ES2932516T3 - Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos - Google Patents

Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2932516T3
ES2932516T3 ES17727999T ES17727999T ES2932516T3 ES 2932516 T3 ES2932516 T3 ES 2932516T3 ES 17727999 T ES17727999 T ES 17727999T ES 17727999 T ES17727999 T ES 17727999T ES 2932516 T3 ES2932516 T3 ES 2932516T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
mrna
polynucleotide
encoding
combination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17727999T
Other languages
English (en)
Inventor
Joshua Frederick
Susannah Hewitt
Ailin Bai
Stephen Hoge
Vladimir Presnyak
Lain Mcfadyen
Kerry Benenato
Ellalahewage Kumarasinghe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ModernaTx Inc
Original Assignee
ModernaTx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ModernaTx Inc filed Critical ModernaTx Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2932516T3 publication Critical patent/ES2932516T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2006—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5446—IL-16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)

Abstract

La descripción se refiere a composiciones y métodos para la preparación, fabricación y uso terapéutico de combinaciones de polinucleótidos inmunomoduladores (p. ej., ARNm) que codifican un polipéptido cebador de respuesta inmunitaria (p. ej., un polipéptido de interleucina 23 (IL-23) o un polipéptido de interleucina 36γ (IL- 36-gamma)) y un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmunitaria (p. ej., un polipéptido OX40L). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/338.496 presentada el 18 de mayo de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/338,506 presentada el 18 de mayo de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/338,467 presentada el 18 de mayo de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/338,483 presentada el 18 de mayo de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/404.173 presentada el 4 de octubre de 2016; Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/404,175 presentada el 4 de octubre de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/415,424 presentada el 31 de octubre de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/438.945 presentada el 23 de diciembre de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/438,942 presentada el 23 de diciembre de 2016; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/443,693 presentada el 7 de enero de 2017; la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/472,513 presentada el 16 de marzo de 2017 y la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. de Serie. 62/480,400 presentada el 1 de abril de 2017.
Antecedentes
El cáncer es una enfermedad caracterizada por la división y el crecimiento celular descontrolados dentro del cuerpo. En los Estados Unidos, aproximadamente un tercio de todas las mujeres y la mitad de todos los hombres experimentarán cáncer en algún momento de su vida. Con la gran cantidad de consecuencias no deseadas provocadas por los tratamientos estándar tales como la quimioterapia y la radioterapia que se utilizan hoy en día, la terapia genética para la manipulación de péptidos relacionados con enfermedades y sus funciones proporciona una estrategia más dirigida para el diagnóstico, tratamiento y gestión de las enfermedades.
Wang, T., et al., Journal of Dermatological Science, 36 (2004), analizan un efecto antitumoral sinérgico mediante la terapia combinatoria de pistola génica usando ADNc de IL-23 e IL-18. Hara, I., et al., Cancer Gene Therapy, 7(1) (2000), se refiere a la terapia de vacunas contra el cáncer utilizando células transducidas con el gen de la interleuquina-12 combinado con la administración sistémica de interleuquina-18. Ngiow, S., et al., Trends in Immunology, 34(11) (2013), explora la actividad de IL-23 en la carcinogénesis y analiza el uso de anticuerpos monoclonales anti-IL-12p/23 en el contexto de los efectos inhibidores de tumores de IL-12 y efectos promotores de tumores de IL-23. Overwijk, W., et al., Journal of Immunology, 176(9) (2006), se refiere a los efectos inmunológicos y antitumorales de IL-23 como adyuvante de vacunas contra el cáncer. Wang, X., et al., Cancer Cell, 28 (2015), se refiere a la transformación por IL-36y del microentorno tumoral y la promoción de respuestas inmunes antitumorales mediadas por linfocitos de tipo 1. Melero, I., et al., Nature Reviews Cancer, 15 (2015), revisa combinaciones sinérgicas en evolución de inmunoterapias dirigidas para combatir el cáncer.
Sin embargo, la terapia génica plantea múltiples desafíos que incluyen una respuesta inmune indeseable y problemas de seguridad debido a la incorporación del gen en localizaciones aleatorias dentro del genoma. Por lo tanto, existe la necesidad de un enfoque terapéutico mejorado para tratar tumores. La invención se define en las reivindicaciones.
Resumen
La presente invención proporciona un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en donde el tratamiento es en combinación con ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en donde el tratamiento es en combinación con ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y una combinación de ARNm, en donde un primer ARNm codifica un polipéptido IL-23 y un segundo ARNm codifica un polipéptido IL-36-gamma. Otros aspectos de la invención se definen en las reivindicaciones.
La presente divulgación se refiere al campo de los agentes terapéuticos de ARNm para el tratamiento del cáncer. Los agentes terapéuticos de ARNm de la divulgación son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer, ya que la tecnología proporciona la administración intracelular de ARNm que codifica polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, polipéptidos relacionados con la oncología, incluyendo estimuladores de la respuesta inmune, factores coestimuladores, inhibidores de puntos de control, y similares, útiles en inmunooncología ("IO")), seguido de la síntesis de novo de proteínas funcionales en las células diana, p. ej., en las células diana en tumores. La divulgación presenta ARNm terapéuticos que tienen nucleótidos modificados para (1) minimizar la activación inmune no deseada (p. ej., la respuesta inmune innata asociada con la introducción in vivo de ácidos nucleicos extraños) y (2) optimizar la eficiencia de traducción del ARNm a proteína. Los aspectos ilustrativos de la divulgación incluyen ARNm terapéuticos que tienen una combinación de modificaciones de nucleótidos para reducir la respuesta inmune innata y la optimización de secuencias, en particular, en el marco de lectura abierto (ORF) de los ARNm terapéuticos que codifican polipéptidos inmunomoduladores para mejorar la expresión de proteínas.
En otros aspectos, la tecnología terapéutica de ARNm de la divulgación presenta la administración de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores (p. ej., relacionados con la oncología) a través de un sistema de administración de nanopartículas lipídicas (LNP). En aspectos ilustrativos, la tecnología terapéutica de ARNm de la divulgación presenta la administración de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores en tumores a través de un sistema de administración de nanopartículas lipídicas (LNP). La divulgación también presenta nuevas LNP basadas en lípidos ionizables que tienen propiedades mejoradas cuando se combinan con ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores (p. ej., relacionados con la oncología) y se administran in vivo, por ejemplo, captación celular, transporte intracelular y/o liberación endosomal o escape endosomal. Las formulaciones de LNP de la divulgación también demuestran inmunogenicidad reducida asociada con la administración in vivo de LNP.
Por consiguiente, la presente divulgación presenta métodos y composiciones para tratar el cáncer, en particular, métodos y composiciones inmunoterapéuticos. En algunos aspectos, la divulgación presenta métodos y composiciones para tratar el cáncer usando una terapia de combinación que presenta dos o más polinucleótidos inmunomoduladores (p. ej., relacionados con la oncología) (p. ej., ARNm) que codifican un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune y un segundo polipéptido, diferente, cebador de la respuesta inmune y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido inhibidor de puntos de control o un polipéptido que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control. En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-23 (IL-23), un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-36 gamma (IL-36 gamma) y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L. En otros aspectos, la divulgación proporciona una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-18 (IL-18) y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L.
Otros aspectos de la divulgación presentan el tratamiento con un ARNm de polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 en combinación con un ARNm que codifica un polipéptido IL-36. Otros aspectos de la divulgación presentan el tratamiento con un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 en combinación con un ARNm que codifica un polipéptido IL-18. Otros aspectos más de la divulgación presentan el tratamiento con ARNm que codifica polipéptidos cebadores de la respuesta inmune en combinación con agentes terapéuticos adicionales, tal como un polipéptido inhibidor de puntos de control (p. ej., anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PDL-1, anti-CTLA4 o una combinación de los mismos). Los aspectos ilustrativos presentan el tratamiento con ARNm encapsulados en nanopartículas lipídicas (LNP-). Los aspectos ilustrativos presentan la administración intratumoral de ARNm en LNP basadas en aminolípidos ionizables.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que lo necesite mediante la administración de al menos dos polinucleótidos, en donde los al menos dos polinucleótidos se seleccionan de un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune (p. ej., un polipéptido IL-23) y un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune (diferente del primero), p. ej., un polipéptido IL-36 gamma o un polipéptido IL-18 y, opcionalmente, un tercer polinucleótido que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune (p. ej., un polipéptido OX40L).
En un aspecto, el primer polinucleótido comprende un ARNm que codifica el primer polipéptido, el segundo polinucleótido comprende un ARNm que codifica el segundo polipéptido, y/o el tercer polinucleótido comprende un ARNm que codifica el tercer polipéptido. En un aspecto, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y/o el tercer polinucleótido comprende al menos un nucleósido modificado químicamente. En algunos aspectos, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición, p. ej., una composición inmunomoduladora, que comprende al menos dos polinucleótidos (p. ej., al menos dos ARNm), en donde los al menos dos polinucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) al menos un polinucleótido que codifica un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune y al menos un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune (diferente del primer polipéptido cebador de la respuesta inmune) ("un doblete");
(ii) al menos un polinucleótido que codifica un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune, al menos un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune (diferente del primero), y al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune ("un triplete").
En algunos aspectos, la composición comprende además al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido inhibidor de puntos de control. En algunos aspectos, la composición se administra a sujetos que la necesitan en combinación con otra terapia contra el cáncer, tal como un polipéptido que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-CTLA4, o una combinación de los mismos).
