ES2919552T3

ES2919552T3 - Procedimientos de utilización de polinucleotidos codificadores de ligando ox40

Info

Publication number: ES2919552T3
Application number: ES16826843T
Authority: ES
Inventors: Joshua Frederick; Ailin Bai
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2022-07-27
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: US20230359371A1; US10143723B2; US20190114090A1; US11003366B2; LT3394093T; WO2017112943A1; EP3394093B1; DK3394093T3; RS63135B1; SI3394093T1; EP3394093A1; US20220378868A1; US20210318817A1; PL3394093T3; PT3394093T; US11403008B2; US20180318385A1; EP4039699A1; US11687256B2; US20200000935A1

Abstract

La divulgación se relaciona con composiciones y métodos para la preparación, fabricación y uso terapéutico de moléculas de polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. También se proporciona un método para activar las células T o aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de utilización de polinucleotidos codificadores de ligando ox40

ANTECEDENTES

El cáncer es una enfermedad caracterizada por la división y el crecimiento celular descontrolado dentro del cuerpo. En los Estados Unidos, aproximadamente un tercio de todas las mujeres y la mitad de todos los hombres experimentarán cáncer en algún momento de su vida. Los polipéptidos participan en todos los aspectos de la enfermedad, incluida la biología de las células cancerosas (carcinogénesis, supresión del ciclo celular, reparación del ADN y angiogénesis), el tratamiento (inmunoterapia, manipulación hormonal, inhibición enzimática), y/o diagnóstico y determinación del tipo de cáncer (marcadores moleculares de cáncer de mama, próstata, colon y cuello uterino, por ejemplo). Con la gran cantidad de consecuencias no deseadas provocadas por los tratamientos estándar tales como la quimioterapia y la radioterapia que se utilizan hoy en día, la terapia genética para la manipulación de péptidos relacionados con enfermedades y sus funciones proporciona una estrategia más específica para el diagnóstico, tratamiento y manejo de enfermedades. Sin embargo, la terapia génica plantea múltiples desafíos que incluyen una respuesta inmunitaria indeseable y problemas de seguridad debido a la incorporación del gen en ubicaciones aleatorias dentro del genoma.

Se están desarrollando varios procedimientos para tratar el cáncer. Por ejemplo, las vacunas de células dendríticas (CD) se han estudiado como una posible terapia contra el cáncer. Sin embargo, las vacunas de CD requieren múltiples etapas para aislar las CD de un sujeto, la manipulación ex vivo de las CD para preparar las células para la presentación del antígeno tumoral y la posterior administración de las CD manipuladas de nuevo al sujeto. Además, se informa que las tasas de respuesta clínica general para las vacunas de CD siguen siendo bajas y la capacidad de las vacunas de CD para inducir la regresión del cáncer sigue siendo baja. Véase, por ejemplo, Kalkinski y col., "Dendritic cell-based therapeutic cancer vaccines: what we have and what we need" ("Vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en células dendríticas: lo que tenemos y lo que necesitamos"), Future Oncol. 5(3):379-390 (2009).

El documento WO 2015/048744 A2 se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunomoduladores. S. Andriani (Cancer Research; vol. 64, n.° 9; 1 de mayo de 2004) se refiere a la transferencia génica mediada por vectores de adenovirus del ligando OX40 a células tumorales en huéspedes portadores de tumores.

BREVE RESUMEN

La presente invención proporciona una formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para su uso en un procedimiento para reducir o disminuir el tamaño de un tumor, inhibir el crecimiento del tumor, o en un procedimiento para tratar el cáncer, donde el ARNm comprende uno o más sitio(s) de unión de microARN (miARN) en una 3'UTR, donde el sitio de unión de microARN es un sitio de unión de miR-122.

También se describen composiciones y procedimientos para activar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Un aspecto de la descripción describe un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otro aspecto, las células T activadas reducen o disminuyen el tamaño de un tumor o inhiben el crecimiento de un tumor en el sujeto.

Otro aspecto de la descripción describe un procedimiento para aumentar el número de células citolíticas naturales (Natural Killer, NK) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otro aspecto, las células NK aumentadas reducen o disminuyen el tamaño de un tumor o inhiben el crecimiento de un tumor en el sujeto.

En algunos aspectos, la descripción describe un procedimiento para activar las células T y aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

En otra realización, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce además la liberación de IL-2. En otra realización, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce además la liberación de IL-4. En otra realización, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce además la liberación de IL-21.

En algunos aspectos, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce la proliferación de células T. En otros aspectos, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce la infiltración de células T en el tumor o aumenta el número de células T que se infiltran en el tumor. En determinados aspectos, la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce una respuesta de células T de memoria. En algunos aspectos, las células T activadas comprenden células T CD4+. En otros aspectos, las células T activadas comprenden células T CD8+. En otros aspectos, las células T activadas comprenden células T CD8. En otros aspectos, las células T activadas comprenden tanto células T CD4+ como células T CD8. En algunos aspectos, el número de células NK aumenta al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, al menos aproximadamente seis veces, al menos aproximadamente siete veces, al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente nueve veces, o al menos aproximadamente diez veces.

En parte de la descripción, el polinucleótido comprende al menos un nucleósido modificado químicamente como se describe en esta invención. En una realización, el al menos un nucleósido modificado químicamente comprende dos o más combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina (y ), Nl-metilpseudouridina (m1^), 2-tiouridina (s2U), 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio- 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-metil-pseudouridina (m1^), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), a-tio-guanosina, atio-adenosina, 5-ciano uridina, 4'-tio uridina 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A) y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deazaguanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQI), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, y dos o más combinaciones de los mismos.

En otro aspecto de la descripción, los nucleósidos en el ARNm se modifican químicamente en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En otro aspecto, los nucleósidos modificados químicamente en el ARNm se seleccionan de entre el grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina, y cualquier combinación de los mismos.

En una realización, los nucleósidos de uridina en el ARNm se modifican químicamente en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En otro aspecto, los nucleósidos de adenina en el ARNm se modifican químicamente en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En otra realización, los nucleósidos de citosina en el ARNm se modifican químicamente en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En otro aspecto, los nucleósidos de guanina en el ARNm se modifican químicamente en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 %.

La presente descripción describe además un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita o aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el ARNm que codifica el polipéptido OX40L es un marco de lectura abierto. En un aspecto, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % a una secuencia enumerada en la tabla 1, donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a un receptor OX40.

Otro aspecto de la descripción describe un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita o aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que comprende un sitio de unión de miARN. En una realización, el sitio de unión de miARN se une a miR-122. En una realización particular, el sitio de unión de miARN se une a miR-122-3p o miR-122-5p.

En un aspecto de la descripción, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % a la SEQ ID NO: 26, donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122. En otro aspecto, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % a la SEQ ID NO: 24, donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122. En otro aspecto, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos que se une a la SEQ ID NO: 22.

Otro aspecto de la descripción describe un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita o aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el polinucleótido comprende además una región no traducida (UTR) en 5'. En algunos aspectos, la UTR 5' comprende una secuencia de ácido nucleico idéntica en al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a una secuencia enumerada en la tabla 3.

En otro aspecto, el polinucleótido utilizado en los procedimientos de la descripción comprende además una UTR en 3'. En algunos aspectos, la UTR 3' comprende una secuencia de ácido nucleico idéntica en al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a una secuencia enumerada en la tabla 4.

En otro aspecto de la descripción, el sitio de unión de miARN se inserta dentro de la UTR 3'. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende además una secuencia espaciadora entre el marco de lectura abierto y el sitio de unión de miARN. En un aspecto, la secuencia espaciadora comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100 nucleótidos.

En algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido comprende además una cap de extremo terminal 5'. En una realización, la cap de extremo terminal 5' es Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, 5' metilG cap, o un análogo de las mismas.

En otro aspecto, el polinucleótido comprende además una poliadenilación en 3' (cola de poliA).

En algunas realizaciones de la descripción, el polinucleótido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez sitios de unión a miARN.

En otro aspecto, el polinucleótido tiene codones optimizados. En un aspecto, el polinucleótido tiene codones optimizados para la expresión en un mamífero. En un aspecto particular, el polinucleótido tiene codones optimizados para la expresión en un ser humano.

En algunos aspectos, el polinucleótido se transcribe in vitro (IVT). En otros aspectos, el polinucleótido es quimérico. En otros aspectos, el polinucleótido es circular.

Otro aspecto de la descripción describe un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita o aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el polipéptido OX40L está fusionado con uno o más polipéptidos heterólogos. En un aspecto, el uno o más polipéptidos heterólogos aumentan una propiedad farmacocinética del polipéptido OX40L

En otro aspecto de la descripción, el polinucleótido comprende además un segundo marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido.

En algunos aspectos de la presente descripción, los procedimientos comprenden además la administración de un segundo polinucleótido. En una realización, el segundo polinucleótido comprende un segundo marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido. En otro aspecto, el segundo marco de lectura abierto es un segundo ARNm. En algunos aspectos, el segundo ARNm comprende al menos un nucleósido modificado químicamente.

En otro aspecto de la descripción, el polinucleótido se formula con un agente de administración. En algunos aspectos, el agente de administración comprende un lipidoide, un liposoma, un lipoplejo, una nanopartícula lipídica, un compuesto polimérico, un péptido, una proteína, una célula, un imitador de nanopartículas, un nanotubo o un conjugado. En un aspecto, el agente de administración es una nanopartícula lipídica. En otro aspecto, la nanopartícula lipídica comprende el lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos PEGilados, lípidos de amino alcohol, KL22, y combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido se formula para la administración in vivo. En un aspecto, el polinucleótido está formulado para administración subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, intraventricular, oral, inhalación de pulverización, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, intratumoral o intramuscular a través de un reservorio implantado, subcutánea, intratumoral o intradérmica. En otro aspecto, el polinucleótido se administra por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intraarticular, por vía intrasinovial, por vía intraesternal, por vía intratecal, por vía intrahepática, por vía intralesional, por vía intracraneal, por vía intraventricular, por vía oral, por inhalación de pulverización, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o a través de un reservorio implantado.

En algunos aspectos, los procedimientos de la presente descripción tratan un cáncer. En un aspecto, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, metástasis óseas, tumores cerebrales, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón de células no pequeñas (cáncer de pulmón no microcítico), cáncer de pulmón de células pequeñas (cáncer de pulmón microcítico), tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer, y cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido se administra mediante un dispositivo que comprende una bomba, un parche, un reservorio de fármaco, un dispositivo de aguja corta, un dispositivo de una sola aguja, un dispositivo de múltiples agujas, un dispositivo de microagujas, un dispositivo de inyección a chorro, un dispositivo balístico de suministro de polvo/partículas, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía de radiofrecuencia, corriente eléctrica, o cualquier combinación de los mismos.

En un aspecto, el polinucleótido se administra por vía intratumoral al sujeto en una dosis unitaria de al menos aproximadamente 10 |jg, al menos aproximadamente 12,5 |jg o al menos aproximadamente 15 |jg. En otro aspecto, la cantidad efectiva está entre aproximadamente 0,10 jg/kg y aproximadamente 1000 mg/kg.

En un aspecto particular de la descripción, el número de células NK aumenta al menos cinco veces a las 24 horas después de la administración.

En otro aspecto, el crecimiento del tumor se inhibe al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o aproximadamente el 100 % después de la administración en comparación con un polinucleótido de control que no codifica un polipéptido OX40L.

En un aspecto de la descripción, los procedimientos de la descripción comprenden además la administración de un antagonista de PD-1 al sujeto. En algunos aspectos, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En un aspecto particular, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos, el antagonista de PD-1 se selecciona de entre el grupo que consiste en Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, y cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, los procedimientos de la descripción comprenden además la administración de un antagonista de PD-L1 al sujeto. En algunos aspectos, el antagonista de PD-L1 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1. En un aspecto particular, el antagonista de PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos, el antagonista de PD-L1 se selecciona de entre el grupo que consiste en Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, y cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, los procedimientos de la descripción comprenden además la administración de un antagonista de CTLA-4 al sujeto. En algunos aspectos, el antagonista de c TlA-4 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4. En un aspecto particular, el antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos, el antagonista de c TlA-4 se selecciona de entre el grupo que consiste en Ipilimumab, Tremelimumab, y cualquier combinación de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

La figura 1 muestra un ejemplo de un polinucleótido (ARNm) que codifica OX40L. El ARNm puede comprender una 5'cap, 5'UTR, un OFR (ARNm) que codifica un polipéptido OX40L, una 3'UTR, un sitio de unión de miR122 y una cola de poli-A.

La figura 2 muestra la expresión de OX40L en la superficie de células B16F10 después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Los picos de la izquierda representan el control (ya sea tratado de forma simulada o tratado con ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación)). Los cuatro picos de la derecha representan la expresión de OX40L a partir de la administración de 6,3 ng, 12,5 ng, 25 ng o 50 ng de ARNm de OX40L.

La figura 3A muestra la expresión de OX40L en la superficie de células HeLa después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L; el tratamiento se realizó en ausencia de mitomicina C. La figura 3B muestra la expresión de OX40L en la superficie de células MC-38 después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L; el tratamiento se realizó en ausencia de mitomicina C. El pico 1 en las figuras 3A y 3B muestra la expresión superficial en células tratadas de forma simulada. Los picos 2-6 muestran la expresión superficial en los días 1, 2, 3, 5 y 7 (respectivamente) después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

La figura 3C muestra la expresión de OX40L en la superficie de células HeLa después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L; el tratamiento se realizó en ausencia de mitomicina C. La figura 3D muestra la expresión de OX40L en la superficie de células MC-38 después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L; el tratamiento se realizó en presencia de mitomicina C. El pico 1 en las figuras 3C y 3D muestra la expresión superficial en células tratadas de forma simulada. Los picos 2-6 muestran la expresión superficial en los días 1, 2, 3, 5 y 7 (respectivamente) después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

La figura 3E muestra la expresión de OX40L humana en la superficie de células HeLa después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El pico 1 muestra la expresión superficial en células tratadas de forma simulada. Los picos 2-6 muestran la expresión superficial en los días 1, 2, 3, 4 y 5 (respectivamente) después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

La figura 3F muestra la cuantificación de proteína OX40L de ratón en lisado celular y sobrenadante de cultivo celular después del tratamiento de células HeLa con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 3G muestra la cuantificación de proteína OX40L humana en lisado celular y sobrenadante de cultivo celular después del tratamiento de células HeLa con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El eje y en las figuras 3F y 3G muestra la cantidad de proteína en nanogramos (ng) por pocillo. La figura 4A muestra un dibujo esquemático del ensayo de activación de células T. Se cultivaron conjuntamente células B16F10 que expresan OX40L o células HeLa con células T CD4+ y anticuerpo anti-CD3 de ratón (células B16F10) o anticuerpo anti-CD3 humano y anti-CD28 humano soluble (células HeLa). La producción de IL-2 se midió utilizando ELISA como correlato de la activación de células T. La figura 4B muestra los resultados del ensayo de activación de células T medidos por IL-2 de ratón. La figura 4C muestra los resultados del ensayo de activación de células T medidos por IL-2 humana. El eje y muestra la expresión de mIL2 en ng/ml.

La figura 4D muestra los datos de la figura 4C con diagrama esquemático que muestra la adición de células que expresan OX40L al ensayo de activación de células T sin tratamiento previo.

La figura 4E muestra un ensayo de activación de células T usando células T preestimuladas cultivadas en presencia o ausencia de células HeLa que expresan OX40L y en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 humano.

La figura 5 muestra los niveles de flujo de luciferasa en tejido tumoral en comparación con tejido hepático en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de luciferasa. Los símbolos representativos son los siguientes. El triángulo invertido en blanco, la estrella en blanco, el rombo en blanco, el rombo sombreado y el círculo en blanco muestran el flujo de luciferasa en el tejido tumoral después de la administración de 50 |jg, 25 |jg, 12,5 |jg, 6,25 |jg y 3,125 |jg de ARNm de mOX40L_miR122 (respectivamente). El triángulo invertido sombreado, la estrella sombreada, el cuadrado en blanco, el cuadrado sombreado y el triángulo en blanco muestran el flujo de luciferasa en el tejido hepático después de la administración de 50 jig, 25 jig, 12,5 jig, 6,25 jig y 3,125 jig de ARNm de mOX40L_miR122 (respectivamente). El círculo sombreado y el triángulo sombreado muestran el flujo de luciferasa en tejido tumoral (círculo sombreado) y tejido hepático (triángulo sombreado) después de la administración del control de PBS.

La figura 6 muestra la cantidad de polipéptido OX40L presente en tejido tumoral de melanoma en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El panel izquierdo muestra 8 horas después del tratamiento y el panel derecho muestra 24 horas después del tratamiento.

La figura 7A muestra la cantidad de polipéptido OX40L presente en tejido tumoral de adenocarcinoma de colon en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un NST-OX40L (ARNm de OX40L no traducible) o sin tratamiento. La expresión de OX40L se midió a las 3 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 168 horas. La figura 7B muestra la cantidad de polipéptido OX40L (superior) y ARNm (inferior) presente en el tejido tumoral tras la administración de dosis crecientes de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 7C muestra la cantidad de polipéptido OX40L (superior) y ARNm (inferior) presente en el tejido hepático tras la administración del mismo polinucleótido. La figura 7D muestra la cantidad de polipéptido OX40L (superior) y ARNm (inferior) presente en el tejido del bazo tras la administración del mismo polinucleótido.

Las figuras 8A-8C muestran la eficacia in vivo (medida el día 42) de administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en un modelo de adenocarcinoma de colon. La figura 8A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con un ARNm de control (control NT OX40L_miR122). La figura 8B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L_miR122). La figura 8C muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier para todos los grupos de tratamiento. (OX40L_miR122, NST_OX40L_miR122, y PBS).

Las figuras 9A-9C muestran la expresión de OX40L en tumores de linfoma de células B A20 en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 9A muestra la expresión de OX40L cuantificada en nanogramos por gramo de tejido tumoral, medida por ELISA. La figura 9B muestra la expresión de OX40L en la superficie celular de células tumorales, medida por citometría de flujo. La figura 9C muestra la expresión de OX40L en la superficie celular de células tumorales medida por citometría de flujo.

Las figuras 10A-10B muestran la infiltración de células citolíticas naturales (NK) en el microambiente tumoral en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 10A muestra el porcentaje promedio de células NK vivas presentes en el microambiente tumoral. La barra de la izquierda muestra el porcentaje de células NK aumentadas después de la administración de mOX40L_mRNA. La barra de la derecha muestra el porcentaje de células NK aumentadas después de la administración de NST mOX40L_mRNA. La figura 10B muestra datos de animales individuales del mismo estudio.

Las figuras 11A-11D muestran la eficacia in vivo de la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en un modelo de tumor de linfoma de células B. La figura 11A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con un ARNm de control (control NST-FIX). La figura 11B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L_miR122). La figura 11C muestra el volumen tumoral promedio para cada grupo, medido el día 35. La figura 11D muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para cada grupo de tratamiento. Los cuadrados muestran el volumen del tumor después de la administración de OX40L_miR122. Los triángulos muestran el volumen del tumor después de la administración de NST-FIX (control).

La figura 12A muestra una respuesta inmunitaria in vivo después de administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Se inocularon ratones con células de adenocarcinoma de colon MC-38. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño palpable, a los ratones se les administró un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L_122; triángulo), un ARNm sin sentido de control (NST-OX40L_122; triángulo invertido) o PBS (cuadrado). Sesenta días después de la administración del polipéptido, los ratones se volvieron a exponer a una segunda inoculación de células tumorales MC-38. La figura 12A muestra el tumor animal individual durante el primer período hasta el día 60. La figura 12B muestra el número de animales que presentan crecimiento tumoral 23 días después de la nueva exposición.

La figura 13 muestra la expresión de OX40L en tumores A20 en varios puntos de tiempo después de una primera y/o segunda dosis de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La expresión se muestra a las 24 horas, 72 horas, 7 días y 14 días después de la administración de una primera dosis del polinucleótido y a las 24 horas, 72 horas y 7 días después de la administración de una segunda dosis del polinucleótido.

Las figuras 14A-14C muestran diferentes tipos de células presentes en el microambiente tumoral tras la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 14A muestra el porcentaje de células que expresan OX40L en tumores A20 que son células cancerosas, células inmunitarias, células no cancerosas/no inmunitarias y células de linaje mieloide. La figura 14B muestra el porcentaje de células que expresan OX40L en tumores MC38 que son células tumorales, células inmunitarias y células de linaje mieloide. La figura 14C muestra el porcentaje de células mieloides en el microambiente tumoral que son células que expresan OX40L tras la administración del polinucleótido.

Las figuras 15A-15D muestran los diferentes tipos de células inmunitarias que se infiltran en el microambiente tumoral en tumores A20 tras la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La figura 15A muestra el porcentaje de células NK en el infiltrado tumoral 24 horas después del tratamiento, según lo detectado por el marcador DX5. La figura 15B muestra el porcentaje de células T CD4+ en el infiltrado tumoral 14 días después del tratamiento, según lo detectado por el marcador CD4. La figura 15C muestra el porcentaje de células T ^cD8+ en el infiltrado tumoral 14 horas después del tratamiento, según lo detectado por el marcador CD8. La figura 15D muestra el porcentaje de células T CD8+ en el infiltrado tumoral de tumores MC3824 y 72 horas después de una primera y segunda dosis de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Las figuras 16A-16B muestran la eficacia in vivo de la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en tumores A20. La figura 16A muestra el volumen del tumor (medido en mm3) a lo largo del tiempo. Los tratamientos se muestran a continuación: mOX40L_miR122 (círculos rellenos); ARNm de control (NST) (cuadrados en blanco); PBS (triángulos en blanco); y sin tratar (círculos en blanco). La figura 16B muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier para los mismos animales.

Las figuras 17A-17B muestran la expresión de la proteína OX40L en hepatocitos humanos primarios, células de cáncer de hígado humano (Hep3B) y células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) a las 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la transfección. La figura 17A muestra la expresión del polipéptido OX40L humano medida en nanogramos por pocillo. La figura 17B muestra la expresión del polipéptido OX40L de ratón medida en nanogramos por pocillo.

Las figuras 18A-18E muestran la eficacia antitumoral in vivo de mOX40L_miR122 administrado por vía intratumoral o intravenosa. La figura 18A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados intratumoralmente con ARNm de control ("NST-OX40L") (las flechas marcan los días de inyección). La figura 18B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados intratumoralmente con ARNm de mOX40L_miR122 ("OX40L-miR122") (las flechas marcan los días de inyección). La figura 18C muestra el crecimiento tumoral en animales tratados por vía intravenosa con ARNm de control ("NST-OX40L") (las flechas marcan los días de inyección). La figura 18D muestra el crecimiento tumoral en animales tratados por vía intravenosa con ARNm de mOX40L_miR122 ("OX40L-miR122") (las flechas marcan los días de inyección). La figura 18E muestra el crecimiento tumoral en animales tratados por vía intravenosa con PBS (las flechas marcan los días de inyección).

La figura 19 muestra las curvas de supervivencia para animales tratados por vía intravenosa con PBS, ARNm de control negativo ("NST-OX40L") o ARNm de mOX40L-miR122 ("OX40L"). Los días de dosis se indican con flechas. Las figuras 20A - 20F muestran la eficacia antitumoral in vivo de la terapia de combinación que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un anticuerpo anti-PD-1. La figura 20A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de ARNm de control ("NST_mOX40L_122") y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). La figura 20B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR122 ("mOX40L_122") y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). La figura 20C muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de ARNm de control. ("NST_mOX40L_122") y anticuerpo anti-PD-1 ("anti-PD-1"). La figura 20D muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR122 ("mOX40L_122") y anticuerpo anti-PD-1 ("anti-PD-1"). La figura 20E muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de anticuerpo anti-PD-1 y PBS. La figura 20F muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con PBS y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). RC = Respondedor completo.

La figura 21 muestra las curvas de supervivencia para animales tratados intratumoralmente con terapia combinada que comprende ARNm de control y anticuerpo de control ("NST_mOX40L_122 IgG2a de rata"), mOX40L_miR122 y anticuerpo de control ("mOX40L_122 IgG2a de rata"), ARNm de control y anticuerpo anti-PD-1 ("NST_mOX40L_122 anti-PD-1"), mOX40L_miR122 y anticuerpo anti-PD-1 ("mOX40L_122 anti-PD-1"), anticuerpo anti-PD-1 y PBS ("PBS anti-PD-1"), y PBS y anticuerpo de control ("PBS IgG2a de rata").

Las figuras 22A - 22B muestran una respuesta inmunitaria de memoria en animales tratados con terapia combinada que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un sitio de unión de miR122 y un anticuerpo anti-PD-1. Los animales se trataron inicialmente con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR122 y anticuerpo anti-PD-1 como se muestra en la figura 20D. Cuatro animales identificados como respondedores completos (RC) se volvieron a exponer con células tumorales MC38. La figura 22A muestra el crecimiento tumoral individual en animales sin tratamiento previo expuestos con células tumorales MC38. La figura 22B muestra el crecimiento tumoral individual en los cuatro animales RC expuestos de nuevo con células tumorales MC38.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente descripción se refiere a procedimientos para activar las células T o aumentar el número de células citolíticas naturales (NK) en un sujeto usando un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El polinucleótido descrito en esta invención puede reducir o disminuir además el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita proporcionando un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

I. Definiciones

Para que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen determinados términos y expresiones. Como se usa en esta descripción, excepto que se indique expresamente lo contrario en esta invención, cada uno de los siguientes términos y expresiones tendrá el significado que se establece a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción.

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos "un" (o "una"), así como los término "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden usar de manera intercambiable en esta invención. En determinados aspectos, el término "un" o "una" significa "único". En otros aspectos, el término "un" o "una" incluye "dos o más" o "múltiples".

Además, "y/o", cuando se usa en esta invención, se debe tomar como una descripción específica de cada uno de los dos elementos o componentes específicos con o sin el otro. Por lo tanto, se pretende que el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en esta invención, incluya "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones técnicas y científicas usados en esta invención tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta descripción. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; el Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos y expresiones usados en esta descripción.

Donde sea que se describan aspectos en esta invención con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Cuando se menciona un intervalo de valores, se debe entender que cada valor entero intermedio, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior indicados de ese intervalo también se describe específicamente, junto con cada subintervalo entre dichos valores. Los límites superior e inferior de cualquier intervalo pueden incluirse o excluirse independientemente del intervalo, y cada intervalo en el que no se incluyen ninguno de los límites o ambos límites también se incluye dentro de la descripción. Cuando se menciona explícitamente un valor, se entiende que también se describen los valores que son aproximadamente de la misma cantidad o magnitud que el valor indicado. Cuando se describe una combinación, también se describe específicamente cada subcombinación de los elementos de esa combinación. Por el contrario, cuando se describen individualmente diferentes elementos o grupos de elementos, también se describen combinaciones de los mismos. Cuando cualquier elemento de una descripción se describe con una pluralidad de alternativas, también se describen por esta invención ejemplos de esa descripción en los que cada alternativa se excluye individualmente o en cualquier combinación con las otras alternativas; más de un elemento de una descripción puede tener tales exclusiones, y por esta invención se describen todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones.

Se hace referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de letras individuales comúnmente aceptados. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'. Se hace referencia a los aminoácidos en esta invención por sus símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission (Comisión de Nomenclatura Bioquímica) de la IUPAC-IUB. En consecuencia, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina y U representa uracilo.

Se hace referencia a los aminoácidos en esta invención por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission de la IUPAC-IUB. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi.

Aproximadamente: el término "aproximadamente", como se usa en relación con un valor numérico a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, indica un intervalo de precisión, familiar y aceptable para un experto en la materia. En general, dicho intervalo de precisión es de ± 10 %.

Cuando se dan los intervalos, se incluyen los extremos finales. Además, a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otra manera a partir del contexto y la comprensión de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o sub-intervalo dentro de los intervalos establecidos en diferentes aspectos de la descripción, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Sustitución de aminoácidos: el término "sustitución de aminoácidos" se refiere a reemplazar un residuo de aminoácido presente en una secuencia original (por ejemplo, una secuencia de consenso) con otro residuo de aminoácido. Un aminoácido puede sustituirse en una secuencia original, por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o mediante procedimientos recombinantes conocidos en la técnica. En consecuencia, una referencia a una "sustitución en la posición X" se refiere a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X con un residuo de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir según el esquema AnY, donde A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido presente de forma natural en la posición n e Y es el residuo de aminoácido de sustitución. En otros aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir según el esquema An(YZ), donde A es el código de una sola letra correspondiente al residuo de aminoácido que sustituye al aminoácido presente de forma natural en la posición X, e Y Z son residuos de aminoácidos de sustitución alternativos, es decir, en el contexto de la presente descripción, las sustituciones (incluso cuando se denominan sustitución de aminoácidos) se realizan a nivel de ácido nucleico, es decir, la sustitución de un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido alternativo se lleva a cabo sustituyendo el codón que codifica el primer aminoácido con un codón que codifica el segundo aminoácido.

Sustitución conservadora de aminoácidos: una "sustitución conservadora de aminoácidos", como se usa en esta invención, es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina o histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina o cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina o triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano o histidina). Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, la sustitución del aminoácido se considera conservadora. En otro aspecto, una cadena de aminoácidos se puede reemplazar de forma conservadora con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de la cadena lateral.

Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras incluyen aquellas en las que (i) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (por ejemplo, Arg, His o Lys) se sustituye con, o por, un residuo electronegativo (por ejemplo, Glu o Asp), (ii) un residuo hidrofílico (por ejemplo, Ser o Thr) se sustituye con, o por, un residuo hidrofóbico (por ejemplo, Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una cisteína o prolina se sustituye con, o por, cualquier otro residuo, o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral hidrofóbica o aromática voluminosa (por ejemplo, Val, His, Ile o Trp) se sustituye con, o por, uno que tiene una cadena lateral más pequeña (por ejemplo, Ala o Ser) o no tiene ninguna cadena lateral (por ejemplo, Gly).

Los trabajadores expertos en la materia pueden identificar fácilmente otras sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, puede tomarse una sustitución de cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, un reemplazo puede ser cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. En general, las sustituciones en regiones funcionalmente importantes de las que se puede esperar que induzcan cambios en las propiedades del polipéptido son aquellas en las que (i) un residuo polar, por ejemplo, serina o treonina, se sustituye con (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína se sustituye con (o por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye con (o por) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye con (o por) uno que no tiene dicha cadena lateral, por ejemplo, glicina. La probabilidad de que una de las sustituciones no conservadoras anteriores pueda alterar las propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la sustitución con respecto a las regiones funcionalmente importantes de la proteína: algunas sustituciones no conservadoras pueden, en consecuencia, tener poco o ningún efecto sobre las propiedades biológicas.

Cantidad efectiva: como se usa en esta invención, el término "cantidad efectiva" de un agente es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto donde se aplica. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata un tumor, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o para inhibir el crecimiento de un tumor, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente. El término "cantidad efectiva" se puede usar de manera intercambiable con "dosis efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva".

Expresión: como se usa en esta invención, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los eventos siguientes: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (porejemplo, mediante splicing, edición, formación de cap en 5' y/o procesamiento en el extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Homología: como se usa en esta invención, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunos aspectos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). Según la descripción, dos secuencias de polinucleótidos se consideran homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, o incluso el 99 % en al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En algunos aspectos, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Según la descripción, dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son idénticas en al menos aproximadamente el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % en al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.

Identidad: como se usa en esta invención, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias a efectos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a efectos de comparación). En determinados aspectos, la longitud de una secuencia alineada a efectos comparativos es al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o el 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. El software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluye, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG, Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research, 12(1), 387(1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).

Respuesta inmunitaria: el término "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que resulta en daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Aislado: como se usa en esta invención, el término "aislado" se refiere a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estuvo asociada (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental). Las sustancias aisladas (por ejemplo, secuencia de nucleótidos o secuencia de proteínas) pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias a partir de las cuales se han asociado. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o más de otros componentes con aspectos a los cuales estuvieron inicialmente asociadas. En algunos aspectos, los agentes aislados tienen una pureza de más de aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99 %. Como se usa en esta invención, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Sustancialmente aislado: por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en el que se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente descripción. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente descripción, o una sal del mismo.

Un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o cualquier composición descrita en esta invención "aislada" es un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o composición que está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta el punto de que ya no están en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, un polinucleótido, vector, polipéptido o composición aislada es sustancialmente pura.

Marco de lectura abierto: como se usa en esta invención, "marco de lectura abierto" u "ORF (open reading frame)" se refiere a una secuencia que no contiene un codón de terminación en un marco de lectura dado.

Unido operativamente: como se usa en esta invención, la expresión "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcritos, entidades, restos o similares.

Polinucleótido: el término "polinucleótido", como se usa en esta invención se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. Este término se refiere a la estructura principal de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ácido desoxirribonucleico ("ADN") de cadena triple, doble y sencilla, así como ácido ribonucleico ("ARN") de cadena triple, doble y sencilla. Esto también incluye formas modificadas, por ejemplo, mediante alquilación y/o mediante capping, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, el término "polinucleótido" incluye polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonuleótidos (que contienen D-ribosa), incluyendo ARNt, ARNr, ARNh, ARNip y ARNm, ya sea con splicing o sin splicing, cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un glucósido N o C de una base de purina o pirimidina y otros polímeros que contienen estructuras principales no nucleotídicas, por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y polímeros de polimorfolino y otros polímeros sintéticos de ácido nucleico específico de secuencia, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita la formación de pares de bases y apilamiento de bases, tal como los que se encuentran en el ADN y el ARN. En aspectos particulares, el polinucleótido comprende un ARNm. En otro aspecto, el ARNm es un ARNm sintético. En algunos aspectos, el ARNm sintético comprende al menos una nucleobase no natural. En algunos aspectos, todas las nucleobases de una determinada clase se han reemplazado con nucleobases no naturales (por ejemplo, todas las uridinas en un polinucleótido descrito en esta invención se pueden reemplazar con una nucleobase no natural, porejemplo, 5-metoxiuridina). En algunos aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, un ARN sintético o un ADN sintético) comprende solo nucleobases naturales, es decir, A, C, T y U en el caso de un ADN sintético, o A, C, T y U en el caso de un ARN sintético.

El experto en la materia apreciará que las bases T en los mapas de codones descritos en esta invención están presentes en el ADN, mientras que las bases T serían reemplazadas por bases U en los ARN correspondientes. Por ejemplo, una secuencia de codón-nucleótido descrita en esta invención en forma de ADN, por ejemplo, un vector o una plantilla de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U en su ARNm transcrito correspondiente. A este respecto, tanto las secuencias de ADN con codones optimizados (que comprenden T) como sus correspondientes secuencias de ARN (que comprenden U) se consideran secuencias de nucleótidos con codones optimizados de la presente descripción. Un experto en la materia también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes reemplazando una o más bases con bases no naturales. Así, por ejemplo, un codón Tt C (mapa de ADN) correspondería a un codón UUC (mapa de ARN), que a su vez correspondería a un codón ^ ^ C (mapa de ARN en el que U se ha reemplazado por pseudouridina).

