소재)]로부터 구입하였다. '유리' SP94 펩타이드(H2N-SFSIILTPILPL-COOH, 서열 확인 번호 6), 접합을 위해 C-말단 Cys로 개질된 SP94 펩타이드(H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH, 서열 확인 번호 7), 및 도 2d 보충 실험들에서 사용된 SP94 펩타이드(H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH, 서열 확인 번호 8)는 업자[New England Peptide(매사츄세츠주 가드너 소재)]로부터 구입하였다. H5WYG 펩타이드(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGGC-COOH) 및 핵 위치 서열(H2N-NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOH)는 업자[Biopeptide Co., Inc.(캘리포니아주 산 디에고 소재)]가 합성하였다. 펩타이드들의 굵은 활자체 부위들은 원래의 서열들이고; 추가의 아미노산 잔기들이 접합 또는 표지 목적들을 위해 가해졌다. 모든 항체들(CHALV-1, 항-Rablla, 항-LAMP-1, 항-EGFR, 항-VEGFR-2, 항-PDGFR-α)는 업자[Abeam, Inc.(매사츄세츠주 캠브릿지 소재)]로부터 구입하였다.
세포 배양 조건들
Hep3B, 간세포들, PBMCs, T-림프세포들, 및 B-림프세포들을 ATCC로부터 수득하여 제조업자의 지시들에 따라 성장시켰다. 요약하면, Hep3B를 10% FBS가 들어있는 EMEM 속에 유지시켰다. 간세포들은 BSA, 피브로넥틴, 및 소 콜라겐 제I형으로 피복된 플라스크 속에서 성장시켰고; 사용된 배양 배지는 5 ng/mL의 상피 성장 인자, 70 ng/mL의 포스파티딜에탄올아민, 및 10% FBS가 들어있는 BEGM(젠타마이신, 암포테리신, 및 에피네프린은 BEGM 발렛 키트로부터 페기되었다)이었다. HUVECs를20% FBS가 들어있는 DMEM 속에서 성장시키고; 젤라틴-피복된 플라스크들을 사용하여 부착을 증진하였다. PBMCs, T 림프세포들, 및 B 림프세포들을 현탁 플라스크들(제조원: Greiner Bio-One; 노쓰캐롤라이나 몬로에 소재) 속에서 성장시켰다. PBMCs를 0.02 mM 티미딘, 0.1 mM 하이포크산틴, 0.05 mM 2-머캅토에탄올, 및 10% FBS가 들어있는 IMDM 속에서 유지시켰다. T 및 B 림프세포들을 20% FBS가 들어있는 IMDM 및 20% FBS가 들어있는 RPMI 1640 배지 각각에서 성장시켰다. 모든 세포는 37℃에서 습윤된 대기(5% C02가 보충된 공기) 속에서 유지시켰다. 부착성 세포들을 0.05% 트립신을 사용하여 1:3의 아-배양으로 계대배양하였고, 이 동안 비-부착성 세포들은 2 x 105 세포들/mL의 밀도로 씨딩(참조:ding)하고 1-5 x 106 세포들/mL에서 유지시켰다.
나노다공성 실리카 입자들의 합성 및 특성화
단일모드 실리카 나노입자들의 합성
단일모드 다공성을 지닌 나노다공성 실리카 입자들을 제조하기 위해 사용된 에어로졸-보조된 증발-유도된 자가-조립 방법은 류(Lu) 등2이 기술하였다. 요약하면, 실리카 전구체(TEOS), 구조-지시 표면활성제(CTAB, 초기에는 임계 미셀 농도 미만의 많은 농도, 또는 CMC), 및 물과 에탄올의 용액 속에 용해된 HCl을 함유하는 균질한 졸을 개질된 시판 분무기(개질된 commercial atomizer)(Model 9302 A; 제조원: TSI, Inc.; 미네소타주 세인트 폴 소재)를 사용하여 에어로졸화하였다. 질소를 담체 가스로서 상요하고, 모든 가열 지대들은 400℃로 유지하여 용매를 증발시키고 유효한 표면활성제 농도를 증가시켰다. 핀홀에서 압력 강하(pressure drop)는 20 psi이었다. 입자들을 80℃로 유지시킨 듀라포어 막 여과기(Durapore membrane filter)(제조원: Millipore; 매사츄세츠주 빌레리카 소재) 위에 수집하였다. 대표적인 반응 혼합물은 55.9 mL의 탈이온화된 H20, 43 mL의 200-프루프 에탄올(proof 에탄올), 1.10 mL의 1.0N HCl, 4.0g의 CTAB, 및 10.32g의 TEOS을 함유하였다. 세포내(중성 pH, 비교적 높은 염 농도들) 조건하에서 보다 신속하게 용해하는 나노다공성 실리카 입자들을 제조하기 위하여, 다양한 양들의 TEOS 및 AEPTMS, 아민-함유 실란을 전구체 졸내로 혼입하고, 시스템의 pH를 농 HCl을 사용하여 2.0으로 조절하였다. 예를 들면, 15 중량% AEPTMS을 지닌 입자들을 제조하기 위하여, 9.36 g의 TEOS 및 1.33 g의 AEPTMS를 사용하였다.
다중모드 실리카 나노입자들의 합성
다중모드 다공성을 지닌 나노다공성 실리카 입자들을 제조하는데 사용된 유액(유화액) 가공은 캐롤(Carroll) 등1이 기술하였다. 요약하면, 1.82 g의 CTAB(수성 상 속에서 가용성)을 20 g의 탈이온수에 가하고, 용해될 때까지 40℃에서 교반하고, 25℃로 냉각되도록 하였다. 0.57 g의 1.0 N HC1, 5.2 g의 TEOS, 및 0.22 g의 NaCl을 CTAB 용액에 가하고, 수득되는 졸을 1시간 동안 교반하였다. 헥사데칸과 3 중량% Abil EM 90(오일 상 속에서 가용성인 비-이온성 유화제)로 구성된 오일 상을 제조하였다. 전구체 졸을 오일상(1:3의 졸:오일의 용적비)과 1000-mL의 환저 플라스크 속에서 합하고, 2분 동안 격렬하게 교반하여 유중수 유액의 형성을 촉진시키고, 회전 증발기(R-205; 제조원: Buchi Laboratory Equipment; 스위스 소재)에 고정시키고, 80℃의 수욕 속에 30분 동안 두었다. 당해 혼합물은 이후에 120 mbar(35 rpm에서 3시간 동안)의 갑압하게 비등시켜 용매를 제거하였다. 입자들을 3000rpm에서 20분 동안 원심분리(Model Centra MP4R; 제조원: International Equipment Company; 테네시주 챠타누가 소재)하고, 상층액을 경사분리하였다. 최종적으로, 입자들을 500℃에서 5시간 동안 하소시켜 표면활성제들 및 과량의 유기 물질을 제거하였다. 캐롤(Carroll) 등에 의해 기술된 바와 같이, 용매 추출은 CTAB(> CMC) 속에서 수성 상을 농축시키며, 생성되는 실리카 입자들(수성 상 속에서)은 농축 시 미셀들 주형 6-12 nm 공극들을 템플레이트(template)하였다. 추가로, 수-오일 계면에서 2개의 표면활성제(CTAB 및 Abil EM 90)의 흡수는 계면 장력을 상승적으로 감소시키며, 이는 거대한, 표면-접근가능한 공극들을 템플레이트하는 20 내지 30 nm의 미세유액 소적들의 자발적인 형성을 초래한다.
실리카 나노입자들의 특성화
나노다공성 실리카 입자들의 역학적 광 산란을 Zetasizer Nano(제조원: Malvern; 영국 워체스터쉐어 소재)를 사용하여 수행하였다. 시료들은 48 μL의 실리카 입자들(25 mg/mL)을 2.4 ml의 IX D-PBS 속에 희석시켜 제조하였다. 용액들을 1 mL의 폴리스티렌 큐베트들(polystyrene cuvettes)(제조원: Sarstedt; 독일 뉨브레크트 소재)로 분석을 위해 이전시켰다. 질소 흡수를 ASAP 2020 표면 영역 및 다공성 분석기(Surface Area and Porosity Analyzer)(제조원: Micromeritics Instrument Corporation; 조지아주 노르크로쓰 소재)를 사용하여 수행하였다. 제타 전위 측정들은 Zetasizer Nano(제조원: Malvern; 영국 워체스터쉐어 소재)를 사용하여 수행하였다. 대표적인 실험에서, 실리카 입자들, 리포좀들, 또는 프로토셀들을 둘 다 150 mM NaCl을 함유하도록 조절한 모의된 체액(pH 7.4) 또는 시트르산 완충액(pH 5.0) 속에서 1:50로 희석시켰으며, 1-mL의 폴딩된 모세관 셀들(제조원: 영국 워체스터쉐어 소재)로 분석을 위해 이전시켰다. DLS 및 질소 흡수 데이타에 대해서는 보충된 도 1을 참조하고 실리카 나노입자들, 리포좀들, 및 프로토셀들의 제타 전위 값들에 대해서는 보충된 도 12를 참조한다.
프로토셀들의 합성, 로딩, 및 표면 작용성화
나노다공성 실리카 입자들에 대한 리포좀 융합
프로토셀들을 합성하는데 사용된 과정은 류 등25-27이 기술하였으며 단지 간단히 언급할 것이다. 업자(Avanti Polar Lipids)로부터 주문한 지질을 클로로포름 속에 예비 용해시키고 -20℃에서 저장하였다. 프로토셀 합성 직전에, 2.5 mg의 지질을 질소의 스트림하에 건조시키고 진공 오븐(Model 1450M, 제조원: VWR International, 펜실바니아주 웨스트 체스터 소재) 속에 밤새 두어 잔류 용매를 제거하였다. 지질들을 0.5X D-PBS 속에서 2.5 mg/mL의 농도로 재-수화시키고 100-nm의 여과기를 미니-압출기 세트(Mini-Extruder set)(제조원: Avanti Polar Lipids, Inc.; 알라바마주 알라바스터 소재)를 사용하여 적어도 10회 통과시켰다. DPPC 및 DSPC를 이들의 각각의 전이 온도(41℃ 및 55℃)로 예비-가온시킨 0.5X D-PBS 속에 용액 속에 용해하고 압출 공정 동안 60℃에서 유지시켰다. 수득되는 리포좀들(직경 ~120-nm)을 4℃에서 1주 이하 동안 저장하였다. 나노다공성 실리카 코어들을 0.5X D-PBS(25 mg/mL) 속에 용해하고 과량의 리포좀들(1:2 내지 1:4 용적비의 액체:실리카)에 30 내지 90분 동안 실온에서 노출시켰다. 프로토셀들을 과량의 지질의 존재하에서 4℃로 3개월까지 저장하였다. 과량의 지질을 제거하기 위하여, 프로토셀들을 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 2회 세척하고, 0.5X D-PBS 속에 재-현탁시켰다.
지지된 지질 이층 조성물의 최적화
SLB의 조성을 최적화하여 대조군 세포들에 대한 비-특이적인 결합 및 독성을 최소화하였다; 사용된 각종 지질들의 구조들에 대해서는 보충된 도 4를 참조한다. 표면 결합, 내재화, 및 전달 실험들에서 사용된 프로토셀들은 DOPC(또는 DPPC)와 5 중량%의 DOPE(또는 DPPE), 30 중량%의 콜레스테롤, 및 5 중량%의 18:1(또는 16:0) PEG-2000 PE로 구성된 SLBs를 가졌다. 필요할 경우, 형광성 지질들(18:1-12:0 NBD-PC, 16:0-12:0 NBD-PC, 또는 Texas Red® DHPE)를 SLB내로 1 내지 5 중량%에서 혼입하였다. 지질들을 재수화 및 압출하기 전에 합께 동결건조시켰는데; 예를 들면 75μL의 DOPC(25 mg/mL), 5 μL의 DOPE (25 mg/niL), 10μL의 콜레스테롤(75 mg/mL), 5μL의 18:1 PEG-2000 PE(25 mg/mL), 및 5μL의 18:1-12:0 NBD-PC(5 mg/mL)를 합하고 건조시켜 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 5 중량% PEG-2000, 및 1 중량% NBD-PC로 구성된 리포좀들을 형성하였다.
다양한 유형들의 표적화 리간드들을 사용한 지지된 지질 이층의 개질
HCC에 대한 프로토셀들의 특이적인 친화성은 SLB에 대해 다양한 밀도들에서 다양한 유형들의 표적화 리간드들을 접합시켜 최적화하였다. SP94 및 H5WYG 펩타이드들(C-말단 시스테인 잔기들을 사용하여 합성함)을 PE의 헤드 그룹(head group)들 속에 존재하는 1차 아민들에, 설프하이드릴 및 아민 잔기들에 대해 반응성이고 PEG 스페이서 암을 지니며, 이의 길이를 변경시켜 특이적인 친화성을 최적화시킨 이종이작용성 가교결합제, NHS-(PEG)n-말레이미드에 접합하였다. SM(PEG)24을 대부분의 연구들(스페이서 아암 = 9.52 nm)에서 사용하였다. 트랜스페린, 항-EGFR, 및 CHALV-1 속에 존재하는 아민 잔기들을 유리된 설프하이드릴들로 설프하이드릴 첨가 키트(제조업자의 지시들에 따라)를 사용하여 전환시켰다. 작용화된 트랜스페린 및 항체들을 SLB 속에서 PE에 SM(PEG)24를 사용하여 접합시켰다. 리간드 밀도는 반응 화학량론 및 항온처리 시간 둘다로 조절하였다. 예를 들면, 프로토셀들을 10-배 몰 과량의 SP94와 함께 2시간 동안 실온에서 항온처리하여 0.015 중량%(~6개의 펩타이드들/프로토셀)을 획득한 반면, 프로토셀들은 5000-배 몰 과량의 SP94와 4℃에서 밤새 항온처리하여 5.00 중량%(~2048 펩타이드들/프로토셀)의 펩타이드 밀도를 획득하였다. 평균 리간드 밀도는 트리신-SDS-PAGE(SP94 및 H5WYG 펩타이드들) 또는 램믈리(Laemmli)-SDS-PAGE(트랜스페린, 항-EGFR, 및 CHALV-1)28로 측정하였다. 요약하면, 프로토셀들을 다양한 리간들 밀도들로 LC-SPDP(스페이서 아암 = 1.57 nm), 1급 아민 및 설프하이드릴 잔기들과 반응하고 환원을 통해 분해될 수 있는 이종이작용성 가교결합제를 사용하여 개질시켰다. 프로토셀들을 10mM 디티오트레이톨(DTT)에 30분 동안 노출시키고 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며; 수득되는 상층액은 유리된 리간드들의 함유하였으며, 이의 농도는 각각의 시료의 밴드 밀도를 영상 J 영상 프로세싱 및 분석 소프트웨어(제조원: National Institutes of Health; 메릴랜드주 베테스다 소재)를 사용하여 표준 곡선에 대해 비교함으로써 SDS-PAGE를 통해 측정하였다. 20%의 겔들(6% 비스-아크릴아미드 및 6M 우레아 함유)을 사용하여 SP94 및 H5WYG 펩타이드 밀도들을 분석하였다. 10% 겔들을 사용하여 항체(항-EGFR 및 CHALV-1) 밀도들을 분석하는 한편, 15% 겔들을 사용하여 트랜스페린의 밀도를 분석하였다.
형광적으로-표지된 나노다공성 코어들의 제조
나노다공성 코어들은 100μL의 입자들(25 mg/mL)을 0.5X D-PBS 중의 900μL의 20% APTES에 가하여 형광적으로-표지하고; 입자들을 APTES 속에서 밤새 실온으로 항온처리하고, 원심분리(10,000 rpm, 5분)하여 반응하지 않은 APTES를 제거하고, 1 mL의 0.5X D-PBS 속에 재-현탁시켰다. 아민-반응성 형광단(예를 들면, Alexa Fluor® 647 카복실산, 석신이미딜 에스테르; DMSO 중 1 mg/mL)을 가하고(mL의 입자들당 5μL의 염료), 입자들을 원심분리하기 전 실온에서 2시간 동안 유지시켜 반응하지 않은 염료를 제거하였다. 형광적으로 표지된 입자들은 0.5X D-PBS 속에 4℃에서 저장하였다.
화학치료학적 약물들을 사용한 단일모드 코어들 및 리포좀들의 로딩
리포좀 융합 전에, 15 중량% AEPTMS(25 mg/mL)을 함유하도록 개질된 단일모드 나노다공성 코어들을 독소루비신(5 mM) 또는 독소루비신, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실의 혼합물(5 mM의 각각의 약물) 속에 1시간 동안 실온에서 침지시켰다. 과량의 약물을 10,000 rpm에서 5분 동안 입자들의 원심분리를 통해 제거하였다. 120-nm의 리포좀들을 DOX로 앞서 기술된29 인산암모늄 구배-계 방법을 사용하여 로딩하였다. 요약하면, 지질 필름들을 300 mM (NH4)2HP04로 재-수화시키고, 리포좀 용액을 100-nm 막을 통해 적어도 10회 압출시켰다. 리포좀들을 등장성 완충 용액(140 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.4)을 사용하여 투석(Float-A-Lyzer G2 투석 단위들, 3.5-5 kDa MWCO; 제조원: Spectrum Laboratories, Inc.; 캐나자 란초 도밍구에즈 소재)을 통해 평형화하고 독소루비신 HC1(1:3 약물:지질 몰 비)과 함께 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 과량의 DOX를 크기-배제 크로마토그래피를 통해 0.7 cm x 10 cm Sepharose® CL-4B 컬럼을 통해 제거하였다. 리포좀들을 앞서 기술한 바와 같이30,31, 5-FU 또는 시스플라틴으로 로딩하였다.
다중성분 혼합물, siRNA, 및 디프테리아 독소 A-쇄를 사용한 다중모드 코어들의 로딩
20 중량% AEPTMS(25 mg/mL)를 함유하도록 개질된 다중모드 나노다공성 코어들을 칼세인(5 mM), Alexa Fluor® 647-표지된 dsDNA 올리고뉴클레오타이드들(100 μΜ), RFP(100 μΜ), 및 CdSe/ZnS 양자점들(10 μΜ)의 용액 속에 4시간 동안 침지시키고, 각각의 운반물의 농도를 변화시켜 고 스펙트럼 영상용의 최적의 형광성 강도를 획득하였다. 칼세인은 1 mg의 각각의 칼세인 및 NLS를 850μL의 1X D-PBS 속에 용해시켜 NLS(C-말단 시스테인 잔기로 합성됨)로 개질시키고; 100μL의 EDC(탈이온수 중 10 mg/mL) 및 50μL의 BMPH(DMSO 중 10 mg/mL)를 가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 과량의 칼세인을 투석(Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치들, 2 kDa MWCO; 제조원: Thermo Fisher Scientific LSR; 일리노이주 록포드 소재)를 통해 제거하였다. dsDNA 올리고뉴클레오타이드를 Ulysis™ Alexa Fluor® 647 핵산 표지 키트를 사용하여(제조업자의 지시들에 따라) 표지하고 50μL의 dsDNA(탈이온수 중 2 mM)를 50μL의 NLS(DMSO 중 1 mM) 및 10μL의 SMCC(DMSO 중 10 mg/mL)와 조합하여 NLS로 개질시키고; 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 과량의 NLS를 투석(Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치들, 7 kDa MWCO; 제조원: Thermo Fisher Scientific LSR; 일리노이주 록포드 소재)를 통해 제거하였다. 보충된 도 13 내지 16에 기술된 전달 시험들을 위해, 20 중량%의 AEPTMS(25 mg/mL)로 개질시킨 단일모드 나노다공성 코어들을 siRNA(100 μΜ) 또는 디프테리아 독소 A-쇄(100 μΜ) 속에 4℃에서 2시간 동안 침지시켰다. 봉입되지 않은 운반물을 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 통해 제거하고, 리포좀들을 운반물-로딩된 코어들에 즉시 융합시켰다.
히스톤 단백질들을 사용한 CB1 플라스미드의 패키징.
CB1 플라스미드(pCB1)을 슈퍼코일링하는데 사용된 공정은 도 4에 나타낸다. 도식은 고도로 포화된 염 용액, 히스톤들 H1, H2A, H2B, H3, 및 H4를 지닌 슈퍼코일상 pCBl을 사용하고 히스톤 단백질에 대한 접합에 의해 핵 공극들을 통해 전좌(translocation)를 촉진하는 핵 위치 서열(NLS)과의 수득되는 pCBl-히스톤 복합체를 개질시켜 CB1 플라스미드(pCBl)(CB1 플라스미드 벡터는 하기에 및 부착된 도 12에 나타낸다)를 슈퍼코일하는데 사용된 공정을 나타낸다. 도 4(B) 및 (D)는 CBl 플라스미드 (B) 및 히스톤-패키징된 pCBl (D)의 원자력 현미경(AFM) 영상을 나타낸다. 기준자들(scale bars) = 100 nm. (C) 및 (E)는 (B) 및 (D)에서 적색 라인들에 각각 상응하는 프로파일들을 강조한다.
히스톤-패키징된 pCBl으로 로딩된 MC40-표적화된 중간다공성 실리카 나노입자-지지된 지질 이층들(프로토셀들)의 합성
도 5에 나타낸 바와 같이, 5(A)는 DNA-로딩된, 펩타이드-표적화된 프로토셀들을 생성하는데 사용된 공정을 묘사하는 개략도를 제공한다. 당해 방법에 따라서, 히스톤-패키징된 pCBl은 입자들을 pCBl-히스톤 복합체의 용액 속에 단순히 침지시켜 프로토셀의 코어를 형성하는 중간다공성 실리카 나노입자들내로 침지시켰다. 페길화된 리포좀들을 이후에 DNA-로딩된 코어들에 융합시켜 지지된 지질 이층(SLB)을 형성시키고 이를 HCC에 결합하는 표적화 펩타이드(MC40) 및 내재화된 프로토셀들의 엔도좀 탈출을 촉진하는 엔도조몰리틱 펩타이드 (H5 WYG)로 추가로 개질시킨 슈퍼코일드 지질 이층(SLB)를 형성하였다. 설프하이드릴-대-아민 가교결합제(스페이서 아암 = 9.5 nm)을 사용하여 펩타이드들을 DOPE 잔기들에 SLB 속에서 접합시켰다. 도 5(B)는 프로토셀의 코어로서 사용된 중간다공성 실리카 나노입자들의 투과전자현미경(TEM) 영상을 나타낸다. 기준자 = 200 nm. Inset = 주사 전자 현미경(SEM) 영상, 이는, 15 내지 25 nm의 공극들이 표면-접근성임을 입증한다. Inset 기준자 = 50 nm. 5(C)는 역학적 광 분산(DLS)에 의해 측정된 것으로서, 중간다공성 실리카 나노입자들의 크기 분포를 나타낸다. 중간공극성 실리카 나노입자들에 대한 누적된 공극 용적 플롯은 도 S-4A에 나타낸 질소 흡습 등온의 흡수 브랜치로부터 바렛-조이너-할렌다(Barrett-Joyner-Halenda)(BJH) 모델을 사용하여 계산하였다. (5D, 우측 축) pCBl-히스톤 복합체에 대한 크기 분포는 DLS로 측정하였다.
중간다공성 실리카 나노입자들은 히스톤-패키징된 pCBl에 대한 고 수용력을 가지고, 수득되는 프로토셀들은 엔도소옴 환경을 모사하는 조건들하에서만 봉입된 DNA를 방출한다.
도 6(A)에 묘사된 바와 같이, 개질되지 않은 중간다공성 실리카 나노입자들ζ = -38.5 mV) 또는 중간다공성 실리카 나노입자들내로 봉입될 수 있는 pCBl 또는 히스톤-패킹된 pCBl('복합체')의 농도를 APTES, 아민-함유 실란(ζ = +11.5 mV)으로 개질시켰다. 도 6(B)는, 1 x 106 세포들/mL가 1 x 109 MC40-표적화된, pCBl-로딩된 프로토셀들과 함께 24 시간 동안 37℃에서 항온처리되는 경우, ZsGreen에 대해 양성인 Hep3B, pCBl에 의해 암호화된 녹색 형광성 단백질의 퍼센트를 나타낸다. x-축은, 프로토셀 코어가 APTES로 개질되는지의 여부 및 pCBl이 히스톤들로 예비패키징되는지의 여부를 규정한다. DOTAP 및 DOPE(1:1 w/w)의 혼합물로 패키징된 pCB 1은 (A) 및 (B)에 대조군으로서 포함되었다. 도 6(C) 및 (D)는 모의된 체액(C) 또는 pH 5 완충액(D)에 대한 노출 시 개질되지 않은 중간다공성 실리카 나노입자들 및 상응하는 프로토셀들로부터 히스톤-패키징된 pCBl의 시간-의존성 방출을 나타낸다. 프로토셀 SLB는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000로 구성되며, (B)의 경우는, 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다. 모든 오차 바들(error bars)은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들(1.96 σ)을 나타낸다.
MC40-표적화된 프로토셀들이 히스톤-패키징된 pCBl을 HCC로 전달하는 공정.
부착된 도 7[1]에 묘사한 바와 같이 MC40-표적화된 프로토셀들은 Hep3B 세포들에 각종의 HCC 라인들에 의해 과-발현되는, Met에 대한 표적화 펩타이드들의 보충으로 인하여 고 친화성으로 결합한다. 유체 DOPC SLB는 펩타이드 이동성을 촉진시키므로, 저 MC40 밀도로 개질시킨 프로토셀들이 Hep3B에 대해 고 특이적인 친화성을 보유하도록 할 수 있다(참조: 도 8A). [2] MC40-표적화된 프로토셀들은 Hep3B에 의해 수용체-매개된 내포내이입(endocytosis)에 의해 내재화된다(참조: 도 8B 및 도 15 A). [3] 엔도소옴 조건들은 SLB[불활성 천연 물질들 참조]을 탈안정화시키며 H5WYG 엔도조몰리틱 펩타이드의 양성자화를 유발하며, 이들 둘 다는, 히스톤-패키징된 pCBl이 Hep3B 세포들의 세포질내에 분산되도록 한다(참조: 도 15B). [4] pCBl-히스톤 복합체들은, 핵 위치 서열(NLS)로 개질되는 경우, Hep3B 세포들의 핵내에서 ~24시간내에 농축되며(참조: 도 16C), 이는 분열하는 암 세포 및 분열하지 않는 암 세포 둘다의 효율적인 형질감염을 가능하도록 한다(참조: 도 17).
MC40-표적화된 프로토셀들은 HCC에 고 친화성으로 결합하며 Hep3B에 의해 내재화되지만 정상 간세포들에 의해서는 내재화되지 않는다.
도 8(A)는 Hep3B 또는 간세포들에 노출되는 경우 MC40-표적화된 프로토셀들에 대한 명백한 해리 상수들(Kd)를 나타내며; Kd 값들은 특이적인 친화성과 역으로 관련되어 있고 포화 결합 곡선들로부터 측정되었다(참조: 도 S-l1). 오차 바들은 n=5에 대해 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다. 도 8(B) 및 (C)는 1000-배 과량의 MC40-표적화된 프로토셀들에 1시간 동안 37℃에서 노출된 Hep3B(B) 및 간세포들(C)에 대한 공초점 형광 현미경 영상들을 나타낸다. Met는 Alexa Fluor® 488-표지된 모노클로날 항체(녹색)으로 염색되었으며, 프로토셀 코어는 Alexa Fluor® 594(적색)으로 염색되었고, 세포 핵은 Hoechst 33342(청색)으로 염색되었다. 기준자들 = 20 μm. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되며 0.015 중량% (A-C) 또는 0.500 중량% (A)의 MC40 표적화 펩타이드로 개질되었다.
MC40-표적화된, pCBl-로딩된 프로토셀들은 피코몰 농도에서 HCC의 세포자살을 유도하지만 정상의 간세포들의 생존능에 최소한의 영향을 지닌다.
도 9(A) 및 (B)는 Hep3B를 MC40-표적화된, pCBl-로딩된 프로토셀들에 37℃에서 연속적으로 노출 시 사이클린 Bl mRNA 및 사이클린 Bl 단백질의 발현에 있어서 투여량(A) 및 시간(B) 의존성 감소들을 나타낸다. 세포들을 다양한 pCBl 농도들에 48 시간 동안 (A)하에서 및 5 pM의 pCBl에 다양한 시간 동안 (B)하에서 노출시켰다. 간세포들에서 사이클린 Bl 단백질 및 Hep3B에서 ZsGreen의 발현은 대조군들로서 포함된다. 실시간 PCR 및 면역형광성을 사용하여 사이클린 Bl mRNA 및 단백질 농도들을 각각 측정하였다. 도 9(C)는 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들 ([pCBl] = 5 pM)에 다양한 기간 동안 37℃에서 연속된 노출 후 G2/M 상에서 정지되는 Hep3B의 퍼센트를 나타낸다. G2/M 상에서 간세포들 및 S 상에서 Hep3B의 퍼센느는 비교를 위해 포함된다. 세포를 세포 주기 분석 전에 Hoechst 33342로 염색하였다. 도 9(D)는 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들([pCBl] = 5 pM)에 다양한 기간 동안 37℃에서 연속 노출 시 세포자살성이 되는 Hep3B의 퍼센트를 나타낸다. 세포자살의 마커들에 대해 양성인 간세포들의 퍼센트는 대조군으로서 포함되었다. Alexa Fluor® 647-표지된 안넥신 V에 대해 양성인 세포들은 세포자살의 조기 단계들내에 있는 것으로 고려된 반면, 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 둘 다에 대해 양성인 세포들은 세포자살의 말기 단계들 내에 있는 것으로 고려하였다. 세포자살 세포들의 총 수는 단일- 및 이중-양성 세포들의 수를 가하여 측정하였다. 모든 실험들에서, 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되고 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. 모든 오차 바들은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다.
MC40-표적화된, pCBl로딩된 프로토셀들은 상응하는 리포플렉스들보다 HCC의 선택적인 세포자살을 2500배 유도한다.