En un aspecto, la composición comprende al menos un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune y al menos un polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune (diferente del primer polipéptido cebador de la respuesta inmune), en donde el primer y el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune tienen una o más actividades seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) cebar las células dendríticas;
(b) promover la maduración de las células dendríticas;
(c) promover la producción de citoquinas y/o quimioquinas en las células presentadoras de antígenos;
(d) expandir o mantener las células Th17;
(e) potenciar la diferenciación de Th1 y/o Th9; y
(f) cualquier combinación de (a)-(f).
En un aspecto, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-12. En un aspecto, el miembro de la familia IL-12 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en IL-12, IL-23, subunidad IL-12p40, subunidad IL-23p19, IL-27, IL-35 y combinaciones de los mismos. En un aspecto, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es IL-23. En un aspecto, el polipéptido IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 o s Eq ID NO: 140. En un aspecto, el polipéptido IL-23 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 141 o 142.
En otros aspectos, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-1. En un aspecto, el miembro de la familia IL-1 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en IL-1a, IL-1p, IL-IRa, IL-18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36p, iL-36y, IL-37, IL-38 y combinaciones de los mismos. En un aspecto, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18. En un aspecto, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es el polipéptido IL-36-gamma. En un aspecto, el polipéptido IL-36-gamma comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16. En un aspecto, el polipéptido IL-36-gamma está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 143 o 144. En un aspecto, el polipéptido cebador de la respuesta inmune es IL-18. En un aspecto, el polipéptido IL-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 147, 149, 151 o 153. En un aspecto, el polipéptido IL-18 está codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID NO: 148 y 155-162.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición (p. ej., una composición inmunomoduladora) que comprende al menos dos polinucleótidos (p. ej., dos ARNm) que codifican un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune y un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune, en donde el primer polipéptido cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-12 y el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-1. En un aspecto, el primer polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-23 y el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-36-gamma. En un aspecto, el primer polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-23 y el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-18.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición (p. ej., una composición inmunomoduladora) que comprende al menos tres polinucleótidos (p. ej., tres ARNm) que codifican al menos un polinucleótido que codifica un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune, al menos un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune (diferente del primero), y al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune. En algunos aspectos, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en:
(a) activar, estimular, promover o potenciar la proliferación de las células T, la supervivencia de las células T, el reclutamiento de las células T o una combinación de los mismos; y/o
(b) activar, estimular, promover o potenciar la proliferación de las células NK, la supervivencia de las células NK, el reclutamiento de las células NK o una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en:
(c) promover o potenciar la expansión y/o función de las células T;
(d) promover o potenciar el desarrollo de las células Th1, Th2 y/o Th9;
(e) inhibir o suprimir el desarrollo y/o actividad de T reg;
(f) promover o potenciar el desarrollo y/o actividad de las células de memoria; y
(g) cualquier combinación de (c)-(f).
En un aspecto, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste en OX40L, CD80, IL-15 y combinaciones de los mismos. En un aspecto, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste en OX40L, CD80, IL-15, y combinaciones de los mismos. En un aspecto, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune es OX40L. En un aspecto, el polipéptido OX40L comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21. En un aspecto, el polipéptido OX40L está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 145 o 146.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición (p. ej., una composición inmunomoduladora) que comprende al menos tres polinucleótidos (p. ej., tres ARNm) que codifican un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune, un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune y un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune, en donde el primer polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-23, el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-18 y el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune es OX-40L. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición (p. ej., una composición inmunomoduladora) que comprende al menos tres polinucleótidos (p. ej., tres ARNm) que codifican un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune, un segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune y un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune, en donde el primer polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-23, el segundo polipéptido cebador de la respuesta inmune es un polipéptido IL-36-gamma y el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune es OX-40L. En otros aspectos, la composición comprende además un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido inhibidor de puntos de control.
En otros aspectos, la divulgación proporciona una composición para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor, comprendiendo la composición al menos dos polinucleótidos (p. ej., dos ARNm) que codifican al menos un primer y un segundo polipéptido, en donde los al menos dos polinucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23,
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36gamma;
(iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-18;
(iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(v) un polinucleótido que codifica un polipéptido CD80; y
(vi) un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-CTLA4; y,
(vii) una combinación de los mismos.
En un aspecto, los al menos dos polinucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23,
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36gamma;
(iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-18;
(iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; y
(v) una combinación de los mismos.
En otro aspecto más, los al menos dos polinudeótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23,
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36gamma;
(iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; y
(iv) una combinación de los mismos.
En otro aspecto, los al menos dos polinucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23 y un polinucleótido que codifica un polipéptido IL36gamma; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23 y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL36gamma y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23 y un polinucleótido que codifica un polipéptido IL18; (v) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL36gamma y un polinucleótido que codifica un polipéptido IL18; y
(vi) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL18 y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor, comprendiendo la composición al menos tres polinucleótidos (p. ej., tres ARNm) que codifican al menos un primer, segundo y tercer polipéptidos, en donde los al menos tres polinucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23, un polinucleótido que codifica un polipéptido IL36gamma y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; y
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23 y un polinucleótido que codifica un polipéptido IL18, y un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 comprende: (i) un polipéptido IL-12p40; (ii) un polipéptido IL-23p19; o (iii) tanto un polipéptido IL-12p40 como un polipéptido IL-23p19. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 comprende un polipéptido IL-12p40, un polipéptido IL-23p19 y un conector posicionado operativamente entre el polipéptido IL-12p40 y el polipéptido IL-23p19. En un aspecto, el conector es un conector Gly/Ser (p. ej., G4S), que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 136-139). En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 140. En otros aspectos, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 141.
En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-18 comprende una secuencia señal heteróloga. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 147, 149, 151 o 153. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-18 comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID NO: 148 y 155-162. En algunos aspectos, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36gamma comprende una secuencia señal heteróloga. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL36-gamma comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36gamma comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 143.
En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 145.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición, p. ej., para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor, comprendiendo la composición al menos tres polinucleótidos (p. ej., tres ARNm) que codifican al menos un primer, segundo y tercer polipéptidos, en donde los al menos tres polinucleótidos comprenden un primer polinucleótido que codifica OX40L, un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23 y un tercer polinucleótido que codifica IL-36gamma, en donde el primer, segundo y tercer polinucleótidos están presentes en la composición en una proporción de masa de aproximadamente 1:1:2, respectivamente. En un aspecto, el primer y segundo polinucleótidos, que codifican OX40L e IL-23 respectivamente, están presentes en la composición en cantidades de masa aproximadamente iguales y el tercer polinucleótido, que codifica IL-36gamma, está presente en la composición en una cantidad de masa mayor que el primer y tercer polinucleótidos. En la presente memoria, se divulgan proporciones de masa adicionales para la composición.
Otros aspectos de la divulgación se refieren a una nanopartícula lipídica que comprende cualquiera de las composiciones anteriores o relacionadas. En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica se formula con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica se formula para administración intratumoral (iTu).
En un aspecto, la divulgación proporciona una nanopartícula lipídica que comprende: un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido OX40L humano; un polinucleótido que codifica un polipéptido IL23 humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido IL-12p40 humano unido operativamente a un polipéptido IL-23p19 humano; y un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36 gamma humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido iL-36 gamma humano.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-12p40 humano está unido operativamente al polipéptido IL-23p19 humano mediante un conector peptídico. En algunos aspectos, el polipéptido IL-12p40 está localizado en el extremo 5' del polipéptido IL-23p19 o el conector (p. ej., conector peptídico). En otros aspectos, el polipéptido IL-12p40 está localizado en el extremo 5' del polipéptido IL-23p19 o el conector (p. ej., conector peptídico). En algunos aspectos, el conector es un conector peptídico, por ejemplo, un conector Gly/Ser (p. ej., G6S). En algunos aspectos, el conector Gly/Ser comprende (GnS)m, en donde n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 y m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20. En algunos aspectos, el conector Gly/Ser comprende (GnS)m, y en donde n es 6 y m es 1 (es decir, G6S).
En aspectos relacionados, un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido IL23 humano o un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido IL-36 gamma humano comprende además un péptido señal. En algunos aspectos, el péptido señal es un péptido señal heterólogo, por ejemplo, un péptido señal derivado de la región variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana, hIGVK4.
En algunos aspectos, el polipéptido OX40L humano comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21. En algunos aspectos, el polipéptido IL-12p40 humano comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, el polipéptido IL-23p19 humano comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, el polipéptido IL-36 gamma humano comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona cualquiera de los polinucleótidos anteriores o relacionados que comprenden además uno o más sitios de unión de microARN (miARN). En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN es un sitio de unión de miR-122 (p. ej., un sitio de unión de miR-122-3p, un sitio de unión de miR-122-5p o ambos). En algunos aspectos, el sitio de unión de miR es al menos un sitio de unión de miR-122-5p. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una 3' UTR que comprende al menos un sitio de unión de miR-122-5p. En algunos aspectos, el sitio de unión de miR-122-5p comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 26. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende una 3' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 120. En un aspecto, el polinucleótido comprende una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 27.