Los pares de bases A-T y G-C estándar se forman en condiciones que permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre N3-H y C4-oxi de timidina y N1 y C6-NH2, respectivamente, de adenosina y entre C2-oxi, N3 y C4-NH2, de citidina y C2-NH2, N'-H y C6-oxi, respectivamente, de guanosina. Así, por ejemplo, la guanosina (2-amino-6-oxi-9-p-D-ribofuranosil-purina) puede modificarse para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-p-D-ribofuranosil-purina). Dicha modificación da como resultado una base de nucleósido que ya no formará efectivamente un par de bases estándar con la citosina. Sin embargo, la modificación de la citosina (1-p-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-p-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina-) da como resultado un nucleótido modificado que no formará un par de bases efectiva con guanosina pero formará un par de bases con isoguanosina (Patente de EE.UU. n.° 5.681.702 de Collins y col.). La isocitosina está disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina se puede preparar mediante el procedimiento descrito por Switzer y col. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 y la bibliografía allí citada; la 2'-desoxi-5-metil-isocitidina se puede preparar mediante el procedimiento de Tor y col., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y la bibliografía allí citada; y los nucleótidos de isoguanina se pueden preparar usando el procedimiento descrito por Switzer y col., 1993, anteriormente mencionado, y Mantsch y col., 1993, Biochem. 14:5593-5601, o por el procedimiento descrito en la Pat. de EE.UU. n.° 5.780.610 de Collins y col. Se pueden sintetizar otros pares de bases no naturales mediante el procedimiento descrito en Piccirilli y col., 1990, Nature 343:33-37, para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo-[4,3]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona. Se conocen otras unidades de nucleótidos modificadas de este tipo que forman pares de bases únicos, tales como las descritas en Leach y col. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer y col., anteriormente mencionadas.

Secuencia de ácido nucleico: los términos "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico contigua. La secuencia puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario, por ejemplo, un ARNm.

La expresión "secuencia de nucleótidos que codifica" y variantes de la misma se refiere a la secuencia de codificación de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNm o ADN) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o fragmento funcional del mismo como se establece en esta invención. La secuencia de codificación puede incluir además señales de iniciación y finalización unidas operativamente a los elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación que puede dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero al que se le administra el ácido nucleico. La secuencia codificante puede incluir además secuencias que codifican péptidos señal.

Polipéptido: los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en esta invención para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede comprender aminoácidos modificados. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales tale como, homocisteína, ornitina, p-acetilfenilalanina, D-aminoácidos y creatina), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.

El término, como se usa en esta invención, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser un único polipéptido OX40L o puede ser un complejo de múltiples moléculas, tales como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos monocatenarios o multicatenarios. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos multicatenarios. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural.

Profilaxis: como se usa en esta invención, una "profilaxis" se refiere a una medida tomada para mantener la salud e impedir la propagación de una enfermedad. Una "inmunoprofilaxis" se refiere a una medida para producir inmunidad activa o pasiva para impedir la propagación de una enfermedad.

Pseudouridina: como se usa en esta invención, pseudouridina se refiere al isómero C-glucósido del nucleósido uridina. Un "análogo de pseudouridina" es cualquier modificación, variante, isoterma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen pero no se limitan a, 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 1-metilpseudouridina (m1^ ), 1-metil-4-tiopseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ) y 2'-O-metil-pseudouridina (^m).

Vía de transducción de señales: una "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. Como se usa en esta invención, la expresión "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente descripción es el receptor OX40.

Similitud: como se usa en esta invención, el término "similitud" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.

Sujeto: por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, mascotas tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; felinos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; osos, animales de alimentación tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayos; y así. En determinados aspectos, el mamífero es un sujeto humano. En otros aspectos, un sujeto es un paciente humano. En un aspecto particular, un sujeto es un paciente humano que necesita un tratamiento contra el cáncer.

Sustancialmente: como se usa en esta invención, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que ocurren, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en esta invención para capturar la posible falta de integridad inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Tratar, tratamiento, terapia: como se usa en esta invención, el término "tratar" o "tratamiento" o "terapia" se refiere a aliviar, mitigar, mejorar, atenuar, retrasar el inicio de, inhibir la progresión de, reducir la gravedad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de una enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno y/o afección.

Sin modificar: como se usa en esta invención, "sin modificar" hace referencia a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de cambiarse de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo silvestre o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden experimentar una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.

II. Procedimientos de uso

Los procedimientos de la presente descripción describen el uso de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

El OX40L humano fue identificado por primera vez en la superficie de linfocitos humanos infectados con el virus de la leucemia de células T humanas tipo I (HTLV-I) por Tanaka y col. (Tanaka y col., International Journal of Cancer (1985), 36(5):549-55). La OX40L humana es una proteína transmembrana tipo II glicosilada de 34 kDa que existe en la superficie de las células como un trímero. OX40L comprende un dominio citoplasmático (aminoácidos 1-23), un dominio transmembrana (aminoácidos 24-50) y un dominio extracelular (aminoácidos 51-183). OX40L también se conoce como miembro 4 de la superfamilia (ligando) del factor de necrosis tumoral (TNFSF4), CD252, CD134L, glicoproteína 1 activada transcripcionalmente por Tax (TXGP1), glicoproteína 34 (GP34) y ACT-4-L.

Por lo tanto, la presente descripción describe un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

En un aspecto, la activación de las células T en el sujeto está dirigida a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, las células T activadas en el sujeto reducen o disminuyen el tamaño de un tumor o inhiben el crecimiento de un tumor en el sujeto. La activación de las células T se puede medir usando aplicaciones en la técnica tales como la medición de la proliferación de células T; medir la producción de citocinas con ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) o ensayos de inmunospot ligados a enzimas (ELISPOT); o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de células T (por ejemplo, CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, C^d27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como la citometría de flujo.

En algunos aspectos, la presente descripción describe un procedimiento para inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En un aspecto, la proliferación de células T en el sujeto está dirigida a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la proliferación de células T en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La proliferación de células T se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como recuento de células, tinción de viabilidad, ensayos de densidad óptica o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de células T (por ejemplo, CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como la citometría de flujo.

En otros aspectos, la presente descripción describe un procedimiento para inducir la infiltración de células T en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En un aspecto, la infiltración de células T en un tumor del sujeto está dirigida a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la infiltración de células T en un tumor del sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La infiltración de células T en un tumor se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como el corte de tejidos y la tinción de marcadores celulares, la medición de la producción local de citocinas en el sitio del tumor, o la detección de marcadores de superficie de células T con técnicas tales como la citometría de flujo.

En otros aspectos, la presente descripción describe un procedimiento para inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En un aspecto, la respuesta de las células T de memoria en el sujeto está dirigida a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la respuesta de las células T de memoria en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Una respuesta de células T de memoria se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como la medición de marcadores de células T asociados con células T de memoria, la medición de la producción local de citocinas relacionada con la respuesta inmunitaria de memoria, o la detección de marcadores de superficie de células T de memoria con técnicas tales como la citometría de flujo.

En determinados aspectos, las células T activadas por los presentes procedimientos son células CD4, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T activadas por los presentes procedimientos son células Th¹. En otros aspectos, las células T activadas por los presentes procedimientos son células Th². En otros aspectos, las células T activadas por la presente descripción son células T citotóxicas.

En algunos aspectos, las células T que se infiltran mediante los presentes procedimientos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40l+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T que se infiltran mediante los presentes procedimientos son células Th¹. En otros aspectos, las células T que se infiltran mediante los presentes procedimientos son células Th². En otros aspectos, las células T que se infiltran mediante la presente descripción son células T citotóxicas.

En algunos aspectos, las células T de memoria inducidas por los presentes procedimientos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40^l+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T de memoria por los presentes procedimientos son células Th¹. En otros aspectos, las células T de memoria por los presentes procedimientos son células Th². En otros aspectos, las células T de memoria por la presente descripción son células T citotóxicas.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar el número de células citolíticas naturales (NK) en un sujeto que lo necesita que comprende administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En un aspecto, el aumento del número de células NK en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, el aumento del número de células NK en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Los aumentos en el número de células NK en un sujeto se pueden medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como la detección de marcadores de superficie de células NK (por ejemplo, CD335/NKp46; CD336/NKp44; CD337/NPp30) o marcadores de células NK intracelulares (por ejemplo, perforina, granzimas, granulisina).

En determinados aspectos, la administración del ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número total de células NK en el sujeto en comparación con el número de células n K en un sujeto al que no se le administra el ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otros aspectos, la administración del ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número total de células NK en el sujeto en comparación con un sujeto al que se le administra una célula dendrítica transducida con el ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otros aspectos, la administración del ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número de células NK en el sujeto dentro del microambiente tumoral en comparación con el de un sujeto al que no se le administra el ARNm que codifica el polipéptido OX40L. En otros aspectos, la administración del ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número de células NK en el sujeto dentro del microambiente tumoral en comparación con el de un sujeto al que se le administra una célula dendrítica transducida con el ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otros aspectos, la concentración de células NK dentro del microambiente tumoral aumenta mientras que el número total de células NK en el sujeto permanece igual.

En determinados aspectos de la descripción, el número de células NK aumenta al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, al menos aproximadamente seis veces, al menos aproximadamente siete veces, al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente nueve veces, o al menos aproximadamente diez veces en comparación con un control (por ejemplo, solución salina o un ARNm sin expresión de OX40L). En una realización particular, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número de células NK al menos aproximadamente dos veces en comparación con un control (por ejemplo, solución salina o un ARNm sin expresión de OX40L).

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-2 en un sujeto que lo necesita que comprende administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para aumentar la IL-2 en el sujeto que lo necesita. En un aspecto, el aumento de IL-2 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En un aspecto, el aumento en la expresión de IL-2 por el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L es al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente seis veces mayor que un control (por ejemplo, tratado con PBS). La expresión de IL-2 se puede medir utilizando cualquier técnica disponible, tales como los ensayos ELISA o ELISPOT.

En otros aspectos, la presente descripción describe un procedimiento para aumentar la IL-4 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para aumentar la IL-4 en el sujeto que lo necesita. En un aspecto, el aumento de IL-4 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En una realización, el aumento en la expresión de IL-4 por el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L es al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente seis veces mayor que un control (por ejemplo, tratado con PBS). La expresión de IL-4 se puede medir utilizando cualquier técnica disponible, tales como los ensayos ELISA o ELISPOT.

En otros aspectos, la presente descripción describe un procedimiento para aumentar la IL-21 en un sujeto que lo necesita que comprende administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para aumentar la IL-21 en el sujeto que lo necesita. En un aspecto, el aumento de IL-21 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En un aspecto, el aumento en la expresión de IL-21 por el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L es al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente seis veces mayor que un control (por ejemplo, tratado con PBS). La expresión de IL-21 se puede medir utilizando cualquier técnica disponible, tales como los ensayos ELISA o ELISPOT.

El polinucleótido (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción se puede administrar en cualquier vía disponible, incluyendo, pero no limitadas a, intratumoral, enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación en la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraperitoneal (en el peritoneo), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (a través del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, gotas para los ojos (sobre la conjuntiva), o en gotas para los oídos. En otros aspectos, el ARNm de la presente descripción se administra por vía parenteral (por ejemplo, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal), por vía intraventricular, por vía oral, por pulverización de inhalación, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o mediante un reservorio implantado.

La presente descripción también incluye un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinadas realizaciones, la administración intratumoral del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, activación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinadas realizaciones, la administración intratumoral del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, proliferación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la infiltración de células T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinadas realizaciones, la administración intratumoral del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, infiltración de células T en un tumor) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinadas realizaciones, la administración intratumoral del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, respuesta de células T de memoria) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinadas realizaciones, la administración intratumoral del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, aumento de células NK) en comparación con otras vías de administración. El ARNm de la presente descripción se puede formular específicamente para la administración intratumoral como se muestra en otra parte de esta invención.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-2 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-4 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-4 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-21 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intratumoral de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-21 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción también incluye un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intraperitoneal del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, activación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intraperitoneal del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, proliferación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la infiltración de células T en un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intraperitoneal del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, infiltración de células T en un tumor) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intraperitoneal del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, respuesta de células T de memoria) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intraperitoneal del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, aumento de células n K) en comparación con otras vías de administración. El ARNm de la presente descripción se puede formular específicamente para la administración intraperitoneal como se muestra en otra parte de esta invención.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-2 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-4 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-4 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-21 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración intraperitoneal de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-21 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción también incluye un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intravenosa del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, activación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intravenosa del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, proliferación de células T) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir la infiltración de células T en un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intravenosa del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, infiltración de células T en un tumor) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intravenosa del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, respuesta de células T de memoria) en comparación con otras vías de administración.

La presente descripción también incluye un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En determinados aspectos, la administración intravenosa del presente ARNm puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (por ejemplo, aumento de células NK) en comparación con otras vías de administración. El ARNm de la presente descripción se puede formular específicamente para la administración intravenosa como se muestra en otra parte de esta invención.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-2 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-4 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-4 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción describe además un procedimiento para aumentar la IL-21 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar por vía intravenosa un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en el sujeto. En un aspecto, el aumento de IL-21 en el sujeto está dirigido a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto.

La presente descripción incluye además un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L como monoterapia, es decir, sin ningún otro agente anticancerosos en combinación. La presente descripción también describe un procedimiento para aumentar el número de células citolíticas naturales (NK) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L como monoterapia. Algunos aspectos de la descripción también incluyen un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21, o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L como monoterapia.

En determinados aspectos, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con uno o más agentes anticancerosos en el sujeto. En otros aspectos, la descripción incluye un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con uno o más agentes anticancerosos en el sujeto. Otros aspectos de la descripción también describen un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21, o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L con uno o más agentes anticancerosos en el sujeto. En algunas realizaciones, el uno o más agentes anticancerosos son un ARNm. En determinadas realizaciones, el uno o más agentes anticancerosos son un ARNm que codifica un antígeno tumoral. En otros aspectos, el uno o más agentes anticancerosos no son un antígeno tumoral o un ARNm que codifica un antígeno tumoral.

En algunos aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son agentes aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos (Food and Drug Administration, FDA) de los Estados Unidos. En otros aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son un agente aprobado previamente por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.

En algunos aspectos, el sujeto de los presentes procedimientos se ha tratado con una o más terapias estándar de atención. En otros aspectos, el sujeto de los presentes procedimientos no ha respondido a una o más terapias estándar de atención o terapias contra el cáncer. En un aspecto, el sujeto se ha tratado previamente con un antagonista de PD-1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con una terapia de anticuerpos monoclonales anti-PD-1 antes del polinucleótido de los presentes procedimientos. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 comprende Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-L1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con una terapia de anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 antes del polinucleótido de los presentes procedimientos. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el sujeto se ha tratado con un antagonista de CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado previamente con un anticuerpo monoclonal que se une a CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos anti-CTLA-4 comprende Ipilimumab o Tremelimumab.

En algunos aspectos, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 (o una porción de unión a antígeno del mismo) útil para la descripción es pembrolizumab. Pembrolizumab (también conocido como "KEYTRUDA®", lambrolizumab y MK-3475) es un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado dirigido contra el receptor de superficie celular humano PD-1 (muerte programada-1 o muerte celular programada-1). Pembrolizumab se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 8.900.587; véase también http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 (último acceso: 14 de diciembre de 2014). El pembrolizumab ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma en recaída o refractario y del CPCNM (No Small Cell Lung Cancer, NSCLC) avanzado.

En otra realización, el anticuerpo anti-PD-1 útil para la descripción es nivolumab. Nivolumab (también conocido como "OPDIVO®"; anteriormente denominado 5C4, Bm S-936558, MDX-1106 u ONO-4538) es un anticuerpo inhibidor del punto de control inmunitario PD-1 IgG4 (S228P) completamente humano que impide de forma selectiva la interacción con los ligandos PD-1 (PD-L1 y PD-L2), bloqueando así la regulación a la baja de las funciones de las células T antitumorales (Patente de EE.u U. n.° 8.008.449; Wang y col., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). Nivolumab ha mostrado actividad en una variedad de tumores sólidos avanzados, incluyendo el carcinoma de células renales (adenocarcinoma renal o hipernefroma), melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) (Topalian y col., 2012a; Topalian y col., 2014; Drake y col., 2013; documento WO 2013/173223.

En otros aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es MEDI0680 (anteriormente AMP-514), que es un anticuerpo monoclonal contra el receptor PD-1. MEDI0680 se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 8.609.089B2 o en http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047 (último acceso el 14 de diciembre de 2014).

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es BGB-A317, que es un anticuerpo monoclonal humanizado. BGB-A317 se describe en la Publicación de EE.UU. n.° 2015/0079109.

En determinados aspectos, un antagonista de PD-1 es AMP-224, que es una proteína de fusión B7-DC Fc. AMP-224 se analiza en la Publicación de EE.UU. n.° 2013/0017199 o en http://www. cancer.gov/publications/dictionaries/cancerdrug? cdrid=700595 (último acceso el 8 de julio de 2015).

En otros aspectos, la descripción incluye un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-PD-1 comprende Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos, la descripción incluye un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-PD-1 comprende Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-LI útil para la descripción es MSB0010718C (también denominado Avelumab; véase el documento US 2014/0341917) o BMS-936559 (anteriormente 12A4 o MDX-1105) (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 7.943.743; y el documento WO 2013/173223). En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (también denominado Durvalumab; Khleif (2013) en: Proceedings from the European Cancer Congress 2013 (Actas del Congreso Europeo del Cáncer 2013); 27 de septiembre-1 de octubre de 2013; Ámsterdam, Países Bajos.

En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para activar las células T en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 comprende Ipilimumab o Tremelimumab, o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar el número de células NK en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4. En otros aspectos, el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 comprende Ipilimumab o T remelimumab, o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos, la descripción se dirige un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un antagonista de CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, IL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4. En otro aspecto, la descripción se dirige a un procedimiento para aumentar IL-2, IL-4, iL-21 o cualquier combinación de las mismas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto (por ejemplo, por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4.

Un anticuerpo anti-CTLA-4 clínico ejemplar es el mAb 10D1 humano (ahora conocido como ipilimumab y comercializado como YERVOY®) como se describe en la Patente de EE.UU. n.° 6.984.720. Otro anticuerpo anti-CTLA-4 útil para los presentes procedimientos es tremelimumab (también conocido como CP-675.206). Tremelimumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 humano anti-CTLA-4. Tremelimumab se describe en el documento WO/2012/122444, la Publicación de EE.UU. n.° 2012/263677, o la Publ. WO n.° 2007/113648 A2.

Por lo tanto, la administración de ARNm a la que se hace referencia en la presente descripción no se realiza en forma de una célula dendrítica que comprende un ARNm que codifica una proteína OX40L. Más bien, la administración en la presente descripción es una administración directa del ARNm que codifica un polipéptido OX40L al sujeto (por ejemplo a un tumor en un sujeto).

Enfermedades, trastornos y/o afecciones

En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido OX40L de la presente descripción pueden usarse para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita.

En algunos aspectos, el tumor está asociado con una enfermedad, trastorno y/o afección. En una realización particular, la enfermedad, trastorno y/o afección es un cáncer. Por lo tanto, en un aspecto, la administración del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L trata un cáncer.

Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células anormales en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Un "cáncer" o "tejido canceroso" puede incluir un tumor en varias etapas. En determinados aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en etapa 0, de modo que, por ejemplo, el cáncer o tumor se encuentra en una fase muy temprana de desarrollo y no ha hecho metástasis. En algunos aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en etapa I, de modo que, por ejemplo, el cáncer o tumor es de tamaño relativamente pequeño, no se ha diseminado al tejido cercano y no ha hecho metástasis. En otros aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en etapa II o etapa III, de modo que, por ejemplo, el cáncer o tumor es más grande que en la etapa 0 o la etapa I, y ha crecido hacia los tejidos vecinos pero no ha hecho metástasis, excepto potencialmente a los ganglios linfáticos. En otros aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en etapa IV, de manera que, por ejemplo, el cáncer o tumor ha hecho metástasis. La etapa IV también se puede denominar cáncer avanzado o metastásico.

En algunos aspectos, el cáncer puede incluir, pero no se limita a, cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, metástasis óseas, tumores cerebrales, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas (cáncer de pulmón no microcítico), cáncer de pulmón de células pequeñas (cáncer de pulmón microcítico), tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer.

En algunos aspectos, el tumor es un tumor sólido. Un "tumor sólido" incluye, pero no se limita a, sarcoma, melanoma, carcinoma u otro cáncer de tumor sólido. "Sarcoma" se refiere a un tumor compuesto por una sustancia como el tejido conectivo embriónico y está compuesto generalmente por células estrechamente empaquetadas incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abermethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma ameoblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, corio-carcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma con tumor de Wilm, sarcoma de endometrio, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocístico, sarcoma sinovial o sarcoma telangiectásico.

El término "melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma metastásico, melanoma nodular, melanoma subungal o melanoma de diseminación superficial.

El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circuncidantes y producir metástasis. Los carcinomas ejemplares incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedocarcinoma, corpus carcinoma, carcinoma cribriforme, carcinoma en cuirasse (en coraza), carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de ducto, carcinoma durum, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de la matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodo, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de riñón de células renales, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma de células de huso, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma en collar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso o carcinoma villosum.

Otros cánceres que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, leucemia, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer papilar de tiroides, neuroblastoma, cáncer neuroendocrino, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer suprarrenal cortical, cáncer de próstata, cáncer de Müller, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de las trompas de Falopio o carcinoma seroso papilar uterino.

III. Composiciones

Polinucleótidos

El polinucleótido de la presente descripción comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. OX40L es el ligando de OX40 (CD134). OX40L también se ha designado CD252 (grupo de diferenciación 252), superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), miembro 4, glicoproteína 1 activada por transcripción tax, TXGP1 o gp34.

El OX40L humano tiene una longitud de 183 aminoácidos y contiene tres dominios: un dominio citoplasmático de los aminoácidos 1-23; un dominio transmembrana de los aminoácidos 24-50, y un dominio extracelular de los aminoácidos 51-183.

En algunos aspectos, el polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de mamífero. En algunos aspectos, el polipéptido OX40L de mamífero es un polipéptido OX40L murino. En algunos aspectos, el polipéptido OX40L de mamífero es un polipéptido OX40L humano. En algunas realizaciones, el polipéptido OX40L comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polipéptido OX40L comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 % a una secuencia de aminoácidos enumerada en la tabla 1 (por ejemplo,, seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1-3) o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la tabla 1, donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a un receptor OX40.

En otros aspectos, el polipéptido OX40L útil para la descripción comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la tabla 1 con una o más sustituciones conservadoras, donde las sustituciones conservadoras no afectan la unión del polipéptido OX40L a un receptor OX40, es decir, la secuencia de aminoácidos se une al receptor OX40 después de las sustituciones.

En determinadas realizaciones, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 % a la SEQ ID NO: 2), donde el polipéptido OX40L se une a un receptor OX40.

En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L comprende una secuencia idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o el 100 % a una secuencia de ácido nucleico enumerada en la tabla 1 (porejemplo, seleccionada de entre las SEQ ID NO: 4-21).

Tabla 1. Secuencias de polipéptidos polinucleótidos de OX40L

En algunos aspectos, el ARNm útil para los procedimientos comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L. En otros aspectos, el ARNm comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio citoplasmático de OX40L. En algunos aspectos, el ARNm comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio transmembrana de OX40L. En determinados aspectos, el ARNm comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y una transmembrana de OX40L. En otros aspectos, el ARNm comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y un dominio citoplasmático de OX40L. En otros aspectos más, el ARNm comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L, una transmembrana de OX40L, y un dominio citoplasmático de OX40L.

En algunos aspectos, el ARNm comprende una secuencia de codones optimizados que codifica un polipéptido OX40L, por ejemplo, una secuencia de codones optimizados de la Tabla 1 (por ejemplo, seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7-21).

En algunos aspectos, los polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de longitud completa. En algunos aspectos, los polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L humano que tiene una longitud de 183 aminoácidos. En determinados aspectos, el polipéptido OX40L puede carecer de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14, o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o C del polipéptido OX40L.

En algunas realizaciones, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción se modifica estructuralmente o se modifica químicamente. Como se usa en esta invención, una modificación "estructural" es aquella en la que se insertan, eliminan, duplican, invierten o aleatorizan dos o más nucleósidos enlazados en un polinucleótido sin una modificación química significativa de los propios ARNm. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el ARNm "AUCG" puede modificarse químicamente a "AU-5meC-G". El mismo ARNm se puede modificar estructuralmente de "AUCG" a "AUCCCG". En este caso, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.

En algunas realizaciones, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción puede tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o, en otros aspectos, una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina o 5-metoxiuridina. En otra realización, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera).

Cuando el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se modifica química y/o estructuralmente, el ARNm puede denominarse "ARNm modificado". Los ejemplos no limitantes de modificaciones químicas se describen en otra parte de esta invención.

Sitios de unión de microARN

El polinucleótido (por ejemplo ARNm), que codifica un polipéptido OX40L puede comprender además uno o más sitios de unión de microARN. Los microARN (o miARN) son ^aRⁿno codificantes de 19-25 nucleótidos de longitud que se unen a la 3'UTR de las moléculas de ácido nucleico y regula a la baja la expresión génica, ya sea reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o inhibiendo la traducción.

Mediante la ingeniería de secuencias diana de microARN en los polinucleótidos (por ejemplo, en una región similar a 3'UTR u otra región) de la descripción, se puede dirigir la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el microARN en cuestión esté disponible. En un aspecto, el sitio de unión de miARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) se une al miARN maduro correspondiente que forma parte de un complejo de silenciamiento inducido por ARN activo (RISC) que contiene Dicer. En otro aspecto, la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente en RISC degrada el ARNm que contiene el sitio de unión de miARN o impide que se traduzca el ARNm.

Como se usa en esta invención, el término "sitio de unión de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que un microARN se une o se asocia. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en, o de manera adyacente, al sitio de microARN.

Algunos microARN, por ejemplo, miR-122, son abundantes en tejido normal pero están presentes en niveles mucho más bajos en tejido canceroso o tumoral. Por lo tanto, la ingeniería de secuencias diana de microARN (es decir, el sitio de unión de microARN) en los polinucleótidos que codifican un polipéptido OX40L (por ejemplo, en una región similar a 3'UTR u otra región) puede dirigirse eficazmente a la molécula para degradación o traducción reducida en tejido normal (donde el microARN es abundante) mientras proporciona altos niveles de traducción en el tejido canceroso o tumoral (donde el microARN está presente en niveles mucho más bajos). Esto proporciona una estrategia dirigida al tumor para los procedimientos y composiciones de la descripción.

En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es totalmente complementario del miARN (por ejemplo, miR-122), degradando así el ARNm fusionado con el sitio de unión de miARN. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN no es completamente complementario al miARN correspondiente. En determinados aspectos, el sitio de unión de miARN por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene la misma longitud que el miARN correspondiente (por ejemplo, miR-122). En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es un nucleótido más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122, que tiene 22 nt) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos más, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es dos nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos más, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es tres nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es cuatro nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es cinco nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es seis nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es siete nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es ocho nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (porejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (porejemplo, el sitio de unión de miR-122) es nueve nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es diez nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es once nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) es doce nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (por ejemplo, miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. Los sitios de unión de miARN que son más cortos que los miARN correspondientes aún son capaces de degradar el ARNm incorporando uno o más de los sitios de unión de miARN o evitando que el ARNm se traduzca.

En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene suficiente complementariedad con el miARN (por ejemplo, miR-122) de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (por ejemplo, miR-122) escinde el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (porejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (porejemplo, miR-122) induce inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN. En otro aspecto, el sitio de unión del microARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (por ejemplo, miR-122) reprime la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN. En un aspecto, el sitio de unión de miARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene un desajuste con respecto al miARN correspondiente (porejemplo, miR-122). En otro aspecto, el sitio de unión de miARN tiene dos desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene tres desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene cuatro desajustes con respecto al miARN correspondiente. En algunos aspectos, el sitio de unión de miARN tiene cinco desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene seis desajustes con respecto al miARN correspondiente. En determinados aspectos, el sitio de unión de miARN tiene siete desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene ocho desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene nueve desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene diez desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene once desajustes con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión de miARN tiene doce desajustes con respecto al miARN correspondiente.

En determinados aspectos, el sitio de unión de miARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) tiene al menos aproximadamente diez nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente diez nucleótidos contiguos del miARN correspondiente (porejemplo, miR-122), al menos aproximadamente once nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente once nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente doce nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente doce nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente trece nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente trece nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, o al menos aproximadamente catorce nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente catorce nucleótidos contiguos del miARN correspondiente. En algunos aspectos, los sitios de unión de miARN tienen al menos aproximadamente quince nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente quince nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente veinte nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente veinte nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos del miARN correspondiente.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y al menos un sitio de unión de miR122, al menos dos sitios de unión de miR122, al menos tres sitios de unión de miR122, al menos cuatro sitios de unión de miR122, o al menos cinco sitios de unión de miR122. En un aspecto, el sitio de unión de miARN se une a miR-122 o es complementario a miR-122. En otro aspecto, el sitio de unión de miARN se une a miR-122-3p o miR-122-5p. En un aspecto particular, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o el 100 % a la SEQ ID NO: 24, donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122. En otro aspecto particular, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o el 100 % a la SEQ ID NO: 26, donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122. Estas secuencias se muestran en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Sitios de unión de miR-122 miR-122

En algunos aspectos, se inserta un sitio de unión de miARN (por ejemplo, el sitio de unión de miR-122) en el polinucleótido de la descripción en cualquier posición del polinucleótido (por ejemplo, UTR 3'); el sitio de inserción en el polinucleótido puede estar en cualquier parte del polinucleótido siempre que la inserción del sitio de unión de miARN en el polinucleótido no interfiera con la traducción del polipéptido OX40L funcional en ausencia del miARN correspondiente (por ejemplo, miR122); y en presencia del miARN (por ejemplo, miR122), la inserción del sitio de unión de miARN en el polinucleótido y la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del polinucleótido. En una realización, se inserta un sitio de unión de miARN en una 3'UTR del polinucleótido.

En determinados aspectos, se inserta un sitio de unión de miARN en al menos aproximadamente 30 nucleótidos aguas abajo del codón de terminación del ARNm que codifica OX40L. En otros aspectos, un sitio de unión de miARN se inserta en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del codón de terminación del polinucleótido, por ejemplo, el ARNm que codifica OX40L. En otros aspectos, se inserta un sitio de unión de miARN en de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, de aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, de aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, de aproximadamente 45 nucleótidos a aproximadamente 65 nucleótidos aguas abajo del codón de terminación del polinucleótido, por ejemplo, el ARNm que codifica OX40L.

Arquitectura de polinucleótidos IVT

En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente descripción que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L es un polinucleótido IVT. Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm incluyen al menos una región de codificación, una 5'UTR, una 3'UTR, una cap 5' y una cola de poli-A. Los polinucleótidos IVT de la presente descripción pueden funcionar como ARNm, pero se distinguen del ARNm de tipo silvestre en sus características de diseño estructural y/o funcional que sirven, por ejemplo, para sobreponerse a problemas existentes de producción eficaz de polipéptidos utilizando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos.

La construcción primaria de un polinucleótido IVT comprende una primera región de nucleótidos enlazados que está flanqueada por una primera región flanqueante y una segunda región flanqueante. Esta primera región puede incluir, pero no se limita a, el polipéptido OX40L codificado. La primera región flanqueante puede incluir una secuencia de nucleósidos enlazados que funcionan como una región 5' no traducida (UTR) tal como la UTR 5' de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la UTR 5' nativa del polipéptido o una 5'UTR no nativa tal como, pero no limitada a, una UTR 5' heteróloga o una UTR 5' sintética. El IVT que codifica un polipéptido OX40L puede comprender en su extremo 5 una región de secuencia señal que codifica una o más secuencias señal. La región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprende una o más secuencias UTR 5' completas o incompletas. La región flanqueante también puede comprender una cap de extremo terminal 5'. La segunda región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más UTR 3' completas o incompletas que pueden codificar la UTR 3' nativa de OX40L o una UTR 3' no nativa tal como, pero no limitadas a, una UTR 3' heteróloga o una UTR 3' sintética. La región flanqueante también puede comprender una secuencia de cola 3'. La secuencia de cola 3' puede ser, pero no se limita a, una cola de poliA, un cuarteto poliA-G y/o una secuencia de bucle en horquilla.

La unión en puente del extremo 5' de la primera región y la primera región flanqueante es una primera región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de inicio.

La unión en puente del extremo 3' de la primera región y la segunda región flanqueante es una segunda región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de terminación. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de terminación. También se pueden usar múltiples codones de terminación en serie en el polinucleótido ⁱV^t. En algunos aspectos, la región operativa de la presente descripción puede comprender dos codones de terminación. El primer codón de terminación puede ser "TGA" o "UGA" y el segundo codón de terminación puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" o "UAG".

La construcción primaria de polinucleótidos IVT comprende una primera región de nucleótidos enlazados que está flanqueada por una primera región flanqueante y una segunda región flanqueante. Como se usa en esta invención, la "primera región" puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica" o simplemente la "primera región". Esta primera región puede incluir, pero no se limita a, el polipéptido codificado de interés. En un aspecto, la primera región puede incluir, pero no se limita a, el marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido de interés.

El marco de lectura abierto puede optimizarse por codones en su totalidad o en parte. La región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más secuencias UTR 5' completas o incompletas que puede estar completamente optimizadas por codones o parcialmente optimizadas por codones. La región flanqueante puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico incluyendo, pero no limitadas a, secuencias miR, secuencias TERZAK™ y secuencias de control de la traducción. La región flanqueante también puede comprender una cap de extremo terminal 5' 138. La región de capping de extremo terminal 5' puede incluir una cap de origen natural, una cap sintética o una cap optimizada. La segunda región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más UTR 3' completas o incompletas. La segunda región flanqueante puede estar completamente optimizada por codones o parcialmente optimizada por codones. La región flanqueante puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico incluyendo, pero no limitadas a, secuencias miR y secuencias de control de la traducción. Después de la segunda región flanqueante, la construcción primaria de polinucleótidos puede comprender una secuencia de cola 3'. La secuencia de cola 3' puede incluir una región de cola sintética y/o un nucleósido de terminación de cadena. Los ejemplos no limitantes de una región de cola sintética incluyen una secuencia poliA, una secuencia poliC, o un cuarteto poliA-G. Los ejemplos no limitantes de nucleósidos de terminación de cadena incluyen 2'-O metilo, F y ácidos nucleicos bloqueados (LNA).

La unión en puente del extremo 3' de la primera región y la segunda región flanqueante es una segunda región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de terminación. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de terminación. Según la presente descripción, también se pueden usar múltiples codones de terminación en serie.

En algunos aspectos, las regiones flanqueantes primera y segunda del polinucleótido IVT pueden variar independientemente de 15-1000 nucleótidos de longitud (por ejemplo, más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 y 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nucleótidos).

En algunos aspectos, la secuencia de cola del polinucleótido IVT puede variar desde ausente hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 nucleótidos). Cuando la región de cola es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en unidades de o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En este aspecto, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión de poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos y 160 nucleótidos son funcionales.

En algunos aspectos, la región de capping del polinucleótido IVT puede comprender una sola cap o una serie de nucleótidos que forman la cap. En este aspecto, la región de capping puede tener de 1 a 10, por ejemplo, 2-9, 3-8, 4 7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, la cap está ausente.

En algunos aspectos, las regiones operativas primera y segunda del polinucleótido IVT pueden variar de 3 a 40, por ejemplo, 5-30, 10-20, 15, o al menos 4, o 30 o menos nucleótidos de longitud y pueden comprender, además de un codón de inicio y/o terminación, una o más señales y/o secuencias de restricción.