도 10(A)는 DOPC 프로토셀들, 10 중량% PEG-2000(18:1)로 개질된 DOPC 프로토셀들, pCBl 및 DOTAP와 DOPE의 혼합물(1:1 w/w)로 구성된 리포플렉스들, 및 10 중량% PEG-2000로 개질된 DOTAP/DOPE 리포플렉스들에 대한 제타 전위 값들을 나타낸다. 모든 제타 전위 측정들은 0.5X PBS(pH 7.4) 속에서 측정하였다. 도 10(B, 좌측 축)은 MC40-표적화된 프로토셀들 또는 리포플렉스들을 통해 전달된 5 pM의 pCBl에 대해 48 시간 동안 37℃에서 연속 노출시 세포자살성이 되는 Hep3B 및 간세포들의 퍼센트를 나타낸다. 도 10(B, 우측 측)은 90%의 1 x 106 Hep3B 세포들 속에서 48시간 내에 37℃에서 세포자살을 유도하는데 필수적인 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들 또는 리포플렉스들의 수를 나타낸다. (B)의 경우, 세포들은 Alexa Fluor® 647-표지된 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드로 염색하였으며; 단일- 및 이중-양성 세포들은 세포자살성인 것으로 고려하였다. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(나타내는 경우)로 구성되며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다. DOTAP/DOPE 리포플렉스들은 10 중량% PEG-2000(나타내는 경우), 0.015 중량% MC40, 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다. pCBl는 모든 실험들에서 NLS로 개질되었다. 모든 오차 바들은 n=3에 대해 95% 신뢰 구간들(1.96 σ)을 나타낸다.
MC40-표적화된 프로토셀들은 고 농도들의 탁솔, Bcl-2-특이적인 siRNA, 및 pCBl을 HCC에 간세포들의 생존능에 영향을 미치지 않고 전달한다.
도 11(A)는 탁솔, Bel-2의 발현을 사일런싱하는 siRNA, 및 1012개의 프로토셀들, 리포좀들, 또는 리포플렉스들내에 봉입될 수 있는 CB1 플라스미드의 농도들을 나타낸다. 도 11A에서 적색 바들은, 탁솔과 pCBl 농도들이, 둘 다 프로토셀들내에 로딩되는 경우 변하는 방법을 나타낸다. 청색 바들은, 탁솔, siRNA, 및 pCBl 농도들이, 3개 모두가 프로토셀들내에 로딩되거나 siRNA 및 pCBl가 리포플렉스들내에 로딩되는 경우에 1012개의 프로토셀들, 리포좀들, 또는 리포플렉스들내에 봉입될 수 있는 CB1 플라스미드 농도들이 변하는 방법을 나타낸다. 도 11(B)는 MC40-표적화된 프로토셀들을 경유해 Hep3B로 전달 시 Oregon Green® 488-표지된 탁솔(녹색), Alexa Fluor® 594-표지된 siRNA(적색), 및 Cy5-표지된 pDNA(백색)의 세포내 분포를 나타내는 공초점 형광 현미경 영상을 나타낸다. 세포들은, 고정시키고 Hoechst 33342(청색)으로 염색하기 전에 1000-배 과량의 MC40-표적화된 프로토셀들과 함께 24시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 기준자들 = 10 μm. 도 11(C)는 10 nM의 탁솔 및/또는 5 pM의 pCBl에 48 시간 동안 37℃에서 노출 시 Hep3B, SNU-398, 및 G2/M 상에서 정지된 간세포 세포들의 분획을 나타낸다. 분획들은 G2/M에서 대수적으로-성장하는 세포들의 퍼센트에 대해 표준화하였다. 도 11(D)는 10 nM의 탁솔, 250 pM의 Bcl-2-특이적인 siRNA, 및/또는 5 pM의 pCBl에 48 시간 동안 37℃에서 노출 시 Alexa Fluor® 647-표지된 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드(PI)에 대해 양성인 Hep3B, SNU-398, 및 간세포 세포들의 퍼센트를 나타낸다. (C) 및 (D)에서, 'pCBl'는 DOTAP와 DOPE의 혼합물(1:1 w/w)을 사용하여 세포들에 비-특이적으로 패키징하고 전달한 pCBl을 말한다. 모든 실험들에서, 프로토셀 SLB들은 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. 리포좀들은 DSPC와 5 중량% DMPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(16:0)로 구성되며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. 리포플렉스들은 DOTAP:DOPE(1:1 w/w) 혼합물로 구성되며 10 중량% PEG-2000, 0.015 중량% MC40, 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. pCBl은 모든 실험들에서 NLS로 개질시켰다. 모든 오차 바들은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들(1.96 σ)을 나타낸다.
CB1 플라스미드에 대한 벡터 맵(vector map)
도 12에 나타낸 바와 같이, CB1 플라스미드(pCBl)를 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 벡터(제조원; Clontech Laboratories, Inc.; 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 및 pNEB193 벡터(제조원: New England BioLabs, Inc.; 매사츄세츠주 입스위치 소재)로 부터 작제하였다. pCBl은 사이클린 Bl-특이적인 소 헤어핀 RNA(shRNA)[참조: Yuan, et al., Oncogene (2006) 25, 1753-1762] 및 조안투스 아종(Zoanthus sp.) 녹색 형광성 단백질(ZsGreen)을 암호화한다. 구성적 shRNA 발현은 RNA PolIll-의존성 사람 U6 프로모터(Pu6)로부터 구동되는 반면, 구성적 ZsGreen 발현은 사이토메갈로바이러스의 이미디에이트 얼리 프로모터(immediate early promoter)(PCMV IE)에 의해 구동된다. ori 및 AmpR 성분들은 이. 콜라이(E. coli)내에서 플라스미드의 증식을 가능하도록 한다. 사이클린 Bl-특이적인 shRNA의 센스 및 안티센스 쇄들을 암호화하는 DNA 서열들은 밑줄쳐져 있으며 dsDNA 올리고뉴클레오타이드를 pSIREN 벡터내로 도입시키는데 사용된 제한 효소 부위들(BamHI는 적색 및 EcoRI는 청색)에 의해 플랭킹(flanking)되어 있다.
히스톤-패키징된 pCBl의 특성화.
도 13(A)는 증가된 농도들의 히스톤들(1:2:2:2:2 몰 비의 H1, H2A, H2B, H3, 및 H4)에 노출된 pCBl에 대한 전기영동적 이동성 이동 검정들을 나타낸다. pCBl:히스톤 몰비는 3 내지 6번 레인들에 대해 제공된다. 레인 1은 DNA 래더(ladder)를 함유하고, 레인 2는 히스톤들이 첨가되지 않은 pCBl을 나타낸다. 도 13(B)는 히스톤-패키징된 pCBl(1:50의 pCBl:히스톤 몰 비)의 TEM 영상을 나타낸다. 기준자 = 50 nm.
로딩되지 않은 및 pCBl 로딩된 중간다공성 실리카 나노입자들의 질소 흡수 분석.
도 14(A)는 히스톤-패키징된 pCBl의 로딩 전 및 후에 중간다공성 실리카 나노입자들에 대한 질소 흡습 등온들을 나타낸다. 도 14(B)는 히스톤-패키징된 pCBl으로 로딩하기 전 및 후의, 중간다공성 실리카 나노입자들의 브루나우어-엠머-텔러(BET) 표면적을 나타낸다. 오차 바들은 n = 3에 대한 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다.
DOPC 프로토셀들에 대한 예각중성자산란(Small-angle neutron scattering: SANS) 데이타.
도 15는 DOPC 프로토셀들에 대한 SANS 데이타를 나타낸다. 데이타 피트(data fit)는 고정 두께의 공초점 쉘을 지닌 다분산 다공성 실리카 구체들에 대한 모델을 사용하여 수득하였으며 공극 개구부들에 뻗어있는 실리카 입자들의 표면에서 36-Å 이층의 존재를 나타낸다. 0, 20, 및 60Å의 이층 두께에 대해 측정된 SANS 데이타는 비교를 위해 포함된다. 36Å의 측정된 이층 두께는 평면의 지지된 지질 이층들 위에서 수행된 다른 중성자 연구들(33-38Å)과 일치하며[참조: Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer 5, 161-171 (2005)], 이들 대조 조건들 하에서, 지질 이층의 수소가 풍부한 탄화수소 코어로부터의 분산을 주로 나타낸다. 실험 데이타는 또한 0.0315 Å-1(즉, 공극들로부터 분산에 의해 유발된 실험 데이타내 피크에 대한 q-값)을 2π로 나누어 측정한, 299.2-Å 공극들의 존재를 입증한다. SANS 데이타는 LANSCE(Los Alamos National Laboratories)에서 100% D20 PBS 완충액 중 5% (v/v) 프로토셀 현탁액을 사용하여 LQD 빔 라인 위에서 수득하였다. 데이타는 NCNR SANS 데이타 분석 패키지(NIST)를 사용하여 일치시켰다.
프로토셀들은 뉴클레아제 분해로부터 봉입된 DNA를 보호하였다.
도 16은 DNase I-처리된 pCBl(레인 3), 히스톤-패키징된 pCBl(레인 5), DOTAP와 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 패키징된 pCBl(레인 7), 프로토셀들 속에서 양이온성 코어들로 로딩된 pCBl(레인 9), 및 프로토셀들 속에서 음이온성 코어들로 로딩된 히스톤-패키징된 pCBl(레인 11)의 아가로즈 겔 전기영동의 결과를 나타낸다. 네이키드(Naked) pCBl(레인 2), 히스톤들로부터 방출된 pCBl(레인 4), DOTAP/DOPE 리포플렉스들로부터 방출된 pCBl(레인 6), 양이온성 코어들을 지닌 프로토셀들로부터 방출된 pCBl(레인 8), 및 음이온성 코어들을 지닌 프로토셀들로부터 방출된 히스톤-패키징된 pCBl(레인 10)을 비교를 위해 포함시킨다. 레인 1은 DNA 래더를 함유한다. 시료들은 DNase I(50 ng의 DNA에 대해 1 단위)과 함께 30분 동안 실온에서 항온처리하고, pCBl 방출을 1% SDS를 사용하여 자극시켰다.
도 17은 중간다공성 실리카 나노입자들('단일모드 코어들'), 20% (v/v) APTES 속에 12 시간 동안 실온에서 침지시킨 중간다공성 실리카 나노입자들('APTES-개질된 코어들'), CB1 플라스미드('pCBl'), 히스톤-패키징된 pCBl ('pCBl-히스톤 복합체'), 및 DOTAP와 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물('DOTAP/DOPE 리포플렉스들')로 패키징된 pCBl에 대한 제타 전위(ζ) 값들을 나타낸다. 제타 전위 측정들은 0.5 X PBS(pH 7.4)에서 수행하였다. 오차 바들은 n=3에 대해 95% 신뢰 구간들(1.96 σ)을 나타낸다.
대표적인 전방 산란-측 산란(forward scatter-side scatter: FSC-SSC) 플롯들 및 FL-1 막대그래프들을 사용하여 도 6 및 S-16 (A) 내지 (D)에서 ZsGreen 발현에 대해 양성인 세포들의 퍼센트를 측정하였다.
도 18은 게이트되어(gated) 세포 부스러기를 배제하는 (A)이거나 (C)가 아닌 ZsGreen-음성 세포들에 대한 FSC-SSC 플롯들(A 및 C) 및 상응하는 FL-1 막대그래프들(각각 B 및 D)을 나타낸다. FL-1 채널에 대한 평균 형광성 강도(MFI) 값들은 (B) 및 (D)에서 제공된다. (E) 내지 (H) FSC-SSC 플롯들(E 및 G) 및 게이트되어 세포 부스러기를 배제하는 (E)이거나 (G)가 아닌 ZsGreen-양성 세포들에 대한 상응하는 FL-1 막대그래프들(각각 F 및 H). (F) 및 (H) 위에서 게이트들은 MFI가 ≤ 282인, 즉, ZsGreen-음성 세포들의 100 X MFI인 세포들의 퍼센트에 상응한다(참조: 패널 D).
MC40 표적화 펩타이드의 확인.
도 19는 Ph.D.™-7 파아지 디스플레이 라이브러리(제조원: New England BioLabs, Inc.; 매사츄세츠주 입스위치 소재)로부터 MC40 표적화 펩타이드를 선택하는데 사용된 공정을 묘사하는 개략도를 제공한다. 1 x 1011 pfu/mL를 100 nM의 재조합체 사람 Met(rhMet)와 항온처리하고, 사람 IgG의 Fc 도메인에 1시간 동안 실온에서 융합시켰다. 단백질 A 또는 단백질 G-피복된 자기 입자들을 사용하여 Met-파아지 복합체들을 친화성 포획하고 후속적으로 TBS (50 mM 트리스-HCl와 150 mM NaCl, pH 7.4)로 10회 세척하여 결합되지 않은 파아지를 제거하였다. 결합된 파아지 클론들을 저-pH 완충액(0.2 M 글리신과 1 mg/mL BSA, pH 2.2)로 용출시키고, 용출물들은 숙주 세균(이. 콜라이 ER2738)의 감염을 통해 증폭시켰다. 개략도에 따라서, 5 라운드들의 친화성 선택을 증가하는 스트링전트 조건들(stringent conditions)을 사용하여 수행하였다: Met 농도는 100 nM로부터 50 nM로부터 10 nM로 감소되었으며, 항온처리 시간은 1시간에서 30분에서 15분으로 감소되었고, 세척 완충액에 가해진 Tween-20의 농도는 0%(v/v)로부터 0.1%로부터 0.5%로 증가하였다. 단백질 A 및 단백질 G에 대해 특이적인 펩타이드들은 단백질 A-피복된 자기 입자들과 단백질 G-피복된 자기 입자들 사이의 선택 라운드들을 교호시켜 피하였다. 5회 라운드들의 선택 후, DNA를 40개의 개개 클론들로부터 회수하여로부터 MC40 표적화 펩타이드를 선택하는데 사용된 공정을 묘사하는 개략도를 제공한다. Ph.D.™-7 키트와 함께 제공된 096gIII 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. MET 수용체에 대해 최대 결합 활성을 갖는 서열들은 하기 나타낸다:
ASVHFPP (Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro) 서열 확인 번호 1
TATFWFQ (Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln) 서열 확인 번호 2
TSPVALL (Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu) 서열 확인 번호 3
IPLKVHP (Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro) 서열 확인 번호 4
WPRLTNM (Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met) 서열 확인 번호 5
MC40 표적화 펩타이드의 특성화.
도 20(A)은 5회 라운드의 선택 후 펩타이드 서열 정렬을 나타낸다; 우세한 서열, ASVHFPP는 앞서 정의된 Met-특이적인 12-머, YLFSVHWPPLKA(서열 확인 번호 15)의 볼드체로 나타낸 부분과 유사하다. 표적과 관련되지 않은 HAIYPRH 펩타이드(~10%)(서열 확인 번호 16)를 나타내는 파아지 클론들은 서열 정렬로부터 빠졌다. 도 20(B) 및 (C)는 rhMet에 결합된 친화성-선택된 파아지 클론들이 효소-연결된 면역흡착성 검정(ELISA)을 통해 측정되었던 정도를 나타낸다. (B)에 나타낸 ELISA 개략도에는 물질들 및 방법들 단락에 기술되어 있다. ELISA 결과들은 (C)에 나타낸다. 도20(D)는 Met에 결합하지 않은 펩타이드들이 제거된 후 서열 정렬을 나타낸다. 도 20에 나타낸 컨센수스 서열(consensus sequence)은 당해 정렬로부터 측정하였다. 도 20(E) 및 (F)는 (1) Met에 대한 Alexa Fluor® 488-표지된 모노클로날 항체 및 관련되지 않은 파아지 클론(TPDWLFP, 서열 확인 번호 17) 및 Ml3 파아지에 대한 Alexa Fluor® 546-표지된 모노클로날 항체(청색 점들) 또는 (2) Met에 대한 Alexa Fluor® 488-표지된 모노클로날 항체 및 MC40 클론 및 M13 파아지에 대한 Alexa Fluor® 546-표지된 모노클로날 항체(오렌지색 점들)에 노출된 Hep3B(E) 및 간세포들(F)에 대한 유동세포분석 산란 플롯들을 나타낸다. 처리되지 않은 세포들(적색 점들)을 사용하여 FL-1(Alexa Fluor® 488 형광성) 및 FL-2(Alexa Fluor® 546 형광성) 채널들에 대한 전압 매개변수들을 설정하였다.
Hep3B에 노출된 MC40-표적화된 프로토셀들에 대한 시료 결합 곡선들.
도 8A에서의 해리 상수들을 측정하기 위하여, 1 x 106개 Hep3B 또는 간세포들을 사이토칼라신 D로 예비-처리함으로써 세포내이입을 억제하고 각종 농도의 Alexa Fluor® 647-표지된, MC40-표적화된 프로토셀들과 함께 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 유동 세포분석을 사용하여 수득되는 세포 집단들에 대한 평균 형광성 강도들을 측정하였고, 이는 프로토셀 농도들에 대해 플롯팅하여 총 결합 곡선들을 수득하였다. 비-특이적인 결합은 세포들을 Alexa Fluor® 647-표지된, MC40-표적화된 프로토셀들과 함께 포화 농도의 표지되지 않은 간세포 성장 인자의 존재하에서 항온처리함으로써 측정하였다. 특이적인 결합 곡선들은 총 결합 곡선들로부터 비-특이적인 결합 곡선들을 감하여 수득하였고; Kd 값들은 특이적인 결합 곡선들로부터 계산하였다. 도 21에 나타낸 실험들에서, 프로토셀 SLB들은 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000 (18:1)로 구성되고 0.015 중량%(~6 펩타이드들/입자)의 MC40 표적화 펩타이드로 개질되었으며; 상응하는 Kd 값은 1050 ± 142 pM이다. 모든 오차 바들은 n = 5에 대해 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다.
MC40-표적화된 프로토셀들은 수용체-매개된 세포내이입을 통해 내재화되며, H5WYG 펩타이드의 부재하에서, 라이소좀들에 대해 지시된다.
도 22(A)는 1시간 내에 37℃에서 각각의 Hep3B 또는 간세포 세포에 의해 내재화된 MC40-표적화된 프로토셀들의 평균 수를 나타낸다. 1 x 106개의 세포들을 다양한 농도의 프로토셀들과 포화 농도(100 μg/mL)의 사람 간세포 성장 인자(HGF)의 부재(-) 또는 존재(+) 하에서 항온처리하고, 유동 세포분석을 사용하여 문헌[참조: Ashley, et al. Nature Materials, 2011, May;10(5):389-97]에 기술된 바와 같은, 각각의 세포와 관련된 평균 수의 입자들을 측정하였다. 프로토셀들을 NBD 및 pHrodo™으로 표지하여 산성 세포내 구획들(각각)로 내재화된 것들로부터 표면-결합된 입자들을 구별하였다. 오차 바들은 n = 3에 대한 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다. (B) 프로토셀들과: (1) Rab5, (2) Rab7, (3) 라이소좀-관련된 막 단백질 1(LAMP-1), 또는 (4) Rablla 사이에서 피어슨 상관 계수들(Pearson's correlation coefficients)(r-값들). Hep3B 세포들을 1000-배 과량의 Alexa Fluor® 594-표지된 프로토셀들과 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리한 후 고정시키고, 침투시키고, Rab5, Rab7, LAMP-1, 또는 Rablla에 대한 Alexa Fluor® 488-표지된 항체와 함께 항온처리하였다. 슬라이드북 소프트웨어(SlideBook software)를 사용하여 r-값들을 측정하고, 이를 n = 3 x 50 세포들에 대해 평균값 ± 표준 편차로 표현한다. 차등 간섭 대비(Differential Interference Contrast: DIC) 영상들을 사용하여 Hep3B 세포들의 경계들을 정의함으로써 세포 경계들의 외부 픽셀들이 r-값의 계산시 무시될 수 있도록 하였다. 프로토셀 SLB들은 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)으로 구성되고 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다.
히스톤-패키징된 pCBl은, NLS로 개질되고 MC40-표적화된 프로토셀들을 통해 전달되는 경우, 시간 의존적 방식으로 HCC 세포들의 핵 속에서 농축된다.
도 23(A) 내지 (C)는 1000-배 과량의 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들에 15 분(A), 12 시간(B), 또는 24 시간(C) 동안 37℃에서 노출된 Hep3B 세포들의 공초점 형광 현미경 영상들을 나타낸다. (B)의 경우, 프로토셀들의 엔도좀 탈출 및 pCBl의 세포질성 분산은 ~2시간 후에 명백하였고; ZsGreen 발현은 12 내지 16 시간까지 검출되지 않았으나, 24시간 째에, Cy5-표지된 pCBl은 세포들 전체에 분포되어 남았고; 세포질성 염색은 (C)에서 가시적이지 않았으나, Cy5 채널의 획득이 감소되어 핵내에 위치한 픽셀들의 포화가 방지되었다. 실리카 코어들은 Alexa Fluor® 594(적색)으로 표지되었고, pCBl은 Cy5(백색)으로 표지되었으며, 세포 핵들은 Hoechst 33342(청색)으로 역염색되었다. 기준자들 = 20 μm. 도 23(D)는 Cy 5 -표지된 pCBl 및 Hoechst 33342-표지된 Hep3B 핵들에 대한 피어슨 상관 계수들(r-값) 대 시간을 나타낸다. 슬라이드북 소프트웨어(SlideBook software)를 사용하여 r-값들을 측정하였으며, 이는 n = 3 x 50 세포들에 대한 평균값±표준편차로 나타낸다. 차등 간섭 대비 (DIC) 영상들을 사용하여 Hep3B 세포들의 경계들을 정의함으로써 세포 경계들의 외부 픽셀들을 r-값들의 계산 시 무시될 수 있도록 하였다. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되었으며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다.
히스톤-패키징된 pCBl은, NLS로 개질되고 MC40-표적화된 프로토셀들을 통해 전달되는 경우, 분열하는 및 분열하지 않는 HCC 세포들 둘 다를 거의 100% 효율로 선택적으로 형질감염시킨다.
도 24 (A), (C), 및 (E)는 1000-배 과량의 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들에 24 시간 동안 37℃에서 노출된 Hep3B 세포들의 공초점 형광현미경 영상들을 나타낸다. Hep3B 세포들은 (A)에서 분열하였고 (C) 및 (E)에서 ~95% 합치성이었으며; pCBl은 모든 영상들에서 히스톤들로 예비-패키징되었고, pCBl-히스톤 복합체는 (E)에서 NLS로 추가로 개질되었다. 실리카 코어들은 Alexa Fluor® 594 (적색)로 표지하였으며, pCBl은 Cy5(백색)으로 표지하였고, 세포 핵들은 Hoechst 33342(청색)으로 역염색하였다. 기준자들 = 20 μm. 도 24(B), (D), 및 (F)는 1 x 109개의 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들('PC')에 24 시간 동안 37℃에서 연속된 노출 시 ZsGreen 발현에 대해 양성이 되는 1 x 106개 Hep3B 및 간세포들의 퍼센트를 나타낸다. 세포들은 (B)에서 분열하여 (D) 및 (F)에서 ~95% 합치성이었고; x-축은, CB1 플라스미드들('pCBl') 및 pCBl-히스톤 복합체들('복합체')가 NLS로 개질되는지의 여부를 나타낸다. pCBl 단독, 및 또한 DOTAP 및 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 패키징된 pCBl을 대조군들로 사용하였다. 세포들을 20 mg/mL의 밀 배아 아글로티닌(WGA)에 노출시켜 핵 공극 복합체를 통한 NLS-변형된 pCBl의 전좌를 차단하였다. 오차 바들은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다. 도 24(G) 내지 (I)는 도 (A), (C), 및 (E) 각각에서 사용된 세포들에 대한 세포 주기 막대그래프들을 나타낸다. G0/G1 상의 세포들의 퍼센트는 각각의 막대그래프에 대해 제공된다. 모든 실험들에서, 프로토셀 SLB들은 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되었으며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다.
도 25는 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들에 1시간 동안 또는 71시간 동안 37℃에서 노출된 Hep3B (A) 및 간세포들 (B)의 공초점 형광현미경 영상들을 나타내고; pCBl 농도는 모든 실험들에서 5 pM로 유지하였다. (B)에서 화살표들은 유사분열 세포들을 나타낸다. 사이클린 Bl은 Alexa Fluor® 594-표지된 모노클로날 항체(적색)으로 표지되었고, 세포 핵들은 Hoechst 33342(청색)으로 염색되었다. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되었으며 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질시켰다. 모든 기준자들은 20 μm이다,
도 26은 MC40-표적화된, pCBl 로딩된 프로토셀들에 1시간 또는 72시간 동안 37℃에서 노출된 Hep3B (A) 및 간세포들(B)의 공초점 형광현미경 영상들을 나타내며; pCBl 농도는 모든 실험들에서 5 pM로 유지되었다. 세포들은 Alexa Fluor® 647-표지된 안넥신 V(백색) 및 프로피듐 요오다이드(적색)으로 염색하여 조기 및 말기 세포자살 각각에 대해 검정하고, 세포 핵들은 Hoechst 33342(청색)으로 역염색하였다. 프로토셀 SLBs는 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 10 중량% PEG-2000(18:1)로 구성되고 0.015 중량% MC40 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다. 모든 기준자들은 20 μm이다.
쯔비터이온성 지질들로 구성된 SLB를 지닌 프로토셀들은 최소의 비-특이적인 세포독성을 유도한다.
첨부된 도 27에 묘사한 바와 같이, 1 x 106개 Hep3B의 퍼센트는 1 x 109개의 APTES-개질된 중간다공성 실리카 나노입자들, APTES-개질된 코어들을 지닌 DOPC 프로토셀들, 스크램블드(scrambled) shRNA 서열('스크램블드 pCBl')을 암호화하는 프라스미드로 로딩된 DOPC 프로토셀들, 또는 스크램블드 pCBl으로 로딩된 DOTAP/DOPE (1:1 w/w) 리포플렉스들에 대해 48 시간 동안 37℃에서 노출 시 세포자살성이 된다. 프로토셀들 및 리포플렉스들은 10 중량% PEG-2000, 0.015 중량% MC40, 및 0.500 중량% H5WYG로 개질되었다. 양- 및 음으로 하전된 폴리스티렌 나노입자들(각각 '아민-PS' 및 '카복실-PS')을 양성 대조군들로 사용한 반면, 10 mM의 항산화제, N-아세틸시스테인(NAC), 또는 1 pmol의 유리된 pCBl에 노출된 Hep3B는 음성 대조군들로 사용하였다. 모든 오차 바들은 n = 3에 대해 95% 신뢰 구간들 (1.96 σ)을 나타낸다.
본원에 기재된 모든 참조문헌들은 관련된 경우 참조로 혼입되어 있다.
실시예 1에 대한 참조문헌들
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

실시예 2
이마티니브의 경피 전달
표피는 피부의 상부 층이며 4개 층들로 추가로 파괴될 수 있다. 표피의 최외각층은 각질층이며 두께는 대략 10 내지 20 pm이고; 이는 경피 전달과 관련된 과제들에 대해 반응성이다. 표피의 다른 3개의 층들은 가시성 표피로 총칭적으로 분류될 수 있고; 가시성 표피는, 두께가 50 내지 100 pm이다. 가시성 표피는 면역 세포들(랑게르한스 세포들), 상피 케라티노사이트들, 감각 신경들[머클 세포들(merkle 세포들)], 및 모세혈관계들, 세정맥들, 및 세동맥들을 함유한다. 진피는, 두께가 1 내지 2 mm이고 3개 유형들의 면역 세포들(비만 세포들, 림프구들, 대식구들, 호중구들, 혈장 세포들), 섬유모세포들, 및 각종 섬유들(신경 섬유들, 콜라겐, 탄성 섬유들)을 함유한다. 추가로, la는 각질층을 가로질러 운반물 전달을 위해 취할 수 있는 4개의 주요 시도들을 나타낸다. (a) 세포내 경로, (b) 소포 경로, (c) 경세포 경로, 및 (d) 각질층의 제거. 진피를 통해 각질층으로부터의 증가하는 수화 구배가 존재함을 주목하는 것이 중요하다. 당해 구배는 살아있는 표피 및 진피내로 다양한 분자들의 확산을 위한 구동력을 제공할 수 있다.
각질층은 "브릭스 및 모르타르(bricks and mortar)" 구조를 갖는다. "브릭스"는 케라틴, 당들 및 지질들로 충전된 죽은 상피 케라티노사이트들이다. "모르타르들"은 세포내 공간을 나타내며 세라미드들, 지방산들, 및 콜레스테롤로 구성된다. 당해 지질 조성물든 부탄올과 유사한 극성을 부여한다. 이러한 극성 및 전체적인 "브릭 및 모르타르" 구조로 인하여, 각질층은 대부분의 분자들에 대해 증대없이 투과성이 아니다.
따라서, 가장 간단한 용어들에서, 피부는 3개의 주요 층들, 상피, 진피, 및 피하 조직들로 구성된다. 최외각 층(각질층)은 장벽으로서의 피부 역활에서 주요 성분이다. 이들은 결정화된 케라틴, 케라토하이알린, 및 세포내 공간으로 돌출된 각종 지질들로 충전된 죽은 상피 케라티노사이트들로 구성된다. 이는 또한 부탄올의 극성과 유사한 극성을 부여하는 각종의 상이한 지질들(즉, 세라미드들, 지방산들, 콜레스테롤)로 구성된다. 이러한 유일한 극성의 결과로, 수소 결합은 각질층의 세포내 공간에서 발생하며, 이는 분자 및 경피 경로를 통해 전달되는 약물들에 두번째 정도의 장애물을 가한다. 지금까지, 3세대들의 경피 전달 기술들이 존재한다. 제1 세대 전달 시스템들은 저 분자량의 친지성 화합물들의 수동적 확산을 이용한다. 제2- 및 제3-세대 전달 시스템은, 각질층의 투과성이 열쇠임을 인식한다. 제2 및 제3 세대들의 향상 전략들은 각질층을 제거하거나 화학적 향상제들, 생화학적 향상제들, 및 전기이동력들을 이용하여 각질층의 투과성을 증가시키는 것이다. 모든 향상 전략들로부터 발생한 쟁점들은 각질층의 충분한 투과성 사이의 균형을 발견하지만, 보다 깊숙한 조직의 모방을 피하는 것이다.
경피 투여 경로는 정맥내 및 경구 투여경로보다 수개의 이점들을 제공한다. 이들은 아주 낮은 독성, 우수한 내성 및, 화학치료제, 타이로신 키나제 억제제들 및 암 환자들용 다른 치료들과 같은 운반물의 우수한 전달을 포함할 수 있다. 당해 외피의 순환은 제1의 통과 대사 및 역(약물-식품, 약물-pH) 상호작용을 우회하면서 약물 흡수를 위한 많은 면적을 제공한다.
이마티니브는 가장 일반적으로 처방된 시판되는 타이로신 키나제 억제제이다. 이마티니브는 비교적 저 분자량(493 Da) 및 1.2의 Log P를 갖는 약 염기이다.