En otros aspectos, la divulgación proporciona el uso de cualquiera de las composiciones o nanopartículas lipídicas anteriores o precedentes como se describe en la presente memoria en la fabricación de un medicamento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo, en donde el medicamento comprende la composición o nanopartícula lipídica y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y en donde el tratamiento comprende la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-CTLA4 o una combinación de los mismos), y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un kit que comprende un contenedor que comprende una composición de polinucleótido (p. ej., un ARNm) o una nanopartícula lipídica que comprende polinucleótidos como (p. ej., ARNm) como se divulga en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración de la nanopartícula lipídica o composición farmacéutica para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En algunos aspectos, el prospecto comprende además instrucciones para la administración de la composición farmacéutica en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo.
En otros aspectos más, la divulgación proporciona un kit que comprende un medicamento que comprende cualquiera de las composiciones o nanopartículas lipídicas anteriores o precedentes como se describe en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración del medicamento solo o en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-CTLA4 o una combinación de los mismos) y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En algunos aspectos, el kit comprende además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del primer medicamento y del segundo medicamento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo.
Otros aspectos de la divulgación se refieren a una composición que comprende cualquiera de las nanopartículas lipídicas anteriores o precedentes como se describe en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión del cáncer en un individuo, en donde el tratamiento comprende la administración de la nanopartícula lipídica en combinación con una segunda composición, en donde la segunda composición comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-CTLA4 o una combinación de los mismos), y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.
En algunos aspectos, el polipéptido inhibidor de puntos de control inhibe PD1, PD-L1, CTLA4 o una combinación de los mismos. En un aspecto, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CTLA4 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD1, un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab, avelumab o durvalumab. En un aspecto, el anticuerpo anti-CTLA-4 es tremelimumab o ipilimumab. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD1 es nivolumab o pembrolizumab.
En varios aspectos de la composición, los polinucleótidos en la composición son ARNm, en donde cada ARNm incluye al menos una modificación química. En un aspecto, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1 -metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tiodihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina,, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina. En algunos aspectos, el ARNm comprende al menos un nucleósido modificado químicamente, en donde el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el al menos un nucleósido modificado químicamente es N1-metilpseudouridina. En algunos aspectos, el polinucleótido es un ARNm de N1-metilpseudouridina completamente modificado. En la presente memoria, se divulgan modificaciones químicas adicionales.
En varios aspectos de la composición, la composición se formula en un vehículo de nanopartículas lipídicas. Por ejemplo, una composición que comprende un primer y segundo polinucleótido, y opcionalmente un tercer polinucleótido, como se describe en la presente memoria, se formulan de manera que todos los polinucleótidos en la composición sean transportados por el mismo vehículo de nanopartículas lipídicas. En un aspecto, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 20-60 % de aminolípido ionizable: 5-25 % de fosfolípido: 25-55 % de esterol; y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG. En un aspecto, un aminolípido ionizable se selecciona del grupo que consiste, por ejemplo, en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-no-2-en-1-ilo) (L319). En un aspecto, el aminolípido ionizable es el Compuesto 18.
En otros aspectos, la nanopartícula lipídica comprende una proporción molar de aproximadamente 20-60 % de aminolípido ionizable: 5-25 % de fosfolípido: 25-55 % de esterol; y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 20-60 % de Compuesto 18: 5-25 % de fosfolípido: 25-55 % de colesterol; y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 50 % de aminolípido ionizable: aproximadamente 10 % de fosfolípido: aproximadamente 38,5 % de colesterol; y aproximadamente 1,5 % de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 50 % de Compuesto 18: aproximadamente 10 % de fosfolípido: aproximadamente 38,5 % de colesterol; y aproximadamente 1,5 % de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 49,83 % de aminolípido ionizable: aproximadamente 9,83 % de fosfolípido: aproximadamente 30,33 % de colesterol; y aproximadamente 2,0 % de lípido modificado con PEG.
En otros aspectos, el vehículo de nanopartículas lipídicas comprende una proporción molar de aproximadamente 49,83 % de Compuesto l8 : aproximadamente 9,83 % de fosfolípido: aproximadamente 30,33 % de colesterol; y aproximadamente 2,0 % de lípido modificado con PEG.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto cualquiera de las composiciones descritas en la presente memoria. En un aspecto, la composición se administra por vía intratumoral. En otro aspecto, la composición se administra regionalmente (es decir, en la región en la que está creciendo el tumor), por ejemplo, la composición puede administrarse por vía intraperitoneal para tumores en la cavidad peritoneal. En un aspecto, el tumor es un carcinoma hepatocelular. En otro aspecto, el tumor es un tumor de ovario, un tumor de colon o un tumor gástrico diseminado. En la presente memoria se describen otros tumores y cánceres adecuados para el tratamiento.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una subunidad IL-12p40 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia enumerada en la TABLA 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a una subunidad IL-23p19 y formar IL-23, que tiene una actividad de IL-23. En otros aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una subunidad IL-23p19 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia enumerada en la TABLA 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a una subunidad IL-12p40 y formar IL-23, que tiene una actividad de IL-23. En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 y la subunidad IL-23P19 están en una única cadena polipeptídica o en dos cadenas diferentes.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia enumerada en la TABLA 1, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una actividad de IL-36-gamma.
En algunos aspectos, el método de la divulgación comprende además administrar una tercera proteína o un tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína. En un aspecto, la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L. En otros aspectos, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia enumerada en la TABLA 1A, en donde la secuencia de aminoácidos tiene actividad de OX40L.
En ciertos aspectos, el primer polinucleótido (p. ej., ARNm), el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm), y/o el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende además una secuencia de ácido nucleico que comprende un sitio de unión del miARN, p. ej., miR-122, p. ej., aacgccauua ucacacuaaa ua (SEQ ID NO: 23) o uggaguguga caaugguguu ug (SEQ ID NO: 25).
El primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido puede comprender además una 5' UTR, una 3' Ut R, una caperuza 5' terminal, y/o una cola poliA en 3'. En otros aspectos, el primer polinucleótido (p. ej., ARNm), el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm), y/o el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) tienen codones optimizados, se transcriben in vitro, son quiméricos o circulares.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido (p. ej., ARNm), el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm), y/o el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) se formula con un agente de administración, p. ej., una nanopartícula lipídica. En otros aspectos, el agente de administración comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)
Figure imgf000009_0001
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo Ci-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2 , -C(O)OR, -OC(O)R, -CXs, -CX2H, -CXH2 , -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR)R, -C(O)N(R)OR, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C 2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y
siempre que cuando R4 sea -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)2, entonces (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1,2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es un heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros cuando n es 1 o 2.
En otros aspectos, el agente de administración comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)
Figure imgf000010_0001
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R'; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2 , -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2 , -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4 y 5; cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, y 13; y
siempre que cuando R4 sea -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)2, entonces (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1,2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros cuando n es 1 o 2.
En algunos aspectos, el compuesto tiene la Fórmula (IA):
Figure imgf000011_0001
l se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, y 9;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o - NHC(O)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(o )n (R)2 , -N(R)C(O)Or , heteroarilo o heterocicloalquilo;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo, y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, m es 5, 7 o 9.
En algunos aspectos, el compuesto tiene la Fórmula (IA) o una sal o estereoisómero del mismo, en donde l se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, y 9;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o - NHC(O)N(R)2;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, m es 5, 7 o 9.
En algunos aspectos, el compuesto tiene la Fórmula (II):
Figure imgf000012_0001
l se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 2, 3, o 4 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, el compuesto tiene la Fórmula (II), o una sal o estereoisómero del mismo, en donde l se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 2, 3, o 4 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, M1 es M'.
En algunos aspectos, M y M' son independientemente -C(O)O- o -OC(O)-.
En algunos aspectos, l es 1, 3 o 5.
En algunos aspectos, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en el Compuesto 1 al Compuesto 232, sales y estereoisómeros de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en el Compuesto 1 al Compuesto 147, sales y estereoisómeros de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.
En ciertos aspectos, el agente de administración comprende el compuesto de la Fórmula (IIa),
Figure imgf000012_0002
En ciertos aspectos, el agente de administración comprende el compuesto de la Fórmula (IIb),
Figure imgf000013_0001
En ciertos aspectos, el agente de administración comprende el compuesto de la Fórmula (IIc) o (IIe),
Figure imgf000013_0002
En algunos aspectos, R4 es como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, R4 se selecciona de -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR.
En ciertos aspectos, el agente de administración comprende el compuesto de la Fórmula (IId),
Figure imgf000013_0003
en donde n se selecciona de 2, 3 y 4, y m, R', R", y R2 a R 6 son como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, cada uno de R2 y R3 pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14.
En algunos aspectos, el compuesto tiene la Fórmula (IId), o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14, n se selecciona de 2, 3 y 4, y R', R", R5 , R6 y m son como se definen en la presente memoria.
En algunos aspectos, R2 es alquilo C8.
En algunos aspectos, R3 es alquilo C8, alquilo C6, alquilo C7, alquilo C8 o alquilo C9.
En algunos aspectos, m es 5, 7 o 9.
En algunos aspectos, cada R5 es H.
En algunos aspectos, cada R6 es H.
En otros aspectos, el agente de administración comprende además un fosfolípido, un lípido estructural, un lípido PEG, un lípido ionizable y/o un compuesto de amina cuaternaria.