En algunos aspectos, los polinucleótidos IVT pueden modificarse estructuralmente o modificarse químicamente. Cuando los polinucleótidos IVT se modifican química y/o estructuralmente, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos IVT modificados".

En algunos aspectos, si los polinucleótidos IVT se modifican químicamente, pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina o 5-metoxiuridina. En otro aspecto, los polinucleótidos IVT pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera).

En algunos aspectos, los polinucleótidos IVT pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en esta invención, tal como, pero no limitado a, el péptido 2A. La secuencia de polinucleótidos del péptido 2A en el polinucleótido IVT puede modificarse u optimizarse por codones mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o son conocidos en la técnica. En algunos aspectos, esta secuencia puede usarse para separar la región codificante de dos o más polipéptidos de interés en el polinucleótido IVT.

Arquitectura de polinucleótidos quiméricos

En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente descripción es un polinucleótido quimérico. Los polinucleótidos quiméricos o construcciones de ARN descritos en esta invención mantienen una organización modular similar a los polinucleótidos IVT, pero los polinucleótidos quiméricos comprenden una o más modificaciones o alteraciones químicas y/o estructurales que transmiten propiedades útiles al polinucleótido. Como tales, los polinucleótidos quiméricos que son moléculas de ARNm modificadas de la presente descripción se denominan "ARNm quimérico modificado" o "ARNm quimérico".

Los polinucleótidos quiméricos tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores.

Los ejemplos de partes o regiones, donde el polinucleótido quimérico funciona como un ARNm y codifica OX40L, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR, tales como UTR 5' o UTR 3'), regiones codificantes, regiones de cap, regiones de cola de poliA, regiones de inicio, regiones de finalización, regiones de secuencia de señal, y combinaciones de las mismas. Las regiones o partes que se unen o se encuentran entre otras regiones también pueden diseñarse para tener subregiones.

En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos de la descripción tienen una estructura que comprende la Fórmula I.

5' [An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L33' Fórmula I

donde:

cada uno de A y B comprende independientemente una región de nucleósidos enlazados;

ya sea A o B o tanto A como B codifican un polipéptido OX40L descrito en otra parte de esta invención;

C es una región opcional de nucleósidos enlazados;

al menos una de las regiones A, B o C está modificada posicionalmente, donde dicha región modificada posicionalmente comprende al menos dos nucleósidos modificados químicamente de uno o más del mismo tipo de nucleósido de adenosina, timidina, guanosina, citidina o uridina, y donde al menos dos de las modificaciones químicas de nucleósidos del mismo tipo son modificaciones químicas diferentes;

n, o y p son independientemente un número entero entre 15-1000;

x e y son independientemente 1-20;

z es 0-5;

L1 y L2 son restos enlazadores opcionales independientemente, estando dichos restos enlazadores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico; y

L3 es un conjugado opcional o un resto enlazador opcional, estando dicho resto enlazador basado en ácido nucleico o no basado en ácido nucleico.

En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que pueden funcionar como una región 5' no traducida (UTR). La secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una UTR 5' natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido OX40L y la secuencia de nucleósidos enlazados de A puede codificar la UTR 5' nativa del polipéptido OX40L o una UTR 5' no heteróloga tal como, pero no limitada a, una UTR sintética.

En otro aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A puede ser una región de cap. La región cap puede estar ubicada en 5' con respecto a una región de nucleósidos enlazados de A que funcionan como una u Tr 5'. La región de cap puede comprender al menos una cap tal como, pero no limitada a, Cap0, Capí, ARCA, inosina, Ní-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2 y Cap4.

En algunos aspectos, el polinucleótido de la descripción comprende una Cap1 5'UTR. En algunos aspectos, un polinucleótido que comprende la secuencia 5'UTR, por ejemplo, Capí, para codificar un polipéptido OX40L descrito en esta invención aumenta la expresión de OX40L en comparación con los polinucleótidos que codifican OX40L que comprenden una 5'UTR diferente (por ejemplo, CapO, ARCA, inosina, Ní-metil -guanosina, 2'fluoroguanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2 o Cap4). En algunos aspectos, un polinucleótido comprende la Capí 5'UTR, donde el polinucleótido codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende la Capí 5'UTR aumenta la expresión de OX40L.

En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de B comprende al menos un marco de lectura abierto de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido OX40L. La secuencia de ácido nucleico puede tener codones optimizados y/o comprenden al menos una modificación.

En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de C comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que pueden funcionar como una UTR 3'. La secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una UTR 3' natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido OX40L y la secuencia de nucleósidos enlazados de C puede codificar la UTR 3' nativa de un polipéptido OX40L o una

UTR 3' no heteróloga tal como, pero no limitada a, una UTR sintética.

En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que funciona como una UTR 5' y al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de

C comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que funciona como una UTR 3'. En un aspecto, la UTR 5' y la

UTR 3' pueden ser de la misma especie o de especies diferentes. En otro aspecto, la UTR 5' y la UTR 3' pueden codificar las regiones nativas no traducidas de diferentes proteínas de la misma o diferentes especies.

Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente descripción pueden clasificarse como hemímeros, gápmeros, wíngmeros o blóckmeros.

Como se usa en esta invención, un "hemímero" es un polinucleótido quimérico que comprende una región o parte que comprende la mitad de un patrón, porcentaje, posición o población de una modificación o modificaciones químicas y la mitad de un segundo patrón, porcentaje, posición o población de una modificación o modificaciones químicas. Los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción también pueden comprender subregiones de hemímeros. En algunos aspectos, una parte o región es un 50 % de una y un 50 % de otra.

En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico completo es el 50 % de una y el 50 % de la otra. Cualquier región o parte de cualquier polinucleótido quimérico de la descripción puede ser un hemímero. Los tipos de hemímeros incluyen hemímeros de patrón, hemímeros de población o hemímeros de posición. Por definición, los hemímeros son 50:50 por ciento hemímeros.

Como se usa en esta invención, un "gápmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos tres partes o regiones con un espacio (gap) entre las partes o regiones. El "gap" puede comprender una región de nucleósidos enlazados o un solo nucleósido que difiere de la naturaleza quimérica de las dos partes o regiones que lo flanquean. Las dos partes o regiones de un gápmero pueden ser iguales o diferentes entre sí.

Como se usa en esta invención, un "wíngmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos tres partes o regiones con un espacio (gap) entre las partes o regiones. A diferencia de un gápmero, las dos partes o regiones flanqueantes que rodean el espacio en un wíngmero son iguales en grado o tipo. Tal similitud puede estar en la longitud del número de unidades de diferentes modificaciones o en el número de modificaciones. Las alas (wings) de un wíngmero pueden ser más largas o más cortas que el espacio (gap). Las partes o regiones del ala (wing) pueden ser un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % más largas o más cortas que la región que comprende el espacio (gap).

Como se usa en esta invención, un "blóckmero" es un polinucleótido con patrón donde las partes o regiones tienen un tamaño o número y tipo de modificaciones equivalentes. Las regiones o subregiones en un blóckmero pueden tener

50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6162, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,

109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286,

287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500 nucleósidos de longitud.

Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente descripción que tienen un patrón de modificación química se denominan "quimeras de patrón". Las quimeras de patrón también pueden denominarse blóckmeros. Quimeras de patrón son aquellos polinucleótidos que tienen un patrón de modificaciones dentro, a través o entre regiones o partes.

Los patrones de modificaciones dentro de una parte o región son aquellos que comienzan y terminan dentro de una región definida. Los patrones de modificaciones en una parte o región son aquellos patrones que comienzan en una parte o región y terminan en otra parte o región adyacente. Los patrones de modificaciones entre partes o regiones son aquellos que comienzan y terminan en una parte o región y se repiten en una parte o región diferente, que no es necesariamente adyacente a la primera región o parte.

Las regiones o subregiones de quimeras de patrón o blóckmeros pueden tener patrones alternos simples tales como ABAB[AB]n donde cada "A" y cada "B" representan diferentes modificaciones químicas (al menos una de la base, el azúcar o el enlazador de la estructura principal), diferentes tipos de modificaciones químicas (por ejemplo, de origen natural y no natural), diferentes porcentajes de modificaciones o diferentes poblaciones de modificaciones. El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300. Además, cada A o B puede representar de 1-2500 unidades (por ejemplo, nucleósidos) en el patrón. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos tales como patrón AABBAABB[AABB]n (un múltiplo doble alterno) o AAABBBAAABBB[AAABBB]n (un triple múltiplo alterno). El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300.

También se pueden mezclar diferentes patrones para formar un patrón de segundo orden. Por ejemplo, un único patrón alterno se puede combinar con un patrón alterno triple para formar un patrón alterno A'B' de segundo orden. Un ejemplo sería [ABABAB][AAABBBAAABBB] [ABABAB][AAABBBAAABBB] [ABABAB][AAABBBAAABBB], donde [ABABAB] es A' y [AAABBBAAABBB] es B'. De manera similar, estos patrones pueden repetirse n número de veces, donde n=3-300.

Los patrones pueden incluir tres o más modificaciones diferentes para formar un patrón ABCABC[ABC]n. Estos patrones de tres componentes también pueden ser múltiplos, tales como AABBCCAABBCC[AABBCC]n y pueden diseñarse como combinaciones con otros patrones tales como ABCABCAABBCCABCABCAABBCC, y pueden ser patrones de orden superior.

Las regiones o subregiones de modificaciones de posición, porcentaje y población no necesitan reflejar una contribución igual de cada tipo de modificación. Pueden formar series tales como "1-2-3-4", "1-2-4-8", donde cada número entero representa el número de unidades de un tipo de modificación particular. Alternativamente, pueden ser solo impares, tales como "1-3-3-1-3-1-5" o incluso solo pares "2-4-2-4-6-4-8" o una combinación de impares y número par de unidades tales como "1-3-4-2-5-7-3-3-4".

Las quimeras de patrón pueden variar en su modificación química por grado (tales como las descritas anteriormente) o por tipo (por ejemplo, diferentes modificaciones).

Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente descripción que tienen al menos una región con dos o más modificaciones químicas diferentes de dos o más miembros nucleósidos del mismo tipo de nucleósidos (A, C, G, T o U) se denominan quimeras "posicionalmente modificadas". Las quimeras posicionalmente modificadas también se denominan en esta invención quimeras de "colocación selectiva" o "polinucleótidos de colocación selectiva". Como su nombre lo indica, la colocación selectiva se refiere al diseño de polinucleótidos que, a diferencia de los polinucleótidos en la técnica, donde la modificación de cualquier A, C, G, T o U es la misma en virtud del procedimiento de síntesis, pueden tener diferentes modificaciones para los A, C, G, T o U individuales en un polinucleótido o región del mismo. Por ejemplo, en un polinucleótido quimérico posicionalmente modificado, puede haber dos o más modificaciones químicas diferentes en cualquiera de los tipos de nucleósidos de A, C, G, T o U. También puede haber combinaciones de dos o más a cualesquiera dos o más del mismo tipo de nucleósido. Por ejemplo, un polinucleótido quimérico de colocación selectiva o posicionalmente modificado puede comprender 3 modificaciones diferentes de la población de adeninas en la molécula y también tener 3 modificaciones diferentes de la población de citosinas en la construcción, todas las cuales pueden tener una única colocación, no aleatoria.

Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente descripción que tienen un porcentaje de modificación química se denominan "quimeras porcentuales". Las quimeras porcentuales puede tener regiones o partes que comprenden al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 8 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 99 % de modificaciones posicionales, de patrón o de población. Alternativamente, la quimera porcentual puede modificarse completamente en cuanto a la posición, el patrón o la población de modificación. El porcentaje de modificación de una quimera porcentual puede dividirse entre modificaciones naturales y no naturales.

Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente descripción que tienen una población de modificación química se denominan "quimeras de población". Una quimera de población puede comprender una región o parte donde los nucleósidos (su enlace de base, azúcar o estructura principal, o una combinación de los mismos) tienen una población seleccionada de modificaciones. Tales modificaciones pueden seleccionarse de entre poblaciones funcionales tales como modificaciones que inducen, alteran o modulan un resultado fenotípico. Por ejemplo, una población funcional puede ser una población o una selección de modificaciones químicas que aumentan el nivel de una citocina. Otras poblaciones funcionales pueden funcionar individual o colectivamente para disminuir el nivel de una o más citocinas. El uso de una selección de estas modificaciones de función similar en un polinucleótido quimérico constituiría por lo tanto una "quimera de población funcional". Como se usa en esta invención, una "quimera de población funcional" puede ser una cuya característica funcional única está definida por la población de modificaciones como se ha descrito anteriormente o el término puede aplicarse a la función general del polinucleótido quimérico en sí. Por ejemplo, en su conjunto, el polinucleótido quimérico puede funcionar de una manera diferente o superior en comparación con un polinucleótido no modificado o no quimérico.

Cabe señalar que los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina o 5-metoxiuridina, no se consideran polinucleótidos quiméricos. Asimismo, los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (tales como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera) no se consideran polinucleótidos quiméricos. Un ejemplo de un polinucleótido que no es quimérico es el polinucleótido canónico modificado con pseudouridina/5-metil citosina. Estos polinucleótidos uniformes se obtienen en su totalidad a través de la síntesis enzimática de transcripción in vitro (IVT); y debido a las limitaciones de las enzimas sintetizadoras, contienen solo un tipo de modificación cuando se produce cada uno del mismo tipo de nucleósido, es decir, adenosina (A), timidina (T), guanosina (G), citidina (C) o uridina (U), que se encuentra en el polinucleótido. Dichos polinucleótidos se pueden caracterizar como polinucleótidos IVT.

Los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción pueden modificarse estructuralmente o modificarse químicamente. Cuando los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción son químicamente y/o estructuralmente modificados, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos quiméricos modificados".

Las regiones o partes de los polinucleótidos quiméricos pueden estar separadas por un resto enlazador o espaciador. Dichos enlazadores o espacios pueden estar basados en ácidos nucleicos o ser no nucleosídicos.

En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en esta invención, tal como, pero no limitado a, un péptido 2A. La secuencia polinucleotídica del péptido 2A en el polinucleótido quimérico puede modificarse u optimizarse por codones mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o procedimientos conocidos en la técnica.

No obstante de lo anterior, los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción pueden comprender una región o parte que no está modificada posicionalmente o no es quimérica como se define en esta invención. Por ejemplo, una región o parte de un polinucleótido quimérico puede modificarse uniformemente en uno o más A, T, C, G o U pero los polinucleótidos no se modificarán uniformemente en toda la región o parte.

Los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción pueden estar completamente modificados en posición o parcialmente modificados en posición. También pueden tener subregiones que pueden tener cualquier patrón o diseño.

En algunos aspectos, las regiones o subregiones de los polinucleótidos quiméricos pueden variar desde ausentes hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos). Cuando la región es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en unidades o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En este aspecto, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión de poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos son funcionales. Los polinucleótidos quiméricos de la presente descripción que funcionan como un ARNm no necesitan comprender una cola de poliA.

Según la presente descripción, los polinucleótidos quiméricos que funcionan como un ARNm pueden tener una región de capping. La región de capping puede comprender una sola cap o una serie de nucleótidos que forman la cap. En este aspecto, la región de capping puede tener de 1 a 10, por ejemplo, 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, la cap está ausente.

La presente descripción contempla polinucleótidos quiméricos que son circulares o cíclicos. Como su nombre lo indica, los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación.

Los polinucleótidos quiméricos, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos quiméricos, y los procedimientos de fabricación, uso y administración de polinucleótidos quiméricos también se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/53907.

En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos de la descripción comprenden cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de OX40L enumeradas en la tabla 1. En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico de la descripción codifica cualquiera de los polipéptidos OX40L enumerados en la tabla 1.

Polinucleótido circular

El polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L puede ser circular o cíclico. Como se usa en esta invención, "polinucleótidos circulares" o "circP" significa un polinucleótido circular monocatenario que actúa sustancialmente como, y tiene las propiedades de un ARN. El término "circular" también pretende abarcar cualquier configuración secundaria o terciaria del circP. Los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación.

Los polinucleótidos circulares, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos circulares, y los procedimientos de fabricación, uso y administración de polinucleótidos circulares también se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/53904.

En algunos aspectos, el polinucleótido circular codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, los polinucleótidos circulares de la descripción comprenden cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de OX40L enumeradas en la tabla 1. En algunos aspectos, los polinucleótidos circulares de la descripción codifican cualquiera de los polipéptidos OX40L enumerados en la tabla 1. En algunos aspectos, el polinucleótido circular aumenta la expresión de OX40L.

Multímeros de polinucleótidos

En algunos aspectos, múltiples polinucleótidos quiméricos distintos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí a través del extremo 3' usando nucleótidos que están modificados en el extremo 3'. Puede usarse conjugación química para controlar la estequiometría del suministro a las células. Esta relación puede controlarse mediante la unión química de polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT usando un nucleótido terminado en 3'-azido en una especie de polinucleótido y un nucleótido que contiene C5-etinilo o alquinilo en la especie de polinucleótido opuesta. El nucleótido modificado se añade postranscripcionalmente usando transferasa de extremo terminal (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. Después de la adición del nucleótido modificado en 3', las dos especies de polinucleótidos pueden combinarse en una solución acuosa, en presencia o ausencia de cobre, para formar un nuevo enlace covalente a través de un mecanismo de química clic como se describe en la bibliografía.

En otro ejemplo, más de dos polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí usando una molécula enlazadora funcionalizada. Por ejemplo, una molécula de sacárido funcionalizada puede modificarse químicamente para contener múltiples grupos reactivos químicos (SH-, NH2-, N3, etc.) para reaccionar con el resto afín en una molécula de ARNm funcionalizada en 3' (es decir, un éster 3'-maleimida, éster 3'-NHS, alquinilo). El número de grupos reactivos en el sacárido modificado se puede controlar de forma estequiométrica para controlar directamente la relación estequiométrica de polinucleótidos quiméricos conjugados y/o polinucleótidos IVT.

En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos y/o los polinucleótidos IVT pueden unirse juntos en un patrón. El patrón puede ser un patrón alterno simple tal como CD[CD]x donde cada "C" y cada "D" representan un polinucleótido quimérico, polinucleótido IVT, diferentes polinucleótidos quiméricos o diferentes polinucleótidos IVT. El patrón puede repetirse x número de veces donde x=1-300. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos tales como patrón CCDD[CCDD] x (un múltiplo doble alterno) o CCCDDD[CCCDDD] x (un múltiplo triple alterno). El múltiplo doble alterno o el múltiplo triple alterno pueden repetirse x número de veces, donde x= 1-300.

Conjugados y combinaciones de polinucleótidos

El polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L puede diseñarse para conjugarse con otros polinucleótidos, tintes, agentes intercalantes (por ejemplo acridinas), reticulantes (por ejemplo psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, zafirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (por ejemplo. EDTA), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]², poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas, proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea, hormonas y receptores de hormonas, especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores o un fármaco.

La conjugación puede resultar en una mayor estabilidad y/o semivida y puede ser particularmente útil para dirigir los polinucleótidos a sitios específicos en la célula, tejido u organismo.

Polinucleótidos que tienen regiones no traducidas (UTR)

El polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L de la descripción puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos heterólogos. En un aspecto, el uno o más polipéptidos heterólogos mejoran una propiedad farmacocinética o una propiedad farmacodinámica del polipéptido OX40L o un polinucleótido que codifica el polipéptido. En otro aspecto, el uno o más polipéptidos heterólogos comprenden un polipéptido que puede extender la semivida del polipéptido OX40L.

En un aspecto, el ARNm codifica una porción extracelular de un polipéptido OX40L y uno o más polipéptidos heterólogos.

En otro aspecto, el ARNm codifica una región extracelular de un polipéptido OX40L y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto, el ARNm codifica una proteína de fusión que comprende una región extracelular de un polipéptido OX40L y un polipéptido que puede extender la semivida del polipéptido OX40L.

El polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L puede comprender además una o más regiones o partes que actúan o funcionan como una región no traducida. Por definición, las regiones no traducidas de tipo silvestre (UTR) de un gen se transcriben pero no se traducen. En ARNm, la 5'UTR comienza en el sitio de inicio de la transcripción y continúa hasta el codón de inicio, pero no incluye el codón de inicio; mientras que la 3’UTR comienza inmediatamente después del codón de terminación y continúa hasta la señal de finalización de la transcripción. Cada vez hay más evidencia sobre las funciones reguladoras que desempeñan las UTR en términos de estabilidad de la molécula de ácido nucleico y traducción. Las características reguladoras de una UTR se pueden incorporar en los polinucleótidos de la presente descripción para, entre otras cosas, mejorar la estabilidad de la molécula. Las características específicas también se pueden incorporar para asegurar una regulación a la baja controlada de la transcripción en caso de que estén mal dirigidas a sitios de órganos no deseados. Las tablas 3 y 4 proporcionan una lista de UTR ejemplares que pueden utilizarse en los polinucleótidos de la presente descripción.

UTR 5' e inicio de traducción

En determinados aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L comprende además una UTR 5' y/o una secuencia de iniciación de la traducción. Las 5’UTR naturales tienen características que desempeñan un papel en el inicio de la traducción. Albergan distintivos como las secuencias de Kozak, que comúnmente se sabe que están involucradas en el procedimiento por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. También se sabe que 5'UTR forma estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de alargamiento.

Mediante la ingeniería de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los polinucleótidos de la descripción. Por ejemplo, la introducción de UTR 5' de ARNm que se sabe que está regulado al alza en cánceres, tales como c-myc, podría usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, tales como polinucleótidos, en células cancerosas. Las regiones no traducidas útiles en el diseño y la fabricación de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la Publicación de Patente internacional n.° WO 2014/164253A2.

En la tabla 3 se muestra una lista de una región 5' no traducida de la descripción. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.

Tabla 3. Re iones 5' no traducidas

También pueden usarse otras secuencias que no sean UTR como regiones o subregiones dentro de los polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones en regiones de los polinucleótidos. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteínas así como los niveles de polinucleótidos.

Las combinaciones de características pueden incluirse en regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una UTR 5' que puede contener una fuerte señal de inicio de la traducción de Kozak y/o una UTR 3’ que puede incluir una secuencia de oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola de poli-A. 5'Ut R puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido del mismo y/o diferentes genes, tales como las 5'UTR descritas en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20100293625.

Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en la transcripción de la que fueron seleccionadas o pueden alterarse en orientación o ubicación. Por lo tanto, una UTR 5' o 3' puede invertirse, acortarse, alargarse, fabricarse con una o más de otras UTR 5' o UTR 3'.

En algunos aspectos, las secuencias UTR se pueden cambiar de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una UTR 3' o 5' puede alterarse con respecto a una UTR de tipo silvestre o nativa por el cambio en la orientación o ubicación como se ha enseñado anteriormente o puede alterarse por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprenden una UTR variante.

En algunos aspectos, se puede utilizar una UTR doble, triple o cuádruple, tal como una UTR 5' o 3'. Como se usa en esta invención, una UTR "doble" es aquella en la que dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una UTR 3' doble beta-globina como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. 20100129877.

En algunos aspectos, las regiones flanqueantes pueden ser heterólogas. En algunos aspectos, la región 5' no traducida puede derivar de una especie diferente a la región 3' no traducida. La región no traducida también puede incluir elementos potenciadores de la traducción (TEE). Como ejemplo no limitante, el TEE puede incluir los descritos en la Solicitud de EE.UU. n.° 20090226470.

UTR 3’ y los elementos ricos en AU

En determinadas realizaciones, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende además una UTR 3'. 3'-UTR es la sección de ARNm que sigue inmediatamente al codón de terminación de la traducción y, a menudo, contiene regiones reguladoras que influyen postranscripcionalmente en la expresión génica. Las regiones reguladoras dentro de la 3'-UTR pueden influir en la poliadenilación, la eficiencia de la traducción, la localización y la estabilidad del ARNm. En una realización, la 3'-UTR útil para la descripción comprende un sitio de unión para los microARN. En algunos aspectos, la 3'-UTR tiene una región silenciadora, que se une a las proteínas represoras e inhibe la expresión del ARNm. En otros aspectos, la 3'-UTR comprende un elemento rico en a U. Las proteínas se unen a los ARE para afectar la estabilidad o la tasa de descomposición de las transcripciones de manera localizada o afectar el inicio de la traducción. En otros aspectos, la 3'-UTR comprende la secuencia AAUAAA que dirige la adición de varios cientos de residuos de adenina llamados cola de poli(A) al final de la transcripción de ARNm.

La tabla 4 muestra una lista de regiones 3' no traducidas útiles para los ARNm que codifican un polipéptido OX40L. Pueden utilizarse variantes de UTR 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.

Tabla 4A. Re iones 3' no traducidas eem lares

En determinados aspectos, la secuencia UTR 3' útil para la descripción comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o aproximadamente el 100 % a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45-62 y cualquier combinación de las mismas. En una realización particular, la secuencia UTR 3' comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, sitio de unión de miR122. En otros aspectos, una secuencia 3'UTR útil para la descripción comprende 3'UTR-018 (SEQ ID NO: 62).

En determinadas realizaciones, la secuencia UTR 3' comprende uno o más sitios de unión de miARN, por ejemplo, sitios de unión de miR-122, o cualquier otra secuencia de nucleótidos heteróloga en el mismo, sin alterar la función de la UTR 3'. En la tabla 4B se enumeran algunos ejemplos de secuencias UTR 3' que comprenden un sitio de unión de miARN.

Tabla 4B. UTR 3' e em lar con sitios de unión de miARN

En determinados aspectos, la secuencia UTR 3' útil para la descripción comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o aproximadamente el 100 % a la secuencia establecida como SEQ ID NO: 63 o 64.

Regiones que tienen una cap 5‘

El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L puede comprender además una cap en 5'. La cap 5' útil para el ARNm que codifica OX40L puede unirse a la proteína de unión de la cap del ARNm (CBP), aumentando así la estabilidad del ARNm. La cap puede ayudar además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el splicing del ARNm.

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción comprende una estructura de cap no hidrolizable que evita el decapping y, por lo tanto, aumenta la semivida del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la cap requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de capping. Por ejemplo, se puede usar una enzima de capping contra Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de atioguanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la cap 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metilfosfonato y selenofosfato. En determinados aspectos, la cap 5' comprende la 2'-O-metilación de los azúcares de ribosa de los nucleótidos de extremo 5'-terminales y/o 5'-anteterminales en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. En otros aspectos, las cap para el ARNm que codifica OX40L incluyen análogos de cap, que en esta invención también se denominan análogos de cap sintética, cap químicas, análogos de cap química o análogos de cap estructurales o funcionales, que difieren de las cap 5' naturales (es decir endógenas, de tipo silvestre o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de cap. Los análogos de cap pueden sintetizarse químicamente (es decir no enzimáticamente) o enzimáticamente y/o unirse a los polinucleótidos de la descripción.

Por ejemplo, la cap Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido de extremo 5' terminal del polinucleótido con capping. La guanina N7 y 3'-O-metilada proporciona el resto de extremo terminal del polinucleótido con capping. Otra cap ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).

En algunos aspectos, la cap es un análogo de cap de dinucleótido. Como ejemplo no limitante, el análogo de la cap de dinucleótidos puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato, tales como los análogos de la cap de dinucleótidos descritos en la Patente de EE.UU. n.° Us 8.519.110.

En otro aspecto, la cap es un análogo de cap que es una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de cap conocido en la técnica y/o descrito en esta invención. Los ejemplos no limitantes de una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de cap incluyen un análogo de cap N7-(4-clorofenoxietil)-G(5')ppp(5')G y N7-(4-clorofenoxietil)-m3’-°G(5')ppp(5')G (véase, por ejemplo, los diversos análogos de cap y los procedimientos de síntesis de análogos de cap descritos en Kore y col. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574). En otro aspecto, un análogo de cap de la presente descripción es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.

Si bien los análogos de cap permiten el capping concomitante de un polinucleótido o una región del mismo, en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de las transcripciones permanecen sin capping. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de cap de una estructura endógena 5'-cap de ácidos nucleicos producidos por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y una estabilidad celular reducida.

El ARNm que codifica OX40L de la descripción también se puede someter a capping después de la fabricación (ya sea IVT o síntesis química), usando enzimas, para generar estructuras 5'-cap más auténticas. Como se usa en esta invención, la expresión "más auténtica" se refiere a una característica que refleja o imita de cerca, ya sea estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo silvestre. Es decir, una característica "más auténtica" es mejor representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características sintéticas o análogas, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Los ejemplos no limitantes de estructuras 5'cap más auténticas de la presente descripción son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión de la cap, una semivida aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas en 5' y/o un decapping en 5' reducido, en comparación con las estructuras 5'cap sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura 5'cap de tipo silvestre, natural o fisiológica). Por ejemplo, la enzima de capping contra el virus Vaccinia recombinante y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido de extremo 5'-terminal de un polinucleótido y un nucleótido de cap de guanina donde la guanina cap contiene una metilación en N7 y el nucleótido de extremo 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura Cap1. Esta cap da como resultado una mayor competencia de traducción y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas 5'cap conocidas en la técnica. Las estructuras de cap incluyen, pero no se imitan a, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1) y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2).

Según la presente descripción, las cap de extremo 5' terminal pueden incluir cap endógenas o análogos de cap. Según la presente descripción, una cap de extremo 5' terminal puede comprender un análogo de guanina. Los análogos de guanina útiles incluyen, pero no se limitan a, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.

Colas de poli-A

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende además una cola de poli A. En otros aspectos, se pueden incorporar grupos terminales en la cola de poli-A para la estabilización. En otros aspectos, una cola de poli-A comprende colas hidroxilo des-3'. Las colas de poli-A útiles también pueden incluir restos estructurales o modificaciones de 2'-Ometilo como enseñan Junjie Li, y col. (Current Biology, vol. 15, 1501-1507, 23 de agosto de 2005).

En un aspecto, la longitud de una cola de poli-A, cuando está presente, tiene más de 30 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la cola de poli-A tiene más de 35 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500 y 3000 nucleótidos). En algunos aspectos, el polinucleótido o región del mismo incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (por ejemplo, de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2000, de 1500 a 2500, de 1500 a 3000, de 2000 a 3000, de 2000 a 2500 y de 2500 a 3000).

En algunos aspectos, la cola de poli-A se diseña en relación con la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región particular del polinucleótido. Este diseño puede basarse en la longitud de una región codificante, la longitud de una característica o región particular o en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos.

En este contexto, la cola de poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor en longitud que el polinucleótido o característica del mismo. La cola de poli-A también puede diseñarse como una fracción de los polinucleótidos a los que pertenece. En este contexto, la cola de poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción, una región de construcción o la longitud total de la construcción menos la cola de poli-A. Además, los sitios de unión diseñados y la conjugación de polinucleótidos para proteína de unión a poli-A pueden mejorar la expresión.

Además, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir mediante la PABP (proteína de unión a poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola de poli-A. Los experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede analizar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la presente descripción están diseñados para incluir un cuarteto de poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En este aspecto, el cuarteto G se incorpora al final de la cola de poli-A. El polinucleótido resultante se somete y ensayo en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluida la semivida en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto de poliA-G da como resultado una producción de proteínas a partir de un ARNm equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una cola de poli-A de 120 nucleótidos sola.

Región de codón de inicio

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción comprende además regiones que son análogas o funcionan como una región de codón de inicio.

En algunos aspectos, la traducción de un polinucleótido se inicia en un codón que no es el codón de inicio AUG. La traducción del polinucleótido puede iniciarse en un codón de inicio alternativo tal como, pero no limitado a, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG (véase Touriol y col. Biology of the Cell 95 (2003) 169 178 y Matsuda y Mauro PLoS ONE, 2010 5:11). Como ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitante, la traducción de polinucleótidos comienza en el codón de inicio alternativo CTG o CUG. Como otro ejemplo no limitante más, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo GTG o GUG.

Se sabe que los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción, tales como, pero no limitados a, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo, afectan la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido. (Véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro PLoS ONE, 20105:11). La enmascaración de cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción puede usarse para alterar la posición de inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura de un polinucleótido.

En algunos aspectos, se usa un agente de enmascaramiento cerca del codón de inicio o codón de inicio alternativo para enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de iniciación de la traducción en el codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo. Los ejemplos no limitantes de agentes enmascaradores incluyen polinucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados antisentido (LNA) y complejos de unión de exón (EJC) (véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro que describen agentes enmascaradores, polinucleótidos LNA y EJC (PLoS ONE, 2010 5:11)).

En otro aspecto, se usa un agente de enmascaramiento para enmascarar un codón de inicio de un polinucleótido con el fin de aumentar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio alternativo. En algunos aspectos, se usa un agente de enmascaramiento para enmascarar un primer codón de inicio o un codón de inicio alternativo con el fin de aumentar la posibilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio o un codón de inicio alternativo aguas abajo del codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo.

En algunos aspectos, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo está ubicado dentro de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR. El complemento perfecto de un sitio de unión de miR puede ayudar a controlar la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como ejemplo no limitante, el codón de inicio o el codón de inicio alternativo está ubicado en el medio de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR-122. El codón de inicio o codón de inicio alternativo puede estar ubicado después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido, decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.

En otros aspectos, el codón de inicio de un polinucleótido se elimina de la secuencia de polinucleótidos para que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no es el codón de inicio. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón que sigue al codón de inicio eliminado o en un codón de inicio aguas abajo o un codón de inicio alternativo. En un ejemplo no limitante, el codón de inicio ATG o AUG se elimina como los primeros 3 nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos para que se inicie la traducción en un codón de inicio aguas abajo o un codón de inicio alternativo. La secuencia de polinucleótidos donde se eliminó el codón de inicio puede comprender además al menos un agente de enmascaramiento para el codón de inicio aguas abajo y/o codones de inicio alternativos para controlar o intentar controlar el inicio de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.

Región de codón de terminación

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción puede comprender además al menos un codón de terminación o al menos dos codones de terminación antes de la región no traducida (UTR) 3'. El codón de terminación se puede seleccionar de entre UGA, UAA y UAG. En algunos aspectos, los polinucleótidos de la presente descripción incluyen el codón de terminación UGA y un codón de terminación adicional. En un aspecto adicional, el codón de terminación de la adición puede ser ^uA^a. En otro aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción incluyen tres codones de terminación, cuatro codones de terminación o más.

Polinucleótido que comprende ARNm que codifica un polipéptido OX40L

En determinados aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción comprende (i) un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 1 anterior, (ii) un sitio de unión de miR-122, tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 2 anterior, (iii) una UTR 5', tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 3 anterior, y (iv) una UTR 3', tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 4A o 4B anterior. En una realización particular, el polinucleótido de la presente descrición comprende una secuencia expuesta en la tabla 5A a continuación (SEQ ID NO: 65).

Tabla 5A. Polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un sitio de unión de miR-122

Los polinucleótidos adicionales que comprenden un ARNm, un sitio de unión de miR-122, una UTR 5' y una UTR 3' se muestran a continuación en la tabla 5B.

Tabla 5B. Polinucleótidos adicionales que comprenden un ARNm un sitio de unión de miR-122

En algunas realizaciones, el polinucleótido de la descripción comprende al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad con la secuencia de polinucleótidos establecida como SEQ ID NO: 65 en la tabla 5A, donde la proteína codificada por el polinucleótido es capaz de unirse al receptor OX40 de tipo silvestre.