본 발명자들은, 이마티니브의 가용성이 pH를 강하시킴에 의해 용이하게 증가될 수 있음을 밝혀내었다. 그러나, pH를 강하시키는 것은 화합물의 이온화를 증가시키고 이온화된 상태에서 분자들은 피부의 지질 이층들을 통해 용이하게 침투하지 않는다. 고유의 가용성(이온화되지 않은 종들의 가용성)을 향상시키기 위하여, 본 발명자들은 수개의 용매 및 공용매 시스템들(도 1X2)을 평가하였다. 모든 제형들은 대조군(pH 7에서의 물)보다 약물 가용성을 증가시키며, 10% 에탄올 및 DMSO 제형들 속에서 최대 가용성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들의 예비 연구들은, 경피 경로로 전달될 이마티니브의 잠재능을 시험하였다. 다수의 주요 예비 실험들을 지금까지 수행하였다. 첫째로, 본 발명자들은 용매 pH의 함수로서 물 속에서 이마티니브의 가요성을 측정하였다(도 1X2). 약물은 피부를 통해 침투하기 위하여 용액 속에 존재하여야 한다. 그러나, 이온화된 종들은 각질층(6)을 통해 용이하게 침투하지 않는다. 이마티니브의 용해도는 pH가 감소하면서 증가하지만, 이러한 용해도는 약물의 화학 구조에 있어서 약 염기성 작용 그룹들의 이온화에 기인하였다.
다음, 본 발명자들은 이마티니브 및 다사티니브의 고유의 용해도(탈이온화된 종들의 용해도)를 증가시키기위한 공용매들/용매 시스템들을 스크리닝하였다. 이마티니브로 부터의 데이타는 도 2X2에 나타낸다. 제형들에 이러한 공용매들의 첨가는 난용성 약물들의 용해도를 증가시키기 위해 광범위하게 사용된다(7-9). 본 발명자들의 선행 작업에서는, 에탄올, PEG 400, 및 DMSO를 용해도 향상제들로서 평가하였다. 이들 공용매들은 각종 약물들의 고유의 용해도를 향상시키는 것으로 잘 알려져 있다. 모든 공용매 제형들 및 DMSO는 대조군과 비교하여 이마티니브의 용해도를 증가시켰다(물, pH 7). 10% 에탄올을 포함하는 제형은 다른 제형들과 비교하여 최대 용해도를 나타내었다. 이마티니브는 또한 DMSO 속에서 매우 가용성인 것으로 밝혀졌다.
최종적으로, 다수의 이들 공용매 제형들을 이들의 시험관내 경피 침투 특성들에 대해 평가하였다(도 3X2). 이들 공용매들은 또한 일부 제형들에서 침투능 향상제들로서 작용하는 것으로 알려져 있음에 주목한다(10-1 1). 이러한 일련의 시험들에서, 복강형성술 수술로부터 수득한 사람 피부를 개질된 프란츠 확산 세포들(Franz diffusion 세포들) 위에 두고 약물 침투를 고 성능 액체 크로마토그래피를 사?하여 시간의 함수로서 측정하였다.
프란츠 확산 세포는 경피 약물 전달의 분야에서 필수적인 도구이다. 환자-기원한 피부는 세포 캡(cell cap)과 용액 챔버 사이에 둔다. 세포 캡은 각질층이 또한 환경에 노출되도록 하는 환경에 노출된다. 용액 챔버에 등장성 확산 완충액을 채운다. 추가로, 용액 챔버는 확산 완충액이 설정을 방해하지 않고 제거되도록 하는 주입 포트를 갖는다. 최종적으로, 용액 챔버는 온도 조절을 허용하는 워터 자켓(water jacket)으로 둘러싸여 있다. 프란츠 확산 세포는 생리학적 조건들을 사용하여 수행될 경피 전달의 시험관내 연구들을 허용한다. 환자-기원한 피부를 통한 어떠한 용질의 확산 완충액내로의 침투도 생체내 시스템에서 용질이 도달하는 전신계 순환과 동등함에 주목한다. 프로토셀들은 이마티니브 메실레이트와 함께 로딩될 것이며, 확산 완충액 중 용질 함량의 특성화는 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 달성할 것이다. 피부의 상이한 층들에서 실리카 함량의 결정은 효소 조직 분해 및 유도적으로 연결된 혈장 질량 분광법(plasma mass spectroscopy: ICP mass spec)을 사용하여 측정될 것이다. SLB 및 나노다공성 입자 코어는 형광적으로 태그되어 공초점 현미경을 허용한다. 또한, 피부 시료들은 프로토셀들을 사용한 처리 및 항온처리 후 절편화함으로써 이들을 TEM을 사용하여 영상화할 수 있다.
도 3X2에서 알 수 있는 바와 같이, 이마티니브는 용매 시스템으로서 물(pH 7)을 사용하여 피부를 통해 침투하지 않는다. 당해 약물은 피부를 통해 평가된 다른 공용매 시스템들과 함께 제한된 정도로 침투할 수 있었다. DMSO는 이마티니브의 최대 투과성을 나타내었다. 이들 데이타로부터, 유량(flux)(피부를 통한 투과성 비율)를 계산하고 이들 값은 도 4X2에 나타낸다. 유량은 대조군과 비교하여 제형들 모두에 대해 증가되었고, DMSO 제형이 이마티니브의 최대 유량을 나타낸다(0.225μg/cm2hr).
따라서, 경피 프로토셀들은 (a) 이마티니브와 같은 하나 이상의 약제학적으로 활성인 제제들로 로딩되고 (b) 하나 이상의 각질층 투과성-향상제들, 예를 들면, 일포화된 오메가-9 지방산들(올레산, 엘라이드산, 에이코센산, 메아드산(mead acid), 에루크산, 및 네르본산, 가장 바람직하게는 올레산), 알코올, 및 디올(가장 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), R8 펩타이드, 및 탄성부여성분들, 예를 들면, 담즙산염들, 폴리옥시에틸렌 에스테르들 및 폴리옥시에틸렌 에테르들, 단일사 표면활성제(예를 들면, 나트륨 데옥시콜레이트)를 포함하는 지질 이층을 지지하는 다공성 나노입자들로 구성될 수 있다. 프로토셀은 평균 약 50 nm 내지 약 300 nm, 바람직하게는 약 65 nm 내지 약 75 nm일 수 있다.
실시예 2에 대한 참조문헌들
Figure pct00005

실시예 3
siRNA로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 의해 유도된 세포자살
결과들
siRNA로딩된 프로토셀들. 실리카 나노입자들을 캐롤(Carroll) 등35이 기술한 바와 같이 제조하였으며 BET 표면적은 > 600 m2/g이고, 세공 부피 분율은 ~65%이며, 다중모드 세공 형태학은 6-12 nm 공극들에 의해 상호연결된, 거대한(20-30 nm), 표면-접근성 세공으로 구성되었다(참조: 도 2BX3-CX3). 실리카 나노입자들을 siRNA(또는 리친 독소 A-쇄로 방법들 단락에서 기술한 바와 같이 로딩하기 전에 크기-분리하였다(참조: 도 2AX3). 일련의 전략들을 사용하여 구축된 프로토셀들 또는 리포플렉스들의 siRNA 로딩 수용력은 도 3AX3에 나타낸다. 리포플렉스들은 쯔비터이온성 인지질, DOPC로 구성되며, 1010개 입자들당 ~10 nM의 siRNA로 봉입된다. 양이온성 지질, DOTAP로 구성된 리포플렉스들의 구축은 siRNA 운반물에 있어서 5-배 증가를 초래하였으며, 이는 아마도 음으로 하전된 분자와 양으로 하전된 액체 성분들 사이의 매력적인 정전기적 상호작용들에 기인한다. 쯔비터이온성 액체 이층을 갖는 음으로 하전된 실리카 코어를 함유하는 프로토셀은 양이온성리포플렉스와 거의 동등한 수용력을 가졌다. 아민-함유 실란, AEPTMS를 사용한 실리카 코어의 개질은 제타 전위를 -32 mV로부터 +12 mV로 증가시켰으며 1010개 입자들 당 ~1μΜ의 siRNA 수용력을 생성하였다. DOTAP 리포좀들을 사용하여 siRNA를 음으로 하전된 코어들36에 상승적으로 로딩하는 것은 입자-계 치료학적 적용들에서 흔히 이용된 쯔비터이온성 리포플렉스들보다 100-배 이상 더 높은, 유사한 수용력을 갖는 프로토셀들을 생성하였다. 대체 생물학적 유액 속에 분산 시 DOPC 및 DOTAP 리포플렉스들, 및 AEPTMS-개질된 코어를 갖는 DOPC 프로토셀들의 안정성은 도 3BX3 및 3CX3에 나타낸다. DOPC 리포플렉스들은 중성 및 약산성 pH 조건들 하에서 이들의 봉입된 siRNA를 신속하게 방출하여, 4 내지 12시간내에 뉴클레오타이드 성분의 완전한 손실을 초래하였다. DOTAP 리포플렉스들이 중성 pH 조건들 하에서 DOPC 리포플렉스들보다 더 안정하였다고 해도, 이들의 siRNA 성분중 대략 50%는 72시간의 기간에 걸쳐 손실되었다. 리포플렉스들 둘 다와는 현저하게 대조적으로, AEPTMS-개질된 코어들을 갖는 DOPC 프로토셀들은 대체 생물학적 유액에 72시간 동안 노출시킨 경우 봉입된 RNA의 95%를 보유하였다. 엔도솜/라이소좀 경로에서 이를 반영하는 약산성 조건들 하에서, siRNA로딩된, AEPTMS-개질된 코어와 지지된 지질 이층의 PE 및 PC 헤드그룹들 사이의 감소된 전정기적 및 이극성 상호작용들은 막 탈안정화 및 산성 매질에 대한 코어의 노출을 유발하였다. 막 탈안정화 후, 운반물 확산의 결합된 비율은 도 3CX3에서 관찰된 방출 프로파일을 생성하였다. 따라서, siRA 로딩 수용력, 입자 안정성, 및 방출 특성들의 측면에서, 프로토셀들은 상응하는 리포플렉스들보다 현저한 개선을 나타낸다.
siRNA-로딩된 프로토셀들에 의해 매개된 세포독성: 본 발명자들은 최근에 간세포 암종(HCC)에 결합하지만 대조군 간세포들에는 결합하지 않음으로써, 광범위한 화학치료제를 전달하여 관련된 표면 마커34를 발현하는 종양 세포들에서 세포자살을 선택적으로 유도하는 표적화 펩타이드(SP94)와 접합된, 프로토셀들의 능력을 입증하였다. 여기서 본 발명자들은 siRNA들 및 단백질 독소들을 포함하는 거대분자 운반물로 로딩된 표적화된 프로토셀들의 특성화를 현저히 확장시켰다. 본 발명자들은 SP94 둘다와 접합하여 HCC에 대해 선택적인 결합을 부여하고 엔도솜 펩타이드와 접합되어 엔도솜/라이소좀 방출을 촉진하는 AEPTMS-개질된 실리카 코어들 및 DOPC/DOPE/콜레스테롤/PEG-2000 (55:5:30:10 질량 비) 지지된 액체 이층으로 구성된 프로토셀들을 제조하였다. 프로토셀들은 세포 주기 역 및 생존능37 둘 다의 조절에 친밀하게 관여한 사이클린 A2, 사이클린 Bl, 사이클린 Dl, 및 사이클린 E, 단백질들을 포함하는 사이클린 상과의 구성원들을 표적화하는 siRNA들의 등몰 혼합물로 로딩하였다.
AEPTMS-개질된 코어들로 구축한 siRNA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들에 의한 HCC 라인, Hep3B에서 유전자 사일런싱의 농도 및 시간 의존성은 도 4X3에 나타낸다. 패널 A는, 증가하는 농도들의 프로토셀들 및, 이에 의해, 증가하는 농도들의 siRNA가 표적화된 유전자들 각각의 단백질 수준에 있어서 48시간내에 투여량-의존성 감소를 유도하였음을 입증한다. 단백질 발현을 90%(IC90)까지 억제하는데 요구된 siRNA의 농도들은 사이클린 A2, 사이클린 Bl, 사이클린 Dl, 및 사이클린 E(각각)에 대해 125 pM, 92 pM, 149 pM 및 370 pM이었다. 패널 B는 표적화된 프로토셀들내에 로딩된 125 pM의 siRNA의 첨가 시 단백질 수준들이 감소하는 방법을 나타낸다. 72 시간까지, 각각의 표적화된 단백질들의 수준은 90% 이상 억제되었으며, 억제도(사이클린 E는 다른 사이크린들보다 어느 정도 더 낮다)는 IC90 값들에 있어서의 차이들을 반영한다. 도 4C X3은 다양한 유형들의 SP94-표적화된 입자들로 달성가능한 유전자 사일런싱의 선택성을 나타낸다. 125 pM의 siRNA로 로딩된 DOPC 프로토셀들은 Hep3B과 48시간 항온처리 후 사이클린 A2 단백질의 거의 완전한 억제를 유도하였지만 형질감염되지 않은 간세포들에 있어서의 영향을 없었다. 대조적으로, 125 pM의 siRNA로 로딩된 DOPC 리포플렉스들은 어느 세포주에서도 사이클린 단백질 수준들에 있어 영향이 거의 없었다. 125 pM의 siRNA로 로딩된 SP94-표적화된 DOTAP 리포플렉스들은 Hep3B에서 사이클린 A2 발현의 ~60% 억제를 유도하였지만 또한 이들의 양성 전하(ζ = +22 mV)에 의해 유발되는 듯한 효과인, 간세포들에서 사이클린 A2 수준들을 감소시켰다. 사이클린 A2 발현을 90%까지 억제하는데 요구되는 다수의 SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들, DOPC 리포플렉스들, 및 DOTAP 리포플렉스들은 패널 C의 우측 축에 나타낸다. 104-배 더 적은 DOPC 프로토셀들이 유사한 DOPC 리포플렉스들보다 요구되었지만, 300-배 더 적은 DOPC 프로토셀들이 DOTAP 리포플렉스들보다 요구되었다. 따라서, 활성 및 반응성 측면에서, 표적화된 프로토셀들은 지질-계 나노입자들보다 현저한 장점들을 부여한다.
siRNA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 노출된 세포들에서 프로토셀 분포 및 사이클린 A2, Bl, Dl, 및 E 발현을 나열하는 공초점 형광현미경 영상들은 도 5 X3에 나타낸다. 패널 A에서 입증된 바와 같이, 프로토셀들을 Hep3B에 첨가한 지 1시간 후에, 각각의 단백질들의 발현은 대조군 수준들에서 유지되며, 실리카 코어들은 끼어든 패턴(punctuate pattern)으로 존재하며, 이는, 엔도솜 국재화를 제안한다. 48시간까지, 실리카 코어들은 Hep3B 세포들의 세포질 전체에 균일하게 분포하며, 표적화된 단백질들 각각의 발현은 배경 수준들로 억제된다. 비교 시, 형질전환되지 않은 간세포들의 동일한 처리는 프로토셀들의 세포 축적 또는 단백질 발현의 억제를 생성하지 않는다(참조: 패널 B).
HCC의 세포독성을 선택적으로 유도하는 siRNA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들의 능력은 도 6 X3에 입증되어 있다. 프로토셀들을 125 pM의 siRNA 콕테일로 로딩하고 Hep3B 또는 대조군 간세포들에 가하였다. 세포자살의 조기 단계들에서 세포들은 안넥신 V 결합에 있어서의 감소로 확인되었지만, 세포자살의 말기 단계들에서 세포들은 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 염색 둘다에 대해 양성이었다. 다수의 세포자살성 Hep3B에 있어서 선택적인 증가는 프로토셀들의 첨가 후 12시간인 조기에 관찰되었고(패널 A), 90% 이상의 세포들은 72시간까지 세포자살 마커들 둘다에 대해 양성이었다. 대조적으로, 세포독성은 형질전환되지 않은 간세포들에서 관찰되지 않았고, 관찰들은 도 6B 및 6C에 나타낸 대표적인 현미경 영상들에 의해 확인되었다. 패널 B는, Hep3B의 전체 집단이 표면-결합된 안넥신 V 및 핵-결합된 프로피듐 요오다이드에 대해 48시간내에 양성이 되었음을 입증하는 반면, 패널 C는, 대조군 간세포들이 세포자멸사의 마커들 둘 다에 대해 음성으로 남았음을 나타낸다.
독소 로딩된 프로토셀들의 특성화. 거대한(20-30 nm), 표면-접근성 세공들로 인하여, 다중모드 실리카 나노입자들은 다양한 단백질 독소들, 예를 들면, 디프테리아, 콜레라, 및 리친 독소들로 용이하게 로딩할 수 있다. 또한, 저 밀도(0.015 중량%, 또는 ~6 펩타이드들/프로토셀)의 SP94로 개질된 DOPC 프로토셀들에 의해 나타난 고도의 차등적 특이성은 특이적으로 세포독성제들의 암 세포들로의 선택적인 전달을 가능하도록 한다. 리친 독소는 피마자 오일 식물[치키누스 콤무니스(Ricinus communis)]이 종자들로부터 발견되며 이황화물 결합들에 의해 함께 유지된 A 및 B 소단위로 이루어진 이종이합체로 구성된다. B 소단위는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 세포내로의 독소의 도입을 매개하지만, A 소단위는 28S rRNA내 특이적인 글리코시드성 결합을 분해함으로써 단백질 합성을 억제한다. 38촉매적으로 활성인 리친 독소 A-쇄(RTA)는 종양-특이적인 면역독소들로서 사용되어 다중 모드 시스템들에서 암 세포들의 성장을 억제하였다39,40.
RTA가 로딩된 DOPC 프로토셀들 및 리포좀들의 수용력들 및 방출 특성들은 도 7 X3에 나타낸다. 패널 A에 의해 입증되는 바와 같이, < 1 nM의 단백질은 1010 DOPC 리포좀들내에서 로딩될 수 있었다. 대조적으로, 개질되지 않은 실리카 코어들을 지닌 DOPC 프로토셀들은 거의 100-배 이상의 RTA를 봉입하였으며, AEPTMS를 사용한 코어들의 개질은 추가의 자릿수까지 당해 수용력을 증가시켰다. RTA-로딩된 DOPC 프로토셀들 및 리포좀들의 pH 의존적 안정성은 패널 B 및 C에 나타낸다. DOPC 프로토셀들은 모의 체액 속에서 중성 pH로 72시간까지 항온처리되는 경우 이들의 봉입된 운반물의 ~5%를 방출하였고, RTA는 온화한 산성(즉, 엔도소옴) 조건들하에서 입자로부터 꾸준하게 방출되었다. 대조적으로, DOPC 리포좀들은 중성 및 산성 조건들 둘다에서 이들의 RTA 함량을 신속하게 손실하였다.
RTA-로딩된 프로토셀들에 의해 매개된 세포독성. 도 8 X3에 나타낸 바와 같이, SP94-표적화된 프로토셀들내에 봉입된 RTA는 Hep3B 세포들내에서 초기의 단백질 합성에 있어서 농도(패널 A) 및 시간(패널 B) 의존성 감소를 유발하였다. RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들의 첨가 후 48시간째에, 단백질 합성의 최대 억제의 1/2이 ~5 pM의 RTA 농도에서 달성되었고, 완전한 억제는 ~30 pM의 RTA에서 관찰되었다(패널 A). RTA-로딩된 프로토셀들은 ~24시간내에 단백질 합성에 있어 50% 감소를 유발하였고 25 pM의 RTA 농도에서 Hep3B에 가하는 경우 60시간내에 완전한 억제를 유발하였다(패널 B). 패널 C에 나타낸 결과들은, RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들이 Hep3B에 첨가되는 경우 초기의 단백질 합성을 효율적으로 억제하였지만 동일한 조건들 하에서 대조군 간세포들에 있어서의 효과는 거의 없었음을 입증한다. 대조적으로, SP94-표적화된 DOPC 리포좀들은, RTA의 최종 농도가 25 pM이 되도록 세포들에 첨가되는 경우, Hep3B 또는 간세포들에서 초기의 단백질 합성을 억제하는데 실패하였다. 또한, 패널 C의 우측 축에 나타낸 바와 같이, 104-배 이상의 RTA-로딩된 리포좀들(~60 pM의 RTA)은 Hep3B 세포들내에서 단백질 생합성을 90%까지 억제하는데 요구되었다.
초기의 단백질 합성 및 세포내 프로토셀 분포들은 도 9 X3에 나타낸 바와 같이, 메티오닌의 Alexa Fluor 488-표지된 유도체 및 Alexa Fluor 647-표지된 실리카 코어들(각각)으로 정량화하였다. RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들을 Hep3B에 첨가한 후 1시간 째에, 단백질 합성은 풍부하였으며, 프로토셀들은 세포질성 소낭들에 위치하였다(패널 A). 48-시간 항온처리 후, 프로토셀들은 세포질 전체에서 분산되었으며, 단백질 합성은 현저히 억제되었다. 패널 B에 나타낸 바와 같이, 형질전환되지 않은 간세포들에 유사한 프로토셀들의 첨가는 프로토셀들의 세포내 축정 또는 초기의 단백질 합성의 억제를 초래하지 않았다.
HCC내에서 세포독성을 선택적으로 유도하지만 대조군 간세포들에서는 유도하지 않는 RTA-로딩된 프로토셀들의 능력은 도 10 X3에 나타낸다. RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들은, 카스파제-9 및/또는 카스파제-3의 활성화제 의해 측정되는 바와 같이, Hep3B 세포들에서 8시간 정도로 조기에 세포자살을 유도하였으며, 세포들의 50%가 20 내지 28시간까지 양성으로 되었다(패널 A). 완전한 세포자살은 48시간까지 관찰되었다. 등가의 프로토셀 농도들은 심지어 항온처리 7일째후, 대조군 수준들보다 낮게 간세포 생존능을 감소시키지 않았다. 프로토셀 분포 및 세포자멸사를 나타내는 현미경 영상들은 패널들 B 및 C에 나타내었다. Hep3B에 RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들의 첨가 48시간 후, 프로토셀들은 세포질 전체에 분산되었으며, 세포들은 카스파제-9 및 카스파제-3 활성화 둘 다에 대해 양성이었다(패널 B). 패널 C에 나타낸 바와 같이, 대조군 간세포들은 카스파제 염색 및 입자 축적에 대해 동일한 시험 조건들 하에서 음성으로 남았다.
논의
유전자 발현의 이상 패턴들에 의해 매개된 많은 질병들의 치료를 위한 집중적인 연구하에 있는 핵산들 및 독소들을 포함하는, 거대분자 치료요법들의 완전한 효능은 전달 시스템들에 있어서의 결함들로 인하여 충족되지 않는 상태이다17,18. 여기서, 본 발명자들은, 프로토프로토셀들이 siRNAs 및 단백질 독소들의 효율적인 패키징 및 특이적인 세포 전달을 가능하도록 하는 특성들을 나타냄을 나타내는 증거를 제시한다.
siRNA을 포함하는 개질되지 않은 핵산들은 여러 이유들로 인해 전신계적으로 투여될 수 없다. 이들은 혈장 뉴클레아제들에 대해 고도로 민감성이며 효율적인 신장 여과로 인하여 매우 짧은 순환 반감기를 갖는다3. 또한, 핵산들은 이들의 실제 음성 전하 및 거대한 크기로 인하여 세포들에 의해 용이하게 취해지지 않는다41. 이들 잼점들을 피하기 위하여, siRNAs를 다양한 중합체들에 접합시키거나 리포좀들과 같은 나노입자들에 접합시켜 왔다. 중성 리포좀들내로의 혼입 또는 양이온성 지질들에 대한 접합은 안정성 및 순환하는 반감기를 증가시켜 왔고, 양이온성 복합체들의 경우에, 세포들에 대한 정전기적으로-매개된 전달을 향상시켰다42,43. 키토산44 및 사이클로덱스트란45을 포함하는 천연 생성물들을 사용하여 siRNA들과의 생물학적으로-활성인 복합체들을 형성시켜 왔다. 폴리에틸렌아민과 같은 양이온성 중합체들과의 접합은 또한 붕해를 방지하고 전달을 향상시키는 것으로 도움으로써 siRNA의 치료학적 효능을 향상시키는 것으로 밝혀져 왔다46.
전신계적으로 투여된 siRNA의 치료학적 용도는 특이적인 기관들 또는 세포들의 소세트들에 전달하여 효능을 향상시키고 비-특이적인 독성을 감소시키는 것을 필요로 한다. 이는 특히 항-암 치료요법들의 경우에 적용되며, 여기서 세포독성 siRNA들의 작용들로부터 정상 세포들을 보호하는 것이 필수적이다. 합병증들은, 표적화된 세포들이, 신생물 세포들이 광범위하에 퍼져있는 혈액학적 종양들 또는 전이성 질병의 경우에서와 같이, 체내 다중 위치들에 존재하는 경우에 발생한다. 이러한 쟁점에 촛점을 맞추기 위해 표적화된 세포들의 표면 위에서 차등적으로 발현된 항원들을 인식하는 분자들을 siRNAs 또는 뉴클레오타이드들을 봉입시키는 입자들에 직접 접합시켜 왔다. 폴레이트47, 콜레스테롤48, 및 트랜스페린13과 같은 수용체 리간드들을 성공적으로 사용하여 각각의 세포 수용체를 과-발현하는 세포들에 대한 siRNA 복합체들의 결합을 지시하여왔다. 표적 세포들 위에서 적절한 분자들을 인식하는 항체들을 또한 사용하여 특이적인 부류의 세포들에 대한 siRNAs를 함유하는 입자들의 선택적인 결합을 지시하여 왔다49. 추가로, 멀티플렉스 스크리닝 과정(multiplex screening procedure)에 의해 선택하여 바람직한 세포 에피토프들에 결합시키는, 펩타이드들 또는 핵산 아프타머들은 siRNAs에 또는 siRNA-함유 입자들의 부류들에 직접 접합시켜 특이적인 세포 상호작용들을 향상시켜 왔다50.
이들의 화학적 구조를 개질시켜 붕해에 대해 보호하거나 표적화 시약들에 대한 접합을 포함하는, 핵산 및 단백질 전달 시스템들의 일부 국면들에서 현저한 장점들에도 불구하고, 다수의 결점들이 잔존한다. 양이온성 지질들 또는 중합체들을 사용하여 핵산들을 정전기적으로 복합체화시키고, 농축시키며, 전달하는 다수의 시약들이 시판되고 있지만, 이들 제형들 중 대부분은 진핵 세포들의 비-특이적인 형질감염을 초래한다. 또한, 양이온성 지질/핵산 복합체(리포플렉스들)은 세포독성인 것으로 밝혀졌으며, 이들의 형질감염 효능 및 콜로이드성 안정성은 혈청의 존재하에서 제한되는 경향이 있다. 역으로, 쯔비터이온성 지질들은 2가 양이온들의 존재에서조차, 핵산들과 효율적으로 압축될 수 없다. 모든 이러한 나노입자 전달 시스템들은 또한 제한된 운반물 수용력들로 고생한다.
본 발명자들의 실험 결과들로부터 나타난 바와 같이, 프로토셀들은 기존의 전달 전략들보다 유의적인 장점들을 제공한다. 본 발명자들은 소 분자 치료제들에 대한 표적화된 나노담체들로서 이들의 활용을 이미 기술하였고 이들의 운반물 수용력, 안정성, 및 세포-특이적인 세포독성이 전통적인 리포좀들보다 훨씬 우수함을 입증하였다. 거대분자들의 나노입자-계 전달은 이들의 거대한 크기, 전하 특성들 및 세포내 운반물 방출과의 잠재적인 쟁점들로 인하여 보다 더 큰 과제들을 나타낸다. 여기서, 본 발명자들은, 프로토셀들이 이들 적용들에서 또한 명백한 장점들을 제공함을 입증하여 왔다. 다중모드 다공성 실리카 나노입자들은 바람직한 운반물(들)의 용액 속에 이들을 침지시킴으로써 핵산, 독소들, 및 거대분자 콕테일들로 신속하게 로딩시킬 수 있다. 운반물-로딩된 코어들에 대한 DOPC 리포좀들의 융합은 중성 pH에서 운반물을 보유하고, 비-특이적인 결합을 감소시키며, 콜로이드성 안정성을 개선시키고, 양이온성 리포좀들 및 리포플렉스들과 관련된 세포독성을 경감시키는 안정화되고 지지된 지질 이층(SLB)의 형성을 초래한다(추가의 세부사항들에 대해서는 참조 문헌 34 참조). 유액 그러나 안정한 SLB에 접합된 표적화 펩타이드들은 세포 표면 수용체들과 일가적으로 상호작용하여, 수용체-매개된 세포내이입을 유도한다. 산성화된 엔도소옴 환경내에서, 삼투압성 팽윤 및 엔도소옴의 파괴(엔도조몰리틱 펩타이드들의 양성자 스폰지 효과에 의해 유발됨)과 함께 SLB 탈안정화는 세포질내에서 실리카 코어들의 분산을 초래한다. 합해진 분산 및 실리카 코어 해리는 > 12시간 동안 조절되고, 지속된 운반물 방출을 가능하도록 한다. 프로토셀들의 결합된 수용력, 안정성, 및 표적화 및 내재화 효능은 정상의 간세포들에 있어서 실질적으로 부작용들없이 Hep3B에 대해 예외적으로 낮은 IC90을 생성한다.