La divulgación comprende además una composición que comprende el primer polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgado en la presente memoria, el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgado en la presente memoria, el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) incluido en la presente memoria, o combinaciones de los mismos, en donde el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y/o el tercer polinucleótido se formulan en el agente de administración divulgado en la presente memoria.
La divulgación comprende además una composición que comprende el primer polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgado en la presente memoria, el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgado en la presente memoria, y el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgado en la presente memoria, en donde el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y el tercer polinucleótido se formulan en el agente de administración divulgado en la presente memoria.
La presente divulgación también divulga un kit que comprende la composición divulgada en la presente memoria e instrucciones para su uso de acuerdo con el método divulgado en la presente memoria.
En algunos aspectos del método de la presente divulgación, las composiciones de la presente divulgación, o el kit de la presente divulgación, la administración de los polinucleótidos a un sujeto que los necesita da como resultado (i) un aumento en el nivel de granulocitos en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma u OX40L; (ii) un aumento en el nivel de células dendríticas de presentación cruzada en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, u OX40L; (iii) un aumento en la relación de células T efectoras a supresoras en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con la relación después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (iv) un aumento en el nivel de células T efectoras de memoria en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (v) un aumento en el nivel de expresión de PDL1 en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel de umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36- gamma, u OX40L; o (vi) una combinación de los mismos.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido interleuquina-23 (IL-23), y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido interleuquina-36-gamma (IL-36-gamma); o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica un tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (OX40L), en donde la administración del doblete o triplete al sujeto da como resultado (i) un aumento en el nivel de granulocitos en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma u OX40L; (ii) un aumento en el nivel de células dendríticas de presentación cruzada en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL -36-gamma, u OX40L; (iii) un aumento en la relación de células T efectoras a supresoras en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con la relación después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (iv) un aumento en el nivel de células T efectoras de memoria en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (v) un aumento en el nivel de expresión de PDL1 en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración del doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36- gamma, u OX40L; o (vi) una combinación de los mismos. En algunos aspectos, en donde el aumento en el nivel de granulocitos se cuantifica como (i) granulocitos como porcentaje de células CD45+, o (ii) granulocitos por mg de tumor. En algunos aspectos, las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de células dendríticas de presentación cruzada se cuantifica como (i) células dendríticas de presentación cruzada por mg de tumor, (ii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada en el ganglio linfático de drenaje tumoral (TdLN), o (iii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada como porcentaje de células CD45+. En algunos aspectos, la relación de células T efectoras a supresoras se cuantifica como relación CD8:Treg. En algunos aspectos, las células T efectoras de memoria son células CD4+ y/o CD8+. En algunos aspectos, el nivel de expresión de PDL1 se cuantifica como (i) número de células positivas para CD1 1b+, o (ii) expresión de PDL1 en células CD1 1b+.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de granulocitos en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de granulocitos se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de granulocitos se mide como (i) granulocitos como porcentaje de células CD45+, y/o (ii) granulocitos por mg de tumor, en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica IL-23 o un único polinucleótido que codifica IL-36-gamma.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de células dendríticas de presentación cruzada en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células dendríticas de presentación cruzada se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de células dendríticas CD103+ de presentación cruzada se mide como (i) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada por mg de tumor, (ii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada en TdLN, (iii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada como porcentaje de células CD45+, o (iv) una combinación de los mismos, en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica IL-23, un único polinucleótido que codifica IL-36-gamma, o un único polinucleótido que codifica OX40L.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar la relación de células T efectoras a supresoras en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde la relación de células T efectoras a supresoras se mide en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, la relación de células T efectoras a supresoras se cuantifica como relación CD8:Treg.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de células T efectoras de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células T efectoras de memoria se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células T efectoras de memoria son células CD4+ y/o CD8+. En algunos aspectos, el aumento en los niveles de células T efectoras de memoria se mide como células T efectoras de memoria dentro del tumor en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica OX40L.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de células positivas para PDL1 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células positivas para PDL1 se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células positivas para PDL1 son células CD11 b+.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, la muestra obtenida del sujeto se selecciona, por ejemplo, de tejido tumoral, infiltrado tumoral, sangre, plasma o una combinación de los mismos. Un experto en la técnica entendería que cualquiera de las células medidas en los métodos divulgados en la presente memoria (p. ej., granulocitos, células dendríticas de presentación cruzada, células T efectoras, células T supresoras, células positivas para PDL1, etc.) y los parámetros correspondientes a esas mediciones (p. ej., niveles absolutos o relativos de células, relaciones con otras células, nivel de subtipos específicos, niveles de activación, presencia/ausencia de marcadores, etc.) pueden medirse en cualquier muestra de tejido en la que estén presentes esas células usando métodos conocidos en la técnica sin experimentación indebida.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, la una o más muestras de control es una muestra o muestras obtenidas de un sujeto sano o un sujeto con un tumor. En algunos aspectos, el nivel umbral es un valor predeterminado o un valor obtenido de una o más muestras.
La presente divulgación también proporciona un método para determinar si se debe tratar a un sujeto que tiene una enfermedad tumoral con una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo el polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L; comprendiendo el método (1) administrar al sujeto una dosis inicial del doblete o triplete, y (2) tratar al sujeto si después de la administración de la dosis inicial del doblete o triplete se determina que el sujeto tiene un aumento en (a) el nivel de granulocitos, (b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada, (c) la relación de células T efectoras a supresoras, (d) el nivel de células T efectoras de memoria, (e) el nivel de células positivas para PDL1, (f) la expresión de PDL1, o ( g) una combinación de los mismos, con respecto a un nivel umbral.
La presente divulgación también proporciona un método para seleccionar a un sujeto diagnosticado con un tumor como candidato para el tratamiento con una composición que comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o, (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L; comprendiendo el método (1) administrar al sujeto una dosis inicial del doblete o triplete, y (2) seleccionar al sujeto para el tratamiento si después de la administración de la dosis inicial del doblete o triplete se determina que el sujeto tiene un aumento en (a) el nivel de granulocitos, (b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada, (c) la relación de células T efectoras a supresoras, (d) el nivel de células T efectoras de memoria, (e) el nivel de células positivas para PDL1, (f) la expresión de PDL1, o (g) una combinación de los mismos, con respecto a un nivel umbral.
La presente divulgación también proporciona un método para medir la eficacia de una composición para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita, en donde la composición comprende (a) dos polinucleótidos en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma; o, (b) tres polinucleótidos en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L; en donde el método comprende medir en al menos una muestra tomada del sujeto (a) el nivel de granulocitos, (b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada, (c) la relación de células T efectoras a supresoras, (d) el nivel de células T efectoras de memoria, (e) el nivel de células positivas para PDL1, (f) la expresión de PDL1, o (g) una combinación de los mismos, en donde un aumento en al menos una de las mediciones con respecto a un nivel umbral indica que el sujeto está respondiendo al tratamiento con el doblete o triplete.
Breve descripción de los dibujos/figuras
Las FIG. 1A y 1B muestran la eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 en el modelo animal de linfoma A20. La FIG. 1A muestra el tratamiento con el control NST-FIX (2,5 |jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 1 de 12 sujetos (8,3 %). La FIG. 1B muestra el tratamiento con mIL-23 sin miR (2,5 jg de ARNm).
Se observó una respuesta completa en 5 de 12 sujetos (41,6 %). Condiciones de dosificación: 2,5 |jg de ARNm, administración intratumoral (iTu), nanopartículas lipídicas basadas en el Compuesto 18 (SM68 l Np ). NST-FIX es ARNm de control negativo.
Las FIG. 2A y 2B muestran la eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 en el modelo animal de cáncer de colon MC38-C. La FIG. 2A muestra el tratamiento con NST-OX40L (2,5 jg de ARNm). La FIG. 2B muestra el tratamiento con ARNm de mIL-23 que carece de sitios de unión de miR en la 3'UTR, "sin miR" (2,5 jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 4 de 10 sujetos (40 %). Se observó una respuesta parcial en 2 de 10 sujetos (20 %). Condiciones de dosificación: 2,5 jg de ARNm, iTu, LNP basada en el Compuesto 18. NST-OX40L es ARNm de control negativo.
Las FIG. 3A-3F muestran que la adición de ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18 a la terapia con ARNm de IL-23 aumenta la eficacia en el modelo de cáncer de colon MC38-C. La FIG. 3A muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y NST-FIX (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 3 de 10 sujetos (30 %). Se observó una respuesta parcial en 6 de 10 sujetos (60 %). La FIG. 3B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 en combinación con ARNm que codifica IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 9 de 10 sujetos (90 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 10 sujetos (10 %). La FIG. 3C muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 en combinación con ARNm que codifica IL-18 (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 6 de 10 sujetos (60 %). Se observó una respuesta parcial en 3 de 10 sujetos (30 %). La FIG. 3D muestra el tratamiento con el control NST-FIX (5 jg de ARNm). Condiciones de dosificación: 2,5 jg de ARNm de cada ARNm (5 jg para el control), iTu, LNP basada en el Compuesto 18. NST-FIX es ARNm de control negativo. La FIG. 3E, FIG. 3F, y FiG. 3G muestran datos correspondientes a los mismos experimentos presentados en la FIG. 3A, FIG. 3B, y FIG. 3D, respectivamente, pero ampliando el marco temporal de los experimentos hasta el día 90.