En determinados aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción comprende (i) la cap 5' proporcionada anteriormente, (ii) UTR 5', tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 3 anterior, (iii) un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido OX40L, tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 1 anterior, (iv) un codón de terminación, (v) una UTR 3', tales como las secuencias proporcionadas en la tabla 4A o 4B anterior, y (vi) una cola de poli proporcionada arriba.

IV. Procedimientos de fabricación de polinucleótidos

La presente descripción también contempla procedimientos para fabricar un polinucleótido descrito en esta invención o un complemento del mismo. En algunos aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) descrito en esta invención, y que codifica un polipéptido OX40L, puede construirse usando transcripción in vitro. En otros aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) descrito en esta invención, y que codifica un polipéptido OX40L, puede construirse mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. En otros aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) descrito en esta invención, y que codifica un polipéptido OX40L, se fabrica utilizando una célula huésped. En determinados aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) descrito en esta invención, y que codifica un polipéptido OX40L, se fabrica mediante una o más combinaciones de IVT, síntesis química, expresión de células huésped, o cualquier otro procedimiento conocido en la técnica.

Los nucleósidos de origen natural, los nucleósidos de origen no natural, o combinaciones de los mismos, pueden reemplazar total o parcialmente a los nucleósidos de origen natural presentes en la secuencia de nucleótidos candidata y pueden incorporarse en una secuencia de nucleótidos de secuencia optimizada (por ejemplo, un ARNm) que codifica un polipéptido OX40L. Los ARNm resultantes pueden examinarse a continuación en cuanto a su capacidad para producir proteínas y/o producir un resultado terapéutico.

Síntesis enzimática de transcripción in vitro

Un polinucleótido descrito en esta invención se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP pueden seleccionarse de entre, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluyendo los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de entre, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero no limitadas a, polimerasas capaces de incorporar ácidos nucleicos modificados. Véase la Pub. de EE.UU. n. ° US20130259923.

El sistema IVT típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP pueden seleccionarse de entre, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluyendo los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de entre, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero no limitadas a, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos descritos en esta invención.

Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en la síntesis de los polinucleótidos de la presente descripción.

Las ARN polimerasas se pueden modificar por inserción o deleción de aminoácidos de la secuencia de ARN polimerasa. Como ejemplo no limitante, la ^aRⁿpolimerasa se modifica para mostrar una mayor capacidad para incorporar un nucleótido trifosfato modificado en 2' en comparación con una ARN polimerasa no modificada (véase la Publicación internacional WO2008078180 y la Patente de EE.UU. 8.101.385).

Las variantes pueden obtenerse desarrollando una ARN polimerasa, optimizando la secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de la ARN polimerasa y/o usando otros procedimientos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 se desarrollan utilizando el sistema de evolución dirigida continua establecido por Esvelt y col. (Nature (2011) 472(7344):499-503) donde los clones de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación tal como, pero no limitadas a, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las Pub. de EE.UU. n.° 20100120024 y 20070117112. Las variantes de la ARN polimerasa también pueden incluir, pero no se limitan a, variantes de sustitución, sustitución conservadora de aminoácidos, variantes de inserción, variantes de deleción y/o derivados covalentes.

En un aspecto, el polinucleótido puede diseñarse para ser reconocido por las ARN polimerasas de tipo silvestre o variantes. Al hacerlo, el polinucleótido puede modificarse para que contenga sitios o regiones de cambios de secuencia del polinucleótido quimérico de tipo silvestre u original.

Las reacciones de síntesis de polinucleótidos o ácidos nucleicos pueden llevarse a cabo mediante procedimientos enzimáticos que utilizan polimerasas. Las polimerasas catalizan la creación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en un polinucleótido o cadena de ácido nucleico. Las ADN polimerasas conocidas actualmente se pueden dividir en diferentes familias basándose en la comparación de la secuencia de aminoácidos y el análisis de la estructura cristalina. La ADN polimerasa I (pol I) o la familia de polimerasas A, incluidos los fragmentos Klenow de E. Coli, la ADN polimerasa I de Bacillus, las ADN polimerasas de Thermus aquaticus (Taq) y las ADN y ARN polimerasas T7, se encuentran entre las mejor estudiadas de estas familias. Otra gran familia es la ADN polimerasa a (pol a) o la familia de polimerasas B, que incluye todas las ADN polimerasas de replicación eucariotas y las polimerasas de los fagos T4 y RB69. Aunque emplean un mecanismo catalítico similar, estas familias de polimerasas difieren en la especificidad de sustrato, la eficacia de incorporación de análogos de sustrato, el grado y la velocidad de extensión del cebador, el modo de síntesis de ADN, la actividad exonucleasa y la sensibilidad frente a inhibidores.

Las ADN polimerasas también se seleccionan en función de las condiciones de reacción óptimas que requieren, como la temperatura de reacción, el pH y las concentraciones de plantilla y cebador. A veces se emplea una combinación de más de una ADN polimerasa para lograr el tamaño de fragmento de ADN y la eficacia de síntesis deseados. Por ejemplo, Cheng y col. aumentan el pH, añaden glicerol y dimetilsulfóxido, disminuyen los tiempos de desnaturalización, aumentan los tiempos de extensión y utilizan una ADN polimerasa termoestable secundaria que posee una actividad exonucleasa de 3' a 5' para amplificar eficazmente las dianas largas de los insertos clonados y el ADN genómico humano (Cheng y col., PNAS, vol. 91, 5695-5699 (1994)). Las ARN polimerasas de los bacteriófagos T3, T7 y SP6 se han utilizado ampliamente para preparar ARN para estudios bioquímicos y biofísicos. Las ARN polimerasas, las enzimas de capping y las poli-A polimerasas se describen en la Publicación internacional en tramitación n.° WO2014028429.

En un aspecto, la ARN polimerasa que se puede usar en la síntesis de los polinucleótidos descritos en esta invención es una ARN polimerasa Syn5. (véase Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013). La ARN polimerasa Syn5 se caracterizó recientemente a partir del cianófago marino Syn5 por Zhu y col. donde también identificaron la secuencia promotora (véase Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013). Zhu y col. encontraron que la ARN polimerasa Syn5 catalizaba la síntesis de ARN en un intervalo más amplio de temperaturas y salinidad en comparación con la ARN polimerasa T7. Además, se encontró que el requisito del nucleótido iniciador en el promotor era menos estricto para la ARN polimerasa Syn5 en comparación con la ARN polimerasa T7, lo que hace que la ARN polimerasa Syn5 sea prometedora para la síntesis de ARN.

En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos descritos en esta invención. Como ejemplo no limitante, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis del polinucleótido que requiere un extremo 3' preciso.

En un aspecto, se puede usar un promotor Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, el promotor Syn5 puede ser 5'-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3' como se describe por Zhu y col. (Nucleic Acids Research 2013).

En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de polinucleótidos que comprenden al menos una modificación química descrita en esta invención y/o conocida en la técnica. (véase, por ejemplo, la incorporación de pseudo-UTP y 5Me-CTP descritas en Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013).

En un aspecto, los polinucleótidos descritos en esta invención pueden sintetizarse usando una ARN polimerasa Syn5 que se ha purificado usando el procedimiento de purificación mejorado y modificado descrito por Zhu y col. (Nucleic Acids Research 2013).

Varias herramientas en ingeniería genética se basan en la amplificación enzimática de un gen diana que actúa como plantilla. Para el estudio de secuencias de genes individuales o regiones específicas de interés y otras necesidades de investigación, es necesario generar múltiples copias de un gen diana a partir de una pequeña muestra de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Dichos procedimientos se pueden aplicar en la fabricación de los polinucleótidos de la descripción.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene amplias aplicaciones en la amplificación rápida de un gen diana, así como en el mapeo (cartografía) y secuenciación del genoma. Los componentes clave para la síntesis de ADN comprenden moléculas de ADN diana como plantilla, cebadores complementarios a los extremos de las cadenas de ADN diana, desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP) como bloques de construcción y una ADN polimerasa. A medida que la PCR avanza a través de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión, las moléculas de ADN recién producidas pueden actuar como plantilla para el siguiente círculo de replicación, logrando una amplificación exponencial del ADN diana. La PCR requiere un ciclo de calentamiento y enfriamiento para la desnaturalización e hibridación. Las variaciones de la PCR básica incluyen, PCR asimétrica [Innis y col., PNAS, vol. 85, 9436-9440 (1988)], PCR inversa [Ochman y col., Genetics, vol. 120 (3), 621-623, (1988)], y PCR de transcripción inversa (RT-P^cR) (Freeman y col., BioTechniques, vol. 26(1), 112-22, 124-5 (1999)). En r T-PCR, un ARN monocatenario es la diana deseada y se convierte primero en un ADN bicatenario mediante transcriptasa inversa.

Se han desarrollado una variedad de técnicas isotérmicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro como alternativas o complementos de la PCR. Por ejemplo, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) se basa en la capacidad de una enzima de restricción para formar una muesca (Walker y col., PNAS, vol. 89, 392-396 (1992),). Se inserta una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en una secuencia de cebador hibridada. Los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa y dNTP para formar un dúplex. La enzima de restricción escinde solo una cadenas del dúplex. Cada cadena de una sola ramificación está a continuación disponible como plantilla para la síntesis posterior. SDA no requiere el complicado ciclo de control de temperatura de la PCR.

La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), también llamada amplificación mediada por transcripción (TMA), es también un procedimiento de amplificación isotérmica que utiliza una combinación de ADN polimerasa, transcriptasa inversa, ARNasa H y ARN polimerasa T7 [Compton, Nature, vol. 350, 91-92 (1991)]. Se utiliza un ARN diana como plantilla y una transcriptasa inversa sintetiza su cadena de ADN complementaria. La ARNasa H hidroliza la plantilla de ARN, dejando espacio para que una ADN polimerasa sintetice una cadena de ADN complementaria a la primera cadena de ^aDⁿque es complementaria a la diana de ARN, formando un dúplex de ADN. La ARN polimerasa de T7 genera continuamente cadenas de ARN complementarias de este dúplex de ADN. Estas cadenas de ARN actúan como plantillas para nuevos ciclos de síntesis de ADN, lo que resulta en la amplificación del gen diana.

La amplificación de círculo rodante (RCA) amplifica un polinucleótido circular monocatenario e involucra numerosas rondas de síntesis enzimática isotérmica donde la ADN polimerasa 029 extiende un cebador al progresar continuamente alrededor del círculo de polinucleótidos para replicar su secuencia una y otra vez. Por lo tanto, se consigue una copia lineal de la plantilla circular. A continuación, se puede hibridar un cebador con esta copia lineal y se puede sintetizar su cadena complementaria. [Véase Lizardi y col., Nature Genetics, vol. 19, 225-232 (1998)]. Un ADN circular monocatenario también puede servir como plantilla para la síntesis de ARN en presencia de una ARN polimerasa (Daubendiek y col., JACS, vol. 117, 7818-7819 (1995)). Polidoros y col. describen una amplificación rápida inversa de extremos de ADNc (RACE) RCA. Un ARN mensajero (ARNm) se transcribe de forma inversa en ADNc, seguido de un tratamiento con ARNasa H para separar el ADNc. A continuación, CircLigase circulariza el ADNc en un ADN circular. La amplificación del ADN circular resultante se logra con RCA. (Polidoros y col., BioTechniques, vol. 41, 35-42 (2006)).

Cualquiera de los procedimientos anteriores se puede utilizar en la fabricación de una o más regiones de los polinucleótidos de la presente descripción.

También se usa ampliamente el ensamblaje de polinucleótidos o ácidos nucleicos mediante una ligasa. Las ADN o ARN ligasas promueven la ligadura intermolecular de los extremos 5' y 3' de las cadenas de polinucleótidos mediante la formación de un enlace fosfodiéster. La reacción en cadena de la ligasa (LCR) es una técnica de diagnóstico prometedora basada en el principio de que dos sondas de polinucleótidos adyacentes se hibridan con una cadena de un gen diana y se acoplan entre sí mediante una ligasa. Si un gen diana no está presente, o si hay un desajuste en el gen diana, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), las sondas no pueden acoplarse por ligasa (Wiedmann y col., PCR Methods and Application, vol.3 (4), s51-s64 (1994)). La LCR se puede combinar con diversas técnicas de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección o para aumentar la cantidad de productos si se usa en la síntesis de polinucleótidos y ácidos nucleicos.

Actualmente se encuentran disponibles en el mercado varios kits de preparación de bibliotecas para ácidos nucleicos. Incluyen enzimas y tampones para convertir una pequeña cantidad de muestras de ácido nucleico en una biblioteca indexada para aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los fragmentos de ADN pueden colocarse en un kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNEXT® ULTRATM de NEWENGLAND BIOLABS® para preparación final, ligadura, selección de tamaño, limpieza, amplificación por PCR y limpieza final.

Se está realizando un desarrollo continuo para mejorar las técnicas de amplificación. Por ejemplo, la Pat. de EE.UU.

8.367.328 de Asada y col., enseña la utilización de un potenciador de reacción para aumentar la eficiencia de las reacciones de síntesis de ADN por las ADN polimerasas. El potenciador de la reacción comprende una sustancia ácida o complejos catiónicos de una sustancia ácida. La Pat. de EE.UU. 7.384.739 de Kitabayashi y col., enseña una sustancia suministradora de iones carboxilato que promueve la síntesis enzimática de ^aDⁿ, donde la sustancia suministradora de iones carboxilato se selecciona de entre ácido oxálico, ácido malónico, ésteres de ácido oxálico, ésteres de ácido malónico, sales de ácido malónico y ésteres de ácido maleico. La Pat. de EE.UU. 7.378.262 de Sobek y col., describe una composición enzimática para aumentar la fidelidad de las amplificaciones de ADN. La composición comprende una enzima con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa y otra enzima que es una polimerasa. Ambas enzimas son termoestables y se modifican reversiblemente para permanecer inactivas a temperaturas más bajas.

La Pat. de EE.UU. n.° 7.550.264 de Getts y col. enseña que se realizan múltiples rondas de síntesis de moléculas de ARN con sentido uniendo colas de oligodesoxinucleótidos en el extremo 3' de moléculas de ADNc e iniciando la transcripción de ARN usando ARN polimerasa. La Publicación de Pat. de EE.UU. n.° 2013/0183718 de Rohayem enseña la síntesis de ARN mediante ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRp) que muestran una actividad ARN polimerasa en plantillas de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos con nucleótidos no estándar se pueden sintetizar con polimerización enzimática poniendo en contacto una plantilla que comprende nucleótidos no estándar con una mezcla de nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos de la plantilla como se describe en la Pat. de EE.UU. n.° 6.617.106 de Benner.

Síntesis química

Pueden aplicarse procedimientos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido OX40L. Por ejemplo, se puede sintetizar un solo oligómero de ADN o ARN que contiene una secuencia de nucleótidos optimizada por codones que codifica el polipéptido aislado particular. En otros aspectos, se pueden sintetizar y a continuación ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado. En algunos aspectos, los oligonucleótidos individuales típicamente contienen salientes 5' o 3' para ensamblaje complementario.

Un polinucleótido descrito en esta invención (por ejemplo, ARNm) puede sintetizarse químicamente utilizando procedimientos de síntesis química y posibles sustituciones de nucleobases conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las Publicaciones internacionales n.° WO2014093924, WO2013052523; WO2013039857, WO2012135805, WO2013151671; la Pub. de EE.UU. n.° US20130115272; o las Pat. de EE.UU. n.° US8999380, US8710200.

Purificación

La purificación de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido OX40L descrito en esta invención puede incluir, pero no se limita a, limpieza de polinucleótidos, garantía de calidad y control de calidad. La limpieza se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a, perlas AGENCOu Rt ® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas poli-T, sondas de captura oligo-T LNA™ (EXIQON® Inc, Vedbaek, Dinamarca) o procedimientos de purificación basados en HPLC tales como, pero no limitados a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC). El término "purificado" cuando se usa en relación con un polinucleótido tal como un "polinucleótido purificado" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal como se usa en esta invención, un "contaminante" es cualquier sustancia que hace que otra sea inadecuada, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado por ejemplo, ADN y ARN) está presente en una forma o entorno diferente de aquel donde se encuentra en la naturaleza, o en una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un tratamiento o procedimiento de purificación.

En algunos aspectos, la purificación de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L de la descripción elimina las impurezas que pueden reducir o eliminar una respuesta inmunitaria no deseada, por ejemplo, reduciendo la actividad de las citocinas.

En algunos aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L de la descripción se purifica antes de la administración usando cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) o (LCMS)). En algunos aspectos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC) o (LCMS)), que codifica un polipéptido OX40L descrito en esta invención aumenta la expresión de OX40L en comparación con los polinucleótidos que codifican el polipéptido OX40L purificado mediante un procedimiento de purificación diferente. En algunos aspectos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HP^lC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC) o (LCMS)) codifica un polipéptido OX40L de mamífero. En algunos aspectos, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido OX40L murino. En algunos aspectos, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido OX40L humano. En algunas realizaciones, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2.

En algunos aspectos, el polinucleótido purificado tiene una pureza de al menos aproximadamente el 80 %, una pureza de al menos aproximadamente el 85 %, una pureza de al menos aproximadamente el 90 %, una pureza de al menos aproximadamente el 95 %, una pureza de al menos aproximadamente el 96 %, una pureza de al menos aproximadamente el 97 %, una pureza de al menos aproximadamente el 98 %, una pureza de al menos aproximadamente el 99 %, o una pureza de aproximadamente el 100 %.

Se puede realizar una garantía de calidad y/o verificación del control de calidad utilizando procedimientos tales como, pero no limitados a, electroforesis en gel, absorbancia UV o HPLC analítica.

En otro aspecto, los polinucleótidos pueden secuenciarse mediante procedimientos que incluyen, pero no limitados a PCR con transcriptasa inversa.

V. Modificaciones

Como se usa en esta invención en un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, los términos "modificación química" o, según corresponda, "modificado químicamente" se refieren a la modificación con respecto a los ribo- o desoxirribonucleósidos de adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) en una o más de su posición, patrón, porcentaje o población. En general, en esta invención, estas expresiones no pretenden hacer referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de cap de ARNm de extremo 5'-terminal de origen natural.

En un polipéptido, el término “modificación” se refiere a una modificación respecto al conjunto canónico de 20 aminoácidos.

Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. En algunos aspectos, las regiones pueden contener una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos (nucleobase). En algunos aspectos, un polinucleótido modificado, introducido en una célula, puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido no modificado. En otros aspectos, la modificación está en la nucleobase y/o la estructura del azúcar. En otros aspectos más, la modificación está en la estructura principal.

Modificaciones químicas:

Algunas realizaciones de la presente descripción proporcionan un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el ARNm incluye al menos una modificación química. En algunos aspectos, la modificación química se selecciona de entre pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,), 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina.

Un "nucleósido", como se usa en esta invención, se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (por ejemplo, una pentosa o ribosa) o un derivado del mismo en combinación con una base orgánica (por ejemplo, una purina o pirimidina) o un derivado de la misma (a la que también se denomina en esta invención "nucleobase" (o "base nitrogenada")). Un "nucleótido" como se usa en esta invención, se refiere a un nucleósido, incluido un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento útil, tal como, por ejemplo, de forma química, enzimática o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos no naturales o modificados. Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos enlazados. Tales regiones pueden tener enlaces de estructura principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándar, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.

La formación de pares de bases de nucleótidos modificados abarca no sólo los pares de bases estándar adenosinatimina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también los pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases modificadas o no estándar, donde la disposición de donantes de enlaces de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno permite la formación de enlaces de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar, o entre dos estructuras complementarias de bases no estándar. Un ejemplo de dicha formación de pares de bases no estándar es la formación de pares de bases entre la inosina y adenina, citosina o uracilo del nucleótido modificado. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse en los polinucleótidos de la presente descripción.

El experto en la materia apreciará que, salvo que se indique lo contrario, las secuencias de polinucleótidos establecidas en la presente descripción indicarán "T" en una secuencia de ADN representativa, pero cuando la secuencia representa ARN, se sustituirán las "T" con "U".

Las modificaciones de polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, como polinucleótidos de ARNm) que son útiles en los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a lo siguiente 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina; 2-metilthio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonilo carbamoiladenosina ; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina; 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilo carbamoiladenosinas; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); Isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosins; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosins; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-deaza-adenosina; Nl-metil-adenosina; N6, N6 (dimetil)adenina; N6-cis-hidroxi-isopenteniladenosina; a-tio-adenosina; 2 (amino)adenina; 2 (aminopropil)adenina; 2 (metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2'-Amino-2'-deoxi-ATP; 2'-Azido-2'-deoxi-ATP; 2'-Deoxi-2'-a-aminoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil)adenina; 6 (metil)adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7 (deaza)adenina; 8 (alquenyl)adenina; 8 (alquinil)adenina; 8 (amino)adenina; 8 (tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; deaza adenina; N6 (metil)adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-deaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-Deazaadenosina TP; 2'Fluoro-N6-Bz-deoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-deoxiadenosina TP; 2'-a-etiniladenosina TP; 2-aminoadenina; 2-aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-Trifluorometiladenosina TP; 2-Azidoadenosina TP; 2'-b-Etiniladenosina TP; 2-Bromoadenosina TP; 2'-b-Trifluorometiladenosina TP; 2-cloroadenosina TP; 2'-Deoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-athiometoxiadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-azidoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-bbromoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-fluoroadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-yodoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-mercaptoadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiometoxiadenosina TP; 2-Fluoroadenosina TP; 2-yodoadenosina TP; 2-Mercaptoadenosina TP; 2-metoxi-adenina; 2-metiltio-adenina; 2-Trifluorometiladenosina TP; 3-Deaza-3-bromoadenosina TP; 3-Deaza-3-cloroadenosina TP; 3-Deaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Deaza-3-yodoadenosina TP; 3-Deazaadenosina TP; 4'-Azidoadenosina TP; adenosina 4'-Carbocíclica TP; 4'-Etiniladenosina TP; 5'-Homo-adenosina TP; 8-Aza-ATP; 8-bromo-adenosina TP; 8-Trifluorometiladenosina TP; 9-Deazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-deaza-2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidins; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; Lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-Dimetil-2'-OMeCitidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; Pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-Amino-2'-deoxi-CTP; 2'-Azido-2'-deoxi-CTP; 2'-Deoxi-2'-a-aminocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-a-azidocitidina TP; 3 (deaza) 5 (aza)citosina; 3 (metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(deaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5 (halo)citosina; 5 (metil)citosina; 5 (propinil)citosina; 5 (trifluorometil)citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromo-citidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; deaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metiM-deaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4- tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; Zebularina; (E)-5-(2-Bromovinil)citidina TP; clorhidrato de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'Fluor-N4-Bz-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-Trifluorometilcitidina TP; 2'-b-Etinilcitidina TP; 2'-b-Trifluorometilcitidina TP; 2'-Deoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-a-tiometoxicitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-bbromocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiometoxicitidine TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-etinilcitidina TP; 4'-Azidocitidina TP; citidina 4'-Carbocílica TP; 4'-etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-Cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-Amino-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-Aminoalil-CTP; 5-Cianocitidina TP; 5-Etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; 5'-Homo-citidina TP; 5-Metoxicitidina TP; 5-Trifluorometil-Citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-Benzoil-citidina TP; Pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wyosina; 1,2'-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-deazaguanosina; 7-ciano-7-deazaguanosina; Archaeosina; Metilwyosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; 6-tio-guanosina; 7-deaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; Nl-metil-guanosina; a-thio-guanosine; 2 (propyl)guanine; 2-(alkyl)guanine; 2'-Amino-2'-deoxy-GTP; 2'-Azido-2'-deoxy-GTP; 2'-Deoxi-2'-a-aminoguanosine TP; 2'-Deoxi-2'-a-azidoguanosine TP; 6 (metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7 (alquil)guanina; 7 (deaza)guanina; 7 (metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(deaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8 (alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8 (tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8-(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; deaza guanina; N (metil)guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-deaza-guanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-deaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxoguanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina TP; 2'-a-etinilguanosina TP; 2'-a-Trifluorometilguanosina TP; 2'-b-etinilguanosina TP; 2'-b-Trifluorometilguanosina TP; 2'-Deoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-a-tiometoxiguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-bbromoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-cloroguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-fluoroguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-yodoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-mercaptoguanosine TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiomethoxiguanosina TP; 4'-Azidoguanosina TP; guanosina 4'-Carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-Deazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; Inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; Epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; Manosilqueuosina; Queuosina; aliamino-timidina; aza timidina; deaza timidina; deoxi-timidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-carboximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taurinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; Dihidrouridina; Pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpseduouridina; 1-metil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-Metil-pseudo-Uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina metil éster; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidro-uridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina metil ester; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-Carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridine; 5-metoxiuridine,), 5-metoxiuridine; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5- metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-Metildihidrouridina; 5-ácido Oxiacético - Uridina TP; 5-ácido Oxyacético -metil éster-Uridina TP; Nl-metil-pseudo-uridina; uridina 5-ácido oxiacético; uridine ácido 5-oxiacético metil éster; 3-(3-Amino-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)- 2-tiouridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2'-O-metiluridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 2(tio)-pseudouracil sustituido en 1; 2,4-(ditio)pseudouracilo sustituido en 1; 4 (tio)pseudouracilo sustituido en 1; pseudouracil; 1-(aminoalquilaminocarboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo sustituido en 1; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina TP; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-Metil-pseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracilo; 2' deoxi uridina; 2' fluorouridina; 2-(tio)uracilo; 2,4-(ditio)psuedouracilo; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-guanosina; 2'-Amino-2'-deoxi-UTP; 2'-Azido-2'-deoxi-UTP; 2'-Azido-deoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2' deoxi uridina; 2' fluorouridina; 2'-Deoxi-2'-aaminouridina TP; 2'-Deoxi-2'-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3 (3 amino-3 carboxipropil)uracilo; 4 (tio)pseudouracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracil; 5 (1,3-diazole-1-alquil)uracilo; 5 (2-aminopropil)uracilo; 5 (aminoalquil)uracilo; 5 (dimetilaminoalquil)uracilo; 5 (guanidiniumalquil)uracilo; 5 (metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5 (metoxicarbonil-metil)uracilo; 5 (metil) 2 (tio)uracilo; 5 (metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5 (metil) 4 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5 (propinil)uracilo; 5 (trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo 5-(alquil)uracilo; 5-(alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5- (guanidiniumalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazole-1-alquil)uracilo; 5-(metoxi)uracilo; 5-(metoxicarbonilirietN)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5-(metil) 4 (tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoallil-uridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6 (azo)uracilo; 6- (azo)uracil; 6-aza-uridina; aliamino-uracilo; aza uracil; deaza uracilo; N3 (metil)uracilo; ácido Pseudo-UTP-1-2-etanoico; Pseudouracilo; 4-Tio-pseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-deaza-pseudouridina; 1-propiniluridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tiopseudouridina; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina; 2-tio-1-metil-pseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tiodihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1-metil-pseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-aza-uridina; Dihidropseudouridina; (±)1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; 1-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-Trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-Hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-(3-Amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseudouridina TP; 1-(4-Amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metanesulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxi-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Metilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metilbencil)pseudo-UTP; 1-(4-Nitrobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Nitro-bencil)pseudo-UTP; 1(4-Nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetilpseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-propionil } pseudouridina TP; 1-Acetilpseudouridina TP; 1-alquil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alquil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-alquil-6-alil-pseudo-UTP; 1-alquil-6-etinil-pseudo-UTP; 1-alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-Alilpseudouridina TP; 1-Aminometil-pseudo-UTP; 1-Benzoilpseudouridina TP; 1-Benciloximetilpseudouridina TP; 1-Bencil-pseudo-UTP; 1-Biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-Biotinilpseudouridina TP; 1-Butil-pseudo-UTP; 1-Cianometilpseudouridina TP; 1-Ciclobutilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclobutil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctil-pseudo-UTP; 1-Ciclopentilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclopentil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-UTP; 1-Hexil-pseudo-UTP; 1-Homoallilpseudouridina TP; 1-Hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-Metanesulfonilmetilpseudouridina TP; 1-Metoximetilpseudouridina TP; 1-Metil-6-(2,2,2-Trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(fenil sustituido)pseudo-UTP; 1-Metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-azido-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-cloro-pseudo-UTP; 1-Metil-6-ciano-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etilcarboxilate-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-Metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-hidroxiamino-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-hidroxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-yodo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-propil-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-tert-butilpseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentil-pseudo-UTP; 1-Fenil-pseudo-UTP; 1-Pivaloilpseudouridina TP; 1-Propargilpseudouridina TP; 1-Propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-tert-Butil-pseudo-UTP; 1-Tiometoximetilpseudouridina TP; 1-Tiomorfolinometilpseudouridina TP; 1-Trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-Trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-deoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-deoxi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'-a-Trifluorometiluridina TP; 2'-b-Etiniluridina TP; 2'-b-Trifluorometiluridina TP; 2'-Deoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-Deoxi-2'-a-tiometoxiuridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-Deoxi-2'-bbromouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-fluorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-yodouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-mercaptouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-Alkil-pseudo-UTP; 4'-Azidouridina TP; uridina 4'-Carbocíclica TP; 4'-Etiniluridina TP; 5-(1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-Furanil)uridina TP; 5-Cianouridina TP; 5-Dimetilaminouridina TP; 5'-Homo-uridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-deoxiuridina TP; 5-Feniletiniluridina TP; 5-Trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-Trifluorometil-Uridina TP; 5-Vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-Morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-Tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(fenil sustituido)-pseudo-UTP; 6-Amino-pseudo-UTP; 6-Azido-pseudo-UTP; 6-Bromo-pseudo-UTP; 6-Butilpseudo-UTP; 6-Cloro-pseudo-UTP; 6-Ciano-pseudo-UTP; 6-Dimetilamino-pseudo-UTP; 6-Etoxi-pseudo-UTP; 6-Etilcarboxilate-pseudo-UTP; 6-Etil-pseudo-UTP; 6-Fluoro-pseudo-UTP; 6-Formil-pseudo-UTP; 6-Hidroxiaminopseudo-UTP; 6-Hidroxi-pseudo-UTP; 6-Yodo-pseudo-UTP; 6-iso-Propil-pseudo-UTP; 6-Metoxi-pseudo-UTP; 6-Metilamino-pseudo-UTP; 6-Metil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Propil-pseudo-UTP; 6-tert-Butil-pseudo-UTP; 6-Trifluorometoxi-pseudo-UTP; 6-T rifluorometil-pseudo-UTP; Alfa-tio-pseudo-UTP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbenzenesulfónico) TP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbenzoico) TP; Pseudouridina TP ácido 1-[3-(2-etoxi)]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoxi)-etoxi}-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-[2-etoxi ]-etoxi)-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}] propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-metilfosfónico; Pseudouridina TP ácido 1-metilfosfónico dietil éster; ácido Pseudo-UTP-N1-3-propiónico; ácido Pseudo-UTP-N1-4-butanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-5-pentanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-6-hexanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-7-heptanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoico; ácido Pseudo-UTP-N1-p-benzoico; Wibutosina; Hidroxiwibutosina; Isowiosina; Peroxiwibutosina; hidroxiwibutosina insuficientemente modificada; 4-demetilwiosina; 2,6-(diamino)purina;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo : 1,3-( diaza)-2-( oxo )-fentiazin-1-il;1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-yl;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno;2(amino)purina;2,4,5-(trimetil)fenilo;2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-citidina; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-adenina;2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-uridina;2'-amino-2'-desoxirribosa; 2-amino-6-cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'fluoro-2'-desoxirribosa; bases modificadas con 2'-fluoro; 2'-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidina-3-il; 2-oxo-piridopirimidina-3-il; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)- 7-(propinil)isocarbostyrilil; 3-(metil)isocarbostyrilil; 4-(fluoro)-6-(metil)benzimidazol; 4-(metil)benzimidazol 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; 5 pirimidinas sustituidas; 5-(metil)isocarbostyrililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidina; 6-(azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-il; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio )-3-(aza)-fentizin-1-il; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-il; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-( diaza)-2-( oxo )-fentiazin-1-il; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-( diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio )-3-(aza)-fenoxazinil-il; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio )-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-il; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-( diaza)-2-( oxo )-fenoxazin-1-il; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-( oxo )-fenoxazin-1-il; 7-(propinil)isocarbostirilo; 7-(propinil)isocarbostirilo, propinil7-(aza)indolilo; 7-deazainosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo sustituido; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il sustituido; 9-(metil)-imidizopiridinilo; aminoindolilo; antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidina-2-en-3-ilo; bis-ortosustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidina-2-en-3-ilo; difluorotolilo; hipoxantina; Imidizopiridinilo; Inosinilo; Isocarbostyrililo; Isoguanisina; Purinas N2-sustituidas; N6-metil-2-aminopurina; Purinas N6-sustituidas; Derivados N-alquilados; Naftalenilo; Nitrobenzimidazolilo; Nitroimidazolilo; Nitroindazolilo; Nitropirazolilo; Nubularina; purinas 06-sustituidas; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidina-2-on3-il; orto-sustituido-6-fenil-pirrolopirimidina-2-on-3-il; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidina-2-en-3-il; para-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidina-2-en-3-il; Pentacenil; Fenantracenil; Fenil; propinil-7-(aza)indolil; pirenil; piridopirimidin-3-il; piridopirimidin-3-il, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3-il; pirrolopirimidin-2-on-3-il; pirrolopirimidinil; estilbenzil; 1,2,4-triazoles sustituidos; tetracenil; tubercidina; Xantina; Xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-deaza-2-amino-purina; ribonucleósido de piridina-4-ona; 2-Amino-ribósido-TP; Formicina A TP; Formicina B TP; Pirrolosina TP; 2'-OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-aracidina TP; 2'-OH-ara-uridina TP; 2'-OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6 (19-Aminopentaoxanonadecyl)adenosina TP

En algunas realizaciones, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.

En algunos aspectos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se seleccionan de entre el grupo que consiste en pseudouridina (^y), Nl-metilpseudouridina (mlY), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,), 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina. En algunos aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.

En algunos aspectos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se seleccionan de entre el grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (mlY), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende pseudouridina (^y) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el ARNm comprende 1-metil-pseudouridina (m lY). En algunas realizaciones, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende 1-metil-pseudouridina (m lY) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende 2-tiouridina (s2U). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende metoxi-uridina (mo5U). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende 2-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende N6-metil-adenosina (m6A). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprende N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).

En algunas realizaciones, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L se modifica de forma uniforme (por ejemplo, completamente modificado, modificado en toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los residuos citosina en la secuencia de ARNm con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como cualquiera de los establecidos anteriormente.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una citosina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (por ejemplo, 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina.

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una uridina modificada incluyen 5-ciano uridina o 4'-tio uridina.

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A) y 2,6-Diaminopurina.

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metilinosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ1), 7-metilguanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, o 7-metil-8-oxo-guanosina.

Otras modificaciones que pueden ser útiles en los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se enumeran en la tabla 6.

Tabla 6. Tipos de modificaciones adicionales

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción pueden incluir cualquier enlazador útil entre los nucleósidos. Dichos enlazadores, incluyendo las modificaciones de la estructura principal, se proporcionan en la tabla 7.

Tabla 7. Modificaciones de enlazadores

El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción puede incluir cualquier modificación útil, tal como el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleósido (por ejemplo a un enlace fosfato/a un enlace fosfodiéster/a la estructura principal fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, metilo o etilo) o halo (por ejemplo, cloro o flúor). En determinados aspectos, están presentes modificaciones (porejemplo, una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar y entre nucleósidos. Las modificaciones según la presente descripción pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de hexitol (HNA), o híbridos de los mismos. En esta invención se describen modificaciones adicionales. Los ácidos nucleicos modificados y su síntesis se describen en la Publicación de Patente internacional en tramitación n.° WO2013052523.