150-nm 코어들을 갖는 프로토셀들은 입자 당(L 당) 평균적으로, ~6 x 10 siRNA 분자들 또는 ~1 x 107개 리친 독소 A-쇄(RTA) 분자들을 봉입하며 모의된 체액에 72시간 동안 노출 시 이들의 운반물의 거의 100%를 보유한다. 비교 시, 지질 및 중합체 나노입자들은 거대분자 운반물에 대해 10 내지 1000-배 더 낮은 수용력을 가지며 중성 pH에서 실질적으로 거의 안정하지 않다51,52. 프로토셀들은, 또한, 다른 중간다공성 실리카 입자들보다 핵산 운반물에 대해 더 높은 수용력을 갖는다. 난소 암으로 siRNA-로딩된 나노리포좀들의 지속적인 전달을 위해 다나카(Tanaka) 등에 의해 개발된 SI MPs은, 이들의 평균 면적이 10배 더 크다고 해도(1.6 μm 대 150 nm), 프로토셀들과 대략 동일한 양의 RNA를 봉입한다(입자당 2.0 pg 대 입자 당 1.3 pg)53. 지아(Xia) 등에 의해 개발된 폴리에틸렌이민-피복된 중간다공성 실리카 나노입자들은 10 μg의 입자들(10 중량%) 당 ~1 μg의 siRNA를 복합체화시키며; 비교시 10 μg의 프로토셀들은 ~6.5 μg의 siRNA(65 중량%)로 로딩된다. 수용력 및 안정성에 있어서의 향상들은 siRNA-로딩된 프로토셀들이 표적 유전자들을 사일런스시키고 문헌에서 보고된 값들의 10 내지 10,000배 미만인 농도에서 HCC의 세포자살을 유도할 수 있다51,52,54-58. siRNA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들은 90 pM 내지 370 pM(IC90) 범위의 siRNA 농도들에서 사이클린 A2, Bl, Dl, and E 발현 중 90%를 사일런싱하고 125 pM의 siRNA 농도에서 48시간 내에 HCC의 > 90%를 사멸시킨다(LC90). 비교 시, 표적화된 리포좀들은 입자의 유형 및 실험들을 수행한 조건들에 따라 5 내지 500nM의 IC90 및 LC90 값들을 갖는다54-56,58-60. siRNA로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들의 치료학적 효능은 또한 중합체-봉입된 중간다공성 나노입자들의 효능을 초과한다. 수개의 그룹들은 다가양이온성 중합체들 내에서 봉입된 중간다공성 실리카 나노입자들을 사용하여 siRNA를 복합체화시키며; 이러한 입자들은 10 내지 20의 나노입자:siRNA(w/w) 비들에서 24 내지 48시간내에 30 내지 60%의 수용체의 녹다운 및 내인성 유전자 발현을 생성한다33,61. 본 발명자들은 AEPTMS-개질된 실리카 나노입자들내에서 siRNA를 로딩하므로, 프로토셀들의 수용력은 ~8의 프로토셀:세포 비에서 사이클린 A2, Bl, Dl, 및 E 발현의 완전한 사일런싱을 생성한다. 결론적으로, 본 발명자들의 발견들은, 프로토셀들이 핵산들 및 독소들을 포함하는 다중 부류의 거대 분자들에 대해 공통의 표적화된 나노담체들로서 제공될 수 있음을 제안한다. 나노다공성 코어들을 또한 치료진단 및 개인 의약의 급성장하는 분야들에 요구된 영상화제 및 진단제들을 포함하는, 다른 별개의 운반물 유형들로 로딩될 수 있다.
물질들 및 방법들
물질들. 사이클린 A2(마우스 mAb), 사이클린 Bl (마우스 mAb), 사이클린 Dl (마우스 mAb), 및 사이클린 E(마우스 mAb)는 업자(Abeam, Inc.: 매사츄세츠주 캠브릿지 소재)로부터 구입하였다. 사일런서 선택 siRNAs(사이클린 A2, Bl, Dl, 및 E의 경우 siRNA 확인번호들은 각각 s2513, s2515, s229, 및 s2526이다)는 Applied Biosystems™ 으로부터 업자[Life Technologies Corporation(캘리포니아주 칼스바드 소재)]에 의해 구입되었다. 사람 Hep3B (HB-8064), 사람 간세포 (CRL-11233), 이글 최소 필수 배지(EMEM), 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 및 1X 트립신-EDTA 용액(0.25% 트립신과 0.53 mM EDTA)은 아메리카 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 버지니아주 마나사스 소재)로부터 구입하였다. l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜 2000](18:1 PEG-2000 PE), l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 및 콜레스테롤은 업자[Avanti Polar Lipids, Inc.(알라바마주 알라바스터 소재)로부터 구입하였다. CaspGLOW™ 플루오레세인 활성 카스파제-9 염색 키트(485/535) 및 CaspGLOW™ 적색 활성 카스파제-3 염색 키트(540/570)는 업자[BioVision, Inc.(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재). ABIL® EM 90(세틸 PEG/PPG- 10/1 디메티온)은 업자[Evonik Industries(독일 에쎈 소재)]로부터 구입하였다. Hoechst 33342(350/461), Alexa Fluor® 488 항체 표지화 키트(495/519), 안넥신 V의 Alexa Fluor® 488 접합체(495/519), Click-iT® AHA Alexa Fluor® 488 단백질 합성 HCS 검정(495/519), 프로피듐 요오다이드(535/617), Alexa Fluor® 647 카복실산, 석신이미딜 에스테르(650/668), SlowFade® 금 안티페이트 시약(Gold antifade reagent), Image-iT® FX 시그날 인핸서, IX 둘베코스 인산염 완충된 염수(D-PBS), 및 소 알부민 분획 V 용액(BSA, 7.5%)은 업자[Invitrogen Life Sciences(캘리포니아주 칼스바드 소재)]로부터 구입하였다. BEGM 발렛 키트들은 업자[Lonza Group Limited(Clonetics; 매릴랜드 워커스빌 소재)]로부터 구입하였다. Amicon® Ultra-4 원심분리 여과 장치들(10 kDa MWCO)은 업자[Millipore(메사츄세츠주 빌레리카 소재)]로부터 구입하였다. 모든 펩타이드들은 업자[New England Peptide(매사츄세츠주 가드너 소재)]로부터 구입하였다. 석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라코사에틸렌글리콜]에스테르(SM(PEG)24)는 업자[Pierce 단백질 Research Products(Thermo Fisher Scientific LSR; 일리노이주 록포드 소재)]로부터 구입하였다. 초 순수한, EM-등급 포름알데하이드(16%, 메탄올-무함유)는 업자[Polysciences, Inc.(펜실바니아주 와링톤 소재)]로부터 구입하였다. 무수 에탄올, 염산(37%), 테트라에틸 오르토실레케이트(TEOS, 98%), 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필트리메톡시실란(AEPTMS, 기술적 등급), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB, ≥ 99%), 나트륨 도데실 설페이트(SDS, ≥ 98.5%), Triton® X-100, 헥사노데칸(≥ 99%), 3급-부탄올(≥ 99.5%), 2-머캅토에탄올(≥ 99.0%), DL-디티오트레이톨(≥ 99.5%), 디메틸 설폭사이드(≥ 99.9%), pH 5 시트르산 완충액, 에틸렌디아미노테트라아세트산(EDTA, 99.995%), 사람 상피 성장 인자, L-α-포스파티딜에탄올아민, 소 피브로넥틴, 소 콜라겐 제I형, 대두 트립신 억제제(> 98%), 페놀 레드가 들어있지 않은 DMEM, 리키누스 콤무니스(Ricinus communis)로부터의 탈글리코실화된 A-쇄 및 Sephadex® G-200는 업자[Sigma-Aldrich(미주리주 세인트 루이스 소재)]로부터 구입하였다.
세포 배양 조건들. Hep3B 및 간세포들은 ATCC로부터 입수하여 제조업자의 지시들에 따라 성장시켰다. 요약하면, Hep3B를 10% FBS가 들어있는 EMEM 속에서 유지시켰다. 간세포들을 BSA, 피브로넥틴, 및 소 콜라겐 제I형으로 피복된 플라스크들 속에서 성장시키며; 사용된 성장 배지는 5 ng/mL 상피 성장 인자, 70 ng/mL 포스파티딜에탄올아민, 및 10% FBS가 들어있는 BEGM(겐타마이신, 암포테리신, 및 에피네프린은 BEGM 발렛 키트로부터 폐기되었다)이었다. 세포들을 37℃에서 습윤된 대기(5% C02가 보충된 대기) 속에서 유지시키고 0.05% 트립신으로 1:3의 아-배양 비에서 계대배양하였다.
다중모드 실리카 나노입자들의 합성. 다중모드 다공성을 갖는 나노다공성 실리카 입자들을 합성하는데 사용된 유액 가공 기술은 캐롤(Carroll) 등35이 기술하여 왔다. 요약하면, 1.82 g의 CTAB(수성 상 속에서 가용성)을 20 g의 탈이온수에 가하고, 40℃에서 용해될 때까지 교반하고, 25℃로 냉각되도록 하였다. 0.57 g의 1.0N HC1, 5.2 g의 TEOS, 및 0.22 g의 NaCl을 CTAB 용액에 가하고, 수득되는 졸을 1시간 동안 교반하였다. 헥사데칸과 3 중량% ABIL® EM 90(오일 상 속에서 가용성인 비-이온성 유화제)로 구성된 오일 상을 제조하였다. 전구체 졸을 오일 상과(1:3 용적 비의 졸:오일) 1000-mL 환저 플라스크 속에서 합하고, 2분 동안 격렬하게 교반하여 우중수 유액의 형성을 촉진시키고, 회전 증발기[R-205; 제조원; Buchi Laboratory Equipment; 스위스 소재]에 고정시키고, 80℃ 수욕 속에 30분 동안 두었다. 이후에, 혼합물을 120 mbar(3시간 동안 35 rpm)의 감압하에 비등시켜 용매를 제거하였다. 입자들을 이후에 3000 rpm에서 20분 동안 원심분리[Model Centra MP4R; 제조원: International Equipment Company; 테네시주 차타누가 소재]하고, 상층액을 경사제거하였다. 최종적으로, 입자들을 500℃에서 5 시간 동안 하소시켜 표면활성제들과 다른 과량의 유기 물질을 제거하였다.
개질되지 않은 입자들이 보다 친수성이 되도록 하기 위하여, 이들을 (i) 4% (v/v) 수산화암모늄 및 4% (v/v) 과산화수소 및 (ii) 0.4 M HC1 및 4%(v/v) 과산화수소로 80℃에서 15분 동안 처리하였다. 이후에, 입자들을 물로 수회 세척하고 0.5 X D-PBS 속에 25 mg/mL의 최종 농도에서 재-현탁시켰다. 나노다공성 코어들은 25 mg의 하소된 입자들을 무수 에탄올 중 1 mL의 20% AEPTMS에 가함으로써, 아민-함유 실란, AEPTMS으로 개질시키고; 입자들을 AEPTMS 속에서 밤새 실온에서 항온처리하고, 원심분리(5,000 rpm, 1분)하여 반응하지 않은 AEPTMS를 제거하고, 1 mL의 0.5 X D-PBS 속에 재-현탁시켰다. AEPTMS-개질된 입자들은 5μL의 아민-반응성 형광단(Alexa Fluor® 647 카복실산, 석신이미딜 에스테르; DMSO 중 1 mg/mL)을 1 mL의 입자들에 가하여 형광성-표지하고; 당해 입자들을 실온에서 2시간 동안 유지시킨 후 원심분리하여 반응하지 않은 염료를 제거하였다. 형광적으로-표지된 입자들을 0.5 X D-PBS 속에 4℃에서 저장하였다. 직경이 ~200-nm보다 큰 입자들을 크기 배제 크로마토그래피 또는 차등적 원심분리를 통해 운반물 로딩 및 리포좀 융합 전에 제거하였다.
실리카 나노입자들의 특성화. 나노다공성 실리카 입자들, 및 운반물-로딩된 프로토셀들 및 리포좀들의 역학적 광 산란을 Zetasizer Nano(제조원: Malvern; 영국 워체스터쉐어 소재)를 사용하여 수행하였다. 시료들은 48L의 실리카 입자들(25 mg/mL)을 2.4ml의 0.5 X D-PBS 속에 희석시켜 제조하였다. 용액들을 1mL의 폴리스티렌 큐베트들(제조원: Sarstedt; 독일 뉨브레크트 소재)에 분석을 위해 이동시켰다. 질소 흡수를 ASAP 2020 표면적 및 다공성 분석기(제조원: Micromeritics Instrument Corporation; 조지아주 노르크로쓰 소재)를 사용하여 수행하였다. 제타 전위 측정들은 Zetasizer Nano(제조원: 영국 워체스터쉐어 소재)를 사용하여 달성하였다. 실리카 입자들을 0.5 X D-PBS 속에서 1:50로 희석시키고 1-mL의 폴딩된 모세혈관 세포들(제조원: Malvern; 영국 워체스터쉐어 소재)에 분석을 위해 이전시켰다.
나노다공성 실리카 입자들에 대한 리포좀 융합. 프로토셀들을 합성하기 위해 사용된 과정은 앞서 기술되어 있으며34,36,62,63 ENREF 33 단지 간단히 언급할 것이다. 업자(Avanti Polar Lipids)로부터 주문한 지질들을 클로로포름 속에 예비-용해시키고 -20℃에서 저장하였다. 프로토셀 합성직 전에, 2.5 mg의 지질을 질소 스트림하에 건조시키고 진공 오븐(Model 1450M, 제조원: VWR International, 펜실바니아 웨스트 체스터 소재) 속에 밤새 두어서 잔류 용매를 제거하였다. 지질들을 0.5 X D-PBS 속에서 2.5 mg/mL의 농도로 재-수화시키고 100-nm 여과기를 통해 적어도 10회 미니-압출기 세트(Mini-Extruder set)(제조원: Avanti Polar Lipids, Inc.; 알라바마주 알라바스터 소재)를 사용하여 통과시켰다. 수득되는 리포좀들(면적 ~120-nm)을 4℃에서 1주 이하 동안 저장하였다. 나노다공성 실리카 코어들(25 mg/mL)을 2- 내지 4-배 용적 과량의 리포좀들과 함께 30 내지 90분 동안 실온에서 항온처리하였다. 프로토셀들을 과량의 지질의 존재하에서 1개월 이하 동안 4℃에서 저장하였다. 과량의 지질을 제거하기 위해, 프로토셀들을 5,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 2회 세척하고, 0.5 X D-PBS 속에 재-현탁시켰다.
지질들은 탈수 및 압출 전에 함께 동결건조시키고; 예를 들면, 75μL의 DOPC (25 mg/mL), 5μL의 DOPE (25 mg/mL), 10μL의 콜레스테롤 (75 mg/mL), 및 10μL의 18:1 PEG-2000 PE(25 mg/mL)를 합하고 건조시켜 DOPC와 5 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 및 10 중량% PEG-2000로 구성된 리포좀들을 형성시켰다. 55:5:30:10의 DOPC:DOPE:콜레스테롤:18:l PEG-2000 PE 질량 비를 사용하여 'DOPC 프로토셀들'을 합성한 반면, 55:5:30:10의 DOTAP:DOPE:콜레스테롤:18:l PEG-2000 PE 질량 비를 사용하여 'DOTAP 프로토셀들'을 합성하였다.
지지된 액체 이층에 대한 펩타이드들의 접합. C-말단 시스테인 잔기들로 합성된, SP94 및 H5WYG 펩타이드들을 설프하이드릴 및 아민 잔기들에 대해 반응성이고 9.52-nm PEG 스페이서 아암(spacer arm)을 지닌 이종이작용성 가교결합제, SM(PEG)24를 사용하여 PE의 헤드 그룹들에 존재하는 1급 아민들에 접합시켰다. 프로토셀들을 우선 10-배 몰 과량의 SM(PEG)24과 함께 2시간 동안 실온에서 항온처리하고 원심분리(5,000 rpm에서 1분)하여 반응하지 않은 가교결합제를 제거하였다. 활성화된 프로토셀들을 이후에 5-배 과량의 SP94와 함께 2시간 동안 실온에서 항온처리하여 0.015 중량% (~6 펩타이드들/프로토셀)의 펩타이드 밀도를 획득하고 500-배 몰 과량의 H5WYG를 4시간 동안 실온에서 사용하여 0.500 중량% (~240 펩타이드들/프로토셀)의 펩타이드 밀도를 획득하였다. 프로토셀들을 세척하여 유리된 펩타이드를 제거하고, 평균 펩타이드 밀도를 앞서 기술한 바와 같이34, 트리신-SDS-PAGE로 측정하였다.
siRNA 및 리친 독소 A-쇄-로딩된 프로토셀들의 합성. 개질되지 않거나 AEPTMS-개질된 코어들 (25 mg/mL)을 siRNA(1X D-PBS 중 250 μΜ) 또는 탈글리코실화된 리친 독소 A-쇄(1X D-PBS 중 100 μΜ) 속에 2시간 동안 4℃에서 침지시켰다. 봉입되지 않은 운반물을 5,000rpm에서 1시간 동안 원심분리를 통해 제거하고, DOPC 리포좀들을 앞서 기술한 바와 같이 운반물-로딩된 코어들에 즉시 융합시켰다. 개질되지 않은 코어들을 siRNA로 본 발명자들에 의해 앞서 기술한 바와 같은36 상승적 메카니즘을 통해 로딩하였다. 요약하면, 25μL의 siRNA(1 mM)를 75μL의 실리카 나노입자들(25 mg/mL)에 가하였다. 당해 용액을 온화하게 와동시키고 200μL의 DOTAP 리포좀들과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 과량의 액체 및 봉입되지 않은 siRNA를 사용 직전에 원심분리로 제거하였다.
siRNA-로딩된 리포플렉스들의 합성. siRNA-로딩된 DOPC 리포플렉스들을 제조하기 위하여, DOPC, DOPE, 콜레스테롤, 및 18:1 PEG-2000 PE를 우선 55:5:30:10의 몰 비로 혼합하고, 질소 스트림하에 건조시키고 진공 오븐 속에 밤새 두어 잔류 클로로포름을 제거하였다. 액체 필름을 이후에 3급-부탄올 속에 용해하고 siRNA 용액(0.85% (w/v) NaCl 및 0.25 M 슈크로즈가 들어있는 10 mM 트리스-HCl(pH 7.4) 속에 희석됨)을 사용하여 1:1(v/v)로 혼합함으로써 최종의 DOPC:siRNA 비가 10:1(w/w)이 되도록 하였다. 당해 혼합물을 와동시키고, 아세톤 및 무수 빙의 욕 속에서 섬광 동결시키고, 진공 건조시켰다. 사용 직전에, 리포플렉스 제제를 등장성 슈크로즈 용액(0.85% (w/v) NaCl 및 0.25 M 슈크로즈가 들어있는 10 mM 트리스-HCl (pH 7.4))으로 수화시켜 최종의 siRNA 농도가 100 μg/mL이 되도록 하고; 봉입되지 않은 siRNA는 원심분리-구동된 여과(10 kDa MWCO)를 통해 제거하였다.
본 발명자들은 약간의 변형들과 함께 우(Wu) 등이 기술한 바와 같이64, siRNA-로딩된 DOTAP 리포플렉스들을 제조하였다. 본 발명자들은 페길화된 세라미드를 18:1 PEG-2000 PE로 대체하고 55:5:30:10의 DOTAP:DOPE:콜레스테롤:PEG-2000 PE 비를 사용하였다. 본 발명자들을 또한, 동결건조된 리포플렉스들을 0.85% (w/v) NaCl 및 0.25 M 슈크로즈가 들어있는 10 mM 트리스-HCl (pH 7.4) 속에 용해하여 최종의 siRNA 농도가 100 μg/mL이 되도록 하고 봉입되지 않은 siRNA를 원심분리 여과 장치(10 kDa MWCO)를 사용하여 제거하였다. 리포플렉스들은 제타 전위 분석을 위해 0.5 X D-PBS 속에 용해시켰다.
DOPC 및 DOTAP 리포플렉스들을 SP94 및 H5WYG로 개질시키기 위해, 이들을 우선 10-배 몰 과량의 SM(PEG)24와 실온에서 2 시간 동안 항온처리하고; 반응하지 않은 가교결합제를 원심분리-구동된 여과(10 kDa MWCO)를 통해 제거한 후, 이들을 5-배 몰 과량의 SP94 및 1000-배 몰 과량의 H5WYG화 함께 2 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 유리된 펩타이드를 원심분리 여과 장치(10 kDa MWCO)를 사용하여 제거하였다.
RTA-로딩된 리포좀들의 합성. RTA-로딩된 DOPC 리포좀들을 제조하기 위하여, 2.5 mg의 지질(55:5:30:10 질량 비의 DOPC:DOPE:콜레스테롤:18:1 PEG-2000 PE)를 질소 스트림하에 건조시키고 진공 오븐(Model 1450M, 제조원: VWR International, 펜실바니아주 웨스트 체스터 소재)에 밤새 두어 잔류 용매를 제거하였다. 지질들을 0.5 X D-PBS 속에서 2.5 mg/mL의 농도로 재-수화하고, 간단히 초음파처리하고, 등용적의 RTA(0.5 X D-PBS 중 100 μΜ)과 혼합하였다. 혼합물을 와동시키고, 아세톤 및 무수 빙욕 속에서 섬광 동결시키고, 동결 건조시켰다. 사용 직전에, 리포좀 제제를 위에 기술된 등장성 슈크로즈 용액으로 재-수화시키고, 격렬하게 와동시키고, 실온에서 2 내지 4시간 동안 정치시켰다. 이후에, 리포좀들을 100-nm 여과기를 통해 미니-압출기 세트(제조원: Avanti Polar Lipids, Inc.; 알라바마주 알라바스터 소재)을 사용하여 적어도 10회 통과시키고 Sephadex® G-200 컬럼 위를 통과시켜 봉입되지 않은 RTA를 제거하였다. RTA-로딩된 리포좀들을 위에서 기술한 바와 같이 SP94 및 H5WYG로 개질시켰다.
운반물 수용력들 및 방출 속도들의 측정. siRNA 및 리친 독소 A-쇄(RTA)에 대한 프로토셀들, 리포플렉스들, 및 리포좀들의 수용력은 1 x 1010 입자들을 1 중량% SDS(D-PBS 속에 용해됨)를 24시간 동안 항온처리하고 당해 용액들을 원심분리하여 프로토셀 코어들 및 다른 부스러기들을 제거함으로써 측정하였다. 상층액 중 siRNA의 농도는, 260 nm에서의 흡광도를 표준 곡선과 비교하여 측정하였다. 상층액 중 RTA의 농도는 밴드 강도들을 표준 곡선에 대해 영상 J 영상 프로세싱 및 분석 소프트웨어(Image J Image Processing and Analysis software)(제조원: National Institutes of Health; 메릴랜드주 베데스다 소재)를 사용하여 비교함으로써 SDS-PAGE로 측정하였다.
중성 및 산성 pH 조건들 하에서 siRNA 및 RTA의 방출 속도는, 1 x 1010개 입자들을 1 mL의 모의 체액(150 mM NaCl 및 10% 혈청이 들어있는 EMEM, pH 7.4) 또는 시트르산 완충액(pH 5.0) 속에 다양한 기간 동안 37℃에서 현탁시켜 측정하였다. 입자들을 원심분리(프로토셀들의 경우 5,000 x g에서 5분 및 리포좀들의 경우 15,000 x g에서 30분; Microfuge® 16 Centrifuge; 제조원: Beckman-Coulter; 캘리포니아주 브레아 소재)를 통해 펠렛화하였다. 상층액 중 siRNA 및 RTA 농도들을 UV-가시성 분광법 및 SDS-PAGE를 사용하여, 위에서 기술한 바와 같이 측정하였다. 방출된 운반물의 농도를 1010개 입자들내에 초기 봉입된 운반물 농도의 퍼센트로 전환하였다.
사이클린 A2, Bl, D1, 및 E 단백질 발현의 정량화. 90%의 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 Dl, 또는 사이클린 E 발현을 사일런싱하는데 필요한 siRNA의 농도를 측정하기 위하여(IC90, 참조: 도 4AX3), 1 x 106개 Hep3B 세포들을 SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들에 로딩된 다양한 농도의 siRNA에 48시간 동안 37℃에서 노출시켰다. 세포들을 원심분리(1000 rpm, 1분)하여 과도한 입자들을 제거하고, 3.7% 포름알데하이드(실온에서 15분)로 고정시키고, 0.2% 트리톤 X-100(실온에서 5분)으로 투과시키고; 세포들을 이후에 항-사이클린 A2, 항-사이클린 Bl, 항-사이클린 Dl, 또는 항-사이클린 E의 1:500 희석액에 노출시키고, Alexa Fluor® 488 항체 표지화 키트를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 표지시켰다. 세포들을 3회 세척하고 D-PBS 속에 유동 세포분석법(FACSCalibur) 속에 재-현탁시켰다. 그라파드 프리즘(GraphPad Prism(제조원: GraphPad Software, Inc.; 캘리포니아주 라 졸라 소재)을 사용하여 대수 플롯들(siR A 농도) 대 평균 형광성 강도로부터 IC90 값들을 계산하고; 초기 단백질 농도를 siRNA로딩된 프로토셀들에 5분 동안 노출된 항체-표지된 세포들의 평균 형광성 강도로 취하였다.
사이클린 A2, 사이클린 Bl, 사이클린 Dl, 및 사이클린 E 발현의 시간-의존적인 감소를 측정하기 위하여(참조: 도 4BX3), siRNA로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들을 1 x 106개의 Hep3B 세포들과 혼합하여 최종 siRNA 농도가 125 pM이 되도록 하고; 세포들 및 프로토셀들을 37℃에서 다양한 기간 동안 항온처리하고, 수득되는 단백질 수준들을 위에서 기술한 바와 같이 면역형광성을 통해 측정하였다.
도 4CX3(좌측 축)에 나타낸 데이타를 수집하기 위하여, 충분한 용적의 siRNA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들, DOPC 리포플렉스들, 또는 DOTAP 리포플렉스들을 1 x 106개의 Hep3B 또는 간세포에 가하여 최종의 siRNA 농도가 125 pM이 되도록 하였다. 시료들을 37℃에서 48 시간 동안 항온처리하고, 사이클린 A2 발현에 있어서의 수득되는 감소를 위에서 기술한 바와 같이 정량화하였다. 도 4C X3 (우측 축)에서 플롯팅된 값들을 측정하기 위하여, 1 x 106개의 Hep3B 세포들을 다양한 농도들(입자들/mL)의 siRNA로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들, DOPC 리포플렉스들, 또는 DOTAP 리포플렉스들에 37℃에서 48 시간 동안 노출시키고; 사이클린 A2 발현을 면역형광성으로 정량화하고, 사이클린 A2 발현을 90% 까지 감소시키는데 필수적인 입자들의 수들 입자 농도 대 사이클린 A2 농도의 플롯으로부터 계산하였다.
도 5 X3에 나타낸 세포들을 10-배 과량의 siRNA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들에 Alexa Fluor® 647-표지된 코어들을 사용하여 37℃에서 1시간 또는 48시간 동안 노출시켰다. 세포들을 D-PBS로 3회 세척하고, Hoechst 33342로 제조업자들의 지시들에 따라 표지하고, 3.7% 포름알데하이드(실온에서 15분)로 고정시키며, 0.2% 트리톤 X-100(실온에서 5분)으로 투과시키고, Image-iT® FX 시그날 인핸서(실온에서, 30분)로 차단하였다. 이후에, 세포들을 사이클린 A2, Bl, Dl, 또는 E(1% BSA 속에서 1:500로 희석됨)에 대한 Alexa Fluor® 488-표지된 항체들에 4℃에서 밤새 노출시키고, D-PBS로 3회 세척하고, SloxvFade® 금으로 고정시켰다.
siRNA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 의해 유도된 세포자살의 정량화.
siRNA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 노출된 Hep3B 및 간세포들(참조: 도 6AX3)의 시간-의존성 생존능은 1 x 106개 세포들을 125pM의 siRNA와 함께 다양한 기간 동안 37℃에서 항온처리하여 측정하였다. 세포들을 원심분리(1000rpm, 1분)하여 과량의 프로토셀들을 제거하고 Alexa Fluor 488®-표지된 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드로 염색하였다. 다수의 생존성(이중-음성) 및 비-생존성(단일- 또는 이중-양성) 세포들을 유동 세포분석(FACSCalibur)을 통해 측정하였다.
도 6BX3 및 6CX3에 나타낸 세포들을 10-배 과량의 Alexa Fluor® 647-표지된 코어들을 지닌 siRNA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 1시간 또는 37시간 동안 37℃에서 노출시켰다. 이후에, 세포들을 D-PBS로 3회 세척하고, Hoechst 3334, Alexa Fluor® 488-표지된 안넥신 V, 및 프로피듐 요오다이드로 제조업자들의 지시들에 따라서 염색하고, 고정(3.7% 포름알데하이드 속에서 10분 동안 실온에서)시키고, SlowFade® 금으로 고정시켰다.
초기의 단백질 합성의 정량화. RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들(참조; 도 8A X3)의 IC90 값은 1 x 106개의 Hep3B 세포들을 다양한 농도들의 프로토셀- 봉입된 RTA와 함께 48시간 동안 37℃에서 항온처리함으로써 측정하였다. 초기의 단백질 합성에 있어서 수득되는 감소를 Click-iT® AHA Alexa Fluor® 488 단백질 합성 HCS 검정(제조업자의 지시들에 따라)을 사용하여 검출하고 유동 세포분석 (FACSCalibur)을 통해 정량화하였다. 각각의 시료의 평균 형광 강도를 대수(독소 농도)에 대해 플롯팅하고, IC90 값을 GraphPad Prism을 사용하여 측정하였다.
초기의 단백질 합성에 있어서의 시간-의존성 감소(참조: 도 8BX3)는 RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들([RTA] = 25 pM)을 1 x 106개의 Hep3B 세포들과 다양한 기간들 동안 37℃에서 항온처리하여 측정하고; 초기의 단백질 합성을 위에서 기술한 바와 같이 검정하였다.
도 8CX3(좌측 축)에 나타낸 데이타를 수집하기 위하여, 충분한 용적의 RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들 또는 리포좀들을 1 x 106개의 Hep3B 또는 간세포들에 가함으로써 최종 RTA 농도가 25 pM이 되도록 하였다. 시료들을 37℃에서 48시간 동안 항온처리하고, 초기의 단백질 합성에 있어서 수득되는 감소를 위에서 기술한 바와 같이 정량화하였다. 도 8C (우측 축)에 플롯팅된 값들을 측정하기 위하여, 1 x 106개의 Hep3B 세포들을 다양한 농도(입자들/mL)의 RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들 또는 리포좀들에 37℃에서 48시간 동안 노출시키고; 단백질 생합성을 Click-iT® AHA Alexa Fluor® 488 단백질 합성 HCS 검정을 사용하여 정량화하고, 초기의 단백질 합성을 90% 까지 감소시키는데 필요한 입자들의 수를 입자 농도 대 초기의 단백질 농도의 플롯으로부터 계산하였다.
도 9X3에 나타낸 세포들은 Alexa Fluor® 647-표지된 코어들이 있는 10-배 과량의 RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들에 1시간 동안 또는 48 시간 동안 37℃에서 노출시켰다. 새로이 합성된 단백질들을 Click-iT® AHA Alexa Fluor® 488 단백질 합성 HCS 검정(제조업자의 지시들에 따라)을 사용하여 표지하였다. 세포들을 이후에 Hoechst 33342로 제조업자의 지시들에 따라 염색하고, 3.7% 포름알데하이드(실온에서 10분)로 고정시키고, SlowFade ® 금을 사용하여 고정시켰다.