Las FIG. 4A-4C muestran la eficacia de la terapia de combinación de ARNm de IL-23 e IL-36-gamma o IL-18 en el modelo de linfoma A20. La FIG. 4A muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 sin miR y NST-FIX (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 8 de 12 sujetos (66,6 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 12 sujetos (8,3 %). La FIG. 4B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 sin miR en combinación con ARNm que codifica IL-36-miR-122 (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 10 de 12 sujetos (83,3%). La FIG. 4C muestra el tratamiento con ARNm "sin miR" que codifica IL-23 y ARNm sin miR" que codifica IL-18 (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 6 de 12 sujetos (50 %). La FIG. 4D muestra el tratamiento con el control NST-FIX (5 jg de ARNm). Condiciones de dosificación: 2,5 jg de ARNm de cada ARNm (5 jg para el control), iTu, LNP basada en el Compuesto 18. NST-FIX es ARNm de control negativo.
Las FIG. 5A-5C muestran una indicación temprana de eficacia superior del ARNm que codifica IL-36-gamma más el ARNm que codifica IL-23 sobre el ARNm que codifica IL-23 solo con una dosis fija de 5 jg de ARNm en el modelo de linfoma A20. La FIG. 5A muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 (5 jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 1 de 10 sujetos (10 %). Se observó una respuesta parcial en 4 de 10 sujetos (40 %). La FiG. 5B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-36-gamma (5 jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 2 de 10 sujetos (20 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 10 sujetos (10 %). La FIG. 5C muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). La FIG. 5D muestra el tratamiento con control de ARNm NST-FIX (5 jg de ARNm). Condiciones de dosificación: 2,5 jg de ARNm de cada ARNm (5 jg para el control), iTu, LNP basada en el Compuesto 18. NST-FIX es ARNm de control negativo. La combinación IL-23/IL-36-gamma es superior a los monoconstituyentes a una dosis fija de ARNm de 5 jg .
Las FIG. 6A-6C muestran una comparación en el modelo de cáncer de colon MC38 de infiltrado inmune. La FIG. 6A muestra una cuantificación de la infiltración de células CD4+, CD8+ y CD11b+ en el sistema modelo MC38 en células por mg de tejido. Se muestran los resultados para MC38-M (poco inmunogénico) y MC38-C (fuertemente inmunogénico). La FIG. 6B muestra una micrografía de tejido de una muestra de MC38-M poco inmunogénico) y la FIG. 6C muestra una micrografía de tejido de una muestra de MC38-C fuertemente inmunogénico.
Las FIG. 7A-7D analizan la eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 y la terapia de combinación de ARNm de IL-23/IL-36-gamma o IL-23/IL-18 en el modelo de cáncer de colon MC38-M. La FIG. 7A muestra el tratamiento con NST-OX40L (2,5 jg de ARNm) en LNP basadas en el Compuesto 18. No se observó respuesta. La FIG. 7B muestra el tratamiento con ARNm de IL-23 "sin miR" (2,5 jg de ARNm) en LNP basadas en el Compuesto 18. Sólo se observó una respuesta parcial (1 de 10, 10 %). MC38-M es un modelo relativamente insensible en el que las monoterapias con OX40L, anticuerpo anti-PD-1 e IL-23 son ineficaces. La FIG. 7C muestra el tratamiento con ARNm que codifican IL-23 e IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). Se observaron respuestas completas en 2 de 10 sujetos (20 %). Se observaron respuestas parciales en 5 de 10 sujetos (50 %). De este modo, la terapia de combinación con ARNm de IL-23/IL-36-gamma es eficaz en el cáncer de colon MC38-M poco inmunogénico. La FIG. 7E muestra que el tratamiento con ARNm que codifican IL-23 e IL-18 (2,5 jg de cada ARNm). Sólo se observó una respuesta parcial (1 de 10, 10 %). La FIG. 7D muestra el tratamiento con el control NST-FIX (5 |jg de ARNm).
La FIG. 8 analiza la eficacia de la monoterapia con ARNm de OX40L en el modelo tumoral A20. El ARNm que codifica OX40L (2,5 jg de ARNm) se formuló en LNP basadas en el Compuesto 18. Se observaron dos respuestas completas.
Las FIG. 9A-9C muestran la eficacia de la monoterapia con ARNm de OX40L "sin miR" o anti-PD-1 en el modelo de cáncer de colon MC38-M (poco inmunogénico). La FIG. 9A muestra el tratamiento con ARNm de OX40L "sin miR" (2,5 jg de ARNm) en LNP basadas en el Compuesto 18. La FIG. 9B muestra el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (dosificación IP de 5 mg/kg 2x/semana). La FIG. 9C muestra una microfotografía de tejido del modelo de cáncer de colon MC38-M.
Las FIG. 10A-10H muestran el efecto de monoterapia, terapia de combinación binaria; y terapia de combinación triple (incluida la administración de dosis única y múltiples a niveles de dosificación variables) utilizando ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L, en donde cada ARNm comprende un sitio de unión de miR122. La FIG. 10A muestra el tratamiento de monoterapia con IL-23_miR-122. No se observaron respuestas completas, sino ocho evasores. La FIG. 10B muestra el tratamiento de combinación con IL-23_miR-122 e IL-36-gamma_miR-122. Se observaron tres respuestas completas (25 %). Se observaron seis evasores. La FIG. 10C muestra el tratamiento con la terapia de combinación triple IL-23_miR-122, IL-36-gamma_miR-122 y OX40L_miR-122. Se observaron tres respuestas completas (25 %). Se observaron cuatro evasores. Para cada muestra: se administraron por vía intratumoral (iTu) 5 jg de ARNm/dosis en total. Cuando se administraron ARNm de control no traducido e IL-36gamma_miR-122 solos, todos los ratones progresaron sobre el día 26 (datos no mostrados). La FIG. 10D, FIG. 10E, y FIG. 10F muestran datos correspondientes a los mismos experimentos presentados en la FIG. 10A, FIG. 10B, y FIG. 10C, respectivamente, pero extendiendo el marco de tiempo de los experimentos hasta el día 70. La FIG. 10G muestra el tratamiento con la terapia del doblete IL-23_miR-122 e IL-36-gamma_miR-122 a una dosis única (8 jg ) y la terapia del triplete IL-23_miR-122, IL-36-gamma_miR-122, y OX40L_miR-122 a una dosis única o dosis múltiples (12 jg ) en células de MC38 luciferasa en relación con un control simulado. La FIG. 10H muestra la supervivencia hasta el día 47 después del tratamiento con una dosis única de 8 jg de la terapia del doblete IL-23_miR-122 e IL-36-gamma_miR-122, una dosis única de 12 jg de la terapia del triplete IL-23_miR-122, IL-36-gamma_miR-122, y OX40L_miR-122, o dosis múltiples de 12 jg de la terapia del triplete IL-23_miR-122, IL-36-gamma_miR-122, y OX40L_miR-122. Se observaron muertes relacionadas con el tratamiento con dosis múltiples de 12 jg de la terapia del triplete IL-23_miR-122, IL-36-gamma_miR-122, y OX40L_miR-122.
La FIG. 11 muestra la bioactividad (p. ej., inducción de la expresión de interleuquina 17 murina (mIL-17) a partir de esplenocitos primarios de ratón) de la proteína IL-23 producida a partir de un ARNm en comparación con la proteína IL-23 recombinante. La línea superior sólida muestra mIL-17 (pg/ml) secretada a partir de esplenocitos primarios de ratón después de añadir IL-23 murina (mIL-23) obtenida de células HeLa transfectadas con un ARNm que codifica mIL-23; la línea inferior sólida muestra la expresión de mIL-17 (pg/ml) después de añadir IL-23 humana (hIL-23) obtenida de células HeLa transfectadas con un ARNm que codifica hIL-23. La línea negra punteada muestra mIL-17 secretada de esplenocitos primarios de ratón después de añadir hIL-23 recombinante; y la línea gris punteada muestra la expresión de mIL-17 de esplenocitos después de añadir mIL-23 recombinante. Los niveles de proteína IL-23 utilizados en el experimento fueron 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 3,3 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml.
La FIG. 12A muestra la producción de interleuquina 6 murina (mIL6) (ng/ml) en células dendríticas derivadas de médula ósea inducida por proteína IL-36gamma murina (mIL-36Y). El primer panel (NT) es un control negativo. El segundo panel muestra la expresión de mIL6 después de añadir mIL-36Y recombinante. El tercer panel muestra la expresión de mIL6 después de añadir mIL-36Y obtenida de células HeLa transfectadas con ARNm que codifica mIL-36Y. El cuarto panel (simulacro) muestra un control simulado. La FIG. 12B muestra la expresión de interleuquina 8 (IL8) (DO450) en células A431 mediante IL-36-gamma humana recombinante y sobrenadantes de células B16F10 transfectadas con tres ARNm que codifican hIL-36-gamma.