En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduce el ARNm. Las características de una respuesta inmune innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc., y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.

Cualquiera de las regiones del polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción puede modificarse químicamente como se enseña en esta invención o como se enseña en la Publicación de Solicitud internacional número WO2013/052523 A1.

En algunos aspectos, un polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción codifica un polipéptido OX40L humano. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 65.

En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción codifica al menos un mutante de OX40L, un fragmento o una variante del mismo, por ejemplo, un fragmento funcional de OX40L que comprende el dominio extracelular de OX40L o un fragmento del dominio extracelular de OX40L, el dominio citoplasmático de OX40L o un fragmento del dominio citoplasmático de OX40L, y/o el dominio transmembrana de OX40L o un fragmento del dominio transmembrana de OX40L.

En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, por ejemplo, ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la descripción se selecciona de entre las secuencias de ácido nucleico de OX40L enumeradas en la tabla 1 (por ejemplo, seleccionadas de entre las SEQ ID NO: 4-21).

El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción también puede incluir bloques de construcción, por ejemplo, ribonucleósidos modificados y ribonucleótidos modificados, de moléculas de polinucleótidos. Por ejemplo, estos bloques de construcción pueden ser útiles para preparar los polinucleótidos de la descripción. Tales bloques de construcción se enseñan en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013052523 y la Publicación de Solicitud internacional n.° WO 2014/093924A1.

Modificaciones en el azúcar

Los nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de bloques de construcción), que pueden incorporarse en un polinucleótido (por ejemplo, ARN o ARNm, como se describe en esta invención), que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción, pueden modificarse en el azúcar del ácido ribonucleico. Por ejemplo, el grupo hidroxilo 2' (OH) se puede modificar o reemplazar con varios sustituyentes diferentes. Las sustituciones ejemplares en la posición 2' incluyen, pero no se limitan a, H, halo, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido; alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido; ariloxi C^6-10opcionalmente sustituido; cicloalquilo C^3-8opcionalmente sustituido; cicloalcoxi C^3-8opcionalmente sustituido; ariloxi C^6-10opcionalmente sustituido; aril C^6-10-alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C^1-12opcionalmente sustituido; un azúcar (por ejemplo, ribosa, pentosa o cualquiera de los descritos en esta invención); un polietilenglicol (PEG), -O(CH²CH²O)nCH²CH²OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 al 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16, y de 4 a 20); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los que el 2'-hidroxilo está conectado por un puente de alquileno C^1-6o heteroalquileno C^1-6al carbono 4' del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ejemplares incluyen metileno, propileno, puentes de éter o amino; aminoalquilo, como se define en esta invención; aminoalcoxi, como se define en esta invención; amino como se define en esta invención; y aminoácido, como se define en esta invención

Generalmente, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene un oxígeno. Los nucleótidos modificados no limitantes ejemplares incluyen la sustitución del oxígeno en la ribosa (por ejemplo, con S, Se o alquileno, tales como metileno o etileno); adición de un doble enlace (por ejemplo, para reemplazar la ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de la ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión del anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino que también tiene una estructura principal de fosforamidato); formas multicíclicas (por ejemplo, triciclo; y formas "desbloqueadas", tales como ácido nucleico de glicol (GNA) (por ejemplo, R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treósico (TNA, donde la ribosa se reemplaza con a-L-treofuranosil-(3'^2')) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces 2-amino-etil-glicina reemplazan la estructura principal de ribosa y fosfodiéster). El grupo de azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, por ejemplo, arabinosa, como azúcar. Dichas modificaciones de azúcar se enseñan en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013052523 y la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2013/75177.

Combinaciones de azúcares modificados, nucleobases y enlaces internucleosídicos

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la descripción pueden incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase, y/o el enlace internucleósido. Estas combinaciones pueden incluir cualquiera o más modificaciones descritas en esta invención.

Los ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados se proporcionan a continuación en la tabla 8. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los polinucleótidos de la descripción. A menos que se indique lo contrario, los nucleótidos modificados pueden sustituirse completamente por los nucleótidos naturales de los polinucleótidos de la descripción. Como ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede sustituirse con un nucleósido modificado descrito en esta invención. En otro ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede estar parcialmente sustituido (por ejemplo, aproximadamente el 0,1 %, el 1 %, el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99,9 %) con al menos uno de los nucleósidos modificados descritos en esta invención. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse en los polinucleótidos de la descripción y tales modificaciones se enseñan en las Publicaciones de Patentes internacionales n.° WO 2013/052523 y WO 2014/093924 A1.

Tabla 8. Combinaciones

Los ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados adicionales se proporcionan a continuación en la tabla 9.

Tabla 9. Combinaciones adicionales

VI. Composiciones farmacéuticas

Formulación, administración, suministro y dosificación

La presente descripción describe el uso de una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para activar las células T en un sujeto que lo necesita. La presente descripción describe además el uso de una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para aumentar el número de células citolíticas naturales (NK) en un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos de la descripción, el polinucleótido se formula en composiciones y complejos en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéutica y/o profilácticamente activas. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser estériles y/o estar libre de pirógenos. Se pueden encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

En algunos aspectos, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. A los efectos de la presente descripción, la expresión "ingrediente activo" se refiere, en general, a los polinucleótidos que se van a suministrar como se describe en esta invención.

Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su administración a seres humanos, el experto en la materia entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para su administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo mamíferos no humanos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos con el fin de hacer las composiciones adecuadas para su administración a diversos animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario con experiencia habitual puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación, si es que la hay, meramente habitual. Los sujetos a los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos.

En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente descripción está formulado para administración subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, intraventricular, oral, inhalación de pulverización, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, intratumoral o intramuscular a través de un reservorio implantado, subcutánea, intratumoral o intradérmica. En otros aspectos, el polinucleótido se formula para administración intratumoral, intraperitoneal o intravenosa. En una realización particular, el polinucleótido de la presente descripción se formula para administración intratumoral.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, dichos procedimientos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes adicionales, y a continuación, si es necesario y/o deseable, dividir, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier otro ingrediente adicional en una composición farmacéutica conforme a la descripción variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la afección del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 %, por ejemplo, entre el 0,5 y el 50 %, entre el 1-30 %, entre el 5-80 %, al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.

Formulaciones

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la descripción se pueden formular usando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad, (2) aumentar la transfección de células; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación de depósito del polinucleótido; (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, dirigir el polinucleótido a tejidos o tipos celulares específicos); (5) aumentar la traducción de proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de proteína codificada in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente descripción pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo-corteza (morfología core-shell), péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótidos (por ejemplo, para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, imitadores de nanopartículas y combinaciones de los mismos. En consecuencia, las formulaciones de la descripción pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que en conjunto aumenta la estabilidad del polinucleótido, aumenta la transfección celular por el polinucleótido, aumenta la expresión de proteína codificada por polinucleótidos, y/o altera el perfil de liberación de proteínas codificadas por polinucleótidos. Además, los polinucleótidos de la presente descripción pueden formularse utilizando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más de otros ingredientes adicionales.

Una composición farmacéutica según la presente descripción puede prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en esta invención, una "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente descripción pueden variar, conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía por la que se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 99 % (p/p) de ingrediente activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 %, por ejemplo, entre el 0,5 y el 50 %, entre el 1 30 %, entre el 5-80 %, al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.

En algunas realizaciones, las formulaciones descritas en esta invención contienen al menos un polinucleótido. Como un ejemplo no limitante, las formulaciones contienen 1,2, 3, 4 o 5 polinucleótidos. En otras realizaciones, el ARNm de la descripción se formula para la administración intratumoral en un tumor de un paciente que lo necesita.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se usa en esta invención, incluye, pero no se limita a, todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Salvo en la medida en que algún medio excipiente convencional pueda no ser compatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de un efecto biológico no deseado o, de otro modo, en la interacción de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se puede contemplar el uso de un medio excipiente convencional.

En algunos aspectos, el tamaño de partícula de la nanopartícula lipídica se aumenta y/o disminuye. El cambio en el tamaño de partícula puede ayudar a contrarrestar una reacción biológica tal como, pero no limitada a, la inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del ARNm modificado suministrado a mamíferos.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en las formulaciones farmacéuticas de la descripción.

En algunos aspectos, los polinucleótidos se administran en o con, se formulan en, o se suministran con nanoestructuras que pueden secuestrar moléculas tales como el colesterol. Se describen ejemplos no limitantes de estas nanoestructuras y procedimientos para fabricar estas nanoestructuras en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130195759. Las estructuras ejemplares de estas nanoestructuras se muestran en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130195759, y pueden incluir un núcleo y una coraza que rodea el núcleo.

Lipidoides

El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se puede formular con lipidoides. La síntesis de lípidoides se ha descrito ampliamente y las formulaciones que contienen estos compuestos son particularmente adecuadas para el suministro de polinucleótidos (véase Mahon y col., Bioconjug Chem. 201021:1448-1454; Schroeder y col, J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc y col, Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869; Siegwart y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:12996-3001).

Si bien estos lípidoides se han utilizado para administrar eficazmente pequeñas moléculas de ARN interferente de doble cadena en roedores y primates no humanos (véase Akinc y col., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:11915-11920; Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869; Leuschner y col., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), la presente descripción describe su formulación y uso en el suministro de polinucleótidos.

Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contengan estos lípidos y, por lo tanto, pueden dar como resultado un suministro efectivo del polinucleótido, a juzgar por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación lipidoide a través de vías de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos lipidoides de polinucleótidos pueden administrarse por diversos medios, incluyendo, pero no limitados a, las vías intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular o subcutánea.

La administración in vivo de ácidos nucleicos puede verse afectada por muchos parámetros, incluyendo, pero no limitados a, la composición de la formulación, la naturaleza de la PEGilación de las partículas, el grado de carga, la relación entre polinucléotidos y lípidos y parámetros biofísicos tales como, pero no limitados a, el tamaño de las partículas (Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879). Como ejemplo, pequeños cambios en la longitud de la cadena de anclaje de los lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) pueden resultar en efectos significativos sobre la eficacia in vivo. Las formulaciones con los diferentes lípidoides, incluyendo, pero no limitados a, clorhidrato de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah y col., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluidos derivados y variantes) y MD1, se pueden probar para determinar su actividad in vivo.

El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "98N12-5" se descrine por Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879.

El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "C12-200" se describe por Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 y Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670. Las formulaciones de lípidoides pueden incluir partículas que comprenden 3 o 4 o más componentes además de los polinucleótidos.

Las formulaciones de lipidoides y polinucleótidos que comprenden lipidoides se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/097077.

Liposomas, lipoplejos y nanopartículas lipídicas

Los polinucleótidos de la descripción pueden formularse mediante el uso de uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En un aspecto, las composiciones farmacéuticas de los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L incluyen liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículo de suministro para la administración de formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños tales como, pero no limitados a, una vesícula multilaminar (MLV) que puede tener cientos de nanómetros de diámetro y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos, una pequeña vesícula unicelular (SUV) que puede ser menor de 50 nm de diámetro y una gran vesícula unilaminar (LUV) que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligandos con el fin de mejorar la unión de los liposomas a tejidos enfermos o para activar eventos tales como, pero no limitados a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH alto o bajo para mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.

La formación de liposomas puede depender de las características fisicoquímicas tales como, pero no limitadas a, la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposómicos, la naturaleza del medio en el que las vesículas lipídicas se dispersan, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su potencial toxicidad, cualquier procedimiento adicional involucrado durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño de optimización, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad lote a lote y la posibilidad de una producción a gran escala de productos liposómicos eficientes y seguros.

Como ejemplo no limitante, los liposomas tales como vesículas de membrana sintética se preparan mediante los procedimientos, aparatos y dispositivos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU n.° US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373y US20130183372.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención incluyen, sin limitación liposomas tales como los formados a partir de liposomas de 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), liposomas de DiLa2 de Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) y MC3 (como se describe en el documento US20100324120), y liposomas que pueden suministrar fármacos de molécula pequeña tales como, pero no limitados a, DOXIL® de Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden incluir, sin limitación, liposomas tales como los formados a partir de la síntesis de partículas lipídicas de plásmido estabilizadas (SPLP) o partículas lipídicas de ácido nucleico estabilizadas (SNALP) que se han descrito previamente y han demostrado ser adecuadas para la administración de oligonucleótidos in vitro e in vivo (véase Wheeler y col. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang y col. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs y col. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey y col., Nat Biotechnol. 20052:1002-1007; Zimmermann y col., Nature. 2006441:111-114; Heyes y col. J Contr Rel.2005107:276-287; Semple y col. Nature Biotech. 2010 28:172-176; Judge y col. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130122104). El procedimiento de fabricación original de Wheeler y col. fue un procedimiento de diálisis de detergente, que fue mejorado más adelante por Jeffs y col. y se denomina procedimiento de formación espontánea de vesículas. Las formulaciones de liposomas se componen de 3 a 4 componentes lipídicos además del polinucleótido. Como ejemplo, un liposoma puede contener, pero no se limita a, el 55 % de colesterol, el 20 % de disteroilfosfatidilcolina (DSPC), el 10 % de Pe G-S-DSG y el 15 % de 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), según lo descrito por Jeffs y col. Como otro ejemplo, determinadas formulaciones de liposomas contienen, pero no se limitan a, el 48 % de colesterol, el 20 % de DSPC, el 2 % de PEG-c-DMA y el 30 % de lípido catiónico, donde el lípido catiónico puede ser 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetilaminopropano (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, o 1,2-dilinoleniloxi-3-dimetilaminopropano (DLenDMA), según lo descrito por Heyes y col.

En algunos aspectos, las formulaciones de liposomas comprenden de aproximadamente el 25,0 % de colesterol a aproximadamente el 40,0 % de colesterol, de aproximadamente el 30,0 % de colesterol a aproximadamente el 45,0 % de colesterol, de aproximadamente el 35,0 % de colesterol a aproximadamente el 50,0 % de colesterol y/o de aproximadamente el 48,5 % de colesterol a aproximadamente el 60 % de colesterol. En otros aspectos, las formulaciones comprenden un porcentaje de colesterol que se selecciona de entre el grupo que consiste en el 28,5 %, el 31,5 %, el 33,5 %, el 36,5 %, el 37,0 %, el 38,5 %, el 39,0 % y el 43,5 %. En algunos aspectos, las formulaciones comprenden de aproximadamente el 5,0 % a aproximadamente el 10,0 % de DSPC y/o de aproximadamente el 7,0 % a aproximadamente el 15,0 % de DSPC.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas que se forman para administrar polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Los polinucleótidos pueden ser encapsulados por el liposoma y/o pueden contenerse en un núcleo acuoso que a continuación puede ser encapsulado por el liposoma (véase las Pub. internacionales n.° WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901 y WO2012006378 y la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130189351, US20130195969 y US20130202684).

En otro aspecto, los liposomas se formulan para un suministro dirigido. Como ejemplo no limitante, el liposoma se formula para el suministro dirigido al hígado. El liposoma utilizado para el suministro dirigido puede incluir, pero no se limita a, los liposomas descritos en, y los procedimientos de fabricación de liposomas descritos en la Publicación de Patente de EE.UU n.° US20130195967.

En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprende un núcleo de aceite y un lípido catiónico que puede interactuar con el polinucleótido que ancla la molécula a la partícula de emulsión (véase la Publicación internacional n.° WO2012006380).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una emulsión de agua en aceite que comprende una fase hidrófoba continua en la que se dispersa la fase hidrófila. Como ejemplo no limitante, la emulsión puede prepararse mediante los procedimientos descritos en la Publicación internacional n.° WO201087791.

En otro aspecto, la formulación lipídica incluye al menos un lípido catiónico, un lípido que puede mejorar la transfección, y al menos un lípido que contiene un grupo de cabeza hidrófilo unido a un resto lipídico (Pub. internacional n.° WO2011076807 y Pub. de ^eE.UU n.° 20110200582). En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una vesícula lipídica que puede tener enlaces cruzados entre bicapas lipídicas funcionalizadas (véase la Pub. de EE.UU. n.° 20120177724).

En un aspecto, los polinucleótidos se formulan en un liposoma como se describe en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013086526. Los polinucleótidos pueden encapsularse en un liposoma usando gradientes de pH inversos y/o composiciones de tampón interno optimizadas como se describe en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013086526.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas de polinucleótidos se formulan en liposomas tales como, pero no limitados a, liposomas de DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), liposomas basados en DOPC neutro (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) (por ejemplo, suministro de ARNpi para cáncer de ovario (Landen y col. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)) y liposomas recubiertos de hialuronano (Quiet Therapeutics, Israel).

En un aspecto, el lípido catiónico es un lípido catiónico de bajo peso molecular tales como los descritos en la Solicitud de Patente de EE.Uu . n.° 20130090372. En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una vesícula lipídica que puede tener enlaces cruzados entre bicapas lipídicas funcionalizadas.

En otros aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un liposoma que comprende un lípido catiónico. El liposoma puede tener una relación molar de átomos de nitrógeno en el lípido catiónico con respecto a los fosfatos en el polinucleótido (relación N:P) de entre 1:1 y 20:1 como se describe en la Publicación internacional n.° WO2013006825. En otro aspecto, el liposoma puede tener una relación N:P mayor que 20:1 o menor que 1:1.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un complejo de policatión de lípidos. La formación del complejo lípido-policatión puede lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Pub. de EE.u U. n.° 20120178702. Como ejemplo no limitante, el policatión incluye un péptido catiónico o un polipéptido, tal como, pero no limitados a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en la Pub. internacional n.° WO2012013326 o la Pub. de Patente de EE.UU. n.° US20130142818. En otro aspecto, los polinucleótidos se formulan en un complejo de lípido-policatión que puede incluir además un lípido no catiónico tal como, pero no limitado a, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un lipidoide de aminoalcohol. Los lipidoides de aminoalcohol que se pueden usar en la presente descripción se pueden preparar mediante los procedimientos descritos en la Patente de EE.UU. n.° 8.450.298.

La formulación de liposomas puede verse afectada por, pero no limitada a, la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación lipídica catiónica, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple y col. (Semple y col. Nature Biotech. 2010 28:172-176), la formulación de liposomas estaba compuesta del 57,1 % de lípido catiónico, el 7,1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, el 34,3 % de colesterol y el 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, cambiar la composición del lípido catiónico podría suministrar ARNpi de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha y col. Mol Ther. 2011 19:2186-2200). En algunos aspectos las formulaciones de liposomas comprenden de aproximadamente el 35 a aproximadamente el 45 % de lípido catiónico, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 % de lípido catiónico, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 % de lípido catiónico y/o de aproximadamente el 55 % a aproximadamente el 65 % de lípido catiónico. En algunos aspectos, la relación de lípido a ARNm en liposomas es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1 y/o al menos 30:1.

En algunos aspectos, la relación de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) aumenta o disminuye y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG se modifica de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de LNP. Como ejemplo no limitante, las formulaciones de LNP contienen de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 3,0 %, de aproximadamente el 1,0 % a aproximadamente el 3,5 %, de aproximadamente el 1,5 % a aproximadamente el 4,0 %, de aproximadamente el 2,0 % a aproximadamente el 4,5 %, de aproximadamente el 2,5 % a aproximadamente el 5,0 % y/o de aproximadamente el 3,0 % a aproximadamente el 6,0 % de la relación molar lipídica de PEG-c-DOMG (R-3-[(ui-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina) (también denominada en esta invención PEG-DOMG) en comparación con el lípido catiónico, DSPC y colesterol. En otro aspecto, el PEG-c-DOMG se puede reemplazar con un lípido PEG tal como, pero no limitado a, PEG-DSG (1,2-Diestearoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol), PEG-DMG (1,2-Dimiristoil-sn-glicerol) y/o PEG-DPG (1,2-Dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, pero no limitado a, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula lipídica tales como las descritas en la Publicación internacional n.° WO2012170930.

En otro aspecto, la formulación que comprende el polinucleótido es una nanopartícula que puede comprender al menos un lípido. El lípido se puede seleccionar de entre, pero no se limita a, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos PEGilados y lípidos de aminoalcoholes. En otro aspecto, el lípido es un lípido catiónico tal como, pero no limitado a, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA y lípidos de aminoalcoholes. El lípido catiónico de aminoalcohol pueden ser los lípidos descritos en, y/o producidos mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130150625. Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9.12- dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 1 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en el documento US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9.12- dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 4 en el documento US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En algunas realizaciones, el polinucleótido de la descripción se formula en una nanopartícula lipídica, donde el polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido de la descripción se formula en una nanopartícula lipídica, donde el polinucleótido comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 65.

Típicamente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), y comprenden además un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un PEG o lípido modificado con PEG.

En un aspecto, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste esencialmente en (i) al menos un lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319); (ii) un lípido neutro seleccionado de entre DSPC, DPPC, Po Pc , DOPE y SM; (iii) un esterol, por ejemplo, colesterol; y (iv) un PEG-lípido, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA, en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0,5-15% PEG-lípido.

En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % en base molar de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), por ejemplo, de aproximadamente el 35 a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 45 a aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 57,5 %, aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 40 % en una base molar.

En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 15 % en base molar del lípido neutro, por ejemplo, de aproximadamente el 3 a aproximadamente el 12 %, de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, o aproximadamente el 7,5 % en una base molar. Los lípidos neutros ejemplares incluyen, pero no se limitan a, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 % en base molar del esterol (por ejemplo, de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 38,5 %, aproximadamente el 35 % o aproximadamente el 31 % en una base molar. Un esterol ejemplar es el colesterol. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 % en base molar del PEG o lípido modificado con PEG (por ejemplo, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 3,5 %, o aproximadamente el 5 % en una base molar. En un aspecto, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio de 2.000 Da. En otros aspectos, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio menor que 2.000 Da, por ejemplo, alrededor de 1.500 Da, alrededor de 1.000 Da, o alrededor de 500 Da. Los lípidos modificados con PEG ejemplares incluyen, pero no se limitan a, PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (también denominado en esta invención PEG-C14 o C14-PEG), PEG-cDMA (se analiza con más detalle en Reyes y col. J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005).

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen el 25-75 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 0,5-15 % del lípido neutro, el 5-50 % del esterol y, el 0,5-20 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen el 35-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 3-12 % del lípido neutro, el 15-45 % del esterol, y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen el 45-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 5-10 % del lípido neutro, el 25-40 % del esterol, y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 60 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente el 31 % del esterol, y aproximadamente el 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 10 % del lípido neutro, aproximadamente el 38,5 % del esterol y aproximadamente el 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 10 % del lípido neutro, aproximadamente el 35 % del esterol, aproximadamente el 4,5 % o aproximadamente el 5 % del PEG o lípido modificado con PEG, y aproximadamente el 0,5 % del lípido de direccionamiento en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 40 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 15 % del lípido neutro, aproximadamente el 40 % del esterol, y aproximadamente el 5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 57,2 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 7,1 % del lípido neutro, aproximadamente el 34,3 % del esterol, y aproximadamente el 1,4 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En un aspecto, las formulaciones de las descripciones incluyen aproximadamente el 57,5 % de un lípido catiónico seleccionado de entre el lípido PEG que es PEG-cDMA (PEG-cDMA se analiza con más detalle en Reyes y col. (J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)), aproximadamente el 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente el 31,5 % del esterol, y aproximadamente el 3,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En algunos aspectos, la formulación de nanopartículas de lípidos consiste esencialmente en una mezcla de lípidos en relaciones molares de aproximadamente 20-70 % de lípido catiónico: 5-45 % de lípido neutro: 20-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG; por ejemplo, en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG.

En aspectos particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 50/10/38,5/1,5 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DMG, PEG-DSG o PEG-DPG), 57,2/7,1134,3/1,4 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DPPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-cDMA), 40/15/40/5 (% en moles de lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DMG), 50/10/35/4,5/0,5 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DSG), 50/10/35/5 (lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con Pe G, por ejemplo, PEG-DMG), 40/10/40/10 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA), 35/15/40/10 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, Pe G-DMG o PEG-cdMa ) o 52/13/30/5 (% en moles de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA).

Se describen composiciones de nanopartículas de lípidos ejemplares y procedimientos para prepararlas, por ejemplo, en Semple y col. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama y col. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; y Maier y col. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.

En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención comprenden un lípido catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural, y opcionalmente comprenden un lípido no catiónico. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 40-60 % de lípido catiónico, aproximadamente el 5-15 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1-2 % de un lípido con PEG y aproximadamente el 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % de lípido catiónico, aproximadamente el 10 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1,5 % de un lípido con PEG y aproximadamente el 38,5 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 55 % de lípido catiónico, aproximadamente el 10 % de lípido no catiónico, aproximadamente el 2,5 % de lípido con PEG y aproximadamente el 32,5 % de lípido estructural. En un aspecto, el lípido catiónico es cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero no limitados a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.

En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención son nanopartículas lipídicas de 4 componentes. La nanopartícula lipídica puede comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 40-60 % de lípido catiónico, aproximadamente el 5-15 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1-2 % de un lípido con PEG y aproximadamente el 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 50 % de lípido catiónico, aproximadamente el 10 % de lípido no catiónico, aproximadamente el 1,5 % de lípido con PEG y aproximadamente el 38.5 % de lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 55 % de lípido catiónico, aproximadamente el 10 % de lípido no catiónico, aproximadamente el 2.5 % de lípido con PEG y aproximadamente el 32,5 % de lípido estructural. En un aspecto, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tales como, pero no limitados a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.

En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención comprenden un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % del lípido catiónico DLin-KC2-DMA, aproximadamente el 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente el 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 55 % del lípido catiónico L319, aproximadamente el 10 % deL lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 2,5 % del lípido con PEG PEG-DMG y aproximadamente el 32,5 % del lípido estructural colesterol.

En un aspecto, el lípido catiónico se selecciona de entre, pero no limitado a, un lípido catiónico descrito en las Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276, WO2013086373 and WO2013086354, las Patentes de EE.UU. n.° 7.893,302, 7.404.969, 8.283.333 y 8.466.122 y las Publicaciones de Patente de EE.UU. n.° US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541 y US20130225836. En otro aspecto, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero no limitado a, la fórmula A descrita en las Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965,WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365,WO2012044638 y WO2013116126 o la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130178541 y US20130225836. En otro aspecto más, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero no limitado a, la fórmula CLI-CLXXIX de la Publicación internacional n.° WO2008103276, la fórmula CLI-CLXXIX de la Patente de EE.UU. n.° 7.893.302, la fórmula CLI-CLXXXXII de la Patente de EE.UU. n.° 7.404.969 y la formula I-VI de la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20100036115, la fórmula I de la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130123338. Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (1Z,19Z)-N5N-dimetilpentacosa-16,19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildocosa-13,16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N;N-dimetiltriaconta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-1-nonilicosa-11,14-dien-1-il] pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-I0-amina, (15Z)-N,N-dimetileptacos-15-en-I0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-I0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-I0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12,15-dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-I—amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-octilciclopropil]eptadecan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(IS,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(IR,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetil-[(IR,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil} dodecan-1-amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1-iloxi]propan-2-amina, 1-{2-[(9z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2s)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi ]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z, 12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctil)oxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina y (1lE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonacosa-l1,20,2-trien-10-amina o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En un aspecto, el lípido es un lípido escindible tales como los descritos en la Publicación internacional n.° WO2012170889. En otro aspecto, el lípido es un lípido catiónico tal como, pero no limitado a, la Fórmula (I) de la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° US20130064894.

En un aspecto, el lípido catiónico se sintetiza mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en las Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2013086373 y WO2013086354.

En otro aspecto, el lípido catiónico es un lípido catiónico de trialquilo. Se describen ejemplos no limitantes de lípidos catiónicos de trialquilo y procedimientos para preparar y usar los lípidos catiónicos de trialquilo en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013126803.

En una realización, las formulaciones de LNP de los polinucleótidos contienen PEG-c-DOMG en una relación molar de lípidos del 3 %. En otro aspecto, las formulaciones de LNP de los polinucleótidos contienen PEG-c-DOMG en una relación molar de lípidos del 1,5 %.

Enun aspecto, las composiciones farmacéuticas de los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L incluyen al menos uno de los lípidos PEGilados descritos en la Publicación internacional n.° WO2012099755.

En un aspecto, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En un aspecto, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica y al menos otro componente adicional. En otro aspecto, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como otro ejemplo no limitante, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una relación molar de 2:40:10:48 (véase, por ejemplo, Geall y col., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines (Suministro no viral de vacunas de ARN autoamplificador), PNAS 2012; PMID:22908294).

En un aspecto, la formulación de LNP se formula mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones internacionales n.° WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en esta invención se encapsulan en formulaciones de LNP como se describe en los documentos WO2011127255 y/o WO2008103276.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en esta invención se formulan en una nanopartícula para administrarse por vía parenteral como se describe en la Pub. de EE.UU. n.° US20120207845.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula lipídica fabricada mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130156845 o la Publicación internacional n.° WO2013093648 o WO2012024526.

Las nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden fabricarse en un entorno estéril mediante el sistema y/o procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130164400.

En un aspecto, la formulación de LNP se formula en una nanopartícula tal como una partícula de ácido nucleico-lípido descrita en la Patente de EE.UU. n.° 8.492.359. Como ejemplo no limitante, la partícula lipídica comprende uno o más agentes activos o agentes terapéuticos; uno o más lípidos catiónicos que comprenden de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula; uno o más lípidos no catiónicos que comprenden de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula; y uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas que comprenden de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula. El ácido nucleico en la nanopartícula puede ser los polinucleótidos descritos en esta invención y/o son conocidos en la técnica.

En un aspecto, la formulación de LNP se formula mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones internacionales n.° WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el ARN modificado descrito en esta invención se encapsula en formulaciones de LNP como se describe en los documentos WO2011127255 y/o WO2008103276.

En un aspecto, las formulaciones de LNP descritas en esta invención comprenden una composición policatiónica. Como ejemplo no limitante, la composición policatiónica se selecciona de entre la fórmula 1-60 de la Publicación de Patente de Ee .UU. n.° US20050222064. En otro aspecto, las formulaciones de LNP que comprenden una composición policatiónica se usan para la administración del ARN modificado descrito en esta invención in vivo y/o in vitro.

En un aspecto, las formulaciones de LNP descritas en esta invención comprenden adicionalmente una molécula potenciadora de la permeabilidad. Las moléculas potenciadoras de la permeabilidad no limitantes se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20050222064.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una composición liposomal en fase de gel liofilizada como se describe en la Publicación de EE.UU. n.° US2012060293.

Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulación in vivo y/o aumentar el suministro dirigido de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato para su uso con la presente descripción pueden prepararse mediante los procedimientos descritos en la Solicitud Internacional n.° WO2013033438 o la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130196948. Como ejemplo no limitante, los conjugados de fosfato pueden incluir un compuesto de cualquiera de las fórmulas descritas en la Solicitud internacional n.° WO2013033438.

La formulación de nanopartículas puede comprender un conjugado de polímero. El conjugado de polímero puede ser un conjugado soluble en agua. El conjugado de polímero puede tener una estructura como la descrita en la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20130059360. En un aspecto, los conjugados de polímero con los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción pueden prepararse usando los procedimientos y/o reactivos poliméricos segmentados descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20130072709. En otro aspecto, el conjugado de polímero puede tener grupos laterales colgantes que comprenden restos de anillo, tales como, pero no limitados a, los conjugados de polímero descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130196948.

Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de nanopartículas de la presente descripción en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir la eliminación fagocítica de las nanopartículas en un sujeto. En un aspecto, el conjugado es un péptido "propio" diseñado a partir de la proteína de membrana humana CD47 (por ejemplo, las partículas "propias" descritas por Rodriguez y col (Science 2013 339, 971-975)). Tal como muestran Rodriguez y col., los péptidos propios retrasaron la eliminación mediada por macrófagos de las nanopartículas, lo cual mejoró el suministro de las nanopartículas. En otro aspecto, el conjugado es la proteína de membrana CD47 (por ejemplo, véase Rodriguez y col. Science 2013 339, 971-975). Rodriguez y col. mostraron que, de manera similar a los péptidos "propios", la c D47 puede aumentar la relación de partículas circulantes en un sujeto en comparación con los péptidos mezclados y las nanopartículas recubiertas con PEG.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se formulan en nanopartículas que comprenden un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente descripción en un sujeto. El conjugado puede ser la membrana CD47 o el conjugado puede derivarse de la proteína de membrana CD47, tal como el péptido "propio" descrito anteriormente. En otro aspecto, la nanopartícula puede comprender PEG y un conjugado de CD47 o un derivado del mismo. En otro aspecto más, la nanopartícula comprende tanto el péptido "propio" descrito anteriormente como la proteína de membrana CD47.

En otro aspecto, un péptido "propio" y/o proteína CD47 se conjuga con una partícula similar al virus o pseudovirión, como se describe en esta invención, para la administración de los polinucleótidos de la presente descripción.

En otro aspecto, las composiciones farmacéuticas que comprenden los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción y un conjugado que puede tener un enlace degradable. Los ejemplos no limitantes de conjugados incluyen un resto aromático que comprende un átomo de hidrógeno ionizable, un resto espaciador y un polímero soluble en agua. Como ejemplo no limitante, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado con un enlace degradable y procedimientos para administrar dichas composiciones en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130184443.

Las formulaciones de nanopartículas pueden ser una nanopartícula de carbohidrato que comprende un vehículo de carbohidrato y un polinucleótido. Como ejemplo no limitante, el vehículo de carbohidrato incluye, pero no se limita a, un material similar a glucógeno o fitoglucógeno modificado con anhídrido, octenilsuccinato de fitoglucógeno, fitoglucógeno beta-dextrina, fitoglucógeno beta-dextrina modificado con anhídrido. (Véase, por ejemplo, la Publicación internacional n.° WO2012109121).

Las formulaciones de nanopartículas de la presente descripción pueden recubrirse con un tensioactivo o polímero para mejorar la administración de la partícula. En un aspecto, la nanopartícula se recubre con un recubrimiento hidrofílico, tales como, pero no limitados a, recubrimientos de PEG y/o recubrimientos que tienen una carga superficial neutra. Los recubrimientos hidrofílicos pueden ayudar a administrar nanopartículas con cargas útiles mayores, tales como, pero no limitadas a, polinucleótidos dentro del sistema nervioso central. Como ejemplo no limitante, se describen nanopartículas que comprenden un recubrimiento hidrofílico y procedimientos para preparar dichas nanopartículas en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130183244.

En un aspecto, las nanopartículas lipídicas de la presente descripción son partículas de polímero hidrofílico. Se describen ejemplos no limitantes de partículas de polímero hidrofílico y procedimientos para preparar partículas de polímero hidrofílico en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130210991.

En otro aspecto, las nanopartículas lipídicas de la presente descripción son partículas poliméricas hidrofóbicas. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico con un lípido catiónico biodegradable que se conoce como nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP). Se ha demostrado que los lípidos catiónicos ionizables, tales como, pero no limitados a, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, se acumulan en plasma y los tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. El metabolismo rápido de los lípidos de eliminación rápida puede mejorar la tolerabilidad e índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de una dosis de 1 mg/kg a una dosis de 10 mg/kg en ratas. La inclusión de un enlace de éster degradado de forma enzimática puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, mientras se mantiene la actividad de la formulación de reLNP. El enlace de éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede ubicarse en el extremo terminal de la cadena lipídica. El enlace de éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.