RTA-로딩된, SP94-표적화된 프로토셀들에 의해 유도된 세포자살의 정량화. 카스파제-9 및 카스파제-3의 시간-의존성 활성화(참조: 도 10AX3)는 1 x 106개의 Hep3B 및 간세포들을 RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들([RTA] = 25 pM)에 다양한 기간 동안 37℃에서 노출시켜 측정하였다. 카스파제 활성화의 정도는 CaspGLOWTM　플루오레세인 활성 카스파제-9 및 CaspGLOWTM　Red 활성 카스파제-3 염색 키트를 사용하여 정량화하고; 유동 세포분석(FACSCalibur)을 사용하여 녹색 형광성(FL1) 및/또는 적색 형광성(FL2)을 배경(생존성 Hep3B 세포들)의 것보다 100-배 더 높은 수준에서 발현하는 세포들의 수를 측정하였다. 세포자살 세포들은 카스파제-9 및/또는 카스파제-3에 대해 양성인 것들로 정의하였다.
도 10BX3 및 10CX3에 나타낸 세포들을 10-배 과량의 Alexa Fluor® 647-표지된 코어들이 있는 RTA-로딩된, SP94-표적화된 DOPC 프로토셀들에 48시간 동안 37℃에서 노출시켰다. 활성 카스파제-9 및 활성 카스파제-3을 CaspGLOWTM　플루오레세인 활성 카스파제-9 및 CaspGLOWTM　적색 활성 카스파제-3 염색 키트들(각각)을 사용하여 표지하였다. 이후에, 세포들을 D-PBS 속에서 3회 세척하고, Hoechst 33342로 제조업자의 지시들에 따라 염색하고, 고정(3.7% 포름알데하이드 속에서 10분 동안 실온에서)시키고, SlowFade ® 금으로 고정시켰다.
유동 세포분석 장치 및 셋팅들. 도 4AX3-4CX3, 6DX3, 8AX3-8CX3, 및 10AX3의 경우, 세포 시료들은 BD CellQuestTM 소프트웨어, 버젼 5.2.1이 장착된 FACSCalibur 유동 세포분석기(제조원: Becton Dickinson; 뉴저지주 프랑클린 레이크스 소재)로 분석하였다. 시료들을 fsc 채널을 사용하여 선형 모드 및 다른 모든 채널들을 사용하여 대수 모드로 획득하였다. 현상들을 전방 광 산란기를 기본으로하여 개시하고, 게이트를 세포 부스러기를 배제한 전방 분산-측 산란 플롯(forward scatter-side scatter plot)에 배치하였다. Alexa Fluor® 488 및 플루오레세인을 488-nm 레이저 광원을 사용하여 여기시키고, 방사 강도를 FL1 채널(530/30 여과기/바이패스)내에서 수집하였다. 프로피듐 요오다이드 및 설포-로다민(CaspGLOWTM　적색 활성 카스파제-3 염색 키트)을 488-nm 레이저 광원을 사용하여 여기시키고, 방사 강도를 FL2 채널(585/42) 속에서 수집하였다. 평균 형광 강도를 FlowJo 소프트웨어, 버젼 6.4(제조원; Tree Star, Inc.; 올랜드주 아쉬랜드 소재)를 사용하여 측정하였다. 모든 플롯들은 Sigma Plot, 버젼 11.0(제조원: Systat Software, Inc.; 캘리포니아주 산 호세 소재)을 사용하여 생성하였다.
공초점 현미경 장치 및 셋팅들. 3- 및 4-색 영상들을 LSM510 소프트웨어의 채널 모드에서 작동된 Zeiss LSM510 META (제조원: Carl Zeiss MicroImaging, Inc.; 뉴욕주 톤우드 소재)를 사용하여 획득하고; 63X, 1.4-NA 오일 액침 대물렌즈를 모든 영상에 사용하였다. 대표적인 레이저력(laser power) 셋팅들은 다음과 같다: 405-nm 다이오드 레이저에 대해 30% 전송, 488-nm 아르곤 레이저에 대해 5% 전송(60% 출력), 543-nm HeNe 레이저에 대해 100% 전송, 및 633-nm HeNe 레이저에 대해 85% 전송. 획득(gain) 및 오프셋(offset)을 각각의 채널에 대해 조절하여 포화를 방지하고 각각 500-700 및 -0.1에서 전형적으로 유지시켰다. 1024 x 1024 해상도를 갖는 8-비트 z-스택들(stacks)을 0.7 내지 0.9-㎛의 광학 슬라이스로 획득하였다. LSM510 소프트웨어를 사용하여 채널들을 오버레이(overlay)하고 z-스택 영상들의 붕괴된 투영(collapsed projection)들을 생성하였다. 모든 형광성 영상들은 붕괴된 투영들이다.
모든 현미경 실험들의 경우, 세포들을 배양 플라스크들 속에서 70 내지 80% 합치율로 성장시키고, 수거(0.05% 트립신, 10분)하고, 4000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 완전한 성장 배지 속에 재-현탁시켰다. 1 x 104 내지 1 x 106개의 세포들/mL을 0.01% 폴리-L-라이신(150-300 kDa)이 피복된 멸균 커버슬립들(25-mm, 1.5번) 위에 씨딩(seeding)하여 37℃에서 4 내지 24시간 동안 부착시킨 후 프로토셀들에 노출시켰다. 48-시간 시료들을 커버슬립들 위에 Cytopro® 원심분리, 모델 7620(제조원: Wescor, Inc.; 유타주 로간 소재)을 사용하여 다시 회전시켰다.
실시예 3에 대한 참조문헌들
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 4
메조다공성 실리카 나노입자-지지된 지질 이중층(MSN-SLBs)를 통하여 니파 바이러스(Nipah Virus)에 '감염된' 숙주 세포로 치료적 RNA와 DNA를 표적화 운반
파라믹소바이러스족(Paramyxoviridae family)의 고도 병원성 일원인, 니파 바이러스(Nipah virus: NiV)는 이의 수많은 전염 경로와 감염과 관련된 높은 사망율로 인하여 BSL-4 선택제로 분류되어 있다. 그러나, NiV의 세포지향성(cellular tropism)의 이해에 대한 최근의 발전에도 불구하고, 치료는 주로 지원적인 상태에 있다. 이에 맞추어, 본 발명자들은 고농도의 치료적 RNA와 DNA를 NiV 유전자로 형질감염된 모델 숙주 세포로 특이적으로 운반하는 메조다공성 실리카 나노입자-지지된 지질 이중층을 개발하였다 (MSN-SLBs; Nature Materials(2011) 10:389-397 참조). MSN-SLBs는 리포좀 (펩타이드와 PEG 접합을 위한 DOPE 5 중량%을 갖는 DOPC)을 100-nm 메조다공성 실리카 나노입자에 융합시킴으로써 형성된다. 이의 높은 표면적(>1000 ㎡/g)과 커다란(20-25 nm), 표면-접근성 세공으로 인하여, 상기 메조다공성 실리카 코어는 NiV 뉴클레오캡시드 단백질(NiV-N)mRNA의 서열-특이적 분해를 유도하는 siRNA를 고농도(1010개의 입자당 대략 10 μM)로 신속하게 부하할 수 있다. siRNA-부하된 코어에 리포좀이 융합되면 장기간(>3 개월)의 운반물 보유를 촉진하며 리간드 디스플레이를 위한 유체 계면을 제공하는 지지된 지질 이중층(SLB)가 생성된다. MSN-SLB 이중층은 다중 카피의 표적화 펩타이드, 대음세포작용(macropinocytosis)을 유도하는 펩타이드(R8), 및 siRNA가 모델 숙주 세포로 세포질 운반될 수 있도록 하는 PEG를 사용하여 개질된다.
파아지 디스플레이를 사용하여, 본 발명자들은 에프린 B2(EB2), 인간 상피 세포 및 뉴우런에 의해 발현되며 대음세포작용을 통한 NiV 출입용 주요 수용체로 작용하는 EphB2, EphB3, 및 EphB4 티로신 키나제의 경막-정박된 리간드에 결합하는 펩타이드를 확인하였으며; TGAILHP(서열 확인 번호: 18)은 인간 EB2를 발현하도록 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 친화도 선택 및 부모 CHO-K1 및 인간 에프린 B1을 발현하도록 형질감염된 CHO-K1 세포 둘다에 대한 카운터-선택을 5회 수행한 후 주요 서열로 확인되었다. 유세포측정법을 사용하여, 본 발명자들은 TGAILHP-표적화된 MSN-SLBs가 높은 농도(1.5 중량% 또는 대략 500개의 펩타이드/입자) 및 낮은 농도(0.015 중량% 또는 대략 5개의 펩타이드/입자) 둘다의 펩타이드 결합가에서 EB2-포지티브 세포(HEK 293)에 대해 나노몰의 친화도를 갖고 있음을 발견하였다. 중요한 것은, 0.015 중량%의 TGAILHP(서열 확인 번호: 18) 및 10 중량% PEG-2000 (이는 콜로이드상 안정성을 촉진하며 비-특이적 상호반응을 감소시킨다)으로 개질시킨 MSN-SLBs이 EB2-네가티브 세포(부모 CHO-K1)에 대한 친화도보다 103배 더 높은 HEK 293 세포에 대한 친화도를 갖는 것이다. 공초점 형광 현미경을 사용하여, 본 발명자들은 0.015 중량%의 TGAILHP(서열 확인 번호: 18) 및 0.500 중량%의 R8로 개질시킨 MSN-SLBs이 HEK 293에 의해 신속하게 (t½ = 5분) 내재화되며 여러가지 대음세포작용 억제제로 미리-처리된 세포는 흡수가 60 내지 80%까지 감소됨을 측정하였다. 매크로피노좀(macropinosome)이 산성화되면 (1) 캡슐화된 siRNA의 방출을 개시시키는 SLB가 불안정하게 만들고 (2) 양성자-스폰지 메카니즘을 통한 매크로피노졸 막을 파괴하는 R8 펩타이드가 양자화되는데, 이 두 현상 모두 siRNA가 세포질에 분포되도록 한다.
선택적 결합 및 내재화시킨 다음, 매크로피노좀 탈출로 TGAILHP-표적화된, siRNA-부하된 MSN-SLBs가 부모 CHO-K1 세포에서의 NiV-N 수준에는 영향을 주지않으면서 대략 5 pM인 siRNA 농도에 HEK 293내 NiV-N mRNA를 90% 사일런스(silence)되도록한다. 그러나, siRNA-매개된 RNAi는 일시적이며, NiV-N mRNA 수준은 처리한지 5일후에 증가하기 시작한다. 따라서, 본 발명자들은 NiV-N에 대해 특이적인 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하는 플라스미드를 디자인하여, 이 플라스미드를 히스톤에 패키징하고, 생성된 18-nm 복합체를 실리카 코어내에 부하하기 전에 핵 위치 서열 (NLS)로 개질시켰다. MSN-SLBs는 DOTAP와 DOPE의 50:50 몰비로부터 형성된 상응하는 리포플렉스보다 히스톤-패키징된 플라스미드(4.5 kbp)에 대해 100배 더 높은 용약을 갖는다. 또한, 플라스미드-부하된 MSN-SLBs를 0.015 중량%의 TGAILHP(서열 확인 번호: 18) 및 0.500 중량%의, HEK 293 중의 NiV-N mRNA의 90%가 사일런스인 R8로 대략 1:20의 입자:코어 (대략 1750개의 플라스미드/세포)로 개질시키고 장기간 RNAi를 유도한다; NiV-N mRNA의 농도는 4주간 이의 초기 값의 <10%로 유지한다. 이들의 막대한 운반물 용량, 뿐만 아니라 이들의 안정성 및 특이성에 기인하여, MSN-SLBs는 바이러스 복제 및 전염을 방지할 수 있는 치료제에 대한 운반 비히클로서 전망이 밝은 것으로 나타났다.
실시예 5
경피적 프로토셀
프로토셀이 SC 침투 증진 및 경피적 운반을 도모하도록 조작될 수 있는지 시험하기 위하여 2개의 실험을 수행하였다. 첫번째 실험에서는, 프로토셀의 표준 제형에 대해 각질층을 경유한 수동적 확산에 의해거나 피부를 통과시킴에 의해 피부를 넘어갈 수 있는지 여부를 결정하는 것이 목표이다. 이를 수행하기 위하여,수직의 Franz 확산 장치, 복강성형술로부터 수득한 전체 두께의 피부, 및 유도결합 플라스마 질량 분광학(ICP-MS)을 사용하였다. 전체 실험 방법은 다음 섹션에서 설명되지만, 간략하게 설명하면, SC를 테이프 스트리핑 방법을 사용하여 샘플 절반으로부터 제거하여, 나머지 샘플을 그대로 남겨두였다. 프로토셀은 평균 직경이 90 nm이고 세공-크기 직경이 2.5 nm인 실리카 입자와, 평균 직경이 120 nm인 리포좀과 55 중량% DOPC, 30 중량%의 Chol, 및 15 중량%의 DOPE-PEG-2000으로 조제된 이중층 조성물을 사용하여 제조하였다.
표 1에는 모든 지질에 대한 명칭, 약자, 및 관련 물성이 나타나 있다. 용기를 채우고, 피부 샘플을 그 위에 놓아 공여체 캡을 닫아 확산 실험용으로 개량한 Franz 확산 셀을 사용하였다. 각 군(SC 그대로, SC 제거)으로부터의 대조군을 0.5XPBS로 처리하는 한편, 나머지 샘플은 8.125 mg의 프로토셀로 24시간 동안 처리하였다. 이어서, 공여체 갭내의 나머지 샘플, 피부 샘플, 및 용기 유체를 수집하여Te 용기 유체만 ICP-MS로 분석하였는데 이는 높은 단가/샘플 때문이다. 도 3aX5에는 ICP-MS에 의해 보고되는 바와 같은, 그룹 당(n=3) 용기 유체내 SiO2의 총량이 나타나 있는데, 이는 프로토셀이 SC를 관통하여 피부를 넘어 확산될 수 있음을 증명한다. 그러나, SC가 손상되지않은 피부 샘플과 비교하여 SC가 제거된 피부 샘플을 통하여 거의 4배량의 프로토셀이 확산될 수 있었지만, 각 그룹내에서의 높은 에러 정도로 인하여 이들 값은 통계학적으로 유의적이지 못하며 따라서 이들 데이타는 제안된 연구의 실행가능성 만을 확인한다. 다음 실험은 2개의 목적으로, 즉, 첫째는, ICP-MS에 대한 높은 단가/샘플로 인하여, 경피적 플럭스를 정량하기 위한 비용-효과적인 방법을 개발하는 것이고, 둘째는, 경피적 운동역학에 대한 프로토셀의 SLB 조성과 제형의 효과를 측정하기 위하여 제공되었다. 높은 민감도, 형광측정기로의 손쉬운 연결, 및 코어를 형광적으로 표지시킬 수 있는 용이함으로 인하여 플럭스를 정량하기 위하여 스펙트럼형광측정법을 선택하였다. 도 3bX5는 I0-아민-함유하는 오가노실란, 3-아미노프로필트리에톡시 실란(APTES)를 사용하여 코어를 작용성화한 다음, 아민-반응성 형광단과 함께 배양시켜 프로토셀 코어가 어떻게 형광적으로 표지될 수 있는가를 도식적으로 설명한 것이다. 피부 자체는 모든 가시 광선에서 고도로 자가형광성이지만, 근적외선 파장에서는 스펙트럼형광측정법 및 공초점 레이져 스캐닝 현미경(CLSM)으로 증명되는 바와 같이 최소량의 자가형광을 나타낸다. 그러므로, 이 실험에서는 Alexa Flour 633 (ex: 632, em: 647)을 선택하였으며 이후의 모든 후속 실험에서도 사용될 것이다. 용기 완충액중 633-표지된 코어에 대한 형광측정기 감도의 범위는 피부의 자가형광 정도에 따라 대략 195 ng/mL 내지 500 ng/mL 이다. 본 실험에서는 지질 전이 온도, 포화/불포화 정도, 및 헤드 그룹에서의 차를 기준으로하여 총 6종의 제형을 갖는 3종의 기본적인 SLB 조성을 사용하여 형광적으로 표지된 코어가 있는 프로토셀을 제작하였다: 1) 70 중량%의 DOPC/30 중량%의 Chol, 2) 55 중량%의 DOPC/30 중량%의 Chol/15 중량%의 DOPE-PEG-2000, 3) 70 중량%의 DSPC/30 중량%의 Chol, 4) 55 중량%의 DSPC/30 중량%의 Chol/15 중량%의 DSPE-PEG-2000, 5) 45 중량%의 DOPC/30 중량%의 Chol/25 중량%의 DOPE, 및 6) 30 중량%의 DOPC/30 중량%의 Chol/25 중량%의 DOPE/15 중량%의 DOPE. 모든 샘플에서 SC를 그대로 남겨두고 대조군은 0.5XPBS로 처리하는 한편, 각 샘플은 8 mg의 프로토셀로 24시간 동안 처리하였다. 도 3cX5에는 결과가 요약되어 있으며 SLB 조성과 제형이 프로토셀의 경피적 운동역학에 큰 영향을 주는 것이 설명되어 있다. 이는 전이온도가 더 낮은 지질이 전체 두께 피부로 더 깊게 확산되며 전이온도가 더 높은 지질은 각질층에 편지된 상태로 남아있음을 제시하는 문헌과 일치한다.51 총합하면, 주요 데이타는 제안된 연구의 실행가능성과 이의 높은 성공 잠재성을 증명한다. 또한, 프로토셀의 경피적 운동역학을 정량하기 위한 비용-효과적인 형광측정법 프로토콜이 개발되었다.
방식
프로토셀 합성 및 특성규명:
콜로이드상 용액중에서 또는 에어로졸화를 통하여 상이한 증발 유도된 자가-조립(EISA) 방식을 사용하여 나노다공성 입자 코어를 합성한다. EISA는 양쪽성 계면활성제와 구조 유도 분자(structure directing agent)로서 블럭-코폴리머를, 단순한 용매 증발을 통하여 고도로 정돈된/균일한 세공 크기를 갖는 구형의 나노크기인 실리카(SiO2) 입자의 자가-조립을 촉진하기 위한 가용성 졸-겔 전구체 (즉, 산 또는 염기, H2O 또는 EtOH, 및 일부 종류의 오가노실란)와 함께 사용한다. 56,57일단 입자 합성이 완료되면, 용매 추출법 또는 500℃에서의 하소법을 사용하여 구조 유도 분자를 제거한다. 입자 크기(30 내지 1000 nm), 다공도, 세공 크기(2.5 내지 2.0 nm), 용해 운동역학, 및 표면 화학은 농도를 조절하고 구조화된 유도 분자의 선택을 통하여 제어될 수 있다. 추가로, 합성후 상기 설명된 공법을 사용하여 작용성화시킬 수 있다 (도 3bX5). 압출을 통하여 SLBs가 형성되며, 압출 공정은 지질의 수용액을 균질한 세공이 있는 다공성 폴리카르보네이트 막에 여러번 통과시킴으로써 단분산 리포좀 용액을 생성시키는 것이다. 지질은 크롤로포름중에 보관된 25 mg/mL 스톡 용액으로 구입하며 이들은 반드시 압출시키기전에 추출하여 건조시켜야 한다. 지질은 최종 질량이 2.5 mg이 되도록 상이한 비율로 만들어진 단일 섬광 바이알에 분배시킨다. 지질 조성과 제형의 선택은 SLB의 물리적 및 화학적 특성에 있어서 단일 수준의 정확한 대조군이 되도록하며, 추가 수준의 대조군은 이를 일단 코어에 융합시킨 후 후속되는 SLB 개질로부터 유래된다 (표 1). 클로로포름은 진공하에서 제거하고 지질을 0.5XPBS를 사용하여 2.5 mg/mL의 최종 농도로 다시 수화시켜 압출시키거나, <6개월 동안 -20℃에서 즉시 보관한다.
약자 지질명 TM(℃) MW(g/mol)
DOPC 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 -20 786.113
DPPC 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 41 733.562
DSPC 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 55 790.145
DOPE 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 -16, 10 744.034
DPPE 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 63, 118 692
DSPE 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 74, 100 748.065
DOPE-PEG 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염) -63.5 2801.465
DPPE-PEG 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염) -63.5 2749.391
DSPE-PEG 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염) -63.5 N/A
Chol 콜레스테롤 147-149 386.65
Chol-S 나트륨 콜레스테릴 술페이트 178-180 488.7
Cer18:1 N-올레오일-D-에리트로-스핑고신 N/A 563.938
Cer18 N-스테아로일-D-에리트로-스핑고신 N/A 567.97
아실-Cer 1-올레일-N-헵타데카노일-D-에리트로-스핑고신 N/A 816.373
표 1은 사용할 지질의 명칭과 물성을 보여준다. 데이타는 www.avantilipids.com으로부터의 것이다.
모든 지질이 유체여서 종종 압출기를 열판에 놓아야 할 필요가 있도록 제형중에서 최고점 Tm 바로 위에서 리포좀을 압출시킨다는 점에 유의한다. 프로토셀은 3:1(v/v) 비율을 사용하여 용적으로 과량으로 리포좀을 코어에 첨가하고 이들을 교반시키면서 실온에서 30 내지 60분간 배양시킴으로써 제조된다. 다음, 이종성인 이작용성 가교결합기(crosslinker)를 사용하여 추가적인 이중층 개질을 수행한 다음 (즉, 펩타이드의 접합), 프로토셀 용액을 목적하는 연구 농도(< 20 mg/mL)로 농축시킨다. 프로토셀과 이들 성분의 특성규명은 세공과 입자 구조를 정성적으로 평가하고 입자 직경과 분포를 가시적이고 통계적으로 정량하기 위하여 투과 전자 현미경(TEM), 수력학적 반경을 수득하기 위한 동적 광 산란(DLS), Brunauer-Emmett-Teller(BET) 표면적 및 Barret-Joyner-Halenda(BJH) 세공-크기 분포를 정량하기 위한 질소 흡수(NS), 콜로이드상 안정성 및 표면 하전을 평가하기 위한 제타 전위(ξ), 및 운반물-부하 용량을 평가하기 위한 흡광 또는 형광으로 구성되어 있다. 9-11프로토셀 코어에 대해 임의의 개질 수행 전 및 후에 전기 언급한 모든 단계를 수행한다. 리포좀과 프로토셀은 임의의 개질 전 및 후에 ξ-전위와 DLS만을 수행한다.
피부 준비 및 Franz 확산 장치:
피부 준비와 적절한 조작은 피부의 구조에 직접적으로 영향을 줄 수 있기 때문에 중요하다. 복부성형술로부터 수득한 전체 두께의 인간 피부는 지역 법력에 다라서 기증받았다. 피부 인수시, 이들을 이중백에 넣어 -20℃에서 <6 개월간 보관한다. 피부의 방벽 기능은 여러번의 동결-해동 사이클로 손상되지 않은채 유지되는 것으로 밝혀졌다. 58,59필요할 때, 동결된 피부를 30℃ 오븐에서 해동시키고 수술용 메스를 사용하여 피하 지방을 제거한 다음, 피부 샘플을 1-㎠ 조각으로 분할한다. 이어서 샘플을 DI H2O로 세정하고 SC면을 톡톡 두드려 건조시킨다. 일부 경우에는 SC를 제거하거나 분리시킬 필요가 있는데; 이는 각각 테이프 스트리핑 또는 효소적 조직 분해법을 사용하여 수행할 수 있다. 실험이 완결되었을 때, 피부 샘플을 0.5XPBS 10 mL로 세척하고 톡톡 두드려 건조시켜, 개별적으로 이중백에 넣어, 호일에 포장하고, 이를 분석할 수 있을 때까지 동결시켜야 한다. Linda Felton 교수의 연구실(Multidisciplinary Research Facility(MRF) houses a vertical에 위치)에서는 9개의 워터-재킷 확산 셀, 가열/냉각 순환기, 빌트인 교반판, 샘플링 포트가 장착되어 있으며 공여체 표면적이 0.64㎠이고, 용기 용적이 5.1 mL인 Franz 확산 장치를 개량하였다. 실험을 준비하기 위하여, 용기에 0.5XPBS (또는 일부의 다른 등장성 완충액)을 채우고 온도를 37℃로 맞춘다. 다음, 공기 방울이 형성되지 않도록 주의하면서 피부를 용기 위에 신장시키고, 공여체 캡을 자리에 꽉 잠그고 탈수를 방지하기 위하여 덮어둔다. 이어서 피부를 1시간 동안 평형시키고, 이후 용기 유체를 대체시켜 피부를 다시 30분간 다시 평형시킨다. 실험을 시작하기 전에, 400 ㎕의 용기 유체를 샘플링 포트로부터 제거하고 용기에 대한 0시간 블랭크가 유래될 수 있도록 보관한다. 원하는 시점에서 샘플링 포트로부터 400 ㎕ 샘플을 취한 다음, 400 ㎕의 확산 완충액을 다시 보충하여 일정한 용적을 유지하고 피부-유체 계면에서 공기 방울이 형성되는 것을 피한다.
스펙트럼형광측정법(spectrafluorimetry):
모든 경피적 프로토셀 확산 실험의 정량화는 FelixGX 소프트웨어, 2개의 PMT 검출기, 광학 필터, 및 4개의 큐벳을 수용할 수 있는 샘플 캐루젤(carousal)이 장착되어 있는 PTI QuantaMaster-40 스펙트럼 형광측정기를 사용하여 정량한다. 피부는 고도로 이종성이며 고도로 자가형광성이고, 이런 특징은 통상적으로 용기 유체로 전이된다. 이런 프로토콜은 이러한 이슈가 분석중에 고려될 수 있도록 개발된 것이다. 표준 곡선은 절반 희석액(half dilutions)을 사용하여 0.16 - 1.95X10-5 mg/mL의 농도 범위에 걸쳐 대조군 샘플(24-시간 시점)의 용기 유체로부터 만든다. 또한, 대조군으로부터 380 ㎕를 뽑아 큐벳에 넣어 블랭크로 제공한다. 상기 블랭크는 실험 기간 동안 캐루젤에 유지시켜, 3개의 샘플만을 그때 그때 분석하도록 한다. 표준물을 3회 수행하여, 평균을 내고 95% 신뢰구간으로 보고하며, log-log 스케일로 플로팅하여 선형 식을 얻는다. 모든 샘플은 통계적 관련성을 위하여 최소 3회 최대 9회 분석한다. 일단 모든 샘플을 분석하여 파일에 저장한 다음, 텍스트 파일로 전송하고, 엑셀 스프레드시트에 수동으로 입력한다. 모든 블랭크-값의 평균값을 평균을 내고 95% 신뢰구간으로 계산한다. 모든 시점에서 모든 샘플에 대해 평균 형광 강도(MFI)를 개별적으로 계산한다. 선형회귀분석법을 사용하여 미지의 농도를 계산한다. 8개의 샘플 각각에 대한 보정값은 모든 값을 표준 곡선으로 정규화하기 위하여 블랭크 MFI로/로부터 각각 0시간을 더하기/빼기를 통하여 결정된다. 이어서 상기 보정값을 각 시점에서의 MFI에 더하기/빼기하여 보정된 MFI를 수득한다. 각각의 MFI의 log를 취하여 표준 곡선으로부터 수득한 식을 사용하여 농도를 계산한다. 마지막으로, 각각의 0-시간 시점에 대해 계산된 농도 값을 모든 다른 시점으로부터 빼서 절대 농도를 수득한다. 모든 표준 곡선은 전체 농도 범위에 걸쳐서 다항식 추세에 따른다는 것에 유의하며; 선형 곡선을 수득하기 위해서는 관련 농도/강도만을 플로팅하고, 선형 추세선에 맞춘다 (R2 > 0.9300).
특별한 목적 1 - 시험관내 경피적 침투 운동역학에 영향을 주는 프로토셀의 지지된 지질 이중층(SLB)과 나노다공성 실리카-입자 코어의 변수의 조사 및 SLB가 코어로부터 해리될 경우의 결정.