Las FIG. 13A-13E muestran la actividad biológica coestimuladora de OX40L expresada en la superficie de células tratadas con ARNm de OX40L. La FIG. 13A muestra un dibujo esquemático del ensayo de activación de células T. Se cocultivaron células B16F10 o células HeLa que expresan OX40L con células T CD4+ y anticuerpo anti-CD3 de ratón (células B16F10) o Dynabeads activadores de T humanas (células HeLa). La producción de IL-2 se midió utilizando ELISA como correlato de la activación de células T. La FIG. 13B muestra los resultados del ensayo de activación de células T medida por IL-2 de ratón. La FIG. 13C muestra los resultados del ensayo de activación de células T medida por IL-2 humana. El eje y muestra la expresión de mIL-2 en ng/ml. La FIG. 13D muestra los datos de la FIG. 13C con diagrama esquemático que muestra la adición de células que expresan OX40L al ensayo de activación de células T sin estimular. La FIG. 13E muestra un ensayo de activación de células T usando células T preestimuladas cultivadas en presencia o ausencia de células HeLa que expresan OX40L y en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 humano.
Las FIG. 14A-14D muestran los diferentes tipos de células inmunes que se infiltran en el microentorno tumoral en tumores A20 después de la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. La FIG. 14A muestra el porcentaje de células NK en el infiltrado tumoral 24 horas después del tratamiento, según lo detectado por el marcador DX5. La FIG. 14B muestra el porcentaje de células T CD4+ en el infiltrado tumoral 14 días después del tratamiento, según lo detectado por el marcador CD4. La FIG. 14C muestra el porcentaje de células T CD8+ en el infiltrado tumoral 14 días después del tratamiento, según lo detectado por el marcador CD8. La FIG. 14D muestra el porcentaje de células T CD8+ en el infiltrado tumoral de tumores MC3824 y 72 horas después de una primera y segunda dosis de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.
Las FIG. 15A y 15B muestran la eficacia antitumoral in vivo de mOX40L_miR-122 administrado por vía intratumoral. La FIG. 15A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados por vía intratumoral con ARNm de control ("NST-OX40L") (las flechas marcan los días de inyección). La FIG. 15B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados por vía intratumoral con ARNm de mOX40L_miR-122 ("OX40L-miR-122") (las flechas marcan los días de inyección).
Las FIG. 16A-16F muestran la eficacia antitumoral in vivo de la terapia de combinación que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un sitio de unión de miR-122 y un anticuerpo anti-PD-1. La FIG. 16A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de ARNm de control ("NST_mOX40L_122") y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). La FIG.
16B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR-122 ("mOX40L_122") y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). La FIG. 16C muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de ARNm de control ("NST_mOX40L_122") y anticuerpo anti-PD-1 ("anti-PD-1"). La FIG. 16D muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR-122 ("mOX40L_122") y anticuerpo anti-PD-1 ("anti-PD-1"). La FIG. 16E muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de anticuerpo anti-PD-1 y PBS. La FiG. 16F muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con PBS y anticuerpo de control ("IgG2a de rata"). CR = respondedor completo.
La FIG. 17 muestra las curvas de supervivencia para animales tratados por vía intratumoral con terapia de combinación que comprende ARNm de control y anticuerpo de control ("NST_mOX40L_122 IgG2a de rata"), mOX40L_miR-122 y anticuerpo de control ("mOX40L_122 IgG2a de rata"), ARNm de control y anticuerpo anti-PD-1 ("NST_mOX40L_122 anti-PD-1"), mOX40L_miR-122 y anticuerpo anti-PD-1 ("mOX40L_122 anti-PD-1"), anticuerpo anti-PD-1 y PBS ("PBS anti-PD-1"), y PBS y anticuerpo de control ("Pb S IgG2a de rata").
Las FIG. 18A y 18B muestran una respuesta inmune de memoria en animales tratados con terapia de combinación que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un sitio de unión de miR-122 y un anticuerpo anti-PD-1. Los animales se trataron inicialmente con inyecciones intratumorales de mOX40L_miR-122 y anticuerpo anti-PD-1 como se muestra en la FIG. 16D. Cuatro animales identificados como respondedores completos (CR) se volvieron a pulsar con células tumorales MC38. La FIG.
18A muestra el crecimiento tumoral en animales sin estimular pulsados con células tumorales MC38. La FIG.
18B muestra el crecimiento tumoral en los cuatro animales CR pulsados de nuevo con células tumorales MC38.
Las FIG. 19A-19G muestran la eficacia tumoral in vivo en tumores primarios tratados y distales no tratados con terapia doble de ARNm (combinación de ARNm que codifican IL-23 e IL-36) y terapia de triplete de ARNm (combinación de ARNm que codifican IL-23, IL-36, y OX40L). La FIG. 19A muestra una descripción esquemática del modelo de doble flanco MC38-S utilizado en los experimentos. Se trata un tumor implantado en un flanco y el efecto se mide tanto en el tumor primario tratado como en el tumor no tratado en el otro flanco. La FIG. 19B muestra el efecto del ARNm de control negativo (ARNm no traducible que codifica OX40L) sobre el tumor primario tratado. La FIG. 19C muestra el efecto del ARNm de control negativo sobre el tumor no tratado. La FIG. 19D muestra el efecto de la terapia doble de ARNm (ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma) sobre el tumor primario tratado. La FIG. 19E muestra el efecto de la terapia doble de ARNm (ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma) sobre el tumor distal no tratado. La FIG.
19F muestra el efecto de la terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23, ARNm que codifica IL-36-gamma y ARNm que codifica OX40L) sobre el tumor primario tratado. La FIG. 19G muestra el efecto de la terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23, ARNm que codifica IL-36-gamma y ARNm que codifica OX40L) sobre el tumor distal no tratado. En cada caso, la dosis total de ARNm inyectada en el tumor (control, doble o triplete) fue de 5 microgramos. Los ARNm se administraron por vía intratumoral en una sola dosis.
Las FIG. 20A-20D muestran que la terapia de triplete de ARNm combinada con un anticuerpo anti-PD-L1 ha mejorado la eficacia en un modelo de tumor B16F10-AP3 difícil de tratar. La FIG. 20A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con control negativo. La FIG. 20B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con un anticuerpo anti-PD-L1. La FIG. 20C muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23, ARNm que codifica IL-36-gamma y ARNm que codifica OX40L). La FIG. 20D muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23, ARNm que codifica IL-36-gamma y ARNm que codifica OX40L) más el anticuerpo anti-PD-L1.
Las FIG. 21A y FIG. 21B muestran una respuesta inmune de memoria en animales tratados con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma). Los animales se trataron inicialmente con 5 ug de ARNm total (2,5 ug de ARNm que codifica IL-23 y 2,5 ug de ARNm que codifica IL-36-gamma) administrados por vía intratumoral Q7D. Diez animales identificados como respondedores completos (CR) se volvieron a pulsar con células tumorales MC38-S. La FIG. 21A muestra el crecimiento tumoral en animales sin estimular pulsados con células tumorales MC38-S. La FIG. 21B muestra el crecimiento tumoral en los diez animales CR pulsados de nuevo con células tumorales MC38-S.
Las FIG. 22A y FIG. 22B muestran un aumento en los granulocitos Ly6G+ en respuesta al tratamiento de tumores MC38 con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma). La FIG. 22A muestra el nivel de granulocitos como porcentaje de células CD45+ 24 horas, 72 horas, 7 días y 14 días después del tratamiento. La FIG. 22B muestra el nivel de granulocitos como granulocitos por mg de tumor 24 horas, 72 horas, 7 días y 14 días después del tratamiento. Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("NoRx" y "NST"), monoterapias con IL-23 e IL-36-gamma ("IL23" e "IL36") y terapia de combinación con doblete de ARNm ("Combo", correspondiente a ratones que recibieron una sola dosis de la terapia de combinación, y "Combo 2 dosis" correspondiente a los ratones que recibieron dos dosis de la terapia de combinación). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
La FIG. 23 muestra un aumento en los granulocitos Ly6G+ como porcentaje de células CD45+ 24 horas, 72 horas y 7 días después del tratamiento de tumores MC38 con terapia de combinación de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 24A y FIG. 24B muestran un aumento en las células dendríticas (DC) CD103+ en respuesta al tratamiento de tumores MC38 con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma). La FIG. 24A muestra el nivel de células dendríticas CD103+ como porcentaje de células CD45+ 7 días después del tratamiento. La FIG. 24B muestra el nivel de células dendríticas CD103+ como células dendríticas CD103+ por mg de tumor 7 días después del tratamiento. Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("NoRx" y "NST"), monoterapias con IL-23 e IL-36-gamma ("IL23" e "IL36") y terapia de combinación con doblete de ARNm ("Combo"). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 25A y FIG. 25B muestran un aumento en las células dendríticas (DC) CD103+ en respuesta al tratamiento de tumores MC38 con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma) o terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). La FIG. 25A muestra el nivel de células dendríticas CD103+ como células CD8+ por mg de tumor 7 días después del tratamiento. La FIG. 25B muestra el nivel de células dendríticas CD8+ en el ganglio linfático de drenaje del tumor (TdLN) 7 días después del tratamiento. Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("Sin estimular" y "NST"), monoterapia con OX40L ("OX40L") y terapias de combinación de doblete y triplete de ARNm ("Doblete" y "Triplete", respectivamente). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 26A-26D muestran un aumento en las células dendríticas CD11 b+ en tumores MC38 y ganglio linfático de drenaje en respuesta al tratamiento con terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). La FIG. 26A muestra el nivel de células cDC2 CD11+ como células por mg de tumor 7 días después del tratamiento. La FIG. 26B muestra el nivel de células dendríticas cDC2 CD11+ en el ganglio linfático de drenaje del tumor (TdLN) 7 días después del tratamiento. La FIG. 26C muestra la activación de CD86 en cDC2 CD11b+ en el ganglio linfático de drenaje 24 h y 72 h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm medida como porcentaje de células cDC2 CD24. La FIG. 26D muestra la activación de CD86 en cDC2 CD11b+ en el ganglio linfático de drenaje 24h y 72h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm medida como intensidad de fluorescencia media (MFI). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 27A y FIG. 27B muestran la activación de CD86 en cDC1 CD8 en el ganglio linfático de drenaje 24h y 72h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm a tumores MC38 medida como porcentaje de células cDC1 CD8 (FIG. 27A) o como intensidad de fluorescencia media (MFI) (FIG. 27B). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 28A-28D muestran un aumento en las células dendríticas inflamatorias (iDC) en tumores MC38 y ganglios linfáticos de drenaje en respuesta al tratamiento con la terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). La FIG. 28A muestra el nivel de iDC en el tumor como células por mg de tumor 7 días después del tratamiento. La FIG. 28B muestra el nivel de iDC en el ganglio linfático de drenaje tumoral (TdLN) 7 días después del tratamiento. La FIG. 28C muestra la activación de CD86 en iDC en el ganglio linfático de drenaje 24h y 72h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm medida como porcentaje de iDC. La FIG. 28D muestra la activación de CD86 en iDC en el ganglio linfático de drenaje 24h y 72h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm medida como intensidad de fluorescencia media (MFI). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
La FIG. 29 muestra un aumento en la relación de células T CD8 efectoras (asesinas) a células T reguladoras (Treg) en respuesta al tratamiento de tumores MC38 con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma) y terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). Las mediciones se tomaron 72 horas y 7 días después del tratamiento. Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("NST"), monoterapia con OX40L ("OX40L") y terapias de combinación de doblete y triplete de ARNm ("Doblete" y "Triplete", respectivamente). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 30A y FIG. 30B muestran un aumento en las células CD4 y CD8 centrales y efectoras en respuesta al tratamiento de tumores MC38 con terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma) o terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). La FIG. 30A muestra el nivel de células CD4 como células CD4 por mg de tumor 7 días y 10 días después del tratamiento. La FIG. 30B muestra el nivel de células CD8 como células CD8 por mg de tumor 7 días y 10 días después del tratamiento. Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles (“NST"), monoterapia con OX40L ("OX40L") y terapias de combinación de doblete y triplete de ARNm ("Doblete" y "Triplete", respectivamente). Las barras muestran los niveles de células CD4 y CD8 sin estimular, centrales de memoria y efectoras de memoria.