En un aspecto, el enlace de éster interno está ubicado en cualquier lado del carbono saturado.

En un aspecto, se provoca una respuesta inmunitaria administrando una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. (Publicación de EE.UU. n.° 20120189700 y Publicación internacional n.° WO2012099805). El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie. El inmunógeno puede ser una proteína recombinante, un ARN modificado y/o un polinucleótido OX40L descrito en esta invención.

Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está ubicada en el tejido mucoso, tales como, pero no limitados a, oral (por ejemplo, las membranas bucal y esofágica y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (por ejemplo, membranas nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (por ejemplo, membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores que 10-200 nm que se prefieren para una mayor eficiciencia de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran muy grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras de mucosa. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas puedan eliminarse del tejido mucoso en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas mayores (con un diámetro de 200 nm-500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai y col. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai y col. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(2): 158-171). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, incluyendo, pero no limitadas a, recuperación de fluorescencia a continuación de fotoblanqueo (FRA^p) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución. Como ejemplo no limitante, las composiciones que pueden penetrar una barrera de mucosa pueden prepararse como se describe en la Pat. de EE.Uu . n.° 8.241.670 o la Publicación de Patente internacional n.° WO2013110028.

La nanopartícula lipídica diseñada para penetrar la mucosa puede comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, pero no se limita a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Se describen ejemplos no limitantes de polímeros biocompatibles en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013116804. El material polimérico puede irradiarse adicionalmente. Como ejemplo no limitante, el material polimérico puede irradiarse con rayos gamma (véase, por ejemplo, la Sol. internacional n.° WO201282165). Los ejemplos no limitantes de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(ácido L-láctico-co-ácido glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactida) (PDLA), poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida-co-caprolactona), poli(D,L-lactida-co-caprolactona-co-glicolida), poli(D,L-lactida-co-PEO-co-D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-PPO-co-D,L-lactida), cianoacrilato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietilenglicol, ácido poli-L-glutámico, poli(hidroxiácidos) polianhídridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poliamidas, poli(éster éteres), policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como poli(tereftalato de etileno), alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como poli(acetato de vinilo), haluros de polivinilo, tales como poli(cloruro de vinilo) (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celulosas derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactida-co-caprolactona), PEG-PLGA-PEG y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona. La nanopartícula lipídica se puede recubrir o asociar con un copolímero tal como, pero no limitados a, un copolímero de bloque (tal como un copolímero de bloque de poliéter-poliamida ramificado descrito en la Publicación Internacional n.° WO2013012476), y copolímero tribloque (poli(etilenglicol))-(poli(óxido de propileno))-(poli(etilenglicol))(véase, por ejemplo, la Publicación de EE.UU. 20120121718 y la Publicación de EE.UU. 20100003337 y la Pat. de EE.UU. n.° 8.263.665). El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana (Yang y col. Angew. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600). Xu y col. describen un procedimiento escalable no limitante para producir nanopartículas que pueden penetrar la mucosa humana (véase, por ejemplo, J Control Release 2013, 170(2):279-86).

La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados tales como, pero no limitados a, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrofóbico o un componente hidrofóbico de otros tensioactivos (por ejemplo, cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).

La nanopartícula lipídica diseñada para penetrar la mucosa puede incluir agentes que alteran la superficie tales como, pero no limitados a, polinucleótidos, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos catiónicos tales como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecilamonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelaina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y diversas DNasas, incluyendo rhDNasa. El agente que altera la superficie puede incrustarse o incorporarse en la superficie de la partícula, o disponerse (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro procedimiento) en la superficie de la nanopartícula lipídica (véase, por ejemplo, la Publicación de EE.UU. 20100215580 y la Publicación de EE.UU.

20080166414 y US20130164343).

En un aspecto, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa comprenden al menos un polinucleótido descrito en esta invención. El polinucleótido puede encapsularse en la nanopartícula lipídica y/o disponerse en la superficie de la partícula. El polinucleótido puede acoplarse de forma covalente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender una pluralidad de nanopartículas. Además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interactuar con la mucosa y alterar las propiedades estructurales y/o adhesivas de la mucosa circundante para disminuir la mucoadhesión, lo cual puede aumentar el suministro de las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa en el tejido mucoso.

En otro aspecto, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa son una formulación hipotónica que comprende un recubrimiento que mejora la penetración de la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio en el cual se administra. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de formulaciones hipotónicas en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013110028.

En un aspecto, para mejorar la administración a través de la barrera de la mucosa, la formulación de polinucleótidos comprende o es una solución hipotónica. Se descubrió que las soluciones hipotónicas aumentan la velocidad a la cual las partículas mucoinertes tales como, pero no limitadas a, partículas que penetran la mucosa, fueron capaces de alcanzar la superficie epitelial vaginal (véase, por ejemplo, Ensign y col. Biomaterials 201334(28):6922-9).

En un aspecto, el polinucleótido se formula como un lipoplex, tal como, sin limitación, el sistema ATUPLEXTM, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de ARNpi-lipoplex de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECTTM de STEMGENT® (Cambridge, MA) y polietilenimina (PEI) o suministro dirigido y no dirigido de ácidos nucleicos basado en protamina (Aleku y col. Cancer Res. 200868:9788-9798; Strumberg y col. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 201023:334-344; Kaufmann y col. Microvasc Res 201080:286-293Weide y col. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide y col. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther.

4:1285-1294; Fotin-Mleczek y col., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song y col., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 20076;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).

En un aspecto, dichas formulaciones también se construyen o se alteran las composiciones de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos celulares in vivo, incluyendo, pero no limitados a, hepatocitos, células inmunitarias, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígenos y leucocitos (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Judge y col., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann y col., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 201023:334-344; Basha y col., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200; Fenske y Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer y col., Science. 2008 319:627-630; Peer y Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133). Un ejemplo de direccionamiento pasivo de formulaciones a células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, que han demostrado unirse a la apoliproteína E y promover la unión y absorción de estas formulaciones en hepatocitos in vivo (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Las formulaciones también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, como se ejemplifica en, pero no limitado a, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y estrategias dirigidas a anticuerpos (Kolhatkar y col., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio y Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu y col., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil y col., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao y col., Expert Opin Drug Deliv. 20085:309-319; Akinc y col., Mol Ther.

2010 18:1357-1364; Srinivasan y col., Metods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie y col., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kim y col., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya y col., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song y col., Nat Biotechnol. 200523:709-717; Peer y col., Science. 2008 319:627-630; Peer y Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la descripción se formulan como una nanopartícula lipídica sólida. Una nanopartícula lipídica sólida (SLN) puede ser esférica con un diámetro promedio de entre 10 y 1000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipofílicas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. En un aspecto adicional, la nanopartícula lipídica puede ser una nanopartícula de lípido-polímero autoensamblada (véase Zhang y col., ACS Nano, 2008, 2 (8), págs 1696-1702). Como ejemplo no limitante, la SLN puede ser la SLN descrita en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013105101. Como otro ejemplo no limitante, la SLN puede prepararse mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013105101.

Pueden utilizarse liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para mejorar la eficacia de los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, dado que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular mediante los polinucleótidos; y/o aumentar la traducción de OX40L codificada. Un ejemplo de esto implica el uso de la encapsulación de lípidos para permitir el suministro sistémico efectivo de ADN de plásmido poliplejo (Heyes y col. Mol Ther. 2007 15:713-720). También pueden utilizarse los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para aumentar la estabilidad del polinucleótido.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se formulan para liberación controlada y/o administración dirigida. Como se usa en esta invención, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de compuesto o composición farmacéutica que se ajusta a un patrón particular de liberación para lograr un resultado terapéutico. En un aspecto, los polinucleótidos se encapsulan en un agente de administración descrito en esta invención y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa encerrar, rodear o envolver. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la descripción, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. La expresión "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede encerrarse, rodearse o envolverse dentro del agente de administración. "Encapsulación parcial" significa que menos del 10, 10, 20, 30, 40, 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede encerrarse, rodearse o envolverse dentro del agente de administración. Ventajosamente, la encapsulación se puede determinar midiendo el escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos el 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción están encapsulados en el agente de administración.

En un aspecto, la formulación de liberación controlada puede incluir, pero no se limita a, copolímeros tribloque. Como ejemplo no limitante, la formulación incluye dos tipos distintos de copolímeros tribloque (Pub. Internacional n.° WO2012131104 y WO2012131106).

En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente se pueden encapsular a continuación en un polímero, hidrogel y/o sellador quirúrgico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico es PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG o COSEa L® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).

En otro aspecto, la nanopartícula lipídica se encapsula en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel cuando se inyecta en un sujeto. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica se encapsula en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica una formulación de polipéptido OX40L para liberación controlada y/o suministro dirigido también incluyen al menos un recubrimiento de liberación controlada. Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, pero no se limitan a, OPADRY®, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa tales como las dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®).

En un aspecto, la formulación de liberación controlada y/o administración dirigida de polinudeótidos comprende al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, pero no se limitan a, poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.

En un aspecto, la formulación de liberación controlada y/o administración dirigida de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido comprende al menos un PEG y/o derivados de polímeros relacionados con PEG como se describe en la Patente de EE.UU. n.° 8.404.222.

En otro aspecto, la formulación de administración de liberación controlada de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido es el sistema polimérico de liberación controlada descrito en el documento US20130130348.

En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se encapsula en una nanopartícula terapéutica. Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos descritos en esta invención y conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a, las Pub. internacionales n.° WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, las Pub. de EE.UU. n.° US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 y US20130230567 y la Pat de EE.UU. n.° 8.206.747, 8.293.276, 8.318.208 y 8.318.211. En otro aspecto, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en la Pub. de EE.UU. n.° US20120140790.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan para liberación sostenida. Como se usa en esta invención, "liberación sostenida" se refiere a una composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, pero no se limita a, horas, días, semanas, meses y años. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula de liberación sostenida comprende un polímero y un agente terapéutico tal como, pero no limitados a, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción (véase la Publicación internacional n.° 2010075072 y la Pub de EE.UU. n.° US20100216804, US20110217377 y US20120201859). En otro ejemplo no limitante, la formulación de liberación sostenida comprende agentes que permiten una biodisponibilidad persistente, tal como, pero no limitados a, cristales, geles macromoleculares y/o suspensiones de partículas (véase la Publicación de patente de EE.UU. n.° US20130150295).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden formular para que sean específicos de la diana. Como ejemplos no limitantes, las nanopartículas terapéuticas incluyen un corticoesteroide (véase la Pub. international n.° WO2011084518). Como ejemplo no limitante, las nanopartículas terapéuticas se formulan en las nanopartículas descritas en las Pub internacionales n.° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y la Pub de EE.UU.n.° US20100069426, US20120004293 y US20100104655.

En un aspecto, las nanopartículas de la presente descripción comprenden una matriz polimérica. Como ejemplo no imitante, la nanopartícula comprende dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero dibloque. En un aspecto, el copolímero dibloque incluye PEG en combinación con un polímero tal como, pero no limitado a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactidaco-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos. En otra realización más, el copolímero dibloque es un copolímero dibloque de alta X (parámetro de interacción de Flory-Huggins), como los descritos en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013120052.

Como ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero de bloque PLGA-PEG (véase la Pub. de EE.UU. n.° US20120004293 y la Pat de E^e.UU. n.° 8.236.330). En otro ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula no detectable que comprende un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA (véase la Pat de EE.UU. n.° 8.246.968 y la Publicación internacional n.° WO2012166923). En otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula no detectable o una nanopartícula no detectable específica de la diana como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130172406.

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero multibloque (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. n.° 8.263.665 y 8.287.910 y la Pub.de Patente de EE.UU. n.° US20130195987).

En otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG (véase, por ejemplo, el hidrogel termosensible (PEG-PLGA-PEG) que se utilizó como un vehículo de administración del gen TGF-beta1 en Lee y col. Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-p1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing (El hidrogel termosensible como vehiculo de administración del gen Tgf-p1 mejora la cicatrización de heridas diabéticas). Pharmaceutical Research, 2003 20(12): 1995-2000; como un sistema de suministro de genes controlados en Li y col. Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel (Sistema de administración de genes controlados basado en hidrogel biodegradable termosensible). Pharmaceutical Research 200320(6):884-888; y Chang y col., Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-Pe G copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle (El copolímero PEG-PLGA-PEG biodegradable anfifílico no iónico mejora la eficiencia de administración de genes en el músculo esquelético de rata). J Control Release 2007 118:245-253). Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción pueden formularse en nanopartículas lipídicas que comprenden el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG.

En un aspecto, los copolímeros de bloque descritos en esta invención se incluyen en un complejo de poliiones que comprende una micela no polimérica y el copolímero de bloque. (Véase, por ejemplo, la Pub. EE.UU. n.° 20120076836).

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, pero no se limitan a, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.

En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprende al menos un polímero de poli(éster de vinilo). El polímero de poli(éster de vinilo) puede ser un copolímero tal como un copolímero aleatorio. Como ejemplo no limitante, el copolímero aleatorio tiene una estructura tal como las descritas en la Solicitud internacional n.° WO2013032829 o la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130121954. En un aspecto, los polímeros de poli(éster de vinilo) pueden conjugarse con los polinucleótidos descritos en esta invención.

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende al menos un copolímero dibloque. El copolímero dibloque puede ser, pero no se limita a, un copolímero de ácido poli(láctico)-poli(etilen)glicol (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente internacional n.° WO2013044219). Como ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica se usa para tratar el cáncer (véase la Publicación internacional n.° WO2013044219).

En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero catiónico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica.

En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero que contiene amina tales como, pero no se limitan a, polilisina, polietilenimina, poli(amidoamina) dendrímeros, poli(beta-amino ésteres) (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. n.° 8.287.849) y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto, las nanopartículas descritas en esta invención comprenden un lípido catiónico de amina tales como los descritos en la Solicitud de Patente internacional n.° WO2013059496. En un aspecto, los lípidos catiónicos tienen un resto amino-amina o aminoamida.

En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, pero no se limitan a, poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.

En otro aspecto, la nanopartícula terapéutica incluye una conjugación de al menos un ligando de direccionamiento. El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando conocido en la técnica, tal como, pero no limitado a, un anticuerpo monoclonal. (Kirpotin y col, Cancer Res. 200666:6732-6740).

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica se formula en una solución acuosa que se puede utilizar para alcanzar el cáncer (véase la Pub internacional n.° WO2011084513 y la Pub de EEUU. n.° US20110294717).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan utilizando los procedimientos descritos por Podobinski y col en la Patente de EE.UU. n.° 8.404.799.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan en, se unen a, y/o se asocian con nanovehículos sintéticos. Los nanovehículos sintéticos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las Pub. internacionales n.° WO2010005740, WO2010030763, WO201213501, WO2012149252, WO2012149255, WO2012149259, WO2012149265, WO2012149268, WO2012149282, WO2012149301, WO2012149393, WO2012149405, WO2012149411, WO2012149454 y WO2013019669, y las Pub. de EE.UU. n.° US20110262491, US20100104645, US20100087337 y US20120244222. Los nanovehículos sintéticos se pueden formular utilizando los procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención. Como ejemplo no limitante, los nanovehículos sintéticos pueden formularse mediante los procedimientos descritos en las Pub internacionales n.° WO2010005740, WO2010030763 y WO201213501 y las Pub. de EE.UU. n.° US20110262491, US20100104645, US20100087337 y US2012024422. En otro aspecto, las formulaciones de nanovehículos sintéticos pueden liofilizarse mediante procedimientos descritos en la Pub. internacional n.° WO2011072218 y la Pat de EE.UU. n.° 8.211.473. En otro aspecto más, las formulaciones de la presente descripción, incluyendo, pero no limitadas a, nanovehículos sintéticos, pueden liofilizarse o reconstituirse mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130230568.

En un aspecto, los nanovehículos sintéticos contienen grupos reactivos para liberar los polinucleótidos descritos en esta invención (véase la Pub. internacional n.° WO20120952552 y la Pub de EE.UU. n.° US20120171229).

En un aspecto, los nanovehículos sintéticos contienen un agente inmunoestimulante para mejorar la respuesta inmunitaria a partir de la administración del nanovehículo sintético. Como ejemplo no limitante, el nanovehículo sintético puede comprender un agente inmunoestimulador de Th1 que puede mejorar una respuesta basada en Th1 del sistema inmunitario (véase la Pub internacional n.° WO2010123569 y la Pub. de EE.UU. n.° US20110223201).

En un aspecto, los nanovehículos sintéticos están formulados para la liberación dirigida. En un aspecto, el nanovehíuclo sintético se formula para liberar los polinucleótidos a un pH especificado y/o después de un intervalo de tiempo deseado. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula sintética se formula para liberar los polinucleótidos después de 24 horas y/o a un pH de 4,5 (véase las Pub. internacionales n.° WO2010138193 y WO2010138194 y las Pub de EE.UU. n.° US20110020388 y US20110027217).

En un aspecto, los nanovehículos sintéticos se formulan para una liberación controlada y/o sostenida de los polinucleótidos descritos en esta invención. Como ejemplo no limitante, los nanovehículos sintéticos para liberación sostenida se formulan mediante procedimientos conocidos en la técnica, descritos en esta invención y/o como se describe en la Pub internacional n.° WO2010138192 y la Pub de EE.UU. n.° 20100303850.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan para liberación controlada y/o sostenida, donde la formulación comprende al menos un polímero que es un polímero de cadena lateral cristalina (CYSC). Los polímeros CYSC se describen en la Patente de EE.UU. n.° 8.399.007.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L están encapsulados en, unidos a, y/o asociados con lípidos zwitteriónicos. Se describen ejemplos no limitantes de lípidos zwitteriónicos y procedimientos de uso de lípidos zwitteriónicos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130216607. En un aspecto, los lípidos zwitteriónicos pueden utilizarse en los liposomas y nanopartículas lipídicas descritas en esta invención.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en nanovehículos coloidales como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130197100.

En un aspecto, la nanopartícula está optimizada para la administración por vía oral. La nanopartícula puede comprender al menos un biopolímero catiónico tal como, pero no limitado a, quitosano o un derivado del mismo. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula puede formularse mediante los procedimientos descritos en la Pub. de EE.UU. n.° 20120282343.

En algunos aspectos, las LNP comprenden el lípido KL52 (un amino-lípido descrito en la Publicación de Solicitud de EE.UU. n.° 2012/0295832). La actividad y/o seguridad (como se mide al examinar uno o más de ALT/AST, recuento de glóbulos blancos e inducción de citocinas) de la administración de las LNP puede mejorarse mediante la incorporación de dichos lípidos. Las LNP que comprenden KL52 pueden administrarse por vía intravenosa y/o en una o más dosis. En algunos aspectos, la administración de LNP que comprenden KL52 produce una expresión igual o mejorada de ARNm y/o proteínas en comparación con las LNP que comprenden MC3.

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se administran utilizando LNP más pequeñas. Dichas partículas pueden comprender un diámetro de menos de 0,1 um hasta 100 nm tal como, pero no limitado a, menor que 0,1 um, menor que 1,0 um, menor que 5 um, menor que 10 um, menor que 15 um, menor que 20 um, menor que 25 um, menor que 30 um, menor que 35 um, menor que 40 um, menor que 50 um, menor que 55 um, menor que 60 um, menor que 65 um, menor que 70 um, menor que 75 um, menor que 80 um, menor que 85 um, menor que 90 um, menor que 95 um, menor que 100 um, menor que 125 um, menor que 150 um, menor que 175 um, menor que 200 um, menor que 225 um, menor que 250 um, menor que 275 um, menor que 300 um, menor que 325 um, menor que 350 um, menor que 375 um, menor que 400 um, menor que 425 um, menor que 450 um, menor que 475 um, menor que 500 um, menor que 525 um, menor que 550 um, menor que 575 um, menor que 600 um, menor que 625 um, menor que 650 um, menor que 675 um, menor que 700 um, menor que 725 um, menor que 750 um, menor que 775 um, menor que 800 um, menor que 825 um, menor que 850 um, menor que 875 um, menor que 900 um, menor que 925 um, menor que 950 um, o menor que 975 um.

En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se administran utilizando LNP más pequeñas que pueden comprender un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm y/o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm.

En algunos aspectos, dichas LNP se sintetizan mediante el uso de procedimientos que comprenden mezcladoras de microfluidos. Los mezcladores de microfluidos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, un micromezclador interdigital de hendidura incluyendo, pero no limitados a, los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador en espiga escalonado (SHM) (Zhigaltsev, I.V. y col., se han publicado Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing (diseño ascendente y la síntesis de sistemas de nanopartículas lipídicas de tamaño límite con núcleos acuosos y de triglicéridos usando mezcla microfluídica de milisegundos) (Langmuir. 2012. 28:3633-40; Belliveau, N.M. y col., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA (Síntesis microfluídica de nanopartículas lipídicas de tamaño límite altamente potentes para el suministro in vivo de ARNpi). Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2012. 1:E37;; Chen, D. y col., Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation (Descubrimiento rápido de potentes nanopartículas de lípidos que contienen ARNpi habilitadas para formulación microfluídica controlada). J Am Chem Soc. 2012.

134(16):6948-51). En algunos aspectos, los procedimientos para generar LNP que comprenden SHM comprenden además la mezcla de al menos dos corrientes de entrada, donde la mezcla se produce mediante advección caótica inducida por microestructura (MICA). Según este procedimiento, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espiga, lo que provoca un flujo rotacional y que pliega los fluidos entre sí. Este procedimiento también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, donde la superficie cambia de orientación durante el ciclado de fluido. Los procedimientos para generar LNP mediante el uso de SHM incluyen los descritos en la Publicación de Solicitud de EE.UU. n.° 2004/0262223 y 2012/0276209.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se formulan en nanopartículas lipídicas creadas utilizando un micromezclador tal como, pero no limitados a, un mezclador microestructurado interdigital de hendidura (SIMM-V2) o un micromezclador interdigital de hendidura estándar (SSIMM) o Caterpillar (CPMM) o Impacting-jet (IJMM) del Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente descripción se formulan en nanopartículas lipídicas creadas mediante el uso de tecnología de microfluidos (véase Whitesides, George M. The Origins and the Future of Microfluidics (El origen y el futuro de los microfluídos). Nature, 2006442: 368-373; y Abraham y col. Chaotic Mixer for Microchannels (Mezclador caótico para microcanales). Science 2002 295: 647-651). Como ejemplo no limitante la formulación de microfluidos controlada incluye un procedimiento pasivo para mezclar corrientes de flujos constantes impulsados por presión en microcanales con un número bajo de Reynolds (véase, por ejemplo, Abraham y col. Chaotic Mixer for Microchannels (Mezclador caótico para microcanales). Science 2002295: 647-651).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden formular en las nanopartículas lipídicas creadas utilizando un chip de micromezclador tal como, pero no limitados a, los de Harvard Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, RU). Un chip de micromezclador puede utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de división y recombinación.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan para la administración utilizando las microesferas de encapsulamiento de fármaco descritas en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013063468 o la Patente de E^e.UU. n.° 8.440.614. Las microesferas pueden comprender un compuesto de fórmula (I), (II), (III), (IV), (V) o (VI) como se describe en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013063468. En otro aspecto, el aminoácido, péptido, polipéptido, lípidos (APPL) son útiles para administrar los polinucleótidos de la descripción a células (véase la Publicación de Patente internacional n.° WO2013063468).

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en nanopartículas lipídicas con un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, tales como, pero no limitados a, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.

En un aspecto, las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En un aspecto, la nanopartícula lipídica tiene un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 25 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, may 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.

En un aspecto, la nanopartícula lipídica es una nanopartícula lipídica de tamaño limitado descrita en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013059922. La nanopartícula lipídica de tamaño límitado puede comprender una bicapa lipídica que rodea un núcleo acuoso o núcleo hidrofóbico; donde la bicapa lipídica puede comprender un fosfolípido tal como, pero no limitados a, diacilfosfatidilcolina, una diacilfosfatidiletanolamina, una ceramida, una esfingomielina, una dihidroesfingomielina, una cefalina, un cerebrósido, una diacilfosfatidilcolina de ácido graso C8-C20 y 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina (POPC). En otro aspecto, la nanopartícula lipídica de tamaño límitado puede comprender un polietilenglicol-lípido tal como, pero no limitados a, DLPE-PEG, Dm Pe -PEG, DPPC-PEG y Ds Pe -PEG.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se suministran, se localizan y/o se concentran en una ubicación específica usando los procedimientos de administración descritos en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013063530. Como ejemplo no limitante, puede administrarse a un sujeto una partícula polimérica vacía antes de, al mismo tiempo que, o después de la administración de los polinucleótidos al sujeto. La partícula polimérica vacía experimenta un cambio de volumen una vez que entra en contacto con el sujeto y se aloja, incrusta, inmoviliza o queda atrapada en una ubicación específica en el sujeto.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un sistema de liberación de sustancia activa (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130102545). El sistema de liberación de sustancia activa puede comprender 1) al menos una nanopartícula unida a una cadena inhibidora de oligonucleótidos que se hibrida con un ácido nucleico catalíticamente activo y 2) un compuesto unido a al menos una molécula de sustrato unida a una sustancia terapéuticamente activa (por ejemplo, los polinucleótidos descritos en esta invención), donde la sustancia terapéuticamente activa se libera mediante escisión de la molécula de sustrato por el ácido nucleico catalíticamente activo.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula que comprende un núcleo interno que comprende un material no celular y una superficie externa que comprende una membrana celular. La membrana celular puede derivarse de una célula o una membrana derivada de

un virus. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula se prepara mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013052167. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula descrita en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013052167 se usa para administrar los polinucleótidos descritos en esta invención.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en bicapas lipídicas (protocélulas) soportadas por nanopartículas porosas. Las protocélulas se describen en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013056132.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en esta invención se formulan en nanopartículas poliméricas como se describe en, o se preparan mediante los procedimientos descritos en, la Patente de EE.UU. n.° 8.420.123 y 8.518.963 y la Patente europea n.° EP2073848B1. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula polimérica tiene una temperatura de transición vítrea elevada tales como las nanopartículas descritas en, o las nanopartículas preparadas mediante los procedimientos descritos en la Patente de EE.UU. n.° 8.518.963. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula polimérica para formulaciones orales y parenterales se prepara mediante los procedimientos descritos en la Patente europea n.° EP2073848B1.

En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en esta invención se formulan en nanopartículas utilizadas en la formación de imágenes. Las nanopartículas pueden ser nanopartículas de liposomas, tales como las descritas en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130129636. Como ejemplo no limitante, el liposoma puede comprender ácido gadolinio(III)2-{4,7-bis-carboximetil-10-[(N,N-diestearilamidometil-N'-amido-metil]-1,4,7,10-tetra-azaciclododec-1-il}-acético y un componente de fosfolípido neutro completamente saturado (véase la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20l30129636).

En un aspecto, las nanopartículas que se pueden usar en la presente descripción se forman mediante los procedimientos descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° US20130130348.

Las nanopartículas de la presente descripción pueden incluir además nutrientes tales como, pero no limitados a, aquellos cuyas deficiencias pueden provocar riesgos para la salud desde anemia hasta defectos del tubo neural (véase, por ejemplo, las nanopartículas descritas en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013072929). Como ejemplo no limitante, el nutriente es hierro en forma de sales ferrosas, férricas o hierro elemental, yodo, ácido fólico, vitaminas o micronutrientes.

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula hinchable. La nanopartícula hinchable puede ser, pero no se limita a, las descritas en la Patente de EE.UU. n.° 8.440.231. Como ejemplo, la nanopartícula hinchable se usa para administrar los polinucleótidos de la presente descripción al sistema pulmonar (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 8.440.231).

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en nanopartículas de polianhídrido tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Patente de EE.UU. n.° 8.449.916.

Las nanopartículas y micropartículas de la presente descripción pueden diseñarse geométricamente para modular la respuesta inmunitaria y/o macrófagos. En un aspecto, las partículas diseñadas geométricamente pueden tener formas, tamaños y/o cargas superficiales variadas para incorporar los polinucleótidos de la presente descripción para la administración dirigida tales como, pero no limitados a, administración pulmonar (véase, por ejemplo, la Publicación internacional n.° WO2013082111). Otras características físicas que las partículas diseñadas geométricamente pueden tener incluyen, pero no se limitan a, ventanajes, brazos en ángulo, asimetría y rugosidad de la superficie, carga que pudiera alterar las interacciones con las células y los tejidos. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas de la presente descripción se preparan mediante los procedimientos descritos en la Publicación internacional n.° WO2013082111.

En un aspecto, las nanopartículas de la presente descripción son nanopartículas solubles en agua tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Publicación internacional n.° WO2013090601. Las nanopartículas pueden ser nanopartículas inorgánicas que tienen un ligando zwitteriónico y compacto para mostrar una solubilidad en agua satisfactoria. Las nanopartículas también pueden tener diámetros hidrodinámicos (DH) pequeños, estabilidad con respecto al tiempo, pH, y salinidad y un nivel bajo de unión a proteína no específica.

En un aspecto, las nanopartículas de la presente descripción se desarrollan mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130172406.

En un aspecto, las nanopartículas de la presente descripción son nanopartículas no detectables o nanopartículas no detectables específicas de la diana, tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130172406. Las nanopartículas de la presente descripción pueden prepararse mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de e E.UU. n.° US20130172406.

En otro aspecto, las nanopartículas no detectables o no detectables específicas de la diana comprenden una matriz polimérica. La matriz polimérica puede comprender dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, poliésteres, polianhídridos, poliéteres, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos, policianoacrilatos o combinaciones de los mismos.

En un aspecto, la nanopartícula es una estructura híbrida de nanopartícula-ácido nucleico que tiene una capa de ácido nucleico de alta densidad. Como ejemplo no limitante, la estructura híbrida de ácido nucleico y nanopartículas se prepara mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130171646. La nanopartícula puede comprender un ácido nucleico, tal como, pero no limitados a, los polinucleótidos descritos en esta invención y/o conocidos en la técnica.

Al menos una de las nanopartículas de la presente descripción puede incrustarse en el núcleo de una nanoestructura o recubrirse con una estructura 3D porosa de densidad baja o recubrimiento que sea capaz de transportar o asociarse con al menos una carga útil dentro o en la superficie de la nanoestructura. Se describen ejemplos no limitantes de nanoestructuras que comprenden al menos una nanopartícula en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013123523.

Hialuronidasa

La inyección localizada intramuscular, intratumoral o subcutánea de polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L puede incluir hialuronidasa, que cataliza la hidrólisis de hialuronano. Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un constituyente de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del hialuronano, lo que aumenta la permeabilidad del tejido (Frost, Expert Opin. Drug Deliver. (2007) 4:427-440). Es útil para agilizar su dispersión y distribución sistémica de proteínas codificadas producidas por células transfectadas. Alternativamente, la hialuronidasa puede usarse para aumentar el número de células expuestas a un polinucleótido de la descripción administrado por vía intramuscular, intratumoral o subcutánea.

Imitadores de nanopartículas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden encapsular dentro de, y/o absorber en un imitador de nanopartículas. Un imitador de nanopartículas puede imitar la función de administración de organismos o partículas tales como, pero no limitados a, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos de la descripción pueden encapsularse en una partícula que no sea de virión que puede imitar la función de administración de un virus (véase la Publicación internacional n.° WO2012006376 y la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130171241 y US20130195968).

Nanotubos

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden juntarse o unirse de otro modo a al menos un nanotubo tales como, pero no limitados a, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases gemelas con un enlazador, nanotubos de carbono y/o nanotubos de carbono de pared simple, Los polinucleótidos pueden unirse a los nanotubos a través de fuerzas tales como, pero no limitadas a, fuerzas estéricas, iónicas, covalentes y/u otras. Los nanotubos y las formulaciones de nanotubos que comprenden polinucleótidos se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/027077.

Nanopartículas autoensambladas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden formularse en nanopartículas autoensambladas. Las nanopartículas autoensambladas de ácido nucleico se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/027077, tales como en los párrafos [000740]-[000743]. Las nanopartículas autoensambladas basadas en polímeros se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/027077.

Macromoléculas autoensambladas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden formular en macromoléculas anfifílicas (AM) para su administración. Las AM comprenden polímeros anfifílicos biocompatibles que tienen una estructura principal de azúcar alquilado unida covalentemente a poli(etilenglicol). En solución acuosa, las AM se autoensamblan para formar micelas. Se describen ejemplos no limitantes de procedimientos para formar AM y AM en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130217753.

Nanopartículas inorgánicas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden formular en nanopartículas inorgánicas (Patente de EE.UU. n.° 8.257.745). Las nanopartículas inorgánicas pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias arcillosas que se hinchan con agua. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas inorgánicas incluyen arcillas de esmectita sintéticas que se fabrican a partir de silicatos simples (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. n.° 5.585.108 y 8.257.745).

En algunos aspectos, las nanopartículas inorgánicas comprenden un núcleo de los polinucleótidos descritos en esta invención y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en esta invención y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger los polinucleótidos en el núcleo.

Nanopartículas semiconductoras y metálicas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden formularse en nanopartículas dispersables en agua que comprenden un material semiconductor o metálico (Pub. de EE.UU. n.° 20120228565) o formarse en una nanopartícula magnética (Pub. de EE.UU. n.° 20120265001 y 20120283503). Las nanopartículas dispersables en agua pueden ser nanopartículas hidrófobas o nanopartículas hidrófilas.

En algunos aspectos, las nanopartículas semiconductoras y/o metálicas pueden comprender un núcleo de los polinucleótidos descritos en esta invención y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en esta invención y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger los polinucleótidos en el núcleo.

Selladores quirúrgicos: geles e hidrogeles

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan en cualquier hidrogel conocido en la técnica que forma un gel cuando se inyecta en un sujeto. Los selladores quirúrgicos tales como geles e hidrogeles se describen en la Solicitud de Patente internacional n.° PCT/US2014/027077.

Formulaciones de suspensión

En algunos aspectos, se describen formulaciones en suspensión que comprenden polinucleótidos, depósitos de aceite inmiscibles en agua, tensioactivos y/o co-tensioactivos y/o codisolventes. Las combinaciones de aceites y tensioactivos pueden permitir la formulación en suspensión con polinucleótidos. La administración de polinucleótidos en un depósito inmiscible en agua se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad mediante la liberación sostenida de ARNm desde el depósito al entorno fisiológico circundante e impedir la degradación de polinucleótidos por nucleasas.

En algunos aspectos, las formulaciones en suspensión de ARNm se preparan usando combinaciones de polinucleótidos, soluciones de base oleosa y tensioactivos. Dichas formulaciones se pueden preparar como un sistema de dos partes que comprende una fase acuosa que comprende polinucleótidos y una fase de base oleosa que comprende aceite y tensioactivos. Los aceites ejemplares para formulaciones de suspensión pueden incluir, pero no se limitan a, aceite de sésamo y Miglyol (que comprende ésteres de ácidos grasos caprílico y cáprico derivados de aceite de coco y palmiste saturado y glicerina o propilenglicol), aceite de maíz, aceite de soja, aceite de cacahuete, cera de abejas y/o aceite de semilla de palma. Los tensioactivos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, Cremophor, polisorbato 20, polisorbato 80, polietilenglicol, transcutol, CAPMUL®, labrasol, miristato de isopropilo y/o Span 80. En algunos aspectos, las suspensiones pueden comprender codisolventes incluyendo, pero no limitados a, etanol, glicerol y/o propilenglicol.