이런 특별한 목적을 성취하기 위하여, 각각의 프로토셀의 생물물리학적 및 생화학적 특성의 체계적인 조작이 수행될 것이다. 먼저, SLB의 각각의 특성을 조사한 다음, 코어의 특성 각각에 대해 독립적으로 평가한다. 플럭스를 정량하기 위하여 스펙트럼형광측정법이 사용되며, 피부를 파라핀 왁스에 임베딩시켜 조직학적으로32 섹션을 나누어 이중-채널 CLSM23을 사용하여 영상화하여 피부로 분재되는 프로토셀을 정성적으로 평가한다. 이에 대해 CLSM이 불충분할 경우, TEM51 또는 다광자 현미경42(SNL-CINT)를 사용한다. SLB에 관한 실험의 경우, 모든 코어는 Alexa Fluor 633으로 형광적으로 표지시키고 에어로졸화를 통하여 합성하여 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 표적화된 프로토셀에 대해 최적화된 코어로 주형을 뜬다. 이들 입자는 ξ= -20 mV, 균일 BJH 세공 크기 = -2.5 nm, 입자 크기 분포 = 90±60, 및 BET 표면적 = 1000 g/㎡을 갖는다. 코어에 관한 실험의 경우, 최고의 전체 플러스를 발생시키는 것으로 결정된 SLB 제형을 사용하며 일정하게 유지한다. 마지막으로, 일단 SLB와 코어 특성이 최적화되면 SLB의 운명이 결정된다. 첫번째 세트의 실험은 중성적으로 하전된 인지질(DOPC, DPPC, 및 DSPC)만이전이온도/유동성을 기준으로 하여, 24시간의 과정에 걸쳐 최대의 전체적인 플럭스를 산출하는 것으로 확인된다. Van den Bergh 등은 유체 지질(Tm <37℃)은 더 깊게 피부로 확산되는 반면, 비-유체 지질(Tm >37℃)은 SC에 편재된 상태로 남아 있음을 밝혔다51. 그러나, 1차적인 결과는 온도-의존적 FRAP에 의해 확인되는 바와 같이, 프로토셀의 혁신적인 특성이 코어에 의해 부여된 나노다공성과 SLB 지질의 겉보기 전이 온도에서의 상응하는 감소로 인하여 지지체 SLB 유동성과 안정성을 동시에 증진시킨다는 발견을 지지한다. 이런 특성은 겉보기 Tm이 41℃에서 37℃로 감소되는 DPPC의 경우에 특히 흥미롭다.9 DPPC 프로토셀에 대한 플럭스가 DOPC와 DSPC 프로토셀의 것들 사이로 떨어질 경우, 후속되는 프로토셀의 기본 조성은 유체 및 비-유체 SLBs를 갖는 프로토셀을 비교하기 위하여 DOPC와 DSPC만을 사용하는데, 이는 그러한 결과가 리포좀 문헌의 것과 일치하기 때문이다. 그러나, SLB-코어 상호반응으로 인하여 DPPC 프로토셀의 전체적인 플럭스가 상기 범위를 벗어날 경우, 3종의 기본 조성을 모두 후속되는 실험에 사용하여 이들 상호반응의 효과를 추가로 조사한다. 두번째 실험은 24시간의 과정에 걸쳐 전체적인 플럭스에 대한 콜레스테롤, 콜레스테롤-술페이트, 및 세라마이드의 효과를 조사하는 것이다. SC는 콜레스테롤, 콜레스테롤 술페이트, 지방산, 및 세라마이드로 이루어져 있다.1,33,60,61 그러므로, 피부에서의 프로토셀의 용해도를 증가시키고자 할 경우 이들 SC 지질을 SLB에 내포시켜 수행하여 침투에 대한 임의의 효과를 설명한다. 이들 지질 각각의 효과는 독립적으로 및 집합적으로 연구한다. 예비결과는 PEG-2000이 플럭스에 대해 커다란 효과를 갖는 것을 증명한다. 추가로, PEG-400은 수많은 상업적으로 입수가능한 국소적 및 경피적 약물 제형에서 통상의 침투 증진제이다.62-64 최적의 PEG 제형을 결정하기 위하여 PEG-2000의 농도를 먼저 변화시키고; 이어서 PEG 농도를 일정하게 하고 PEG 길이를 변화시킨다. 네번째 세트의 실험은 상기 최적화된 SLB를 아르기닌-풍부 펩타이드(즉, R8)로 개질시키는 것이다. 아르기닌-풍부 펩타이드는 세포의 내재화를 증가시키는 한편,65 헵타-아르기닌 펩타이드를 사이클로스포린-A에 접합시키면 경피적 운동역학을 증진시키는 것으로 증명되었다.28 다음 과제는 코어 특성이 경피적 운동역학에 어떻게 영향을 주는지 측정하는 것이다. SLB 제형을 일정하게 유지하면서, 코어 크기와 표면 작용성화의 효과를 측정한다. Alvarez-Roman 등은 폴리스티렌 비드가 크기-의존적 방식으로 피부의 상이한 위치에 우선적으로 축적된다는 것을 증명하였다.23 추가로, Rancan 등은 메조다공성 스토버 실리카 입자가 피부 세포에 의해 흡수되어 개질된 SC를 갖는 피부를 통하여 확산되며, 이들 둘다 크기-의존적 방식임을 밝혔다.66 Verma 등은 변형시킬 수 있으며, 직경이 120 nm인 리포좀의 현격하게 증진된 침투를 보고하였는데, 직경이 70 nm인 리포좀을 사용하였을 때 최고로 증진되었다.20 이러한 연구는 경피적 운동역학에 있어서 화학적 및 물리적 표면 특성 외에 입자 크기의 중요성을 설명한다. 에어로졸-보조된 EISA에 의해 생성된 광범위한 분산 외에, 콜로이드상 합성법을 사용하여 3개의 단분산 크기의 입자(30 nm, 100 nm, 및 200 nm)를 합성하여 특성을 규명한다. 여섯번째 세트의 실험은 코어 작용성화/코어 전하의 효과를 조사하는 것이다. 개질되지 않은 실리카는 강력하게 네가티브인 ξ-전위(-40 내지 -15 mV)를 가지며 ξ-전위를 변경시키기 위하여 작용성화시킨다.56 최적의 코어 크기를 사용하여, 입자가 강력하게 포지티브인 전하(>10 mV)를 갖도록 작용성화하거나 소수성이 부여되도록 메틸화시킨다. 일곱번째 세트의 실험은 SLB를 형광적으로 표지시키고 SLB의 운명을 결정하기 위한 형광 공-편재화 실험을 수행하는 것이다. 마지막으로, 최적화된 경피-PC를 사용하여, 시간-의존적 플럭스를 측정한다.
특별한 목적 2 - SLB 제형, 조성, 및 작용성화에 경피적 운동역학에 영향을 주는 메카니즘의 설명.
Fick의 1차 확산 법칙의 단순 반복은 용기(CR)와 공여체(CD) 사이의 농도차와 SC의 두께를 기본으로 한 SC 투과도(P)에 경피적 플럭스(J)를 연관시켜1,17, 전체적인 플럭스와 투과도에서의 변화를 통하여, 프로토셀 SLB 제형간을 직접 상관시킨다. 그러나, 투과도 계수는 실험 데이타로부터 계산하며, 플럭스와 투과도의 실험적 측정은 경피적 확산의 운동역학에 대한 정보만을 드러낼 뿐, 투과 증진의 메카니즘에 대해서는 아무것도 제시하지 못하며17,30, 투과 증진 메카니즘은 경피-PC 운반물 전달에 대해 이해하는데 있어서 중요한 변수이다. 약학에서 SC 투과의 특성을 규명하기 위한 표준 방법은 DSC를 통한 SC 지질의 TM에서의 감소량 분석을 통한 것이다.17,26,29-32,35 인간의 SC 지질과 전형적으로 관련있는 TM 피크는 3개가 있다.32-39 75℃에서의 첫번째 것은 라멜라에서 무질서한 상태로 변하는 지질 구조에서의 변화로 인한 것이며, 90℃는 겔에서 액체 상태로 단백질-관련 지질이 전이되는 것과 관련있으며, 120℃는 단백질-관련 지질이 변성되었음을 나타내는 것이다. 여러가지 투과 증진제로 처리한 SC 샘플에서는, TM에서의 큰 감소와 감소된 피크 강도가 집중적으로 보고되었다.32 그러나, DSC만이 SC 거대구조에 대한 정보를 제공하며, 따라서 추가적인 특성규명을 위해서는 SLB가 어떻게 투과를 증진시키는지 완전히 연구할 필요가 있다. XRD는 소재 과학 특성규명 기술로 고정된 각도로부터 ㅌ-선 산란 패턴을 기본으로 하여 결정 구조에 대한 정보를 제공한다. Kim 등과 수많은 다른이들은 이전에 SC의 구조를 특성화하기 위하여 작은- 및 광각 XRD를 사용하였다.26,32,33 작은-각 XRD의 경우, 피크 2개는 세라마이드(d=6.13 nm)와 결정성 콜레스테롤(d=3.38 nm)로 인한 산란과 관련있다. 광각 XRD의 경우, 16.7Å에서의 피크는 결정성 콜레스테롤과 관련있다.32 SC 지질 신장과 관련된 탄소-수소 및 탄소-산소 신장 빈도 (2850/cm & 2920/cm)에서의 변화량과 SC 케라틴 분자의 구조에서의 변화량(1650/cm)을 측정함으로써 SC 구조에서의 변화량을 특성화하기 위하여 FTIR 분광학을 또한 사용할 수 있다.32,35,67 수행할 마지막 방법은 조직학/현미경이다. SC 구조에서의 거시적 변화량을 조사하기 위하여 표준 H&E 착색법을 사용하며, 피부에서의 입자 분포를 정성저긍로 평가하기 위해서는 형광 현미경을 사용한다. 이런 특별한 목적에 있어서 가장 큰 도전은 SC 구조를 손상시키지 않고 DSC, XRD, 및 FTIR용 SC 샘플을 분리시키는 것이다. 일단 분리가 완결되면, 특별한 목적 1에서 생성된 피부 샘플을 특성화하여 각각의 SLB 제형이 SC의 구조를 어떻게 변경시키는지 상관시킨다.
특별한 목적 3 - 경피적 확산에 유리하거나 불리한 물리적 및 화학적 특성을 갖는 약물인, 니코틴과 이부프로펜을 사용하여 경피-PC의 운반 효과를 시험관내로 평가함.
니코틴 패치는 국내에서 가장 통상적으로 사용되는 경피용 패치 중 하나이다. 니코틴의 화학적 및 물리적 특성(Ko/w=15.85, H2O에 혼화성, 162.234 Da, Tm = -7.9℃)은 경피적 운반용에 이상적으로 만든다. 한편, 이부프로펜의 화학적 및 물리적 특성은 다음과 같다: Ko/w=9332.54, H2O에 불용성, 206.28 Da, Tm = 74-77℃. 이의 불량한 용해도와 특히 친유성인 Ko/w에 의해 증명되는 바와 같이, 이의 경피적 운동역학은 SC중에 우선적으로 분배되기 때문에 형편없이 좋지 못하며 더 깊은 조직중으로 확산되지 않는다.17 첫번째 실험은 최적화된 코어 입자를 사용하여 부하한 다음 최적화된 SLB를 경피적 운반을 위하여 융합시킴으로써 두 약물에 대한 부하 능력을 측정하는 것이다. 부하 능력 및 약물 방출 운동역한은 UV 현미경을 사용하여 측정한다. 추가로, 프로토셀이 약물의 겉보기 화학적 행동을 어떻게 차폐시키는지 평가하기 위하여 이부프로펜 부하된-코어의 수성 용해도와 Ko/w를 측정할 필요가 있다. 두번째 실험은 유리 약물로서 니코틴과 이부프로펜을 프로토셀을 사용하여 경피적으로 운반하는 것이다. 이어서 프로토셀을 사용한 경피적 운반 효과를 측정하고 피부에서의 프로토셀 약물 방출 프로필을 규명하기 위하여 HPLC를 사용하여 약물 플럭스를 계산한다.58,59 마지막 실험은 화학적 및 물리적 특성이 상이한 약물의 조합물을 운반할 수 있는지에 대해 측정하는 것이다. 이는 이들 2종의 약물을 프로토셀 코어에 상이한 비율로 부하함으로써 수행된다. 나노입자를 사용하여 피부를 통해, 상이한 경피적 행동에 유리하도록, 맞추어진 약물 조합물을 운반하는 능력은 혁신이지만 아직 증명되지 않았다. 잠재적으로 문제가 되는 이슈는 대부분의 HPLC 컬럼이 실리카 비드를 사용하며, 따라서 HPLC 분석전에 입자가 용해되도록 샘플 pH를 적정해야만 한다는 것이다.
특별한 목적 4 - NU/NU 누드 마우스 모델을 사용하여 니코틴 또는 이부프로펜이 부하된 경피적 PCs의 기본적인 약리학적 특성을 생체내 측정
상기 마우스 모델은 모발이 없으며, 흉선이 없으므로 작용성 적응 면역 시스템이 결여되어 있지만, 이들은 작용성 NK 선천성 면역 시스템을 갖고 있어, 연구에 잘 맞는다. 이들 주요 생체내 연구에서, 본 발명자들은 누출과 수분 증발을 방지하기 위하여 밴드 에이드를 사용하여 경피-PCs를 국소적으로 투여할 것이다. 적용시킨 후 본 발명자들은 니코틴과 이부프로펜의 혈청 수준을 시간의 함수로 모니터하여, 경피-PCs의 생물분포, 약물동태학, 및 경피-PCs의 배출을 평가할 것이다. 또한, 본 발명자들은 자극 또는 손상에 대한 징후에 대해 피부를 조사할 것이다. 분석은 HPLC, 형광 스펙트럼 영상화, 조직학, 및 ICP-MS를 사용하여 수행될 것이다.
실시예 5에 대한 참고문헌
참고문헌 및 인용된 참고문헌
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실시예 6
신흥 바이러스 병원균의 치료를 위한 모듈형 나노입자 플랫폼
1. 개요/초록
1.1 문제 설정:
항-바이러스 약물은 신흥 바이러스 및 조작된 바이러스에 의해 유발된 감염증을 포함한, 바이러스성 감염증을 효과적으로 치료하기 위하여 반드시, 전형적으로 다량의, 빈번한 투여량으로 투여되어야 한다. 그러나, 높은 투여량은 숙주에게 독성 부작용을 유발할 수 있으며, 부적절하게 흡수되었을 경우, 약물 내성 병원균의 발달을 가속시킬 수 있다. 그러므로, 치료의 횟수, 빈도, 지속기간, 및 투여량을 감소시키고, 현재의 한계를 넘어서는 치료를 지연시키며, 질병의 재발을 방지하기 위해서는 생체적합성 나노입자 운반 비히클을 개발할 필요가 있다. 그러나, 리포좀과 폴리머성 나노입자를 포함한, 최신 기술의 나노운반체(nanocarriers)는 낮은 용량, 불량한 안정성, 및 표적 세포에 의해 최소의 흡수라는 문제점을 안고 있다. 이런 제안은 '프로토셀'이라 명명된, 모듈형의, 적응성이 높은 나노운반체를 디자인함으로써 이러한 단점들에 맞추어 추구하게 되었으며, 상기 '프로토셀'은 리포좀과 메조다공성 실리카 나노입자의 장점을 시너지적으로 합한 것이다.
1.2.
프로토셀은 지지된 지질 이중층내에 감싸여있는 메조다공성 실리카 나노입자로 이루어져 있으며 화학적으로 별개의 치료제 및 진단제에 대해 극단적으로 높은 부하 용량(비교되는 리포좀보다 >1000배 더 높다), 복합 생물학적 유체중에서의 장기간의 안정성, 및 낮은 리간드 밀도에서 표적 세포에 대한 서브-나노몰의 친화도를 동시에 나타낸다. 부하량, 방출성, 안정성, 및 표적화 특이성을 정밀하게 제어할 수 있는 우리의 능력, 뿐만 아니라 입자 크기, 형태, 전하, 및 표면 개질(들)을 조작할 수 있는 우리의 능력은 우리가 투여량과 표적이탈(off-target) 효과를 급진적으로 감소시키고, 면역원성을 완화시키며, 생체적합성 및 생물분해성을 최대화하고, 생물분포 및 지속성을 제어할 수 있도록 한다. 본 발명자들이 Nature Materials의 2011년 5월 커버 논문8에 보고한 바와 같이, 이들의 독특한 생물물리학적 특성으로 인하여, 현재 기술의 리포좀보다 인간의 간암 치료에 있어서 100만배 이상 더 효과적이다. 이런 제안에서, 본 발명자들은 프로토셀의 용도를 잠재적 생물위협과 상관성을 갖는 신흥 바이러스까지 확장시키고자 하며 전통적인 항바이러스제 및 신규 항바이러스제와 함께 부하되며 잠재적 숙주 세포 및 이미 감염된 세포 둘다에 대해 표적화된 프로토셀의 예방 및 진단적 잠재성을 평가하고자 한다.
2. 실험 방식
2.1 기술적 방식:
출입, 융합, 복제, 또는 출아(budding) 과정1을 억제하는 소분자 약물, 더욱 최근에는, 특정 바이러스 유전자, 또는 숙주에 의해 내성화된 경우, 바이러스 출입에 대한 세포 수용체(들)의 발현2-3을 사일런싱하는 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 치료적 핵산을 사용하여 바이러스 감염증을 치료한다. 그러나, 많은 항바이러스제는 (1) 과민성 및 알레르기 반응, 뿐만 아니라 다양한 기타 유해한 부작용; (2) 약물 내성 병원균 유행의 증가 및 조작된 내성에 대한 잠재성; 및 (3) 감염 부위에서의 충분한 축적을 촉진하기 위하여 대량의 투여량과 빈번한 투여(이는, 차례차례, 불량한 생체이용성, 신속한 소거, 제한된 용해도, 불완전한 흡수, 및 표적이탈 축적에 의해 유발된다)를 해야 할 필요성4을 포함한, 이들의 효과를 제한하는 과다한 단점을 갖고 있다. 표적이탈 효과를 감소시키기 위하여 치료적 siRNAs를 디자일 할 수 있지만 혈청에서의 제한된 안정성, 짧은 반감기, 조직 및 세포로의 불량한 침투성을 갖고 있으며, 선천적 면역 반응5을 유도한다. 따라서, 전통적인 항바이러스제 및 신규한 항바이러스제의 약물동력학 및 약력학을 개선할 수 있는 생체적합한 나노입자 운반 시스템('나노운반체(nanocarriers')에 대한 필요성이 있다. 리포좀, 폴리머성 나노입자, 덴드리머, 탄소 나노튜브, 및 다공성, 무기 나노입자를 포함한, 수많은 나노운반체가 다양한 생체내 진단 및 치료적 용도로 개발되었다6. 생체적합성의 향상, 순환 시간의 증가, 면역원성의 감소, 및 표적이탈 상호반응의 최소화에 대해서는 실질적인 발전이 있었지만, 최신 기술의 나노운반체의 치료적 효과는 여전히 낮은 부하 용량, 불량한 표적화 특이성, 및 생리학적 조건하에서의 제한된 안정성에 의해 제한된다. 이를 목표로, 본 발명자들은 2종의 전망밝은 나노입자 운반 비히클: 리포좀과 메조다공성 실리카 나노입자(MSNPs)의 장점을 시너지적으로 합한, 메조다공성 실리카 나노입자-지지된 지질 이중층('프로토셀')7-9을 개발하였다.
프로토셀은 리포좀과 메조다공성 실리카 나노입자의 장점을 합한 것이다.
프로토셀(도 1X6 참조)은 지지된 지질 이중층(SLB)내에 싸여있는 구형 MSNP 코어로 이루어져 있다. MSMPs는 표면적이 극히 높으며(>1200 ㎡/g) 따라서, 이들을 당해 운반물(들)의 용액에 단순히 담금으로써 고농도의 다양한 치료 및 진단제와 함께 부하될 수 있다. 또한, MSMPs를 합성하는데 사용되는 에어로졸-보조식 증발-유도 자가-조립(EISA) 공법10이 광범위한 구조-지시 계면활성제 및 생성된 입자의 합성후 가공에 적합하기 때문에, 세공 크기가 2.5 nm에서 25 nm까지 변화될 수 있으며, 세공 벽도 양이온성 또는 소수성 실란으로 개질될 수 있이며, 이들 둘다 소분자 약물(산성, 염기성, 및 소수성) 및 약물 칵테일, siRNAs, 단백질, 및 작은 헤어핀 RNAs(shRNA)를 암호화하는 DNA 벡터, 뿐만 아니라 경우에 따라, 양자점(quantum dots) 및 산화철 나노입자와 같은 진단제를 포함한, 여러가지 화학적으로 별개인 운반물의 캡슐화가 용이하도록 한다. 본 발명자들은 프로토셀이 소분자 약물의 경우 50 중량% 이하의 부하 용량을 가지며, 이는 MSNP-기본 운반 비히클11보다 5배, 및 유사한 크기의 리포좀8보다는 1000배 더 높은 것이다. 코어의 실리카 압축정도를 제어함으로써 방출 속도를 조절할 수 있으며, 따라서, 이의 생리학적 조건하에서의 용해 속도를 조절할 수 있고; 열적 하소에 의해 압축을 최대화하여 지연된 방출 프로필(2주 이하 동안 일일 7 내지 10% 방출)을 갖는 입자를 생성시킬 수 있는 한편, 계면활성제를 추출하기 위하여 산성화된 에탄올을 사용하게 되면 입자 용해도가 증진되어 캡슐화된 약물의 급작스러운 방출이 발생하게 된다 (12시간내에 100% 방출). 운반물-부하된 MSMPs에 리포좀을 융합시키면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 표적화 리간드와 같은, 작용성 분자의 디스플레이를 위한, 안정하고, 유체인, 생체적합성 계면을 제공하는 접착성 SLB가 형성된다. 본 발명자들은 프로토셀이 복합 생물학적 유체(예를 들면, 완전 성장 배지 및 혈액)중에 분산되었을 때, SLB가 체온에서 유체이든 비-유체이든 상관없이, 소분자 약물을 4주까지 안정하게 캡슐화하며; 대조적으로, 리포좀은 이들의 이중층이 높은 패킹 밀도를 갖는 완전 포화 지질로 이루어진 경우라도 이들의 캡슐화된 약물을 신속하게 누출시키며, 따라서, 이중층을 통과하는 약물의 확안을 제한해야함을 증명하였다8. 유체인, 아직도 안정한 SLB는 본 발명자들이 낮은 리간드 밀도에서 높은 표적화 특이정을 정교하게 달성할 수 있도록 하여, 면역원성과 비-특이적 상호반응을 감소시킨다; 본 발명자들은 입자당 평균 딱 5개의 표적화 펩타이드로 개질된 프로토셀은 SLB가 유체, 쯔비터이온성 지질, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)로 이루어져 있을 때 비-표적 세포에 대해서보다 표적 세포에 대한 친화도가 10,000배 더 높다는 것을 밝힌바 있다.8 또한, 본 발명자들은 내포작용과 엔도좀 탈출을 개시하는 펩타이드를 프로토셀 SLB상에 내포시키면 캡슐화된 운반물이 세포질에 분산되도록 하며, 운반물 분자를 표적화 잔기, 예로서 핵 위치 서열(NLS)로 개질시킴으로써, 본 발명자들이 특정 기관내에 운반물을 세포내 축적시킬 수 있음을 밝힌 바 있다.8 별개의 운반물에 대한 이들의 높은 용량, 낮은 리간드 밀도에서의 높은 표적화 특이성, 및 장기간의 이중층 안정성으로 인하여, 화학치료 약물의 칵테일이 부하되고 인간의 간암에 표적화된 프로토셀은 필적하는 리포좀보다 100만배 더 효과적이다.8 제안된 R&D에서, 본 발명자들은 세포내 병원균에 감염된 세포에 치료제를 표적화 운반하기 위하여 프로토셀을 조작할 것이며 유리 약물 및 약물-부하된 리포좀과 유사하거나 이보다 탁월한 치료 효과를 실현하는 것이 목표이다.
가요성인, 모듈형 특성의 프로토셀은 다양한 생체내 시도가 실현될 수 있도록 한다.
항바이러스제가 잠재적이거나 이미 감염된 숙주세포내에 축적되는 것을 촉진하기 위해서는, 프로토셀이 반드시: (1) 숙주에게 독성을 일으키지 않고 충분한 기간 동안 순환에서 존속되어야하며; (2) 표적 조직(들)내에 축적되어야하고; (3) 표적 세포(들)에 선택적으로 결합하여 내재화되어야하며; (4) 이들의 캡슐화된 약물을 필수적인 운동역학으로 적합한 세포내 성분(들)내에 방출시켜야하고; (5) 용이하게 배출될 수 있는 생체적합성 모노머로 분해되어야 한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 표적화 리간드를 낮은 밀도로 사용하여 개질시킨 페길레이트된 프로토셀은 표적 세포에 용이하게 결합하여 이에 의해 내재화되어 엔도좀 산성화로 SLB를 불안정하게 만들어, 코어를 노출시키고 캡슐화된 약물을 서방출 또는 버스트 방출(burst release)(상기 단계 3 및 4)시킬때 까지 약물을 캡슐화시킨다는 것을 밝혔다.8 제안된 R&D 기간중에, 본 발명자들은 바이러스-감염된 세포에 대해 표적화되어 있으며 하기 기재되는 바와 같은 항바이러스제와 함께 부하되어 있는 프로토셀의 시험관내 성능을 다시 평가하지만 마우스와 조류의 배야 모델에서 프로토셀의 생체분포, 생체적합성, 및 생분해성의 특성도 규명할 것이다 (상기 단계 1, 2, 및 5). 본 발명자들의 1차적인 생체내 연구로 프로토셀의 생체적합성이 높으며 표적 조직내에 광범위하게 분포되고 지속될 수 있도록 조작할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 도 2AX6에 나타낸 바와 같이, 200 mg/kg 투여량의 페길레이트된 프로토셀을 3주간 매주 3회씩 주사한 Balb/c 마우스는 독성이 증가하거나 체중이 소실되는 징추를 나타내지 않았으며; 이들의 높은 부하 용량을 고려할 때, 이런 결과는 프로토셀이 적어도 900 mg/kg의 소분자 약물을 버스트방출 또는 서방출 운동학으로 운반할 수 있음을 나타낸다. 또한, 도 2BX6에 의해 증명되는 바와 같이, 직경이 20 내지 200 nm인, 페길레이트된 프로토셀은 200 mg/kg의 투여량으로 Balb/c 마우스에게 주사시 48시간 동안 광범위하게 분포된 상태를 유지하였는데, 이는 표적 조직내에 표적화된 프로토셀이 축적되기에 충분한 시간을 제공한다. 본 발명자들은 또한 크기와 표면 개질(들)을 제어함으로써, 본 발명자들이 각각, 급성 림프구성 백혈병 및 간세포 암종 치료 동안 Balb/c 및 Nu/Nu 마우스의 뼈와 간내에 프로토셀의 축적을 촉진할 수 있으며, 화학치료제인 독소루비신의 치료적 관련 투여량과 함께 부하된 경우에도, 각각 기관 중량 및 병리학에 의해 측정한 바(비공개 데이타), 독성의 증가 또는 조직학적 독성의 징후 없이 4주 동안 표적 조직에 지속됨을 알아냈다. 추가로, UCLS Center for Environmental Implication of Nanotechnology에서 우리 동료들은 MSNPs가 생분해성이며 궁극적으로는 오줌과 변에 실릭산으로 배출됨을 알아냈다.12 마지막으로, 본 발명자들은 고밀도(10 중량%까지)의, 길이가 7 내지 12개 아미노산인 펩타이드로 개질된 프로토셀은 C57B1/6 마우스에서 400 mg/kg의 총 투여량으로 주사시 IgG나 IgM 반응을 하나도 유발하지 않음을 알아냈다(비공개 데이타). 특정 용도에 요구되는 생체분포에 따라, 본 발명자들은 MSNP 크기와 형태(구형, 디스크형, 및 막대형13) 및 SLB 전하와 표면 개질(들)을 제어하여, 프로토셀을 고도로 모듈형의, 가요성 나노입자 운반 시스템으로 만들 수 있다.
항바이러스제가 부하되며 미감염 및 감염된 숙주 세포에 대해 표적화된 프로토셀의 합성.
상기 제안된 R&D에서, 본 발명자들은 siRNA와 소분자 항바이러스제를 Nipah 바이러스(NiV), BSL-4 파라믹소바이러스에 감염된 세포로 표적 운반하기 위한 프로토셀을 조작할 것이며 이들 바이러스에 대해 승인된 백신이나 효과적인 치료제는 존재하지 않으며, 궁극적인 목표는 치료 횟수, 빈도, 기간, 및 투여량을 최소화하고, 현재의 제한치를 넘는 치료를 지연시키며, 유리 약물 또는 리포좀 약물로 성취할 수 있는 것과 비교하여 질병의 재발을 방지하는 것이다. 본 발명자들은 모델 신흥 바이러스로서 NiV를 선택하였는데 이는 이의 잘-특성화된 구조와 세포지향성(cellular tropism), 뿐만 아니라 생물위협(biothreat)으로서 이의 연관성때문이다.14 본 발명자들은 이전에 siRNA를 표적 세포의 세포질로 운반하는데 있어서 프로토셀의 용도를 보고한 바 있다; 그러나, 이들 연구에서 우리가 사용한 MSNPs는 유중수 유화 기술15을 사용하여 합성한 것으로, 이 기술은 입자 크기, 크기 분포, 및 수을에 있어서 배치-대-배치 변화가 높은 단점이 있다. 그러므로, 본 발명자들은 에어로졸-보조식 EISA 공법을 채택하여 시작하는데, 이 공법은 다량의 입자를 재현가능한 특성으로 생산할 수 있어, siRNA의 캡슐화 및 운반에 적합한 MSNPs를 생성시킬 수 있도록 한다. 이들 MSNPs는 네가티브-하전된 siRNA(13-15 kDa)를 수용하기에 충분히 큰, 포지티브-하전된 세공을 가져야하며 간과 비장에서의 축적을 최소화하고 세망내피계(RES)의 단핵구/대식세포에 의한 흡수를 감소시키기 위해서는 <200-nm이어야 하며; 표면적과 세공 연결성을 최대화하는 것이 또한 부하 용량을 최대화하는데 있어서 중요하다. 이러한 특성을 갖는 입자를 생성시키기 위하여, 본 발명자들은 2가지 합성 전략을 조사할 것이다. 첫번째 전략에서, 본 발명자들은 2성분 계면활성제 시스템을 사용하여 단일상 입자를 생성시키는데; 구체적으로, 본 발명자들은 거대 기공-형성 계면활성제, 예로서 Fluronic®F127을, 높은 정도의 연결성을 갖는 고표면적 메조상을 통상적으로 형성시키는 계면활성제, 예로서 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)와 함께 사용할 것이다. 우리가 안정한, 이들 계면활성제의 3중상 혼합물을 시릴카 전구체 졸중에 형성시킬 수 있다면, >5-nm 세공을 갖는 입자를 생성시킬 수 있어야 한다. 두번째 전략에서, 우리는 거대 기공-형성 계면활성제(예를 들면, F127)를 벤조산과 중합시켜 안정한, 벌레와 유사한 메조상을 미리 형성시키코; 이후 이런 하이브리드 계면활성제를 실리카 전구체 졸에, 폴리머성 팽윤제(예를 들면, 폴리프로필렌 글리콜)과 함께 가하여 크기가 20-nm 이하인 표면-접근성 세공을 수득한다. 일단 세공 크기와 기하학을 최적화시킨 다음, 본 발명자들은 입자를 아민화된 실란, 예로서 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTES)와 반응시켜, 세공 구조에 최소의 영향을 주는 입자의 제타 전위를 극적으로 증가시킨다. 마지막으로, 본 발명자들은 입자 크기와 크기 분포를 감소시키기 위하여, 에어로졸-보조식 EISA 공법을 개량하기 위한 방법을 조사하는데, 이 공법은 통상적으로 입자의 분포를 광범위하게 만들며 (50-nm에서 >1 ㎛까지); 전구체 졸을 에탄올로 희석시키거나 이를 에어로졸화시키기전에 가열함으로써 전구체 졸의 점도를 감소시키면 생성된 입자의 분포는 <200-nm로 이동되어야 한다. 모든 MSNPs의 크기와 크기 분포, 제타 전위, 표면적, 및 세공 크기 분포는 동적 광산란법(DLS), 전자 현미경, 및 질소 흡수법을 사용하여 특성규명할 것이다. 일단 본 발명자들이 적합한 특성을 갖는 MSNPs를 발생시킨 다음, 본 발명자들은 이전에 보고된 기술7을 사용하여 이들의 siRNA 부하 용량과 pH-의존적 방출 속도를 시험할 것이다; 비록 본 발명자들이 처음에 버스트방출할 수 있는 입자를 사용하더라도, 본 발명자들은 하기 설명되는 체외(ex ovo) 연구 결과에 따라서 방출 속도를 채택할 것이다. 이후, 본 발명자들은 65 중량%의 DOPC, 5 중량%의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 및 30 중량%의 콜레스테롤로 이루어진 리포좀을 siRNA-부하된 코어에 융합시키고 생성된 SLB를 단일쇄 항체 단편(scFvs) 또는 펩타이드(접합을 용이하도록 C-말단 시스테인 잔기를 사용하여 합성)로, 상업적으로-입수가능한 가교결합기(이는 DOPE중의 1급 아민 잔기 및 시스테인중의 술프하이드릴 잔기와 반응한다)를 사용하여 개질시킨다. 본 발명자들은 또한 SLB를 10 중량%의 PEG-2000을 사용하여 개질시키는데, PEG-2000은 생체내에서 혈청 단백질이 나노운반체 표면에 흡착되는 것을 감소시키고 RES6에 의한 흡수를 최소화하는 것으로 밝혀졌으며, 개질시킨 후 질량 분광측정법을 사용하여 평균 리간드 및 PEG 밀도를 특성화한다. 도 1X6에는 우리가 개발하도록 제안한 프로토셀의 도식이 나타나 있다.