La FIG. 31 presenta curvas de supervivencia que muestran el efecto de la depleción de las células CD sobre la eficacia del tratamiento de tumores MC38 con terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). Los niveles de células CD4 y CD8 se deplecionaron mediante la administración de anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 a ratones con tumores MC38. La flecha indica la administración de la terapia de triplete. Se administraron dosis de anticuerpos que deplecionaban las células CD (indicadas por círculos) antes y después de la administración de la terapia de triplete.
Las FIG. 32A y 32B muestran la expresión de PD-L1 en células cancerosas de ratones con tumores MC38 en respuesta a la administración de terapia de triplete de ARNm. La FIG. 32A muestra el porcentaje de células cancerosas (CD45-, FSchi, MHCII-) positivas para PD-L1 7 días después del tratamiento con terapia de triplete de ARNm. La FIG. 32B muestra el nivel de expresión de PD-L1 en células cancerosas (CD45-, FSchi, MHCII-) medido como MFI (intensidad de fluorescencia media). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística.
Las FIG. 33A y FIG. 33B muestran la expresión de PD-L1 en ratones con tumores MC38 en respuesta a la administración de monoterapias con IL-23 o IL-36-gamma o terapia de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma). La FIG. 33A muestra el porcentaje de células CD11b+ positivas para PD-L1. La FIG. 33B muestra la fuerza de la expresión de PD-L1 en células CD11b+, medida como MFI (intensidad de fluorescencia media). Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("NoRx" y "NST"), monoterapias con IL-23 e IL-36-gamma ("IL23" e "IL36") y terapia de combinación de doblete de ARNm ("Combo"). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística. Todas las mediciones se realizaron 7 días después de que se implantaran las células tumorales.
Las FIG. 34A y FIG. 34B muestran la expresión de PD-L1 en ratones con tumores MC38 en respuesta a la administración de monoterapia con OX40L o terapias de doblete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma) o de triplete (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L). La FIG. 34A muestra el porcentaje de células CD11b+ positivas para PD-L1. La FIG. 34B muestra la fuerza de la expresión de PD-L1 en células CD11b+, medida como MFI (intensidad de fluorescencia media). Las mediciones presentadas corresponden al tratamiento con controles ("NoRx"), monoterapia con OX40L ("OX40L") y terapias de combinación de doblete y triplete de ARNm ("doblete" y "triplete", respectivamente). Las barras verticales representan la media con S.D. Las barras horizontales sobre los datos representan la significancia estadística. Todas las mediciones se realizaron 7 días después de que se implantaran las células tumorales.
Las FIG. 35A-35D muestran la eficacia antitumoral in vivo de la terapia de triplete de ARNm combinada con un anticuerpo anti-PD-LI (10F.9G2) en tumores MC38 inmunosupresores. La FIG. 35A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de anticuerpo de control. La FIG. 35B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de anticuerpo anti-PD-L1 (10F.9G2) solo. La FIG. 35C muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de terapia de triplete de ARNm. La FIG. 35D muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de terapia de triplete de ARNm más anticuerpo anti-PD-L1 (10F.9G2). Las líneas punteadas verticales indican el día de la administración del anticuerpo de control, el anticuerpo anti PD-L1, la terapia de triplete de ARNm o la terapia de triplete de ARNm más anticuerpo anti PD-L1.
Las FIG. 36A y FIG. 36B muestran la eficacia antitumoral in vivo de la terapia de combinación de triplete de ARNm (ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica OX40L) en el modelo singénico H22 (carcinoma hepatocelular (HCC)). La FIG. 36A muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de ARNm de control. ("NST_FIX"). La FIG. 36B muestra el crecimiento tumoral en animales tratados con inyecciones intratumorales de terapia de combinación de triplete de ARNm.
La FIG. 37 muestra el volumen tumoral medio (mm3) para cada grupo de ratones tratados según el diseño descrito en la Tabla 11. Las flechas punteadas muestran la falta de eficacia de OX40L administrado en el Grupo 8 y el efecto sinérgico de la combinación de OX40L con IL-23 en el Grupo 5.
La FIG. 38A muestra el volumen tumoral medio (mm3) para grupos de ratones tratados con combinaciones de tripletes que comprenden OX40L de ratón, IL-23 de ratón e IL-36-gamma de ratón. Se usaron diferentes cantidades de ARNm que codifica IL-36-gamma de ratón en cada triplete. La cantidad total de ARNm en cada dosis de triplete se mantuvo constante añadiendo la cantidad apropiada de ARNm de control NST.
La FIG. 38B muestra el volumen tumoral medio (mm3) para grupos de ratones tratados con combinaciones de tripletes que comprenden OX40L de ratón, IL-23 de ratón e IL-36-gamma humana. Se usaron diferentes cantidades de ARNm que codifica IL-36-gamma humana en cada triplete. La cantidad total de ARNm en cada dosis de triplete se mantuvo constante añadiendo la cantidad apropiada de ARNm de control NST.
Las FIG. 39A-39O muestran el volumen tumoral medio (mm3) para cada grupo de ratones tratados según el diseño del estudio descrito en la Tabla 11. Las fechas en las que se administraron los ARNm se indican mediante líneas punteadas verticales. Cada dibujo indica el número de animales por grupo (n), el número de respondedores completos (CR) y el número de animales con tumores con un volumen por debajo de 100 mm3 al final del estudio. Cada dibujo también indica la composición administrada a cada animal y la relación entre cada ARNm en la composición.
La FIG. 40 muestra los cambios en el peso corporal (%) para cada grupo de ratones tratados según el diseño del estudio descrito en la Tabla 11. El dibujo muestra los valores de peso corporal medio para cada grupo.
Las FIG. 41A-41O muestran los cambios en el peso corporal (%) para cada grupo de ratones tratados según el diseño del estudio descrito en la Tabla 11. El dibujo muestra los cambios individuales en los valores de peso corporal para cada animal en cada grupo.
La FIG. 42 presenta curvas de supervivencia que muestran el efecto del tratamiento de tumores MC38 según el diseño descrito en la Tabla 11. Las flechas punteadas muestran (i) la falta de eficacia de OX40L administrado en el Grupo 8, (ii) la eficacia moderada de IL-23 en el Grupo 9, (iii) el efecto sinérgico de la combinación de OX40L con IL-23 en el Grupo 5, y (iv) la mayor eficacia observada, que correspondió al Grupo 1 (mOX40L/mIL-23/mIL-36-gamma 1:1:1).
La FIG. 43A muestra el volumen tumoral medio (mm3) para ratones que portan tumores MC38-S y tratados con combinaciones de tripletes que comprenden IL-23, IL-36-gamma y OX40L.