Las suspensiones se pueden formar preparando primero una formulación de polinucleótidos que comprende una solución acuosa de polinucleótido y una fase de base oleosa que comprende uno o más tensioactivos. La formación de la suspensión se produce como resultado de la mezcla de las dos fases (acuosa y oleosa). En algunos aspectos, dicha suspensión se puede suministrar a una fase acuosa para formar una emulsión de aceite en agua. En algunos aspectos, la administración de una suspensión a una fase acuosa da como resultado la formación de una emulsión de aceite en agua en la que la fase de base oleosa que comprende polinucleótidos forma gotas que pueden variar en tamaño desde gotas de tamaño nanométrico hasta gotas de tamaño micrométrico. En algunos aspectos, combinaciones específicas de aceites, tensioactivos, cotensioactivos y/o codisolventes se pueden utilizar para suspender polinucleótidos en la fase oleosa y/o para formar emulsiones de aceite en agua tras la administración en un entorno acuoso.

En algunos aspectos, las suspensiones modulan la liberación de polinucleótidos en el entorno circundante. En tales aspectos, la liberación de polinucleótidos puede modularse por difusión desde un depósito inmiscible en agua seguido de resolubilización en un entorno circundante (por ejemplo, un entorno acuoso).

En algunos aspectos, los polinucleótidos dentro de un depósito inmiscible en agua (por ejemplo, suspendidos dentro de una fase oleosa) dan como resultado una estabilidad alterada de los polinucleótidos (por ejemplo, degradación alterada por nucleasas).

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan de manera que tras la inyección, se forma espontáneamente una emulsión (por ejemplo, cuando se administra a una fase acuosa). Tal formación de partículas puede proporcionar una alta relación de área superficial a volumen para la liberación de polinucleótidos de una fase oleosa a una fase acuosa.

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanoemulsión tal como, pero no limitadas a, las nanoemulsiones descritas en la Patente de EE.UU. n.° 8.496.945. Las nanoemulsiones pueden comprender nanopartículas descritas en esta invención. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas pueden comprender un núcleo hidrofóbico líquido que puede estar rodeado o recubierto con una capa lipídica o tensioactiva. La capa de lípido o tensioactivo puede comprender al menos un péptido de integración de membrana y también puede comprender un ligando dirigido (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 8.496.945).

Cationes y aniones

Las formulaciones de polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden incluir cationes o aniones. En algunos aspectos, las formulaciones incluyen cationes metálicos tales como, pero no limitados a, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ y combinaciones de los mismos. Como ejemplo no limitante, las formulaciones incluyen polímeros y polinucleótidos en complejo con un catión metálico (véase, por ejemplo, las Pat de EE.UU. n.° 6.265.389 y 6.555.525).

En algunos aspectos, las nanopartículas catiónicas que comprenden combinaciones de cationes divalentes y monovalentes se formulan con polinucleótidos. Tales nanopartículas pueden formarse espontáneamente en solución durante un período determinado (por ejemplo, horas, días, etc.). Tales nanopartículas no se forman en presencia de cationes divalentes solos o en presencia de cationes monovalentes solos. El suministro de polinucleótidos en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprenden nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad de los polinucleótidos al actuar como un depósito de acción prolongada y/o reduciendo la tasa de degradación por nucleasas.

Nanopartículas y micropartículas moldeadas

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden formularse en nanopartículas y/o micropartículas. Como ejemplo, las nanopartículas y/o micropartículas se pueden fabricar utilizando la tecnología ^pRⁱNT® de LIQUIDA TECHNOLOGIES® (Morrisville, ⁿC) (véase, por ejemplo, la Pub. internacional n.° WO2007024323).

En algunos aspectos, las nanopartículas comprenden un núcleo de los polinucleótidos descritos en esta invención y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en esta invención y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger los polinucleótidos en el núcleo.

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en micropartículas. Las micropartículas pueden contener un núcleo de los polinucleótidos y una coraza de un polímero biodegradable y/o biocompatible. Como ejemplo no limitante, las micropartículas que se pueden usar con la presente descripción pueden ser las descritas en la Patente de EE.UU. n.° 8.460.709, la Publicación de Patente de e E.UU. n.° US20130129830 y la Publicación de Patente internacional n.° WO2013075068. Como otro ejemplo no limitante, las micropartículas pueden diseñarse para extender la liberación de los polinucleótidos de la presente descripción durante un período de tiempo deseado (véase, por ejemplo, liberación prolongada de una proteína terapéutica en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130129830).

Nanojacket y nanoliposomas

Keystone Nano (State College, PA) puede formular los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en nanojacket (nanopartículas) y nanoliposomas. Las nanojacket están hechas de compuestos que se encuentran naturalmente en el cuerpo, incluyendo calcio, fosfato y también pueden incluir una pequeña cantidad de silicatos. Las nanojacket pueden variar en tamaño de 5 a 50 nm y se pueden usar para administrar compuestos hidrofílicos e hidrofóbicos tales como, pero no limitados a, polinucleótidos.

Los nanoliposomas están hechos de lípidos tales como, pero no limitados a, lípidos que se encuentran naturalmente en el cuerpo. Los nanoliposomas pueden variar en tamaño de 60-80 nm y se pueden usar para administrar compuestos hidrofílicos e hidrofóbicos tales como, pero no limitados a, polinucleótidos. En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un nanoliposoma tal como, pero no limitadas a, nanoliposomas de ceramida.

Minicélulas

En un aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden formularse en minicélulas bacterianas. Como ejemplo no limitante, las minicélulas bacterianas son las descritas en la Publicación internacional n.° WO2013088250 o la Publicación de Patente de EEUU. n.° US20130177499. Las minicélulas bacterianas que comprenden agentes terapéuticos tales como los polinucleótidos descritos en esta invención pueden usarse para administrar los agentes terapéuticos a los tumores cerebrales.

Composiciones semisólidas

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan con una matriz hidrofóbica para formar una composición semisólida. Como ejemplo no limitante, la composición semisólida o la composición similar a una pasta se prepara mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente internacional n.° WO201307604. La composición semisólida puede ser una formulación de liberación sostenida como se describe en la Publicación de Patente internacional n.° WO201307604.

En otro aspecto, la composición semisólida tiene además una membrana microporosa o un polímero biodegradable formado alrededor de la composición (véase por ejemplo, la Publicación de Patente internacional n.° WO201307604).

La composición semisólida que usa los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L puede tener las características de la mezcla semisólida como se describe en la Publicación de Patente internacional n.° WO201307604 (por ejemplo, un módulo de elasticidad de al menos 10-4 Nm m -2, y/o una viscosidad de al menos 100 mPas).

Exosomas

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en exosomas. Los exosomas pueden cargarse con al menos un polinucleótido y administrarse a células, tejidos y/u organismos. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se pueden cargar en los exosomas descritos en la Publicación internacional n.° WO2013084000.

Suministro basado en seda

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un sistema de administración basado en seda de liberación sostenida. El sistema de administración a base de seda se puede formar poniendo en contacto una solución de fibroína de seda con un agente terapéutico tal como, pero no limitados a, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Como ejemplo no limitante, el sistema de administración basado en seda de liberación sostenida que se puede usar en la presente descripción y los procedimientos para preparar dicho sistema se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130177611.

Micropartículas

En algunos aspectos, las formulaciones que comprenden polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L comprenden micropartículas. Las micropartículas pueden comprender un polímero descrito en esta invención y/o conocido en la técnica tales como, pero no limitados a, poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido. La micropartícula puede tener superficies adsorbentes para adsorber moléculas biológicamente activas tales como polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, las micropartículas para usar con la presente descripción y los procedimientos para preparar micropartículas se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US2013195923 y US20130195898 y la Patente de EE.UU. n.° 8.309.139 y 8.206.749.

En otro aspecto, la formulación es una microemulsión que comprende micropartículas y polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, las microemulsiones que comprenden micropartículas se describen en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US2013195923 y US20130195898 y la Patente de EE.UU. n.° 8.309.139 y 8.206.749.

Lípidos de aminoácido

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en lípidos de aminoácidos. Los lípidos de aminoácidos son compuestos lipófilos que comprenden un residuo de aminoácido y una o más colas lipófilas. Se describen ejemplos no limitantes de lípidos de aminoácidos y procedimientos para preparar lípidos de aminoácidos en la Patente de EE.UU. n.° 8.501.824.

En algunos aspectos, los lípidos de aminoácidos tienen una parte hidrófila y una parte lipófila. La porción hidrófila puede ser un residuo de aminoácido y una porción lipófila puede comprender al menos una cola lipófila.

En algunos aspectos, las formulaciones de lípidos de aminoácidos se usan para administrar los polinucleótidos a un sujeto.

En otro aspecto, las formulaciones de lípidos de aminoácidos administran un polinucleótido en forma liberable que comprende un lípido de aminoácido que se une y libera los polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, la liberación de los polinucleótidos puede proporcionarse mediante un enlazador lábil en ácido tales como, pero no limitados a, los descritos en las Patentes de EE.UU. n.° 7.098.032, 6.897.196, 6.426.086, 7.138.382, 5.563.250, y 5.505.931.

Microvesículas

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en microvesículas. Los ejemplos no limitantes de microvesículas incluyen las descritas en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130209544.

En algunos aspectos, la microvesícula es una microvesícula mediada por ARRDC1 (ARMM). Se describen ejemplos no limitantes de ARMM y procedimientos para preparar ARMM en la Publicación de Patente internacional n.° WO2013119602.

Complejos de interpolielectrolito

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un complejo de interpolielectrolito. Los complejos de interpolielectrolito se forman cuando los polímeros dinámicos de carga forman complejos con una o más moléculas aniónicas. Se describen ejemplos no limitantes de polímeros de carga dinámica y complejos de interpolielectrolito y procedimientos para preparar complejos de interpolielectrolitos en la Patente de EE.UU. n.° 8.524.368.

Sistemas poliméricos cristalinos

En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en sistemas poliméricos cristalinos. Los sistemas poliméricos cristalinos son polímeros con restos cristalinos y/o unidades de extremo terminales que comprenden restos cristalinos. Se describen ejemplos no limitantes de polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos denominados "polímeros CYC", sistemas de polímeros cristalinos y procedimientos para preparar tales polímeros y sistemas en la Patente de EE.UU. n.° US 8.524.259.

Excipientes

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en esta invención, incluye, pero no se limita a, todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes, agentes aromatizantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, agentes de ajuste del pH y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Salvo en la medida en que algún medio excipiente convencional pueda no ser compatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de cualquier efecto biológico no deseado o, de otro modo, en la interacción de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se puede contemplar el uso de un medio excipiente convencional.

En algunos aspectos, un excipiente farmacéuticamente aceptable tiene una pureza de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En algunos aspectos, un excipiente se aprueba para su uso en seres humanos y para uso veterinario. En algunos aspectos, un excipiente puede ser aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE.UU. En algunos aspectos, un excipiente puede ser de calidad farmacéutica. En algunos aspectos, un excipiente puede cumplir con los estándares de la Farmacopea de los EE.UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas. La composición también puede incluir excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y/o agentes perfumantes.

Los diluyentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes de granulación y/o dispersión ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEEN®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [Span®60], triestearato de sorbitán [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, éter laurílico de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, laurilsulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato de sodio, etc y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes aglutinantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol); aminoácidos ((por ejemplo, glicina); gomas naturales y sintéticas ((por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (Veegum®), y arabogalactano de lárice); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.

Los conservantes ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos, y/u otros conservantes. La oxidación es una vía de degradación potencial del ARNm, especialmente para las formulaciones líquidas de ARNm. Para prevenir la oxidación, se pueden agregar antioxidantes a la formulación. Antioxidantes ejemplares incluyen, entre otros, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbil, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, EDTA, m-cresol, metionina, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tioglicerol y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, fenetidina, fenetidina, imidureaxidinio, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero no se limitan a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (^bH^a), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.

En algunos aspectos, el pH de las soluciones de polinucleótidos se mantiene entre pH 5 y pH 8 para mejorar la estabilidad. Los tampones ejemplares para controlar el pH pueden incluir, pero no se limitan a, fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, histidina (o histidina-HCl), carbonato de sodio, y/o malato de sodio. En otro aspecto, los tampones ejemplares enumerados anteriormente pueden usarse con contraiones monovalentes adicionales (que incluyen, pero no se limitan a, potasio). También pueden usarse cationes divalentes como contraiones tampón; sin embargo, estos no son los preferidos debido a la formación de complejos y/o degradación del ARNm.

Los agentes tamponadores ejemplares también pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.

Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aceites de almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de grosella negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, cacahuete, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, savoury (summer savoury), espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y germen de trigo. Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.

Los excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.

Los aditivos ejemplares incluyen tampones fisiológicamente biocompatibles (porejemplo, clorhidrato de trimetilamina), adición de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (como por ejemplo calcio DTPA, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio). Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.

Crioprotectores para ARNm

En algunos aspectos, las formulaciones de polinucleótidos comprenden crioprotectores. Como se usa en esta invención, el término "crioprotector" se refiere a uno o más agentes que, cuando se combinan con una sustancia dada, ayudan a reducir o eliminar el daño a esa sustancia que se produce al congelarse. En algunos aspectos, los crioprotectores se combinan con polinucleótidos para estabilizarlos durante la congelación. El almacenamiento congelado de ARNm entre -20 °C y -80 °C puede ser ventajoso para la estabilidad a largo plazo (por ejemplo, 36 meses) del polinucleótido. En algunos aspectos se incluyen crioprotectores en las formulaciones de polinucleótidos para estabilizar el polinucleótido a través de ciclos de congelación/descongelación y en condiciones de almacenamiento congelado. Los crioprotectores de la presente descripción pueden incluir, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, lactosa, glicerol, dextrosa, rafinosa y/o manitol. La trehalosa figura en la lista de la Administración de Fármacos y Alimentos como generalmente considerada segura (GRAS) y se usa comúnmente en formulaciones farmacéuticas comerciales.

Agentes de carga

En algunos aspectos, las formulaciones de polinucleótidos comprenden agentes de carga. Como se usa en esta invención, el término "agente de carga" se refiere a uno o más agentes incluidos en las formulaciones para transmitir una consistencia deseada a la formulación y/o estabilización de los componentes de la formulación. En algunos aspectos, se incluyen agentes de carga en formulaciones de polinucleótidos liofilizadas para producir una torta "farmacéuticamente elegante", que estabiliza los polinucleótidos liofilizados durante el almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, 36 meses). Los agentes de carga de la presente descripción pueden incluir, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, manitol, glicina, lactosa y/o rafinosa. En algunos aspectos, las combinaciones de crioprotectores y agentes de carga (por ejemplo, sacarosa/glicina o trehalosa/manitol) puede incluirse tanto para estabilizar los polinucleótidos durante la congelación como para proporcionar un agente de carga para la liofilización.

También se proporcionan ejemplos no limitantes de formulaciones y procedimientos para formular los polinucleótidos de la presente descripción en la Publicación internacional n.° WO2013090648 depositada el 14 de diciembre de 2012.

Suministro desnudo

Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden administrarse a una célula (por ejemplo, a una célula tumoral) desnudos. Como se usa en esta invención, "desnudo" se refiere a administrar polinucleótidos libres de agentes que promuevan la transfección. Por ejemplo, los polinucleótidos administrados a la célula, por ejemplo, célula tumoral, pueden no contener modificaciones. Los polinucleótidos desnudos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden administrarse a la célula tumoral utilizando vías de administración conocidas en la técnica, por ejemplo, administración intratumoral, y descritas en esta invención.

Administración parenteral e inyectable

Las formas de dosificación líquidas para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes de aspectos de suspensión y emulsionantes, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes. En determinados aspectos, para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros, y/o combinaciones de los mismos.

Una composición farmacéutica para administración parenteral, por ejemplo, administración intratumoral puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados puede haber sido aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos (FDA) de los EE.UU. Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluye ácido clorhídrico, manitol, nitrógeno, acetato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio.

Se pueden formular las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida utilizando agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer, USP y la solución isotónica de cloruro de sodio. Convencionalmente, se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables. La formulación estéril también puede comprender adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores.

Las formulaciones inyectables, por ejemplo, intratumoral, se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Las formulaciones inyectables, por ejemplo, intratumoral, pueden ser para inyección directa en una región de tejido, órgano y/o sujeto, por ejemplo, tumor.

Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable retardar la absorción del ingrediente activo por inyección intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Formas de dosificación

Una composición farmacéutica descrita en esta invención puede formularse en una forma de dosificación descrita en esta invención, tales como tópica, intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal o subcutánea).

Formas de dosificación líquidas

Las formas de dosificación líquidas para administración parenteral por ejemplo, intratumoral) incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. En determinados aspectos, para administración parenteral, las composiciones pueden mezclarse con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros, y/o combinaciones de los mismos.

Inyectable

Se pueden formular las preparaciones inyectables (por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida y pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se incluyen, pero no se limitan a, el agua, la solución de Ringer, USP y la solución isotónica de cloruro de sodio. Convencionalmente, se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, puede ser deseable retardar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción de los polinucleótidos depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un polinucleótido administrado por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo los polinucleótidos en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se fabrican formando matrices microencapsuladas de los polinucleótidos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de polinucleótidos a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberación del polinucleótido. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen, pero no se limitan a, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables pueden prepararse atrapando los polinucleótidos en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

VII. Kits y dispositivos

Kits

La descripción describe una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente descripción. Típicamente, los kits comprenderán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos y/o realice múltiples experimentos.

En un aspecto, la presente descripción proporciona kits que comprenden los polinucleótidos de la descripción. En algunos aspectos, el kit comprende uno o más polinucleótidos.

Los kits pueden ser para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El kit puede comprender además el envase e instrucciones y/o un agente de administración para formar una composición de formulación. El agente de administración puede comprender una solución salina, una solución tamponada, un lipidoide o cualquier agente de administración descrito en esta invención.

Enalgunos aspectos, la solución tampón incluye cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. En otro aspecto, la solución tampón incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5 %, sacarosa al 5 % con calcio 2 mM, manitol al 5 %, manitol al 5 % con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con manosa y calcio 2 mM (véase, por ejemplo, la Pub. de EE.UU. n.° 20120258046). En un aspecto adicional, la solución tampón se precipita o se liofiliza. La cantidad de cada componente puede variarse para permitir formulaciones tampón congruentes,reproducibles, simples o salinas, con mayor concentración. Los componentes también pueden variarse para aumentar la estabilidad del ARN modificado en la solución tampón en un período de tiempo y/o en una variedad de condiciones. En un aspecto, la presente descripción describe kits para la producción de proteínas, que comprenden: un polinucleótido que comprende una región traducible, proporcionado en una cantidad efectiva para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando se introduce en una célula diana; un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico inhibidor, proporcionado en una cantidad efectiva para inhibir sustancialmente la respuesta inmunitaria innata de la célula; y embalaje e instrucciones.

En un aspecto, la presente descripción describe kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, donde el polinucleótido muestra una degradación reducida por una nucleasa celular, y embalaje e instrucciones.

Dispositivos

La presente descripción describe dispositivos que pueden incorporar polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Estos dispositivos contienen en una formulación estable los reactivos para sintetizar un polinucleótido en una formulación disponible para administrarse inmediatamente a un sujeto que lo necesita, tal como un paciente humano.

Se pueden emplear dispositivos de administración para administrar los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L según los regímenes de dosificación individuales, múltiples o divididos que se enseñan en esta invención. Dichos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación internacional n.° WO 2013151666 A2.

Se contempla el uso de procedimientos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos junto con los procedimientos y composiciones descritos en esta invención como aspectos de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos procedimientos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, lúmenes o catéteres, así como dispositivos que utilizan calor, corriente eléctrica o mecanismos impulsados por radiación.

Según la presente descripción, estos dispositivos de administración múltiple pueden utilizarse para administrar las dosis únicas, múltiples o divididas contempladas en esta invención. Dichos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación internacional n.° WO 2013151666 A2.

EJEMPLOS

^{E j e m p l o} 1. Expresión en la superficie celular in vitro ^{d e u n p o l i p é p t i d o O X 4 0 L}

Se midió la expresión de un polipéptido OX40L en la superficie de las células cancerosas después del tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

A. Formulación de mOX40L miR122

En este ejemplo se utilizó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). El ARNm modificado con OX40L se formuló en nanopartículas lipídicas (LNP) como se describe en esta invención. (Moderna Therapeutics, Cambridge, MA).

B. Análisis de la expresión en la superficie celular de OX40L

Se sembraron células de melanoma de ratón (B16F10, ATCC n.° CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) en placas de 12 pocillos a una densidad de 140.000 células por pocillo. Dosis crecientes de mOX40L_miR122 (SEQ ID NO: 66) formulados en LNP se añadieron a cada pocillo directamente después de sembrar las células. Las dosis de mOX40L_miR122 incluían 6,3 ng, 12,5 ng, 25 ng o 50 ng de ARNm por pocillo. Las células de control se trataron de forma simulada o se trataron con ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación).

Después del tratamiento, se detectó la expresión de OX40L en la superficie celular mediante citometría de flujo. Las células se recogieron transfiriendo los sobrenadantes a una placa de fondo en U Pro-Bind de 96 pocillos (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Alemania). A continuación, las células de cada pocillo se levantaron con solución quelante sin tripsina y se tiñeron con anticuerpo anti OX40L de ratón conjugado con PE (R&D Systems, Minneapolis, ^{M n )} y se visualizaron por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 2 .}

C. Resultados

^{L a f i g u r a 2} muestra una expresión dependiente de la dosis de OX40L en la superficie de células cancerosas B16F10 después del tratamiento con ARNm modificado con OX40L. Las cuatro dosis de mOX40L_miR122 generaron una expresión significativa de OX40L en la superficie celular en comparación con las muestras de control.

Estos resultados muestran que la administración de un ARNm modificado con OX40L da como resultado la expresión de un polipéptido OX40L en la superficie de las células diana.

^{E j e m p l o 2 : C i n é t i c a d e e x p r e s i ó n} in vitro ^{d e O X 4 0 L e n l a s u p e r f i c i e c e l u l a r}

En este ejemplo, se midieron los niveles de expresión de un polipéptido OX40L en la superficie de las células cancerosas a lo largo del tiempo. También se midió la cuantificación de la expresión de la proteína OX40L.

A. Formulación de mOX40L miR122

En este ejemplo se utilizó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino o OX40L humano) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66; hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65). El ARNm modificado con OX40L se formuló en nanopartículas lipídicas (LNP) como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 o se formuló en LIPOFECTAMINE 2000 (L2K) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante.

B. Líneas celulares

Se sembraron células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC n.° CCL-2; ATCC, Manassas, VA) a una densidad de 250.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. 24 horas después de la siembra, se añadió a cada pocillo mOX40L_miR122 o hOX40L_miR122 formulado con L2K que contenía 3 |jg de ARNm. Las células se trataron con mOX40L_miR122 o hOX40L_miR122 en presencia o ausencia de 50 jg/m l de mitomicina C 24 horas después de la transfección.

Se sembraron células de adenocarcinoma de colon de ratón (MC-38; Rosenberg y col., Science 233(4770):1318-21 (1986)) a una densidad de 300.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Se añadió mOX40L_miR122 formulado con LNP que contenía 3 jg de ARNm a cada pocillo 24 horas después de sembrar las células. Las células MC-38 se trataron con mOX40L_miR122 en presencia o ausencia de 25 jg/m l de mitomicina C.

Las células de control se trataron de forma simulada. La expresión de OX40L en la superficie celular se midió los días 1, 2, 3, 5 y 7 después del tratamiento con mOX40L_miR122 y los días 1, 2, 3, 4 y 5 después del tratamiento con hOX40L_miR122. Las células se recogieron y analizaron por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1. Los resultados de las células tratadas con mOX40L_miR122 se muestran en la ^{f i g u r a 3 A - 3 D ;} los resultados de las células tratadas con hOX40L-_miR122 se muestran en la ^{f i g u r a 3 E .} Los lisados celulares y los sobrenadantes de cultivos celulares también se recogieron y analizaron para determinar la expresión de la proteína OX40L (cuantificada en nanogramos por pocillo). Los resultados de la cuantificación de la proteína OX40L humana y de ratón después de los tratamientos se muestran en la ^{f i g u r a 3 F} y ^{3 G} , respectivamente.

C. Resultados

^{L a f i g u r a 3 A - 3 D} muestra que se detectó OX40L en la superficie de las células HeLa hasta al menos el día 7 después del tratamiento con mOX40L_miR122. ^{L a f i g u r a 3 A - 3 D} también muestra que la expresión de OX40L en la superficie celular en células MC-38 tratadas con mOX40L_miR122 volvió a la línea de base el día 5 después del tratamiento. En ambas líneas celulares, la reducción gradual en los niveles de expresión de OX40L en la superficie celular a lo largo del tiempo fue bloqueada por la presencia de mitomicina C. La ^{f i g u r a 3 E} muestra que la expresión de OX40L humana se detectó en la superficie de las células HeLa hasta al menos el día 5 después del tratamiento conhOX40L_miR122.

No se detectó un desprendimiento significativo del polipéptido OX40L en los sobrenadantes de cultivo. Esto sugiere que la OX40L expresada a partir del ARNm no se eliminó activamente de la superficie celular, lo que se confirmó en la ^{f i g u r a 3 F y 3 G .} Veinticuatro horas después del tratamiento con mOX40L_miR122, hOX40L_miR122, o tratamiento simulado, se prepararon los lisados celulares utilizando tampones de lisis celular estándar y procedimientos para el análisis de proteínas. La ^{f i g u r a 3 F} y la ^{f i g u r a 3 G} muestran que ambos mOX40L_miR122 ( ^{f i g u r a 3 F} ) y hOX40L_miR122 ( ^{f i g u r a 3 G} ) produjeron proteínas que fueron reconocidas por ELISA disponibles en el mercado. La mayoría de la proteína expresada se asoció con el lisado celular, y solo aproximadamente el 0,1 % de la proteína producida se detectó en el sobrenadante de las células transfectadas.

Estos resultados muestran que el tratamiento de células con un ARNm modificado con OX40L da como resultado la expresión de un polipéptido OX40L en la superficie de las células diana. Estos resultados también muestran que las células transfectadas eliminan sólo pequeñas cantidades de proteína.

^{E j e m p l o} 3. Actividad biológica in vitro ^{d e O X 4 0 L}

La activación de células T implica dos eventos de señalización celular simultáneos: una señal principal del complejo receptor de células T (por ejemplo, estimulación de CD3) y una segunda señal de una interacción ligando-receptor coestimuladora (por ejemplo, interacción OX40L/OX40R). Kober y col., European Journal of Immunology 38:2678-2688 (2008). En este ejemplo, se evaluó la actividad biológica coestimuladora de OX40L expresada en la superficie de las células tratadas con mOX40L_miR122 o hOX40L_miR122.

A. Preparación de células que expresan OX40L

Se sembraron células de melanoma de ratón (B16F10, ATCC n.° CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) en placas de 6 pocillos a una densidad de 300.000 células por pocillo. Se sembraron células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) en placas de 6 pocillos como se ha descrito anteriormente. Un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y que comprende además un sitio de unión de miR-122 (OX40L de ratón, mOX40L_miR122, SEQ ID NO: 66; OX40L humano, hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65) se formuló en L2K como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2. 24 horas después de sembrar las células, se añadieron a cada pocillo las formulaciones que contenían 3 |jg de ARNm de mOX40L_miR122 o hOX40L_miR122. Las células de control se trataron de forma simulada o se trataron con ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm excepto sin codones de iniciación). Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C.

B. Preparación de células T CD4+ sin tratamiento previo

Se extrajeron bazos de ratones C57BL/6 y se procesaron usando técnicas estándar en la técnica para generar suspensiones de células individuales de esplenocitos. Se aislaron las células T CD4+ totales de las suspensiones de esplenocitos utilizando un kit de aislamiento de células T CD4 de ratón (Miltenyi, San Diego, CA). Se aislaron las células T CD4+ sin tratamiento previo de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) agotando las células que no son CD4 utilizando un kit de aislamiento de células T de perlas magnéticas disponible en el mercado.

C. Ensayo de activación de células T

Se añadieron 200.000 células T a cada pocillo de células B16F10 transfectadas o células HeLa en presencia de anticuerpo agonista anti-CD3 de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) o anticuerpo agonista anti-CD3 humano y anti-CD28 humano soluble; y las células se cocultivaron durante 72 horas (ratón) o 120 horas (humano). Un esquema de los ensayos se muestra en la ^{f i g u r a 4 A .}

Después del cocultivo con células T, se midió la producción de IL-2 de ratón utilizando un ELISA de IL-2 de ratón. (ratón IL-2 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). La cantidad de IL-2 producida por las células T CD4+ sirve como un indicador de la activación de las células T. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 4 B .} La producción de IL-2 humana se midió usando un ELISA de IL-2 humana (IL-2 DuoSet ELISA humano, R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 4 C , 4 D ,} y ^{4 E .}

D. Resultados

La ^{f i g u r a 4 B} muestra que la expresión de OX40L en la superficie de las células B16F10 tratadas con mOX40L_miR122 provoca una respuesta de IL-2 de células T in vitro. El ARNm de mOX40L_miR122 indujo aproximadamente 12 ng/ml de IL2. Las células B16F10 tratadas con ARNm de control negativo no traducido mostraron niveles iniciales de activación de células T comparables a las células tratadas de forma simulada (es decir, aproximadamente 6 ng/ml de IL2). Por lo tanto, el ARNm de mOX40L_miR122 indujo una expresión de IL2 aproximadamente dos veces mayor en comparación con un control (ARNm tratado con simulación o no traducido).

La ^{f i g u r a 4 C} y ^{4 D} muestran que, en presencia de anticuerpo anti-CD3 humano recubierto en placa y anti-CD28 humano soluble como activadores primarios de células T, el cultivo conjunto con las células HeLa transfectadas con ARNm de OX40L mejoró enormemente la producción de IL-2. Sin expresión de OX40L, se detectó poca o ninguna producción de IL-2. La ^{f i g u r a 4 E} muestra un nivel similar de aumento de la producción de IL-2 humana cuando se realizó el mismo experimento con células T CD4+ preestimuladas (es decir, con tratamiento previo).

Estos resultados muestran que el polipéptido OX40L es biológicamente activo como molécula coestimuladora.

^{E j e m p l o 4 . N i v e l e s d e e x p r e s i ó n} in vivo ^{d e A R N m m o d i f i c a d o}

Para investigar los niveles de expresión in vivo de un polinucleótido que comprende ARNm modificado, se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica luciferasa y que comprende además un sitio de unión de miR-122 (SEQ ID No : 69). El ARNm modificado con luciferasa se formuló en MC3 LNP. (Publicación de EE.UU. n.° US20100324120).

A. Modelo de ratón de adenocarcinoma de colon MC-38

Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6. (Rosenberg y col., Science 233(4770): 1318-21 (1986)).

B. Tratamiento con ARNm modificado con luciferasa

Una vez que los tumores MC-38 alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los ratones fueron tratados con una dosis intratumoral única de 3,125 |jg, 6,25 |jg, 12,5 |jg, 25 |jg o 50 |jg de ARNm modificado con luciferasa (SEQ ID NO: 69; Cap1, ARNm de G5 RP en 1,5 % de DMG MC3 LNP). Los animales de control se trataron con una dosis intratumoral de PBS. 24 horas después del tratamiento, los animales se anestesiaron, se les inyectó el sustrato de luciferasa D-luciferina y se evaluaron las imágenes de bioluminiscencia (BLI) de animales vivos en un generador de imágenes IVIS 15 minutos después. Se obtuvieron señales del tejido tumoral y se compararon con señales del tejido hepático del mismo animal. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 5 .}

C. Resultados

^{L a f i g u r a 5} muestra que la señal de luciferasa en el tejido tumoral se detectó hasta 48 horas después de la dosificación. La ^{f i g u r a 5} también muestra que las tres dosis más altas de ARNm modificado (50 jig, 25 jig y 12,5 jig) produjeron señales de luciferasa comparables en tejido tumoral. La dosis de 12,5 jig de ARNm modificado produjo una señal de tumor alta con una señal de hígado (tejido normal) más baja en el modelo de ratón con carcinoma de colon MC-38.

Estos resultados muestran que la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm modificado y un sitio de unión de miARN se dirige preferentemente a los tejidos tumorales sobre los tejidos normales.

^{E j e m p l o 5 . E x p r e s i ó n d e p e n d i e n t e d e l a d o s i s} in vivo ^{d e O X 4 0 L e n t u m o r e s B 1 6 F 1 0}

Se evaluó la expresión in vivo de OX40L en un modelo de tumor B16F10.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). El ARNm modificado con OX40L se formuló en MC3 LNP como se describe en el documento US20100324120. También se preparó ARNm de control negativo (OX40L NST, SEQ ID NO: 68; una versión no traducible del mismo ARNm excepto sin codones de iniciación).

B. Modelo de tumor B16F10 de melanoma de ratón

Se establecieron tumores subcutáneos B16F10 en ratones C57BL/6. (Overwijk y col. Current Protocols in Immunology cap. 20, unidad 20.1 (2001)).

Una vez que el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 200 mm3, los animales fueron tratados con una única dosis intratumoral de mOX40L_miR122 (Cap1, ARNm de G5 RP en 0,5 % en moles de DMG MC3 LNP) a una dosis de 5 jg de ARNm (aproximadamente 0,25 mg/kg) o 15 jg de ARNm (aproximadamente 0,75 mg/kg). Los animales de control se trataron con dosis equivalentes de ARNm de control negativo, OX40L _NST. Los animales de control adicionales se trataron con PBS.

C. Medición de OX40L en tejido tumoral

Los animales se sacrificaron 8 horas y 24 horas después de la dosificación. Se recogió tejido tumoral y se analizó la expresión de OX40L usando un ensayo ELISA de OX40L de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 6} como la cantidad de OX40L presente por gramo de tejido tumoral.

D. Resultados

^{L a f i g u r a 6} muestra que una única dosis intratumoral de 5 jg de mOX40L_miR122 resultó en más de 200 ng de OX40L/g de tejido tumoral tanto a las 8 horas como a las 24 horas después de la dosificación. La ^{f i g u r a 6} también muestra que una única dosis intratumoral de 15 jg de mOX40L_miR122 resultó en más de 500 ng de OX40L/g de tejido tumoral tanto a las 8 horas como a las 24 horas después de la dosificación.

Por el contrario, se detectaron menos de 100 ng de OX40L en el hígado de los animales tratados con la dosis más alta de 15 jg de mOX40L_miR122.

Estos datos muestran que la administración de mOX40L_miR122 da como resultado niveles significativos de expresión del polipéptido OX40L en el tejido tumoral.

^{E j e m p l o 6 . E x p r e s i ó n} in vivo ^{d e O X 4 0 L e n t u m o r e s M C - 3 8}

Se evaluó la expresión in vivo de OX40L en un modelo de tumor MC-38.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). El ARNm modificado con OX40L se formuló en MC3 LNP como se ha descrito anteriormente. También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación; OX40L NST; SEQ ID NO: 68).

B. Modelo de ratón de adenocarcinoma de colon MC-38

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3, los animales fueron tratados con una única dosis intratumoral de mOX40L_miR122 (Cap1, ARNm de G5 RP en 1,5 % en moles de DMG MC3 LNP) a una dosis de 12,5 |jg de ARNm. Los animales de control se trataron con una dosis equivalente de ARNm de control negativo, OX40L_NST. Los animales de control adicionales se dejaron sin tratar ("NT"). Para los experimentos de dosis-respuesta, a los animales se les administró una inyección intratumoral de 3,125, 6,25 o 12,5 jg de mOX40L_miR122; los animales de control se dejaron sin tratar o se trataron con 12,5 jg de ARNm de control negativo.