표적화된, 약물-부하된 프로토셀의 결합, 내재화, 및 운반물 운반 특성의 시험관내 최적화.
본 발명자들은 인간의 에프린 B2를 발현하도록 형질감염된 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포에 대해 패닝시키고 부모 CHO 세포와 인간의 에프린 B1을 발현하도록 형질감염된 CHO 세포에 대해 공제식 패닝을 수행함으로써, NiV에 대한 출입 수용체인, 에프린 B2에 결합하는 펩타이드를 확인하기 위하여, 파아지 디스플레이를 사용하였다. 선택 단계를 5회전 수행한 후, 우세한 서열이 7-합체, TGAILHP(서열 확인 번호: 18)이었으며, 효소-연결된 면역흡수체 분석법에 의해 측정한 바(비공개 데이타), 이는 몇몇 에프린 B2-포지티브 세포주에 매우 잘 결합한다. 본 발명자들은 유세포측정법 또는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 다양한 에프린 B2-포지티브 및 네가티브 셀에 대해 고밀도 및 저밀도의 TGAILHP 펩타이드로 개질된 프로토셀의 해리 상수(Kd)를 측정하여 이들 값을 에프린 B2-특이적 scFv를 나타내는 프로토셀의 친화도와 비교한다7; 10 중량% 이하의 헵타펩타이드로 개질된 프로토콜이 비-면역원성이라는 것을 고려할 때, 표적화 펩타이드가 scFv보다 바람직하다. 본 발명자들은 또한 숙주 세포(즉, 에프린 B2를 발현시키는 세포) 및 감염된 세포(즉, 초기 연구에서 NiV-G를 발현시키도록 형질감염된 세포) 둘다를 표적화하기 위하여, 프로토셀을 NiV 부착 당단백질(G)에 결합하는 scFv로 개질시키는데18, 이 당단백질은 감염된 세포의 표면에서 발현된다. 에프린 B2 또는 NiV-G에 결합하는 리간드가 목적하는 친화도를 성취하기에 불충분할 경우, 본 발명자들은 추가의 리간드를 확인하기 위하여 파아지 디스플레이를 수행할 것이다. 이후, 본 발명자들은 펩타이드 및 scFv-표적화된 프로토셀이 표적 세포에 의해 내재화되었는지 결정하기 위하여, 내재화되었을 경우, 이들의 세포내 원기(들)를 평가하기 위하여 공초점 형광 현미경을 사용할 것이다. 표적화 리간드가 자연적으로 내재화를 개시하지 않을 경우, 우리는 고밀도로 나노입자상에 디스플레이될 때 대음세포작용(macropinocytosis) 및 매크로피노좀(macropinosome) 탈출 둘다 개시시키는 것으로 알려진 펩타이드(옥타아르기닌, 또는 R8)로 SLB를 추가로 개질시킬 것이다.19-20 siRNA-부하된 프로토셀의 치료적 효과를 평가하기 위하여, 우리는 먼저 근적외선 형광 리포터 단백질(mKATE), NiV 뉴클레오캡시드 단백질(N), 및 NiV 매트릭스 단백질(M)에 대해 특이적인 siRNAs를 디자인하여 검증할 것이다. 이후, 우리는 실시간 PCR을 사용하여 (1) mKATE를 암호화하는 NiV-G/F 슈도타입의 수포성 구내염 바이러스(NiVpp18)로 미리 감염시켜 mKATE-특이적인 siRNA(s)가 부하된 에프린 B2-표적화된 프로토셀에 노출시킨, Vero 및/또는 인간 배아 신장(HEK) 세포; (2) NiV-N 및 NiV-M으로 미리-형질감염시키고 NiV-N 및 M-특이적 siRNA(s)가 부하된 에프린 B2-표적된 프로토셀에 노출시킨 Vero 및/또는 HEK 세포; 및 (3) mKATE와 NiV-G의 표면 발현을 둘다 암호화하는 NiVpp로 미리-감염시켜 mKATE-특이적 siRNA가 부하된 G-표적화된 프로토셀에 노출시킨, Vero 및/또는 HEK 세포에서의 발현 수준을 측정한다. 동시에, 살아있는 NiV에 대한 검증을 위하여, 우리는 University of Texas Medical Branch(UTMB)의 A. Freiberg에게 NiV-N 및 NiV-M siRNAs를 제공할 것이다; 만약 N 또는 M-특이적 siRNA(s)가 시험관내에서 바이러스 복제를 억제할 경우, 우리는 siRNA-부하된, 에프린 B2-표적화된 프로토셀의 효과도 시험할 것이다. siRNA가 지연된 기간 동안(>72시간) 표적 유전자를 사일런싱시키기에 불충분할 경우, 우리는 mKATE, NiV-N, 및/또는 NiV-M에 대해 특이적인 shRNA(s)를 암호화하는 미니서클 DNA 벡터(들)21를 디자인하고, 부하하여 운반할 것이다. 우리는 또한 채널로도스핀22과 다른 광-개폐식 이온 채널이 소분자 항-바이러스제의 전달용으로 조작되어 프로토셀 SLB내에 내포되어 트리거된 운반이 가능할 수 있을지에 대해 결정할 것이다.
프로토셀의 생체내 치료적 잠재성을 평가하기 위하여 조류의 배아를 사용한다.
일단 본 발명자들이 펩타이드 또는 scFv-표적화된 프로토셀의 시험관내 결합, 내재화, 및 운반물 운반 특성을 최적화한 후, 우리는 생체내 치료적 잠재성을 평가할 것이다. 그렇게 하기 위하여, 우리는 생체내 시스템 모델로서 조류 배야를 사용하는데 이는 NiV가 통상의 작은 동물 모델(즉, 마우스 및 래트)에서는 질병을 일으키지 않기 때문이다.14 또한, NiV 발명23을 연구하는데 조류 배아가 사용되었으며 단일-세포 해상도가 가능한 생존중 영상 기술을 할 수 있다. 마지막으로, 조류 배야의 단가는 비싸봐야 작은 동물 모델의 1/10 내지 1/100이며 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUU) 규제를 받지 않아, 비용-효과적이며, 나노입자의 높은-처리량 선별에 있어 이들이 이상적이다. 우리는 먼저 NiVpp-암호화된 단백질의 발현을 최대화하기 위하여 배야 연령과 NiVpp 농도를 최적화하면서, 한편으로는 배야에 대한 독성을 최소화한다. 이어서 우리는 mKATE-특이적인 siRNA(s)가 부하되었으며 NiV-G에 표적화된 프로토셀의 사일런싱 효과를, mKATE를 암호화하고 감염된 세포에서 NiV-G의 표면 발현을 유도하는 NiVpp로 미리 감염시킨 배아를 사용하여 측정한다. 마지막으로, 우리는 siRNA(또는 필요에 따라, 미니서클 DNA), 전통적인 항-바이러스제 (예, 리바비린), 및 신규의, 광범위한 스펙트럼의 항바이러스제(예, LJ00124)를 포함한, 항-바이러스제의 복합 조합물을 인간 에프린 B2를 발현시키도록 형질감염시키고 mKATE 및 NiV-G를 암호화하는 NiVpp로 감염시킨 배아로 운반하는, 프로토셀의 능력을 평가한다.
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실시예 7
표적화되지 않은 프로토셀의 생체분포 및 독성
표적화되지 않은 프로토셀의 1차적인 생체분포 및 독성을 평가하였다. Bulb/c 또는 Nu/Nu 마우스를 사용하여 살아있는 동물 형광 영상화법을 이용하면, 형광 코어로 개질시킨, 표적화되지 않은 프로토셀은 마우스당 4 mg의 최대 투여량으로(200 mg/kg) IV 주사후 전신적으로 분포하는 것으로 나타났다 [도 1X7A]. 상기 전신 순환 기간은 표적화된 프로토셀이 특이화된 세포내에 셀의 위치와는 상관없이 축적될 시간을 제공한다. 24-48시간에 걸쳐, 나머지 프로토셀은 간과 비장에 축적되는 것으로 나타날 수 있다. 200 mg/kg으로 3회 투여한 후, 상당한 농도의 입자가 적어도 2주간 간에서 유지된다 (도 1X7B 및 D). 이런 간에서의 축적 및 체류는 병리학 및 간 중량을 통하여 측정한 바, 어떠한 간 독성도 일으키지 않는다 (도 2X7). 그러므로, 표적화되지 않은 프로토셀은 표적화된 운반에 사용될 수 있는 이들의 잠재성 외에, 다량이고 지연된 투여량의 항바이러스제 및 siRNA를 운반하는데 이상적인 저수조(reservoirs)로 제공될 수 있다. 또한, 매주 3회 200 mg/kg 투여량(마우스당 총 실리카 투여량은 36 mg)으로 3주 후, 독성 또는 체중 증가에서의 감소가 관찰되지 않았다 (도 1X7C). 이보다 훨씬 높은 투여량에서도, 프로토셀은 최소 내지 독성이 없는 것으로 나타났다.
실시예 8
경피적 프로토셀 확산
방식: 표준 프로토셀 제형(DOPC(Tm = -20℃) 55 중량%, 콜레스테롤 30 중량%, DOPE-PEG 15 중량%)을 사용하고 이들을 각질층이 그대로 남아있는 피부 샘플에 노출시키고 각질층을 제거한다. ICP 질량 스펙트럼을 사용하여 분석한다.
피부로부터 지방조직을 제거하고 이들을 0.64 cm x 0.64 cm 사각형으로 절단하였다. 이어서 피부를 Franz 확산 셀 위에 놓고 45분간 평형되도록 하였다. 평형시킨 후, 확산 완충액을 제거하고 깨끗한 확산 완충액으로 교체시켰다. 일단, 피부를 다시 45분간 평형되도록하고, 8.125 mg(650 ㎕)의 프로토셀을 상기 셀 캡에 첨가하였다. 24시간 후, 셀 캡내 유체를 수집하였다. 이어서, 세포를 토닥거려 건조시키고, 세척하였다. 수용체 유체를 또한 수집하였다. 피부와 수용체를 ICP 질량 스펙트럼으로 분석하였다. SC는 3개의 샘플에 대해 그대로 두었으며 다른 3개의 샘플에서는 테이프를 사용하여 제거하였다. 대조군은 SC가 제거된 피부 샘플과 SC가 그대로 있는 피부 샘플이며, 0.5X PBS로 처리하였다. 상기 데이타는 각 샘플로부터의 용기 유체에 대한 ICP 질량 스펙트럼 결과를 보여준다. 용기 유체에 대한 ICP는 2011년 10월 27일에 수행하였다. 이 데이타의 평균을 내고 표준 편차를 측정하였다. 도 1X8, 2X8, 3X8. 공여체 캡 샘플의 ICP 질량 스펙트럼을 측정하였다. 도 4X8.
1차 데이타는 작은 퍼센트의 프로토셀이 전체 및 부분적 두께의 피부를 통하여 확산될 수 있음을 제시하였으며, 이는 프로토셀 표면 개질이 피부의 침투성에 영향을 줄 수 있으며 이어서 피부를 통한 프로토셀의 확산에도 영향을 줄 수 있음을 제시하는 것이다.
피부를 통해 확산되는 프로토셀의 양을 정량하는 신속한 방법을 확인하기 위하여, Alexa Fluor 633으로 형광적으로 표지시킨 SiO2 코어를 만들어 스펙트럼형광측정법을 사용하여 용기 유체중 SiO2의 농도를 측정하였다. 이는 또한 셀 공여체 캡에 남아있는 SiO2의 양을 측정하기 위하여 확장될 수 있다. 도 6X8, 7X8, 8X8, 9X8을 참조.
코어 작용성화는 도 5X8에 나타나 있다.
포지티브 대조군은 피부의 자동형광의 잇점을 취하면서 피부중의 형광적으로-태그된 입자가 영상화될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 9
경피적 SiO 2 나노입자
형광측정기 세팅
강도 유니트 = 수(counts)/초
여기: 632 nm
방출 스캔: 644 nm - 650 nn; *모든 값은 647 nm*에서 계산되었음
스텝 크기 = 1 nm
슬릿 크기 = 2 nm
통합 시간 = 1초
ASOC 샘플링 주파수 = 0.2 kHz
추정 및 공지의 변수:
- 모든 입자는 Dylight 633을 사용하여 10 ㎍: 1 mg의 염료로 NH2-실리카에 형광적으로 태그시켰다.
- Dylight 633에 대한 방출 최대값은 647 nm이며 632 nm에서 여기 최대값을 갖는다.
- 모든 블랭크는 용기 유체로 이루어진 동일한 스톡 용액으로부터 취하였으며 따라서 그 값들을 평균하였다.
- 각 샘플에 대해서 최소 3회, 최대 9회 수행하였다.
- 각각의 수행전에 샘플을 혼합하였다.
- 모든 오차 막대는 95% 신뢰구간을 표시하며; 평균으로부터의 표준 편차를 계산한 다음 이를 사용하여 표준오차를 계산하고 1.96을 곱하여 95% 신뢰도를 수득하였다.
- 대조군 용기로부터 24시간 용기 유체를 사용하여 표준곡선을 발생시켰다(S1으로 표시).
- 표준곡선은 1:2의 희석액으로 0.16 mg/mL의 [시작]에서 시작하여 1.953125E-5 mg/mL로 다운되었다.
- 표준곡선은 2차순 다항식(R2>0.99)에 따르지만, 관련 농도 범위에 걸쳐 상기 곡선의 선형 부분을 사용함으로써 선형회귀분석법을 적용시킬 수 있다(R2.0.93); 표준곡선을 Log 평균 F1 대 Log[SiO2] 플로팅하였다.
- 피부는 자가형광에서 높은 정도의 이질성을 나타내며, 따라서 0시간 샘플은 공여체 캡중의 프로토셀 투여 전에 채취하고 자가형광에서의 차를 24시간 블랭크 사이에서 확립하였다(S1).
- 이후 이 차를 보정값으로 0시간 샘플로부터 더하거나 빼서 모든 나머지 용기 유체(S2-S9)을 대조군(S1)에 표준화시켰다.
- 곡선의 선형 부분으로부터의 식을 사용하여 0, 4, 및 24시간 시점에서의 보정된 평균 형광 강도로부터 미지의 농도를 계산하였다.
- 0시간 시점으로부터 수득한 농도를 4 및 24시간 시점으로부터 빼서 용기내의 실제 SiO2 함량을 측정하였다.
변형된 Franz 확산 셀을 모든 실험에 사용하였다. 피하 조직의 제거 후, 기증된 복부 피부를 대략 2 ㎠ 조각으로 절단하여 공기 방울이 형성되는 것을 피하면서 5.1 mL 용기상에 놓고 60분간 평형시켰다. 용기 유체를 37℃에서 유지시켰다. 60분 후, 피부를 제거하고, 용기 유체를 교체시켜 피부를 다시 30분간 평형시켰다. 30분 후, 0시간 샘플을 취하고 (대략 400 ㎕) 신선한 확산 완충액으로 교체시켰다. 다양한 프로토셀 제형을 각 제형에 대해 n=4로 투여하였다 (500 ㎕의 0.5XPBS중 16 mg/mL). 각 실험으로부터의 1번 피부(S1)를 0.5XPBS로 처리하였다. S1 24시간 용기 유체로부터 1:2 희석액을 사용하여 0.16 mg/mL - 1.953125E-5 mg/mL의 농도 범위내에서 생성시켰다. 모든 표준곡선은 동일한 일반적인 2차순 다항식 추세에 따르며 Log 대 Log 스케일상에 플로팅된다. 적색선은 95% 신뢰도의 평균 블랭크 값(S1 24시간)을 나타낸다. 도 1X9.
스펙트럼형광측정법과 함께 선형회귀분석을 수행하여 이를 사용하여 4시간 및 24시간 시점에서 각 용기내의 미지의 농도를 알아냈다. 선형 추세선을 관련 농도/강도 범위에 적용시켜 y = mx+b 형태를 갖는 식을 수득하였다; 모든 R2 > 0.9300. 0, 4, 및 24 시간에서의 각 농도를 수득하기 위하여 10x 풀었다. 이후 이 값에 5.1을 곱하여 각 시점에서의 SiO2의 전체 mg을 수득하였다. 최종량은 0시간 샘플로부터 수득한 값을 빼서 얻었다. 도 2X9.
9개의 상이한 이중층 제형을 갖는 PCs와 지지된 지질 이중층(SLB)이 없는 SiO2 코어를 조사하였다. SiO2 코어 w/o SLB가 최고의 형광 강도를 나타내지만, 최대 변수의 경우, 이들을 0.5XPBS로 투여하였기 때문에 나타난 강도는 대개 용해로 인한 것이지 온전하게 코어만의 것이 아니다. 콜레스테롤을 30 중량% 갖는 DOPC 프로토셀이 최소량의 변화로 가장 한결같은 확산을 나타내며, 그 다음이 콜레스테롤을 30 중량% 갖는 DSPC 프로토셀이다. 25 중량%의 DOPE, 30 중량%의 콜레스테롤 및 45 중량% DOPC를 갖는 프로토셀은 24시간 시점에서 ㎍ 양의 SiO2를 나타냈다. 마지막으로, 25 중량% DOPE, 30 중량% 콜레스테롤, 30 중량% DOPC, 및 15 중량% PEG를 갖는 프로토셀은 DOPC/콜레스테롤 조제된 PCs보다 경피적 확산에 있어서 확실한 증가를 나타냈지만, 각 샘플 간의 통계적 변화가 높았다. 상기 결과는 SLB 제형이 경피적 확산에 크게 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. 또한, PEG를 갖는 제형에 대해 흥이로운 추세가 관찰되었다. 도 3X9.
DOPC(Tm = -20℃)/콜레스테롤 프로토셀은 DSPC(Tm = 55)/콜레스테롤 프로토셀과 비교시 24시간 시점에서 2배의 SiO2 양을 나타냈다. 이는 전이온도가 더 낮은 지질이 전체 두께 피부로 더 깊이 확산되고 전이온도가 더 높은 지질은 각질층에 편재된 상태로 남아있음을 제시하는 리포좀 문헌과 일치한다. DOPC/chol 및 DSPC/chol 제형에 PEG를 첨가하게되면 경피적 확인이 현격하게 감소되었다. 친수성 폴리머인 PEG는 침투 증진제로 이전에 사용되었었다. 본 발명자는 감소된 확산은 세포간 구조를 파괴하지 않아 확산을 방해하는 세포간 라멜라의 수성 부분 사이에서의 상호반응으로 인한 것으로 가설을 세웠다. DOPC PC 제형에 DOPE를 도입시키면 시험된 다른 제형(값비싼 슬라이드)보다 증가된 확산을 나타낸다. DOPE와 PEG를 둘다 첨가하면 경피적 확산에서의 현격한 증가(높은 통계적 변화와 함께)를 나타내며 이는 에탄올아민과 PEG의 조합이 경피적 확산을 좋게 증가시킬 수 있음을 제시하는 것이다. 이런 추세는 DSC, 작은 각도 XRD, 공초점 현미경, 및 가능하게는 FTIR을 사용하여 추가로 조사될 것이다. 도 4X9.
도 5X9와 6X9는 시간의 함수로서 보정된 평균 형광 강도에서의 개별적 증가를 나타낸다. 모든 그래프에서, S1은 0, 4, 및 24시간 시점에서의 블랭크 값을 나타낸다. 블랭크로부터의 자가형광은 전반에 걸쳐서 변화되며 둘 중 하나는 대략 동일한 상태로 남아있거나 시간이 경과함에 따라 "24시간 블랭크 값"으로 증가한다. 일부 문헌에는 용기 유체에서 나타난 자가형광은 시간의 함수로 감소하지만 여기서는 관찰되지 않았다고 제시되어 있다. 일부 예에서 강도의 기울기 대 시간은 처음 4시간내에서 훨씬 더 가파르며 시간이 경과함에 따라 감소하며, 다른 경우의 기울기는 처음 4시간에 덜 현저하며 시간이 경과함에 따라 더욱 가파르게 되고, 일부 경우에는 기울기가 시간이 경과함에 따라 일정하게 유지된다. 이는 피부의 이질성으로 인한 것으로 놀라운 것이 아니다. 도 7X9, 8X9 및 9X9는 운동역학에 대한 제형의 효과를 설명한다.
서열
ASVHFPP (Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro) SEQ ID NO: 1
TATFWFQ (Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln) SEQ ID NO: 2
TSPVALL (Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu) SEQ ID NO: 3
IPLKVHP (Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro) SEQ ID NO: 4
WPRLTNM (Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met) SEQ ID NO: 5
H2N-SFSIILTPILPL-COOH, SEQ ID NO: 6
H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH, SEQ ID NO: 7
H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH, SEQ ID NO: 8
GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQ-
GGYGGC-COOH, SEQ I.D NO: 9,
RRMKWKK , SEQ ID NO:10
PKKKRKV, SEQ ID NO: 11
KR[PAATKKAGQA]KKKK, SEQ ID NO:12
H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH, SEQ ID. NO: 13
H2N-RRRRRRRR-COOH, SEQ ID NO:14
YLFSVHWPPLKA, SEQ ID NO:15
HAIYPRH peptide, SEQ ID NO:16
TPDWLFP, SEQ ID NO:17
TGAILHP, SEQ ID NO:18
SEQUENCE LISTING <110> STC.UNM SANDIA CORPORATION <120> POROUS NANOPARTICLE-SUPPORTED LIPID BILAYERS (PROTOCELLS) FOR TARGETED DELIVERY INCLUDING TRANSDERMAL DELIVERY OF CARGO AND METHODS THEREOF <130> N12-186PCT <140> PCT/US12/60072 <141> 2012-10-12 <150> 61/547,402 <151> 2011-10-14 <150> 61/578,463 <151> 2011-12-21 <150> 61/577,410 <151> 2011-12-19 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide <400> 1 Ala Ser Val His Phe Pro Pro 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide <400> 2 Thr Ala Thr Phe Trp Phe Gln 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide <400> 3 Thr Ser Pro Val Ala Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide <400> 4 Ile Pro Leu Lys Val His Pro 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide <400> 5 Trp Pro Arg Leu Thr Asn Met 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Free SP94 peptide <400> 6 Ser Phe Ser Ile Ile Leu Thr Pro Ile Leu Pro Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cys-SP94 peptide <400> 7 Ser Phe Ser Ile Ile Leu Thr Pro Ile Leu Pro Leu Gly Gly Cys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP94 peptide <400> 8 Ser Phe Ser Ile Ile Leu Thr Pro Ile Leu Pro Leu Glu Glu Glu Gly 1 5 10 15 Gly Cys <210> 9 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization peptides <400> 9 Gly Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly 1 5 10 15 Gly Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys 20 25 30 Pro Arg Asn Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Cys 35 40 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization peptides <400> 10 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization peptides <400> 11 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuclear localization peptides <400> 12 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H5WYG fusogenic peptide <400> 13 Gly Leu Phe His Ala Ile Ala His Phe Ile His Gly Gly Trp His Gly 1 5 10 15 Leu Ile His Gly Trp Tyr Gly Gly Cys 20 25 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusogenic peptide - polyarginine 8-mer <400> 14 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MET Receptor Binding Peptide 12-mer <400> 15 Tyr Leu Phe Ser Val His Trp Pro Pro Leu Lys Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> target un-related peptide <400> 16 His Ala Ile Tyr Pro Arg His 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> irrelevant phage clone <400> 17 Thr Pro Asp Trp Leu Phe Pro 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primary receptor for NiV entry via macropinocytosis <400> 18 Thr Gly Ala Ile Leu His Pro 5 <210> 19 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin B1-specific siRNA precursor DNA <400> 19 ggatccgaaa tgtaccctcc agaaattgaa ttcgtttctg gagggtacat ttctttttga 60 attc 64 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin B1-specific siRNA <400> 20 gaaauguacc cuccagaaau u 21

Claims (145)

  1. 지지된 지질 이중층(lipid bilayer)과 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 추가적인 성분을 갖는 나노다공성(nanoporous) 실리카 또는 금속 산화물 코어,
    세포 표적화종(targeting species);
    프로토셀과 캡슐화된 DNA, 및 이중사 선형 DNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 운반물 성분을 적어도 1종 포함하는 기타 운반물(cargo)의 엔도좀 탈출을 촉진하는 융합성 펩타이드(fusogenic peptide);
    플라스미드 DNA;
    약물(drug);
    영상화제(imaging agent),
    작은 간섭 RNA, 작은 헤어핀 RNA, 마이크로RNA, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세포-표적화 다공성 프로토셀(protocell)에 있어서,
    상기 운반물 성분 중 1종은 임의로 핵 위치 서열(nuclear localization sequence)과 추가로 컨쥬게이트 되는 것을 특징으로 하는 세포-표적화 다공성 프로토셀(protocell).
  2. 제1항에 있어서, 상기 실리카 코어가 구형이며 직경의 범위가 약 10 nm 내지 약 250 nm인 프로토셀.
  3. 제2항에 있어서, 상기 실리카 코어의 평균 직경이 약 150 nm인 프로토셀.
  4. 제2항 또는 3항에 있어서, 상기 실리카 코어의 크기 분포가 단분산(monodisperse) 또는 다분산(polydisperse)인 프로토셀.
  5. 제2항 또는 3항에 있어서, 상기 실리카 코어가 단분산인 프로토셀.
  6. 제2항 또는 3항에 있어서, 상기 실리카 코어가 다분산인 프로토셀.
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질로 이루어진 것인 프로토셀.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOPC를 DOPE와 함께 포함하는 것인 프로토셀.
  9. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOTAP, DOPG, DOPC 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 프로토셀.
  10. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOPG와 DOPC를 포함하는 것인 프로토셀.
  11. 제8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것인 프로토셀.
  12. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOPC를 약 5 중량%의 DOPE, 약 30 중량%의 콜레스테롤, 및 약 10 중량%의 PEG-2000 PE(18:1)과 함께 포함하는 것인 프로토셀.
  13. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층이 약 5 중량%의 DOPE, 약 5 중량%의 PEG, 약 30 중량%의 콜레스테롤, 약 60 중량%의 DOPC 및/또는 DPPC를 포함하는 것인 프로토셀.
  14. 제13항에 있어서, 상기 PEG가 상기 DOPE에 접합되어 있는 것인 프로토셀.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화종이 표적화 펩타이드인 프로토셀.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 SP94 펩타이드인 프로토셀.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 서열 확인 번호: 6, 서열 확인 번호: 7 또는 서열 확인 번호: 8인 프로토셀.
  18. 제15항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 서열 확인 번호: 1, 서열 확인 번호: 2, 서열 확인 번호: 3, 서열 확인 번호: 4 또는 서열 확인 번호: 5에 따르는 MET 결합 펩타이드인 프로토셀.
  19. 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합성 단백질이 H5WYG 펩타이드(서열 확인 번호: 13) 또는 폴리아르기닌의 8합체(서열 확인 번호: 14)인 프로토셀.
  20. 제19항에 있어서, 상기 융합성 펩타이드가 서열 확인 번호: 13인 프로토셀.
  21. 제1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 DNA를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 핵 위치 서열을 발현시키도록 임의로 개질되는 것인 프로토셀.
  22. 제21항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 슈퍼코일상이거나 패키징된 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  23. 제22항에 있어서, 상기 DNA가 슈퍼코일상이고 패키징된 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  24. 제20항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 핵 위치 서열을 발현시키도록 개질되는 것인 프로토셀.
  25. 제21항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 인간 히스톤 단백질의 혼합물을 포함하는, 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  26. 제25항에 있어서, 상기 히스톤의 혼합물이 H1, H2A, H2B, H3, 및 H4로 이루어진 것인 프로토셀.
  27. 제25항에 있어서, 상기 히스톤의 혼합물이 1:2:2:2:2의 중량비를 갖는 H1, H2A, H2B, H3 및 H4인 프로토셀.
  28. 제1항 내지 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 폴리펩타이드 독소, 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현시킬 수 있는 것인 프로토셀.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 독소가 리신(ricin) 독소 쇄-A 또는 디프테리아 독소 쇄-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로토셀.
  30. 제1항 또는 28항에 있어서, 상기 shRNA 또는 상기 siRNA가 세포의 세포자살(apoptosis)을 유도하는 것인 프로토셀.
  31. 제1항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 리포터 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 프로토셀.
  32. 제31항에 있어서, 상기 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질인 프로토셀.
  33. 제1항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵 위치 서열이 서열 확인 번호: 9, 서열 확인 번호: 10, 서열 확인 번호: 11 또는 서열 확인 번호: 12에 따르는 펩타이드인 프로토셀.
  34. 제1항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵 위치 서열이 서열 확인 번호: 9에 따르는 펩타이드인 프로토셀.
  35. 제1항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 항암제를 추가로 포함하는 것인 프로토셀.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항암제가 에베로리무스, 트라벡테딘, 아브락산, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파닙, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244(ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타닙, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 오로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), PIK-1 조절제, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키나제 억제제, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트-1 또는 2 억제제, 초점 접착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제(mek) 억제제, VEGF 트랩 항체, 페메트렉세드(pemetrexed), 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, Lep-etu, 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 티클리무맙, 이필리무맙, 고시폴(gossypol), Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌기타이드(cilengitide), 기마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 KRX-0402, 루칸톤(lucanthone), LY 317615, 뉴라디압(neuradiab), 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈람파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포사이드, 겜시타빈, 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리시클립; PD0325901, AZD-6244, 카페시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]-, 이나트륨 염, 7수화물, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 공액된 에스트로겐, 베바시주맙, IMC-1C11, CHIR-258); 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀논, 바탈라닙, AG-013736, AVE-0005, [D-Ser(But)6, Azgly 10]의 아세테이트 염(피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트 [C59H84N18O14-(C2H4O2)x (여기서 x=1 내지 2.4], 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, ABX-EGF 항체, 에르비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-57016, 이오나파르닙, BMS-214662, 티피파르닙; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날라이드 히드록삼산, 발프로산, 트리초스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페닙, KRN951, 아미노글루테티마이드, 아르나사크린, 아나그렐라이드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin:BGC) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카르바진, 다시티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 글리백, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레티노산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록스우리딘, 5-데옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로놀락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데니류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포르-유리 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RAD001, ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, 워르트마닌(wortmannin), ZM336372, L-779,450, PEG-필그라스팀, 다르베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시맙, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길레이트된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길레이트된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자시티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도마이드, 겜투주맙, 히드로코르티손, 인터류킨-11, 덱스라족산, 알렘투주맙, 모든(all)-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터류킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 시클로스포린, 리포조말 다우노루비신, Edwina-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디페닐히드라민, 히드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르페라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 다르베포이에틴 알파 또는 이들의 혼합물인 프로토셀.
  37. 제1항 내지 36항에 있어서, 상기 약물이 항바이러스제를 포함하는 것인 프로토셀.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항바이러스제가 항-HIV 약제, 항-HBV 약제 또는 항-HCV 약제인 프로토셀.
  39. 지지된 지질 이중층과 서열 확인 번호: 1, 서열 확인 번호: 2, 서열 확인 번호: 3, 서열 확인 번호: 4 또는 서열 확인 번호: 5에 따르는 MET 결합 펩타이드를 갖는 나노다공성 실리카 코어를 포함하는 프로토셀.
  40. 제31항에 있어서, 상기 MET 결합 펩타이드가 서열 확인 번호: 1에 따르는 펩타이드인 프로토셀.
  41. 제39항 또는 40항에 있어서, 상기 MET 결합 펩타이드가 상기 지질 이중층에 접합되어 있는 것인 프로토셀.
  42. 제39항 내지 41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로토셀이 프로토셀과 캡슐화된 DNA의 엔도좀 탈출을 촉진하는 융합성 펩타이드; 플라스미드 DNA; 이중사 선형 DNA, 약물; 영상화제, 작은 간섭 RNA, 작은 헤어핀 RNA 및 마이크로 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 적어도 1종 추가로 포함하며, 여기서 상기 플라스미드 DNA, 상기 약물, 상기 영상화제 및/또는 상기 RNA는 핵 위치 서열에 추가로 접합되어 있는 것인 프로토셀.
  43. 제42항에 있어서, 상기 약물이 적어도 1종의 항암제를 포함하는 것인 프로토셀.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항암제가 에베로리무스, 트라벡테딘, 아브락산, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파닙, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244(ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타닙, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 오로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), PIK-1 조절제, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키나제 억제제, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트-1 또는 2 억제제, 초점 접착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제(mek) 억제제, VEGF 트랩 항체, 페메트렉세드(pemetrexed), 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, Lep-etu, 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 티클리무맙, 이필리무맙, 고실폴(gossypol), Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌기타이드(cilengitide), 기마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 KRX-0402, 루칸톤(lucanthone), LY 317615, 뉴라디압(neuradiab), 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈람파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포사이드, 겜시타빈, 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리시클립; PD0325901, AZD-6244, 카페시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]-, 이나트륨 염, 7수화물, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 공액된 에스트로겐, 베바시주맙, IMC-1C11, CHIR-258); 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 바탈라닙, AG-013736, AVE-0005, [D-Ser(But)6, Azgly 10]의 아세테이트 염(피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트 [C59H84N18O14-(C2H4O2)x (여기서 x=1 내지 2.4], 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, ABX-EGF 항체, 에르비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-57016, 이오나파르닙, BMS-214662, 티피파르닙; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날라이드 히드록삼산, 발프로산, 트리초스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페닙, KRN951, 아미노글루테티마이드, 아르나사크린, 아나그렐라이드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin:BGC) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카르바진, 다시티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 글리백, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레티노산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록스우리딘, 5-데옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로놀락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데니류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포르-유리 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RAD001, ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, LY293646, 워르트마닌(wortmannin), ZM336372, L-779,450, PEG-필그라스팀, 다르베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시맙, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길레이트된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길레이트된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자시티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도마이드, 겜투주맙, 히드로코르티손, 인터류킨-11, 덱스라족산, 알렘투주맙, 모든(all)-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터류킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 시클로스포린, 리포조말 다우노루비신, Edwina-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디페닐히드라민, 히드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르페라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 다르베포이에틴 알파 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로토셀.
  45. 제39항 내지 44항에 있어서, 상기 약물이 항바이러스제를 적어도 1종 포함하는 것인 프로토셀.
  46. 제45항에 있어서, 상기 항바이러스제가 항-HIV 약제, 항-HBV 약제, 항-HCV 약제 또는 이들의 혼합물인 프로토셀.
  47. 제39항 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 적어도 1종의 리포터 분자를 발현시킬 수 있는 것인 프로토셀.
  48. 제39항 내지 47항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 DNA를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 핵 위치 서열을 발현시키도록 개질되는 것인 프로토셀.
  49. 제48항에 있어서, 상기 DNA가 슈퍼코일상이거나 패키징된 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  50. 제49항에 있어서, 상기 DNA가 슈퍼코일상이고 패키징된 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  51. 제48항 내지 51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 핵 위치 서열을 발현시키도록 개질되는 것인 프로토셀.
  52. 제47항 내지 51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 인간 히스톤 단백질의 혼합물을 포함하는, 히스톤-패키징된 슈퍼코일상 플라스미드 DNA인 프로토셀.
  53. 제52항에 있어서, 상기 히스톤의 혼합물이 H1, H2A, H2B, H3, 및 H4로 이루어진 것인 프로토셀.
  54. 제53항에 있어서, 상기 히스톤의 혼합물이 1:2:2:2:2의 중량비를 갖는 H1, H2A, H2B, H3 및 H4인 프로토셀.
  55. 제48항 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 폴리펩타이드 독소, 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현시킬 수 있는 것인 프로토셀.
  56. 제55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 독소가 리신(ricin) 독소 쇄-A 또는 디프테리아 독소 쇄-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로토셀.
  57. 제55항에 있어서, 상기 shRNA 또는 상기 siRNA가 세포의 세포자살을 유도하는 것인 프로토셀.
  58. 제48항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 리포터 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 프로토셀.
  59. 제58항에 있어서, 상기 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질인 프로토셀.
  60. 제39항 내지 59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵 위치 서열이 서열 확인 번호: 9, 서열 확인 번호: 10, 서열 확인 번호: 11 또는 서열 확인 번호: 12에 따르는 펩타이드인 프로토셀.
  61. 제60항에 있어서, 상기 핵 위치 서열이 서열 확인 번호: 9에 따르는 펩타이드인 프로토셀.
  62. 치료 효과를 발휘하기에 유효한 양의, 제1항 내지 61항 중 어느 한 항에 따르는 프로토셀의 집단을 약제학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 프로토셀내에서 운반물(cargo)로서 배치되지 않은 약물을 추가로 포함하는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 약물이 항암제 또는 항바이러스제인 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항바이러스제가 항-HIV 약제, 항-HBV 약제, 항-HCV 약제 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  66. 제62항 내지 65항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구적 투여형인 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 투여형이 피내(intradermal), 근육내, 골내(intraosseous), 복강내, 정맥내, 피하(sucutaneous) 또는 척추강내(intrathecal)의 것인 조성물.
  68. 제62항 내지 65항 중 어느 한 항에 있어서, 국소적 또는 경피적 투여형인 조성물.
  69. 서열 확인 번호: 1, 서열 확인 번호: 2, 서열 확인 번호: 3, 서열 확인 번호: 4 또는 서열 확인 번호: 5에 따르는 MET 결합 펩타이드.
  70. 제69항에 있어서, 서열 확인 번호: 1에 따르는 MET 결합 펩타이드.
  71. 제69항 또는 70항에 따르는 MET 결합 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  72. 프로토셀이 간세포암(hepatocellular cancer) 세포에 선택적으로 결합하도록 표적화 펩타이드를 포함하는 프로토셀의 집단을, 항암제 및 항-HBV 약제, 항-HCV 약제 또는 이들의 혼합물과 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 S94 펩타이드, MET 결합 펩타이드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  74. 제72항에 있어서, 상기 항암제가 넥사바르(소라페닙: sorafenib), 수니티닙, 베바시주맙, 타르베카(에를로티닙: erlotinib), 타이케르브(라파티닙: lapatinib) 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  75. 제72항 내지 74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-HBV 약제가 Hepsera(아데포비르 디피복실: adefovir dipivoxil), 라미부딘(lamivudine), 엔테카비르(entecavir), 텔비부딘(telbivudine), 테노포비르(tenofovir), 엠트리시타빈(emtricitabine), 클레부딘(clevudine), 발토리시타빈(valtoricitabine), 암독소비르(amdoxovir), 프라데포비르(pradefovir), 라시비르(racivir), BAM 205, 니타족사니드(nitazoxanide), UT 231-B, Bay 41-4109, EHT899, 자닥신(zadaxin; 티모신 알파-1) 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  76. 제72항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-HCV 약제가 보세프레비르(boceprevir), 다클라타스비르(daclatasvir), 아수나파비르(asunapavir), INX-189, FV-100, NM 283, VX-950(telaprevir), SCH 50304, TMC435, VX-500, BX-813, SCH503034, R1626, ITMN-191(R7227), R7128, PF-868554, TT033, CGH-759, GI 5005, MK-7009, SIRNA-034, MK-0608, A-837093, GS 9190, GS 9256, GS 9451, GS 5885, GS 6620, GS 9620, GS 9669, ACH-1095, ACH-2928, GSK625433, TG4040(MVA-HCV), A-831, F351, NS5A, NS4B, ANA598, A-689, GNI-104, IDX102, ADX184, ALS-2200, ALS-2158, BI 201335, BI 207127, BIT-225, BIT-8020, GL59728, GL60667, PSI-938, PSI-7977, PSI-7851, SCY-635, 리바비린(ribavirin), 페길레이트된 인터페론, PHX1766, SP-30 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  77. 암치료를 필요로 하는 환자의 암세포에 항암제를 운반하도록 채택된, 제1항 내지 61항 중 어느 한 항에 따르는 프로토셀의 집단을 포함하는 조성물을 유효량으로 이 환자에게 투여함을 특징으로 하는, 암 치료 방법.
  78. 간세포암에 걸린 환자에게 제72항 내지 76항 중 어느 한 항에 따르는 조성물을 유효량으로 투여함을 특징으로 하는, 간세포암의 치료 방법.
  79. 암치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 61항 중 어느 한 항에 따르는 프로토셀의 집단을 유효량으로 (상기 DNA 플라스미드는 슈퍼코일상이고 항암 폴리펩타이드 및/또는 RNA를 발현시키도록 채택된다), 임의로는, 상기 프로토셀내에 운반물로 조제되는, 유효량의 추가의 항암제와 함께 투여함을 특징으로 하는 암 치료 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 항암 폴리펩타이드가 리신 독소 쇄-A 또는 디프테리아 독소 쇄-A인 방법.
  81. 제79항 또는 80항에 있어서, 상기 RNA가 shRNA 또는 siRNA로 암세포의 세포자살을 유도하는 것인 방법.
  82. 제79항 내지 81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA가 s565, s7824 또는 s10234로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 shRNA가 사이클린 B1-특이적 shRNA로 세포 죽음을 유도하는 것인 방법.
  84. 제79항 내지 84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제가 에베로리무스, 트라벡테딘, 아브락산, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파닙, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244(ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타닙, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 오로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), PIK-1 조절제, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키나제 억제제, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트-1 또는 2 억제제, 초점 접착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제(mek) 억제제, VEGF 트랩 항체, 페메트렉세드(pemetrexed), 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, Lep-etu, 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 티클리무맙, 이필리무맙, 고실폴(gossypol), Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌기타이드(cilengitide), 기마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 KRX-0402, 루칸톤(lucanthone), LY 317615, 뉴라디압(neuradiab), 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈람파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포사이드, 겜시타빈, 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리시클립; PD0325901, AZD-6244, 카페시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]-, 이나트륨 염, 7수화물, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 공액된 에스트로겐, 베바시주맙, IMC-1C11, CHIR-258); 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 바탈라닙, AG-013736, AVE-0005, [D-Ser(But)6, Azgly 10]의 아세테이트 염(피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트 [C59H84N18O14-(C2H4O2)x (여기서 x=1 내지 2.4], 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, ABX-EGF 항체, 에르비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-57016, 이오나파르닙, BMS-214662, 티피파르닙; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날라이드 히드록삼산, 발프로산, 트리초스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페닙, KRN951, 아미노글루테티마이드, 아르나사크린, 아나그렐라이드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin:BGC) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카르바진, 다시티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 글리백, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레티노산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록스우리딘, 5-데옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로놀락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데니류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포르-유리 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RAD001, ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, 워르트마닌(wortmannin), ZM336372, L-779,450, PEG-필그라스팀, 다르베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시맙, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길레이트된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길레이트된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자시티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도마이드, 겜투주맙, 히드로코르티손, 인터류킨-11, 덱스라족산, 알렘투주맙, 모든(all)-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터류킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 시클로스포린, 리포조말 다우노루비신, Edwina-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디페닐히드라민, 히드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르페라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 다르베포이에틴 알파 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  85. 제79항 내지 84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로토셀 또는 상기 프로토셀 이외의 상기 조성물이 항바이러스제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 항바이러스제가 항-HBV 약제 또는 항-HCV 약제인 방법.
  87. 제 62항 내지 76항 중 어느 한 항에 따르는, 유효량의 조성물을 암치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 특징으로 하여 환자에서 암을 치료하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 암이 편평세포암종, 선암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광, 뼈, 장, 유방, 자궁경부, 결장(결장직장), 식도, 두부(head), 콩팥, 간(간세포), 폐, 비인후, 목, 난소, 고환, 췌장, 전립선, 및 위의 암종; 백혈병, 버킷(Burkitt) 림프종, 비-호지킨(Hodgkin) 림프종, B-세포 림프종; 악성 흑색종; 골수증식 질환, 에윙(Ewing) 육종, 혈관육종, 카포시(Kaposi) 육종, 지방육종, 근육종, 말초신경삼피암종, 활막육종; 신경교종, 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 교아종, 신경아세포종, 신결절종, 신경절신경종, 수모세포종, 송과체 종양, 뇌수막종, 뇌막 육종, 신경섬유종, 슈반종(Schwannomas), 장암, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 혼합된 소세포 및 비-소세포 폐암, 흉막 중피종, 고환암, 갑상선암 및 성상세포종인 방법.
  89. 암에 걸릴 위험이 있는 환자에서 암을 진단하는 방법으로, 이 방법은 상기 환자에게, 암세포에 선택적으로 결합하여 암세포에 프로토셀을 운반하도록 채택된 표적화 펩타이드를 포함하는, 제1항 내지 61항 중 어느 한 항에 따르는 프로토셀의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 특징으로 하며, 상기 프로토셀은 리포터 분자를 발현시키도록 채택된 플라스미드 DNA를 포함하고 임의로 추가의 리포터 분자를 포함하며, 상기 환자에서 암세포에 상기 프로토셀이 결합시, 존재할 경우, 상기 리포터 분자가 암세포로 방출되고, 리포터 분자는 환자가 암에 걸렸는지 아닌지, 그리고 암에 걸렸을 경우, 암의 정도 및/또는 존재할 경우, 암 종양의 크기를 결정하기 위한 기준과 비교될 수 있는 신호를 끌어내는 방법.
  90. 환자에서 암치료를 모니터링하는 방법으로, 환자에게 암세포에 선택적으로 결합하여 암세포에 프로토셀을 운반하도록 채택된 표적화 펩타이드를 포함하는, 제1항 내지 61항 중 어느 한 항에 따르는 프로토셀의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 특징으로 하며, 상기 프로토셀은 리포터 분자를 발현시키도록 채택된 플라스미드 DNA를 포함하고 임의로 추가의 리포터 분자를 포함하며, 상기 환자에서 암세포에 상기 프로토셀이 결합시, 상기 리포터 분자가 암세포로 방출되고 리포터 분자는 치료의 개시때 및 치료 과정 중 변화되는 간격으로 환자가 상기 치료에 반응하는지 안하는지, 반응할 경우, 치료에 대한 반응의 정도를 결정하기 위한 기준과 비교될 수 있는 신호를 끌어내는 방법.
  91. 다수의 다공성 나노입자를 포함하는 경피적 프로토셀로, 다공성 나노입자는 (a) 1종 이상의 약제학적-활성제와 함께 부하되며 (b) 지질 이중층에 의해 캡슐화되거나 지질 이중층을 지지하고, 상기 지질 이중층은 1가 포화 오메가-9 지방산, 알코올, 디올, 용매, 보조-용매, R8 펩타이드, 및 탄성부여성분(edge activator)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 각질층 투과성-증진제 1종 이상을 포함하며, 상기 프로토셀은 약 50 nm 내지 약 300 nm의 평균 직경을 갖는 것인 경피적 프로토셀.
  92. 제91항에 있어서, 상기 1가 포화 오메가-9 지방산이 올레산, 엘라이드산, 에이코세노산, 미드산(mead acid), 에루스산, 및 네르본산, 가장 바람직하게는 올레산,과 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 경피적 프로토셀.
  93. 제91항에 있어서, 상기 알코올이 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 부탄올과 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 용매와 보조-용매는 PEG 400 및 DMSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 경피적 프로토셀.
  94. 제91항에 있어서, 상기 디올이 에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 경피적 프로토셀.
  95. 제91항에 있어서, 상기 탄성부여성분(edge activator)이 담즙염, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 에테르, 및 단일쇄 계면활성제, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 경피적 프로토셀.
  96. 제91항에 있어서, 상기 탄성부여성분이 나트륨 데옥시콜레이트인 경피적 프로토셀.
  97. 제92항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 50 nm 내지 약 300 nm인 경피적 프로토셀.
  98. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 55 nm 내지 약 270 nm인 경피적 프로토셀.
  99. 제92항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 60 nm 내지 약 240 nm인 경피적 프로토셀.
  100. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 210 nm인 경피적 프로토셀.
  101. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 190 nm인 경피적 프로토셀.
  102. 제92항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 160 nm인 경피적 프로토셀.
  103. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 130 nm인 경피적 프로토셀.
  104. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 100 nm인 경피적 프로토셀.
  105. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 90 nm인 경피적 프로토셀.
  106. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약, 더욱 바람직하게는 65 nm 내지 약 80 nm인 경피적 프로토셀.
  107. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 75 nm인 경피적 프로토셀.
  108. 제91항에 있어서, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75 nm인 경피적 프로토셀.
  109. 제91항에 있어서, 상기 프로톨셀의 평균 직경이 대략 70 nm인 경피적 프로토셀.
  110. 제91항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 상기 나노입자가 실리카, 생분해성 폴리머, 졸겔(solgel), 금속 및 금속 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 조성물로 이루어져 있으며; (b) 상기 프로토셀은 적어도 1종의 항암제를 포함하는 것인 경피적 프로토셀.
  111. 제91항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 상기 나노입자가 실리카, 생분해성 폴리머, 졸겔(solgel), 금속 및 금속 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 조성물로 이루어져 있으며; (b) 상기 프로토셀은 에베로리무스, 트라벡테딘, 아브락산, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파닙, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244(ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타닙, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 오로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), PIK-1 조절제, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키나제 억제제, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트-1 또는 2 억제제, 초점 접착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제(mek) 억제제, VEGF 트랩 항체, 페메트렉세드(pemetrexed), 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, Lep-etu, 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 티클리무맙, 이필리무맙, 고실폴(gossypol), Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌기타이드(cilengitide), 기마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 KRX-0402, 루칸톤(lucanthone), LY 317615, 뉴라디압(neuradiab), 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈람파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포사이드, 겜시타빈, 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리시클립; PD0325901, AZD-6244, 카페시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]-, 이나트륨 염, 7수화물, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 공액된 에스트로겐, 베바시주맙, IMC-1C11, CHIR-258); 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 바탈라닙, AG-013736, AVE-0005, [D-Ser(But)6, Azgly 10]의 아세테이트 염(피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트 [C59H84N18O14-(C2H4O2)x (여기서 x=1 내지 2.4], 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, ABX-EGF 항체, 에르비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-57016, 이오나파르닙, BMS-214662, 티피파르닙; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날라이드 히드록삼산, 발프로산, 트리초스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페닙, KRN951, 아미노글루테티마이드, 아르나사크린, 아나그렐라이드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin:BGC) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카르바진, 다시티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 글리백, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레티노산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록스우리딘, 5-데옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로놀락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데니류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포르-유리 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RAD001, ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, 워르트마닌(wortmannin), ZM336372, L-779,450, PEG-필그라스팀, 다르베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시맙, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길레이트된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길레이트된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자시티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도마이드, 겜투주맙, 히드로코르티손, 인터류킨-11, 덱스라족산, 알렘투주맙, 모든(all)-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터류킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 시클로스포린, 리포조말 다우노루비신, Edwina-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디페닐히드라민, 히드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르페라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 다르베포이에틴 알파 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 항암제를 적어도 1종 포함하는 것인 경피적 프로토셀.
  112. (a) 약제학적 유효량의 이마티닙과 함께 부하되며 (b) 지질 이중층에 의해 캡슐화되어 지질 이중층을 지지하는 다공성 나노입자를 다수개 포함하며, 상기 지질 이중층은 PEG 400, DMSO 및 에탄올, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 각질층 투과성-증진서 1종 이상을 포함하고, 상기 프로토셀의 평균 직경이 약 65 nm 내지 약 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75 nm인 경피적 프로토셀.
  113. 제112항에 있어서, 상기 프로토셀의, 이마티닙의 평균 플럭스(average flux)가 대략 0.20 내지 약 0.30 ㎍/㎠시간인 경피적 프로토셀.
  114. 제113항에 있어서, 상기 지질 이중층이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질로 이루어진 것인 경피적 프로토셀.
  115. 암으로 고통받는 환자의 치료 방법으로서, 약제학적-유효량의 제110항 내지 114항 중 어느 한 항의 프로토셀을 환자에게 경피적으로 투여함을 특징으로 하는 방법.
  116. 만성 골수성 백혈병, 위장관기질종양 및 급성 림프구성 백혈병 호산구증가증(HES)로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 중 1종 이상을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서, 약제학적-유효량의 제112항 내지 114항 중 어느 한 항의 프로토셀을 환자에게 경피적으로 투여함을 특징으로 하는 방법.
  117. 암으로 고통받는 환자의 치료 방법으로서, 약제학적-유효량의 제111항의 프로토셀을 환자에게 경피적으로 투여함을 특징으로 하는 방법.
  118. 약제학적 유효량의, 제91항 내지 109항, 112항, 113항 및 114항 중 어느 한 항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 경피적 약제학적 조성물.
  119. 약제학적 유효량의, 제110항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 경피적 약제학적 조성물.
  120. 약제학적 유효량의, 제111항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 경피적 약제학적 조성물.
  121. 아민-함유 실란(AEPTMS)으로 개질되어 있으며 (a) siRNA 또는 리신 독소 A-쇄와 함께 부하되고 (b) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 1종 이상을 포함하는 지질 이중층 (이때 지질 이중층은 양이온성 지질과 1종 이상의 쯔비터이온성 인지질을 포함한다)에 의해 캡슐화되고 지질 이중층을 지지하는, 다수의 음으로 하전된, 나노다공성, 나노입자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀.
  122. 제121항에 있어서, 상기 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로토셀.
  123. 제122항에 있어서, 상기 프로토셀이 다음과 같은 특징 중 적어도 1개를 갖는 것인 프로토셀: 약 600 ㎡/g 이상의 BET 표면적, 약 60% 내지 약 70%의 세공 부피 분율(pore volume fraction), 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 30 nm인 세공으로 이루어진 다중모드 세공 형태학, 및 평균 직경이 약 5 nm 내지 약 15 nm인 세공에 의해 상호연결된 표면-접근성 세공.
  124. 제121항 또는 122항에 있어서, 상기 프로토셀이 1010개의 나노입자 실리카 코어당 대략 10 nM의 siRNA를 캡슐화하는 프로토셀.
  125. 아민-함유 실란(AEPTMS)으로 개질되어 있으며: (a) 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 D1, 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이클린 슈퍼족(superfamily)의 일원을 표적화하는 siRNA 1종 이상과 함께 부하되고; (b) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 1종 이상을 포함하는 지질 이중층에 의해 캡슐화되고 지질 이중층을 지지하는, 다수의 음으로 하전된, 나노다공성, 나노입자 실리카 코어를 포함하며, 이때 (1) 상기 지질 이중층은 SP94 및 엔도조몰리틱(endosomolytic) 펩타이드와 함께 부하되고, (2) 상기 프로토셀은 간세포 암종 세포에 선택적으로 결합하는 것인 프로토셀.
  126. 제123항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOPC/DOPE/콜레스테롤/PEG-2000을 대략 55:5:30:10의 질량비로 포함하는 것인 프로토셀.
  127. 암을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로, 제121항 내지 126항 중 어느 한 항의 프로토셀을 약제학적-유효량으로 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 환자가 간암을 앓고 있으며 약제학적-유효량의 제123항 내지 125항 중 어느 한 항의 프로토셀을 투여하는 방법.
  129. 약제학적-유효량의 제121항 내지 126항 중 어느 한 항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  130. (a) NiV 뉴클레오캡시드 단백질(NiV-N) mRNA의 서열-특이적 분해를 유도하는 siRNA와 함께 부하되며 (b) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 1종 이상을 포함하는 지질 이중층에 의해 캡슐화되고 지질 이중층을 지지하는, 다수의 메조다공성(mesoporous), 나노입자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀.
  131. 제130항에 있어서, 상기 지질 이중층이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 표적화 펩타이드, 및 R8을 포함하며, 상기 메조다공성, 나노입자 실리카 코어는 (1) 각각 대략 100 nm의 평균 직경, 1,000 ㎡/g 이상의 평균 표면적 및 약 20 nm 내지 약 25 nm의 평균 직경을 갖는 표면-접근성 세공을 가지며, (2) 1010개의 입자당 대략 1 μM 또는 그 이상의 siRNA 부하량을 갖는 것인 프로토셀.
  132. 제131항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 에프린 B2(EB2)에 결합하는 펩타이드인 프로토셀.
  133. 제132항에 있어서, 상기 표적화 펩타이드가 TGAILHP (서열 확인 번호: 18)인 프로토셀.
  134. 제133항에 있어서, 상기 프로토셀이 대략 0.01 내지 대략 0.02 중량%의 TGAILHP (서열 확인 번호: 18), 대략 10 중량%의 PEG-2000 및 대략 0.500 중량%의 R8을 포함하는 것인 프로토셀.
  135. 니파 바이러스(Nipah virus: NiV)에 감염되었거나, 감염될 위험이 있는 환자의 치료 방법으로, 약제학적-유효량의 제130항 내지 134항 중 어느 한 항의 프로토셀을 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
  136. 약제학적-유효량의 제130항 내지 134항 중 어느 한 항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  137. (a)(1) 각각 실리콘 원자로 작용성화되는, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, (2) 모노아민 또는 폴리아민, (3) N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(AEPTMS), (4) 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), (5) 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTS), (6) 아미노-작용성 트리알콕시실란, 및 (7) 양자화된 2급 아민, 양자화된 3급 알킬 아민, 양자화된 아미딘, 양자화된 구아니딘, 양자화된 피리딘, 양자화된 피리미딘, 양자화된 피라진, 양자화된 퓨린, 양자화된 이미다졸, 양자화된 피롤, 및 4급 알킬 아민, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아민-함유 실란으로 개질되며;
    (b) siRNA 또는 리신 독소 A-쇄와 함께 부하되고;
    (c) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질을 포함하는 지질 이중층에 의해 캡슐화되고 지질 지지되며, 이때 지질 이중층은 양이온성 지질과 1종 이상의 쯔비터이온성 인지질을 포함하는,
    다수의 음으로 하전된, 나노다공성, 나노입자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀.
  138. 제137항에 있어서, 상기 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로토셀.
  139. 제138항에 있어서, 상기 프로토셀이 다음과 같은 특징 중 적어도 1개를 갖는 것인 프로토셀: 약 600 ㎡/g 이상의 BET 표면적, 약 60% 내지 약 70%의 세공 부피 분율(pore volume fraction), 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 30 nm인 세공으로 이루어진 다중모드 세공 형태학, 및 평균 직경이 약 5 nm 내지 약 15 nm인 세공에 의해 상호연결된 표면-접근성 세공.
  140. 제138항 또는 139항에 있어서, 상기 프로토셀이 1010개의 나노입자 실리카 코어당 대략 10 nM의 siRNA를 캡슐화하는 프로토셀.
  141. (a)(1) 각각 실리콘 원자로 작용성화되는, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, (2) 모노아민 또는 폴리아민, (3) N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(AEPTMS), (4) 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), (5) 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTS), (6) 아미노-작용성 트리알콕시실란, 및 (7) 양자화된 2급 아민, 양자화된 3급 알킬 아민, 양자화된 아미딘, 양자화된 구아니딘, 양자화된 피리딘, 양자화된 피리미딘, 양자화된 피라진, 양자화된 퓨린, 양자화된 이미다졸, 양자화된 피롤, 및 4급 알킬 아민, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아민-함유 실란으로 개질되며;
    (b) 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 D1, 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이클린 슈퍼족(superfamily)의 일원을 표적화하는 siRNA 1종 이상과 함께 부하되고;
    (c) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포르-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](18:1 PEG-2000 PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 콜레스테롤 및 이들의 혼합물/조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 이중층에 의해 캡슐화되고 지질 이중층을 지지하며,
    (1) 상기 지질 이중층은 SP94 및 엔도조몰리틱(endosomolytic) 펩타이드와 함께 부하되고, (2) 상기 프로토셀은 간세포 암종 세포에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는
    다수의 음으로 하전된, 나노다공성, 나노입자 실리카 코어를 포함하는 프로토셀.
  142. 제141항에 있어서, 상기 지질 이중층이 DOPC/DOPE/콜레스테롤/PEG-2000을 대략 55:5:30:10의 질량비로 포함하는 것인 프로토셀.
  143. 암을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로, 제137항 내지 142항 중 어느 한 항의 프로토셀을 약제학적-유효량으로 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 환자가 간암을 앓고 있으며 약제학적-유효량의 제141항 또는 142항의 프로토셀을 투여하는 방법.
  145. 약제학적-유효량의 제137항 내지 142항 중 어느 한 항의 프로토셀과, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
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