C. Medición de OX40L en tejido tumoral

Para medir la expresión de OX40L a lo largo del tiempo, los animales se sacrificaron 3, 6, 24, 48, 72 y 168 horas después de la dosificación. Se recogió tejido tumoral y se analizó para determinar la expresión de OX40L usando ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 7 A} como la cantidad de OX40L presente por gramo de tejido tumoral.

Para medir la expresión de OX40L en función de la dosis-respuesta, los animales se sacrificaron 24 horas después de la dosificación y se recogió el tejido tumoral para su análisis como se ha descrito anteriormente. Se analizó tejido tumoral, tejido hepático y tejido esplénico para determinar la cantidad de proteína OX40L ( ^{f i g u r a 7 B - 7 D} , superior) y ARNm ( ^{f i g u r a 7 B - 7 D} , inferior).

Las células tumorales también se analizaron para determinar la expresión de OX40L en la superficie celular mediante citometría de flujo (datos no mostrados). El tejido tumoral se picó y se procesó a través de filtros de células para preparar suspensiones de células individuales. Las suspensiones celulares se tiñeron con anticuerpo anti-OX40L de ratón conjugado con PE (R&D Systems, Minneapolis, MN) y se visualizaron por citometría de flujo.

D. Resultados

^{L a f i g u r a 7 A} muestra que una única dosis intratumoral de 12,5 jg de mOX40L_miR122 resultó en hasta 1200 ng de OX40L/g de tejido tumoral a las 24 horas después de la dosificación. Las densidades ópticas de dos de las muestras tratadas con OX40L durante 24 horas estuvieron por encima del intervalo estándar, lo que resultó en valores subestimados que se muestran en la ^{f i g u r a 7 A} . ^{L a f i g u r a 7 A} también muestra que la expresión de OX40L era detectable en tejido tumoral hasta 168 horas (7 días) después de la dosificación. Por el contrario, los animales tratados con el control no mostraron OX40L detectable en el tejido tumoral en ningún momento. La ^{f i g u r a 7 B} muestra un aumento dependiente de la dosis en la proteína OX40L (superior) y el ARNm (inferior) en el tejido tumoral. La ^{f i g u r a 7 C} y ^{7 D} muestran que la presencia de proteína OX40L y ARNm en hígado y bazo (respectivamente) son menores que las cantidades presentes en el tejido tumoral.

Los resultados de la citometría de flujo mostraron que aproximadamente el 6,5 % de todas las células vivas asociadas a tumores eran positivas para la expresión de OX40L (datos no mostrados).

Ejemplo 7. Eficacia in vivo de ARNm modificado con OX40L en un modelo de adenocarcinoma de colon

Se evaluó la eficacia in vivo de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miRl22; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación; OX40L_miR122 NT; SEQ ID NO: 68). Ambos ARNm modificados se formularon en MC3 LNP como se ha descrito anteriormente.

B. Modelo de ratón de adenocarcinoma de colon MC-38

Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6 como se ha descrito anteriormente.

Catorce días después de la inoculación de células tumorales, los animales se trataron dos veces por semana durante tres semanas con una dosis intratumoral de ARNm modificado formulado con MC3 LNP (15 |jg de ARNm por dosis). Los animales de control se trataron con una dosis y un régimen equivalentes de ARNm de control negativo, OX40L_miR122 NT (SEQ ID NO: 68).

El volumen del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados utilizando calibradores manuales. El volumen del tumor se registró en milímetros cúbicos.

El estudio de eficacia in vivo se llevó a cabo hasta el día 42 después de la dosificación. Al finalizar el estudio, los conjuntos completos de datos se analizaron y se presentaron en la ^{f i g u r a 8 A} y 8 ^{B .} Se prepararon las curvas de supervivencia finales de Kaplan-Meier y se muestran en la ^{f i g u r a 8 C .} Los criterios de valoración en el estudio fueron la muerte del animal o un volumen tumoral que alcanzaba los 1500 mm3.

C. Resultados

^{L a f i g u r a 8 A} muestra que la administración de un ARNm modificado de control tuvo poco efecto sobre el volumen del tumor, según se evaluó al finalizar el estudio (día 42 después de la primera dosis). La ^{f i g u r a 8 B} muestra que administrar mOX40L_miR122 a los ratones inhibió o ralentizó el crecimiento del tumor en algunos animales y redujo o disminuyó el tamaño del tumor en algunos animales, según se evaluó al finalizar el estudio (día 42).

^{L a f i g u r a 8 C} muestra que los animales que reciben mOX40L_miR122 tuvieron tiempos de supervivencia más largos medidos el día 42 en comparación con los animales de control.

Estos datos muestran que los polinucleótidos mOX40L_miR122 tienen eficacia antitumoral cuando se administran in vivo.

^{E j e m p l o 8 . E x p r e s i ó n} in vivo ^{d e O X 4 0 L e n t u m o r e s A 2 0}

Los modelos de ratón de linfoma de células B que utilizan la línea celular A20 son útiles para analizar un microambiente tumoral. (Kim y col., Journal of Immunology 122(2):549-554 (1979); Donnou y col., Advances in Hematology (Avances en hematología) 2012:701704 (2012)). Por lo tanto, la expresión in vivo de OX40L y el microambiente tumoral se evaluaron en un modelo de tumor de linfoma de células B A20.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). El ARNm modificado con OX40L se formuló en MC3 LNP como se ha descrito anteriormente. También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación; OX40L NT; SEQ ID NO: 68).

B. Modelo de tumor de linfoma de células B A20

Los tumores de linfoma de células B se establecieron por vía subcutánea en ratones BALB/c. Se cultivaron células de linfoma de células B de ratón (A20, ATCC n.° TIB-208; ATCC, Manassas, VA) según las instrucciones del proveedor. Las células se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB/c para generar tumores subcutáneos. Se controló el tamaño y la palpabilidad del tumor.

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 1300 mm3 los animales se separaron en dos grupos. El grupo I fue tratado con una única dosis intratumoral de mOX40L_miR122 (Cap1, ARNm de G5 RP en 0,5 % en moles de DMG MC3 LNP) a una dosis de 15 jg de ARNm. El grupo II (controles) se trató con una dosis equivalente de ARNm de control negativo, OX40L NT.

C. Medición de OX40L en tejido tumoral

El tejido tumoral se recogió 24 horas después de la dosificación y se analizó para determinar la expresión de OX40L mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 9 A} como la cantidad de OX40L presente por gramo de tejido tumoral.

Las células tumorales A20 también se analizaron para determinar la expresión de OX40L en la superficie celular. El tejido tumoral se picó y se procesó a través de filtros de células para preparar suspensiones de células individuales. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-OX40L de ratón (policlonal IgG de cabra, conjugado con PE; R&D Systems, Minneapolis, MN) y anticuerpo anti-CD45 de ratón (clon 30-F11, conjugado con PE-Cy5; eBioscience, San Diego, CA) para identificar leucocitos (es decir, células cancerosas A20 y células inmunitarias infiltrantes). Las células se analizaron posteriormente por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 9 B} y ^{9 C .}

D. Resultados

^{L a f i g u r a 9 A} muestra que una única dosis intratumoral de 15 |jg de mOX40L_miR122 resultó en hasta 250 ng de OX40L/g de tejido tumoral a las 24 horas después de la dosificación. Por el contrario, los animales tratados con el control mostraron menos de 100 ng de OX40L en el tejido tumoral 24 horas después de la dosificación.

^{L a f i g u r a 9 B} muestra que aproximadamente el 3 % de todas las células CD45+ vivas (es decir, células tumorales) expresaron OX40L en la superficie celular. En un experimento similar, se encontró que aproximadamente el 15,8 % del total de células vivas del tumor expresaban OX40L introducido, en comparación con menos del 0,5 % de células vivas positivas para OX40L en tumores tratados con el ARNm de control negativo ( ^{f i g u r a 9 C} ).

^{E j e m p l o 9 . E f e c t o s f a r m a c o d i n á m i c o s} in vivo ^{d e O X 4 0 L}

Se evaluó la capacidad de expresión de OX40L mediada por mOX40L_miR122 para reclutar células citolíticas naturales (NK) en el sitio del tumor.

A. Modelo de tumor de linfoma de células B A20

En los tumores de linfoma de células B descritos anteriormente en el ejemplo 8 también se evaluó la infiltración de células NK después del tratamiento. Como se ha descrito anteriormente, los ratones fueron tratados con una única dosis intratumoral de ARNm de mOX40L_miR122 o control NT OX40L (dosis de 15 jg ; Capí, ARNm de G5 RP en 0,5 % en moles de DMG MC3 LNP). 24 horas después de la dosificación, los tumores se recogieron como se ha descrito anteriormente y se procesaron a través de filtros de células para preparar suspensiones de células individuales.

B. Infiltración de células citolíticas naturales

Las suspensiones de células individuales se incubaron con el anticuerpo anti-NKp46 de ratón (clon 29A1.4, conjugado con PerCP-eFluor® 710; eBioscience, San Diego, CA), que es específico para el marcador de células NK p46 (CD335) y anticuerpo anti-CD3 de ratón (clon 145-2C11, conjugado con FlTC; BioLegend, San Diego, CA), que es específico de las células T. Las células se analizaron en base a la expresión de CD45+ de leucocitos, así como la expresión de NKp46 y CD3e mediante citometría de flujo. Las células NK son p46+ y CD3-. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 1 0 A} y ^{1 0 B .}

C. Resultados

^{L a f i g u r a 1 0 A} muestra que los animales tratados con mOX40L_miR122 mostraron un aumento de aproximadamente 5 veces en el número relativo de células NK dentro de los tumores A2024 horas después de la dosificación. La ^{f i g u r a 1 0 B} muestra los datos de animales individuales del mismo estudio.

Estos resultados muestran que el tratamiento con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumentó el número de células NK dentro del microambiente tumoral.

^{E j e m p l o 1 0 . E f i c a c i a i n} vivo ^{d e l A R N m m o d i f i c a d o c o n O X 4 0 L e n u n m o d e l o d e l i n f o m a d e c é l u l a s B}

Se evaluó la eficacia in vivo de mOX40L_miR122 en un modelo de linfoma de células B.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del ARNm del Factor IX que contiene múltiples codones de terminación; NST-FIX, SEQ ID NO: 67). Ambos ARNm modificados se formularon de la misma manera (Cap1, ARNm de G5 RP en 1,5 % en moles de DMG MC3 LNP).

B. Modelo de tumor de linfoma de células B A20

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3 los animales se separaron en dos grupos. El grupo I fue tratado con dosis intratumorales repetidas de mOX40L_miR122 (Cap1, ARNm de G5 RP en 1,5 % en moles de DMG MC3 LNP) a una dosis de 12,5 ^g de ARNm. El grupo II (control) se trató con una dosis equivalente de ARNm de control negativo, NST-FIX. Los animales recibieron dosis los días 20, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 44, 48 y 51. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 1 1 A , 1 1 B , 1 1 C} y ^{1 1 D .}

El estudio se llevó a cabo hasta el día 57. Se prepararon las curvas de supervivencia finales de Kaplan-Meier y se muestran en la ^{f i g u r a 1 1 D .} Los criterios de valoración en el estudio fueron la muerte del animal o un volumen tumoral que alcanzaba los 2000 mm3.

C. Resultados

^{L a f i g u r a 1 1 A} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con ARNm de NST-FIX de control. La ^{f i g u r a 1 1 B} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con mOX40L_miR122. Las flechas representan los días de dosificación. Múltiples dosis de un ARNm modificado de control tuvieron poco efecto sobre el volumen del tumor. Por el contrario, múltiples dosis de mOX40L_miR122 redujo o disminuyó el tamaño de los tumores en algunos animales o inhibió el crecimiento de los tumores en algunos animales.

^{L a f i g u r a 1 1 C} muestra el tamaño promedio del tumor para cada grupo evaluado en el día 35 del estudio. Estos datos muestran que administrar mOX40L_miR122 redujo o inhibió el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con ARNm de control. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) en el día 34 en comparación con el día 19:

Usando la fórmula anterior y los datos que se muestran en la ^{f i g u r a 1 1 C ,} el % de TGI para mOX40L_miR122 era del 57 %. En otras palabras, los animales tratados con mOX40L_miR122 mostraron una inhibición del crecimiento tumoral del 57 % entre los días 19 y 34 en comparación con los animales tratados con el control.

^{L a f i g u r a 1 1 D} muestra que los animales que reciben mOX40L_miR122 tuvieron tiempos de supervivencia más largos medidos el día 42 en comparación con los animales de control.

^{E j e m p l o 1 1 . R e s p u e s t a i n m u n i t a r i a d e m e m o r i a} in vivo

Se evaluó la capacidad de mOX40L_miR122 para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa (memoria) en el modelo de adenocarcinoma MC-38.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm de OX40L que contiene múltiples codones de terminación; NST-OX40L; ^sE^qID NO: 68). Ambos ARNm modificados se formularon de la misma manera (Cap1, ARNm de G5 RP en 1,5 % en moles de DMG MC3 LNP).

B. Modelo de adenocarcinoma de colon MC-38

Siete días después de la inoculación de células tumorales, los animales se trataron cada tres días (Q3D) con un máximo de 10 dosis intratumorales de ARNm modificado formulado con MC3 LNP (12,5 ^g de ARNm por dosis). Los animales de control se trataron con una dosis y un régimen equivalentes de ARNm de control negativo, OX40L_miR122 NT.

El volumen del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados utilizando calibradores manuales. El volumen del tumor se registró en milímetros cúbicos. En el día 60 después de la inoculación del tumor, seis animales con aparente respuesta completa (RC) del grupo mOX40L_miR122 se volvieron a exponer a 5 * 105 células tumorales MC-38; como control, también se inocularon seis animales sin tratamiento previo con 5 * 105 células MC-38. Los resultados del análisis se muestran en la ^{f i g u r a 1 2 A} y ^{1 3 B .}

C. Resultados

^{L a f i g u r a 1 2 A} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con ARNm de NST-OX40L de control, mOX40L_miR122, o PBS. La ^{f i g u r a 1 2 A} muestra que a 6 de 15 animales a los que se les administró mOX40L_miR122 (40 %) mostraron una respuesta completa sin un crecimiento tumoral significativo medido el día 60. En comparación, los animales a los que se les administró la construcción de ARNm de control negativo o PBS mostraron un crecimiento tumoral significativo hasta el día 60. ( ^{f i g u r a} 12A). Estos resultados muestran que la administración de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor.

En el día 60, seis respondedores completos ("RC") del grupo mOX40L_miR122 y seis animales de control sin tratamiento previo se volvieron a exponer con células MC-38. La ^{f i g u r a 1 2 B} muestra el crecimiento tumoral individual en animales expuestos de nuevo con células MC-38. Los animales a los que se les administró previamente mOX40L_miR122 no mostraron crecimiento tumoral (0/6 animales) durante 23 días después de la reexposición con células tumorales. En comparación, el 67 % (6/9 animales) de los animales en el grupo de control sin tratamiento previo mostró crecimiento tumoral en el día 23. Estos resultados muestran que la administración de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L induce una respuesta inmunitaria de memoria con efectos antitumorales.

^{E j e m p l o 1 2 . E x p r e s i ó n s o s t e n i d a} in vivo ^{d e O X 4 0 L e n t u m o r e s A 2 0}

Se evaluó la expresión in vivo de OX40L en el microambiente tumoral en un modelo de tumor de linfoma de células B A20 en varios momentos después de una y/o dos dosis de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miRl22; SEQ ID NO: 66). El ARNm modificado con OX40L se formuló en MC3 LNP como se ha descrito anteriormente. También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación; NST-OX40L; SEQ ID NO: 68).

B. Modelo de tumor de linfoma de células B A20

Los tumores de linfoma de células B se establecieron como se ha descrito anteriormente. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 1300 mm3 los animales se separaron en tres grupos. El grupo I fue tratado con una única dosis intratumoral de mOX40L_miR122 (Capí, ARNm de G5 RP en 0,5 % en moles de DMG MC3 LNP) a una dosis de 15 |jg de ARNm. El grupo II (control) se trató con una dosis equivalente de ARNm de control negativo, OX40L NT. El grupo III se trató con una inyección intratumoral de PBS. Cada grupo también comprendía un subgrupo de animales que recibieron una segunda dosis de ARNm o PBS 7 días después de la primera dosis.

C. Medición de la expresión de OX40L

Se analizaron células vivas de células tumorales A20 para determinar la expresión de OX40L en la superficie celular. El tejido tumoral se picó y se procesó a través de filtros de células para preparar suspensiones de células individuales. Las células vivas se tiñeron con anticuerpo anti-OX40L de ratón (policlonal IgG de cabra, conjugado con PE; R&D Systems, Minneapolis, MN). Las células se analizaron posteriormente por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 1 3 .}

D. Resultados

^{L a f i g u r a 1 3} muestra una expresión de OX40L estadísticamente significativa a las 24 horas, 72 horas y 7 días después de una dosis única de mOX40L_miR122. En particular, la ^{f i g u r a 1 3} muestra que la expresión de OX40L en tumores A20 se mantiene a las 72 horas y 7 días después de una dosis única de mOX40L_miR22. En animales que recibieron una segunda dosis, se detectó una expresión de OX40L estadísticamente significativa 24 horas después de la segunda dosis de mOX40L miR122.

Estos datos muestran que la administración de mOX40L_miR122 da como resultado niveles significativos y sostenidos de expresión del polipéptido OX40L en el tejido tumoral.

Ejemplo 13. Identidad de los tipos de células que expresan OX40L después del tratamiento con ARNm

Se evaluó la identidad de los tipos de células que expresan OX40L después del tratamiento con ARNm en los tumores A20 y MC38. Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente. Se establecieron modelos de ratón de tumores A20 y tumores MC38 como se ha descrito anteriormente.

A. Diferenciación celular por citometría de flujo

Las células dentro de los tumores A20 se diferenciaron mediante los anticuerpos CD19 y CD45, que identifican las células cancerosas A20 del linfoma B que expresan CD19 (CD19+, CD45+) de los infiltrados inmunitarios no cancerosos (CD19-, CD45+) y las células no cancerosas/no inmunitarias (CD19-, CD45-), respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 14A. Las células dentro de los tumores MC38 se diferenciaron mediante el marcador CD45 para diferenciar las células inmunitarias infiltrantes del huésped (CD45+) de células cancerosas y células huésped no inmunitarias (CD45-). Los resultados se muestran en la figura 14B. Las células del infiltrado inmunitario se diferenciaron con el anticuerpo CD11b. Las células del infiltrado inmunitario CD11b+ se analizaron por separado para determinar la expresión de OX40L. Los resultados se muestran en la figura 14C.

B. Resultados

La figura 14A muestra que en tumores A20 tratados con mOX40L_miR122, el 76 % de la población de células que expresan OX40L eran las propias células tumorales A20, mientras que aproximadamente el 19 % de la población de células positivas para OX40L eran células inmunitarias de infiltración dentro de los tumores A20. Se demostró que la población de células inmunitarias del huésped que expresan OX40L eran predominantemente células de linaje mieloide, según lo determinado por tinción positiva para CD11b. De las células de linaje mieloide CD11b+ en los tumores A20, un promedio del 25,4 % fueron positivas para la expresión de OX40L (figura 14C).

La figura 14B muestra que en los tumores MC38, la mayoría de las células positivas para OX40L eran células cancerosas (un promedio del 57,3 %), mientras que el 35,6 % de las células positivas eran infiltrados inmunitarios, nuevamente derivados principalmente del linaje mieloide (CD45+, CD11b+).

Estos datos muestran que la administración de mOX40L_miR122 da como resultado la expresión de OX40L en un porcentaje significativo del ambiente del tumor después de la administración de ARNm intratumoral, y que la mayoría de las células que expresan OX40L eran células cancerosas seguidas de infiltrados de células inmunitarias mieloides.

Ejemplo 14. Modulación de poblaciones de células inmunitarias en tumores tratados con ARNm de OX40L

Dada la actividad demostrada de OX40L en las células citolíticas naturales (NK) inmunitarias innatas y las células T CD4+/CD8+, el objetivo de los siguientes estudios fue evaluar los efectos farmacodinámicos del tratamiento intratumoral con OX40L en las poblaciones de células inmunitarias asociadas a tumores. Los modelos tumorales de ratón A20 y MC38 se establecieron como se ha descrito anteriormente.

A. Diferenciación celular por citometría de flujo

Los tumores A20 se trataron con una dosis única de 12,5 |jg de mOX40L_miR122 o ARNm de control (RNA/LNP) formulado en nanopartículas lipídicas. Las muestras de tumor se analizaron inicialmente 24 horas después del tratamiento. Las células NK se diferenciaron usando un anticuerpo contra el marcador de superficie de células NK maduras, DX5. Los resultados se muestran en la figura 15A. Se analizaron otras muestras de tumores 14 días después del tratamiento con mOX40L_miR122. Las células T CD4+ y CD8+ se identificaron utilizando anticuerpos anti-CD4 de ratón y anti-CD8 de ratón, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 15B-15C.

Se realizó un experimento similar en el modelo de tumor MC38. A los ratones con tumores MC38 se les administró una única inyección intratumoral de mOX40L_miR122 o NST-OX40L. En algunos animales se administró una segunda dosis de ARNm 6 días después de la primera dosis. Se evaluó el infiltrado de células inmunitarias para células CD8+ 24 horas y 72 horas después de cada dosis de ARNm. Los resultados se muestran en la figura 15D.

B. Resultados

La figura 15A muestra que 24 horas después de la administración de mOX40L_miR122 a los tumores A20, la infiltración de células NK aumentó significativamente en los animales que recibieron dosis de OX40L en comparación con los controles. Las figuras 15B-15C muestran que 14 días después de la administración de mOX40L_miR122 a tumores A20, la infiltración de ambas células T CD4+ (figura 15B) y CD8+ (figura 15C) en el microambiente tumoral aumentó significativamente en comparación con las muestras tumorales de control.

^{L a f i g u r a 1 5 D} muestra un aumento significativo en la infiltración de células T CD8+ 72 horas después de una segunda dosis de mOX40L_miR122 en tumores MC38 en comparación con tumores tratados con control.

Estos datos de dos modelos tumorales demuestran que la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L promueve un mayor número de células inmunitarias tanto innatas como adaptativas dentro del microambiente tumoral.

^{E j e m p l o 1 5 . E f i c a c i a / n} vivo ^{e n t u m o r e s A 2 0}

^{S e e v a l u ó l a e f i c a c i a} in vivo en el modelo tumoral A20. Los tumores A20 se establecieron como se ha descrito anteriormente.

A. Tratamiento de tumores

Los ratones se trataron con 12,5 |jg por dosis mOX40L_miR122 en LNP, 12,5 |jg por dosis de ARNm de control negativo diseñado para no traducirse en proteína en LNP (NST-OX40L), un control negativo de PBS, o se dejaron sin tratar. Se dosificaron ARNm/LNP y controles negativos en un volumen de 25 j l directamente en las lesiones tumorales A20 con una frecuencia de una vez cada 7 días hasta un máximo de 6 dosis. Los volúmenes tumorales de animales individuales se muestran en la ^{f i g u r a 1 6 A} (medido en mm3). En la ^{f i g u r a 1 6 B} se muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los mismos animales. Los ejes x de ambos gráficos son días posteriores a la inducción de la enfermedad, es decir, implantación de células cancerosas subcutáneas.

B. Resultados

^{L a f i g u r a 1 6 A} muestra que un mayor número de animales tratados con mOX40L_miR122 mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los animales de control. Todos los animales de control (30/30) fueron sacrificados el día 60 después de la inducción de la enfermedad (principalmente debido a que alcanzaron el punto final predeterminado de carga tumoral > 2000 mm3). Por el contrario, 4/9 animales o el 44 % de los ratones tratados con mOX40L_miR122 aún no habían alcanzado el punto final de la carga tumoral en el día 98.

^{L a f i g u r a 1 6 B} muestra el beneficio de supervivencia del tratamiento con mOX40L_miR122, en el que 2 ratones en el brazo mOX40L_miR122 (como se indica con asterisco * en la ^{f i g u r a 1 6 A} ) y 1 del grupo PBS se eliminaron del estudio debido a la ulceración del tumor y no se incluyeron en la estimación de supervivencia. Con este criterio, 2/8 o el 25 % de los animales tratados con ARNm de OX40L aparentemente respondieron completamente el día 98 después de la implantación en comparación con 0/29 de los animales de control.

Estos datos muestran la eficacia in vivo de administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (mOX40L_miR122) en el modelo tumoral A20.

E j e m p l o 1 6 . m i R - 1 2 2 m o d u l a l a e x p r e s i ó n d e O X 4 0 L

Se evaluaron los efectos de incorporar un sitio de unión de miR-122 en el polinucleótido.

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (OX40L de ratón, mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66; OX40L humano, hOX40L_miR122, SEQ ID NO: 65). También se prepararon polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica el polipéptido OX40L de ratón o el polipéptido OX40L humano, cada uno sin un sitio de unión de miR-122, para comparar los efectos de la presencia del sitio de unión de miR-122.

B. Transfecciones celulares

Se transfectaron hepatocitos humanos primarios, células de cáncer de hígado humano (Hep3B) y células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) con un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica el polipéptido OX40L humano (hOX40L) o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica el polipéptido OX40L humano y que comprende además un sitio de unión de miR-122 (hOX40L_miR122). Se analizó la expresión de OX40L en las células 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la transfección. Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 1 7 A .} El mismo experimento también se realizó con ratón OX40L, como se muestra en la ^{f i g u r a 1 7 B .}

C. Resultados

^{L a f i g u r a 1 7 A} muestra que la incorporación de un sitio de unión de miR-122 en el polinucleótido redujo notablemente la expresión de OX40L humano en hepatocitos primarios en puntos de tiempo posteriores. Específicamente, a las 24 horas posteriores a la transfección, la expresión de OX40L se redujo en un 88 % de 6706 ng/pocillo en células tratadas con hOX40L (sin sitio de unión de miR-122) a 814 ng/pocillo en células tratadas con hOX40L_miR122 (que comprende un sitio de unión de miR-122). A las 48 horas posteriores a la transfección, la expresión de OX40L se redujo en un 94 % de 11.115 ng/pocillo a 698 ng/pocillol en células tratadas con un polinucleótido que comprende un sitio de unión de miR-122.

^{L a f i g u r a 1 7 B} muestra resultados similares para OX40L de ratón. La incorporación de un sitio de unión de miR-122 en el polinucleótido redujo la expresión de OX40L de ratón en hepatocitos primarios en un 85 % a las 24 horas (de 1237 ng/pocillo a 182 ng/pocillo) y en un 91 % a las 48 horas (de 1704 ng/pocillo a 161 ng/pocillo).

Estos datos muestran que la incorporación de un sitio de unión de microARN (miR-122) en un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L reduce la expresión del polipéptido OX40L en los hepatocitos primarios en comparación con un polinucleótido que carece de un sitio de unión de miR-122.

^{E j e m p l o 1 7 . A c t i v i d a d / n} vivo ^{d e u n p o l i n u c l e ó t i d o q u e c o d i f i c a O X 4 0 L d e s p u é s d e l a a d m i n i s t r a c i ó n}i n t r a v e n o s a

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de terminación: NST_OX40L_122).

B. Modelo de tumor de leucemia mieloide aguda (LMA)

Los tumores de leucemia mieloide aguda (LMA) se establecieron por vía subcutánea en ratones. Se cultivaron células LMA de ratón (células P388D1, ATCC n.° CCL-46, ATCC, Manassas, VA) según las instrucciones del proveedor. Las células se inocularon por vía subcutánea en ratones DBA/2 para generar tumores subcutáneos. Se controló el tamaño y la palpabilidad de los tumores.

Una vez que se establecieron los tumores, los animales se separaron en cinco grupos. La dosificación para los grupos de dosificación intratumoral fue cada 7 días (Q7D), comenzando 7 días después de la implantación del tumor. El grupo I se trató con dosis intratumorales de mOX40L_miR122 a una dosis de 12,5 |jg de ARNm (dosis fija). El grupo II se trató con dosis intratumorales de ARNm de NST_OX40L_122 de control en el mismo régimen de dosificación. La dosificación para los grupos de dosificación intravenosa fue cada 7 días, comenzando 4 días después de la implantación del tumor. El grupo III se trató con dosis intravenosas de mOX40L_miR122 a una dosis de 0,5 mg de ARNm por kg de peso corporal. El grupo IV se trató con dosis intravenosas de ARNm de control con el mismo régimen de dosificación. El grupo V se trató con dosis intravenosas de PBS.

C. Resultados

Los resultados se muestran en la ^{f i g u r a 1 8 A - 1 8 E} y la ^{f i g u r a 1 9 .} La ^{f i g u r a 1 8 A} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm NST_OX40L_122 de control. La ^{f i g u r a 1 8 B} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR122. La ^{f i g u r a 1 8 C} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con ARNm de control intravenoso. La ^{f i g u r a 1 8 D} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intravenosas de ARNm de mOX40L_miR122. La ^{f i g u r a 1 8 E} muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intravenosas de PBS (control negativo).

Estos resultados muestran que tanto la administración intratumoral como la intravenosa de un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L que comprende un sitio de unión de miARN reduce o inhibe el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con ARNm de control o PBS.

^{L a f i g u r a 1 9} muestra las curvas de supervivencia de los animales tratados con dosis intravenosas de mOX40L_miR122 en comparación con animales tratados por vía intravenosa con ARNm de control o PBS. Estos resultados muestran que la dosificación intravenosa de mOX40L_miR122 aumenta la supervivencia en un modelo de tumor de ratón en comparación con la supervivencia de ratones tratados con un ARNm de control.

^{E j e m p l o 1 8 . E f i c a c i a / n} vivo ^{d e l a c o m b i n a c i ó n d e u n A R N m q u e c o d i f i c a u n p o l i p é p t i d o O X 4 0 L y u n a n t i c u e r p o}a n t i - P D - 1

A. Preparación de ARNm modificado con OX40L y anticuerpo anti-PD-1

Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión de miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (NST_OX40L_122).

Las soluciones de dosificación de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 (BioXcell BE0146, anti-mPD-1, clon RMP1-14, n.° de lote 5792-599016J1) se prepararon diluyendo una alícuota del patrón (6,37 mg/ml) a 0,5 mg/ml en PBS estéril. La solución de dosificación de 0,5 mg/ml proporcionó la dosis de 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. La solución de dosificación de anti-PD-1 se preparó diariamente y se almacenó protegida de la luz a 4 °C.

Las soluciones de dosificación de IgG2a de rata (BioXcell BE0089, IgG2a de rata, clon 2A3, n.° de lote 601416M1) se prepararon diluyendo una alícuota del patrón (7,38 mg/ml) a 0,5 mg/ml en PBS estéril. La solución de dosificación de 0,5 mg/ml proporcionó la dosis de 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. La solución de dosificación de anti-PD-1 se preparó diariamente y se almacenó protegida de la luz a 4 °C.

B. Modelo de adenocarcinoma de colon MC38

Una vez que se establecieron los tumores, los animales se dividieron en grupos y recibieron dosis intratumorales de una de las siguientes terapias combinadas que se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 10: Dosificación e intervalo combinados

Los ratones recibieron dosis intratumorales de ARNm cada 7 días (Q7D). Los ratones recibieron dosis intratumorales de anticuerpo cada dos semanas (BIWx2).

C. Resultados

Los resultados se muestran en la figura 20A-20E y la figura 21. La figura 20A muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de NST_OX40L_122 de control combinado con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Había 0/15 respondedores completos (RC) en el grupo de control. La figura 20B muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR122 combinado con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Para el día 90 después de la implantación, la RC fue de 0/15 para este grupo. La figura 20C muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con ARNm de control intratumoral combinado con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD-1. Para el día 90 después de la implantación, la RC fue de 2/15 para este grupo. La figura 20D muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR122 combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD-1. Para el día 90 después de la implantación, la RC fue de 6/15 para el grupo de combinación dual. La figura 20E muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de PBS combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD-1. Para el día 90 después de la implantación, la RC fue de 0/15 para este grupo. La figura 20F muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de PBS combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Para el día 90 después de la implantación, la RC para este grupo de tratamiento fue 0/14.

Estos resultados muestran que la terapia de combinación que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un inhibidor del punto de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-PD-1, es eficaz in vivo para inhibir o reducir el crecimiento tumoral en el modelo tumoral de ratón MC38. La combinación de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de nanopartículas lipídicas de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L para su uso en un procedimiento para reducir o disminuir el tamaño de un tumor, inhibir el crecimiento del tumor, o en un procedimiento para tratar el cáncer,

donde el ARNm comprende uno o más sitio(s) de unión de microARN (miARN) en una 3'UTR, donde el sitio de unión de microARN es un sitio de unión de miR-122.

2. La formulación de ARNm para uso según la reivindicación 1, donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122-3p o miR-122-5p.

3. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % a la SEQ ID NO: 24, y el sitio de unión de miARN se une a miR-122.

4. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % a la SEQ ID NO: 26, y el sitio de unión de miARN se une a miR-122.

5. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la inserción del sitio de unión de miARN en el ARNm no interfiere con la traducción del polipéptido OX40L funcional en ausencia del miARN correspondiente (por ejemplo, miR122); y en presencia del miARN (por ejemplo, miR122), la inserción del sitio de unión de miARN en el ARNm y la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del ARNm.

6. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la UTR 3' es una UTR 3' sintética o una UTR 3' natural.

7. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1-3, donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a un receptor OX40,

opcionalmente donde la secuencia de aminoácidos tiene una o más sustituciones conservadoras, donde las sustituciones conservadoras no afectan la unión del polipéptido OX40L a un receptor OX40.

8. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el ARNm comprende una secuencia idéntica en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre las SEQ ID NO: 4-21.

9. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el ARNm comprende una secuencia idéntica en al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % a la secuencia establecida como SEQ ID NO: 65, donde la proteína codificada por el ARNm es capaz de unirse al receptor OX40 de tipo silvestre.

10. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el ARNm está modificado químicamente.

11. La formulación de ARNm para uso según la reivindicación 10, donde el ARNm modificado tiene una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, opcionalmente donde el ARNm está completamente modificado para una modificación particular, opcionalmente donde todas las uridinas son reemplazadas por un análogo de uridina, opcionalmente donde el ARNm modificado está completamente modificado con N1-metilpseudouridina (m1^) y/o 5-metilcitosina.

12. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el ARNm se formula para administración intratumoral y opcionalmente se administra por vía intratumoral.

13. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el procedimiento comprende además administrar un antagonista de PD-1, un antagonista de PD-L1 y/o un antagonista de CTLA-4, opcionalmente donde

I) el antagonista de PD-1 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, opcionalmente el antagonista de PD-1 es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el antagonista de PD-1 se selecciona de entre el grupo que consiste en Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, y cualquier combinación de los mismos,

II) el antagonista de PD-L1 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, opcionalmente un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el antagonista de PD-L1 se selecciona de entre el grupo que consiste en Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, y cualquier combinación de los mismos, y/o

III) el antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, opcionalmente el antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el antagonista de CTLA-4 se selecciona de entre el grupo que consiste en Ipilimumab, Tremelimumab, y cualquier combinación de los mismos.

14. La formulación de ARNm para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde en el procedimiento se activan células T, opcionalmente donde las células T activadas reducen o disminuyen el tamaño del tumor o inhiben el crecimiento del tumor.