La FIG. 43B muestra el volumen tumoral medio (mm3) para ratones que portan tumores MC38-S y tratados con combinaciones de dobletes que comprenden IL-23 y OX40L. La cantidad total de ARNm en la dosis, en comparación con los ratones tratados como en la FIG. 43A, se mantuvo constante añadiendo la cantidad apropiada de ARNm de control NST.
La FIG. 44 es un diagrama que ilustra el efecto abscopal para el tratamiento del cáncer.
Descripción detallada
Un enfoque particularmente emocionante para el tratamiento del cáncer implica la prevención o el tratamiento de la enfermedad con sustancias que estimulan la respuesta inmune, lo que se conoce como inmunoterapia. La inmunoterapia, también conocida en la técnica como inmunooncología, ha comenzado a revolucionar el tratamiento del cáncer al introducir terapias que no se dirigen al tumor, sino al sistema inmune del huésped.
Estas terapias poseen perfiles de respuesta farmacológica únicos y, por lo tanto, representan terapias que podrían curar muchos tipos distintos de cáncer. Los cánceres de pulmón, riñón, vejiga y piel se encuentran entre los que obtienen una eficacia sustancial del tratamiento con inmunooncología en términos de supervivencia o respuesta tumoral, siendo el melanoma posiblemente el que muestra los mayores beneficios. La inmunoterapia a menudo presenta un tratamiento con inhibidores de puntos de control con una clase nueva y emocionante de fármacos biológicos conocidos como anticuerpos inhibidores de puntos de control.
La presente divulgación presenta métodos y composiciones para tratar el cáncer, en particular, métodos y composiciones inmunoterapéuticos. En algunos aspectos, la divulgación presenta métodos y composiciones para tratar el cáncer usando una terapia de combinación que presenta dos o más polinucleótidos (p. ej., ARNm) que codifican un primer polipéptido cebador de la respuesta inmune y un segundo polipéptido, diferente, cebador de la respuesta inmune y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido inhibidor de puntos de control o un polipéptido que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control. En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-23 (IL-23), un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-36 gamma (IL-36 gamma) y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L. En otros aspectos, la divulgación proporciona una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que codifica un polipéptido Interleuquina-18 (IL-18) y, opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a métodos para tratar el cáncer utilizando un enfoque de combinación que presenta ARNm que codifican IL-23, IL-36 o IL-18 y/u OX40L. Sin estar ligado a la teoría, se cree que el cebado de una respuesta inmune anticancerosa es posible mediante la administración, p. ej., por vía intratumoral, de ARNm que codifican un miembro de la familia IL-12 (p. ej., IL-23) y/o un miembro de la familia IL-1 (p. ej., IL-36 o IL-18). La IL-23 es importante en la estimulación, por ejemplo, de células T, células asesinas naturales, macrófagos y/o células dendríticas. La IL-36 es importante en la estimulación, por ejemplo, de células T, células asesinas naturales, granulocitos y/o células dendríticas. La IL-18, junto con la IL-12, induce inmunidad mediada por células y es importante en la estimulación, por ejemplo, de células T, células asesinas naturales, y/o macrófagos Se cree que el ARNm que codifica IL-36, o el ARNm que codifica IL-18, en combinación con el ARNm que codifica IL-23 proporciona una primera señal de estimulación al sistema inmune, por ejemplo, dentro del entorno tumoral, p. ej., a través de la inyección intratumoral de dichos ARNm. Se cree que la administración de ARNm que codifica un polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune, por ejemplo, OX40L, proporciona una segunda señal de estimulación, cuando se proporciona en combinación con ARNm que codifican IL-23 e IL-36, debido, al menos en parte, a la capacidad de OX40L de estimular las células T.
En algunos aspectos, los métodos inmunoterapéuticos divulgados en la presente memoria pueden (1) transformar el microentorno tumoral (TME) para optimizar la inmunogenicidad, y/o (2) potenciar las respuestas de las células T para incitar el control abscopal y la memoria anticancerosa. El efecto abscopal, es decir, tratar un tumor localmente, pero actuando globalmente, se ilustra en la FIG. 44.
Algunos aspectos de la divulgación incluyen el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 en combinación con ARNm que codifica IL-36. Otros aspectos de la divulgación presentan el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 en combinación con ARNm que codifica IL-18. Los aspectos ilustrativos incluyen el tratamiento con ARNm encapsulados en nanopartículas lipídicas (LNP-). Los aspectos ilustrativos incluyen la administración intratumoral de ARNm en LNP basadas en aminolípidos ionizables.
Otros aspectos de la divulgación presentan composiciones y métodos para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una combinación que comprende ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma o IL-18, y OX40L. En algunos aspectos, la combinación de ARNm comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L. Un aspecto de la presente divulgación está dirigido a composiciones farmacéuticas que comprenden dos o más polinucleótidos (p. ej., ARNm) que codifican un polipéptido IL-23, un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido OX40L.
En otro aspecto, la composición es una composición lipídica que comprende un aminolípido ionizable, tal como un compuesto de fórmula (I) como se divulga a continuación, p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48. En algunos aspectos de la presente divulgación, la composición lipídica de la composición farmacéutica comprende lípidos/componentes adicionales. Por ejemplo, la composición lipídica puede incluir uno o más fosfolípidos, p. ej., MSPC o DSPC. La composición lipídica también puede comprender un compuesto de amina cuaternaria tal como DOTAP.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una composición lipídica (p. ej., una nanopartícula lipídica (LNP)) que comprende: (1) un compuesto que tiene la fórmula (I); (2) opcionalmente, un lípido auxiliar (p. ej., un fosfolípido); (3) opcionalmente, un lípido estructural (p. ej., un esterol); (4) opcionalmente, un conjugado lipídico (p. ej., un PEG-lípido); y (5) opcionalmente, un compuesto de amina cuaternaria.
Los encabezados proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o aspectos de la divulgación, que pueden estar definidos por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad. Antes de describir la presente divulgación con detalle, debe entenderse que esta divulgación no se limita a las composiciones o etapas de proceso específicas, ya que estas variar.
I. Definiciones
Con el fin de que la presente divulgación se pueda entender más fácilmente, primero se definen determinados términos. Tal y como se usa en esta solicitud, excepto que se proporcione expresamente lo contrario en la presente memoria, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se muestra a continuación. Se muestran definiciones adicionales a lo largo de la solicitud.
La divulgación incluye aspectos en los que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o de otro modo es relevante para un producto o proceso dado. La divulgación incluye aspectos en los que más de uno, o todos los miembros del grupo, están presentes en, se emplean en, o de otro modo son relevantes para un producto o proceso dado.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos "un" (o "una"), así como los términos "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en la presente memoria. En determinados aspectos, el término "un" o "una" significa "único". En otros aspectos, el término "un" o "una" incluye "dos o más" o "múltiples".
Además, "y/o", cuando se usa en la presente memoria, se debe tomar como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes específicos con o sin el otro. Por lo tanto, se pretende que el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en la presente memoria, incluya "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; el Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.
Donde sea que se describan aspectos en la presente memoria con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el rango. Cuando se menciona un rango de valores, debe entenderse que cada valor entero intermedio, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior indicados de ese rango también se divulga específicamente, junto con cada subrango entre dichos valores. Los límites superior e inferior de cualquier rango pueden incluirse o excluirse independientemente del rango, y cada rango en el que se incluyen uno, ninguno o ambos límites también se incluye dentro de la divulgación. Cuando se menciona explícitamente un valor, debe entenderse que los valores que son aproximadamente de la misma cantidad o magnitud que el valor indicado también están en el alcance de la divulgación. Cuando se divulga una combinación, cada subcombinación de los elementos de esa combinación también se divulga específicamente y está en el alcance de la divulgación. Por el contrario, cuando se divulgan individualmente diferentes elementos o grupos de elementos, también se divulgan las combinaciones de los mismos. Cuando cualquier elemento de una divulgación se divulga como que tiene una pluralidad de alternativas, también se divulgan por el presente los ejemplos de esa divulgación en los que cada alternativa se excluye individualmente o en cualquier combinación con las otras alternativas; más de un elemento de una divulgación puede tener tales exclusiones, y por el presente se divulgan todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones.
Se hace referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de letra única comúnmente aceptados. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'. Se hace referencia a los nucleótidos en la presente memoria por sus símbolos de una letra conocidos comúnmente, recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Por consiguiente, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina y U representa uracilo.
Se hace referencia a los aminoácidos en la presente memoria por sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi.
Aproximadamente: El término "aproximadamente", como se usa en relación con un valor numérico a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, indica un intervalo de precisión, familiar y aceptable para un experto en la técnica. En general, dicho intervalo de precisión es de ± 10 %.
Cuando se proporcionan rangos, se incluyen los puntos finales. Además, a menos que se indique lo contrario 0 resulte evidente de otra manera a partir del contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor específico o subrango dentro de los rangos establecidos en diferentes aspectos de la divulgación, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del rango, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Administrado en combinación: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administrado en combinación" o "administración combinada" o "terapia de combinación" significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o en un intervalo tal que puede haber una superposición de un efecto de cada agente en el paciente. En algunos aspectos, se administran en aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 o 1 minuto entre sí. En algunos aspectos, las administraciones de los agentes se espacian lo suficientemente cerca unas de otras para que se logre un efecto combinatorio (p. ej., sinérgico).
Sustitución de aminoácidos: El término "sustitución de aminoácidos" se refiere a reemplazar un residuo de aminoácido presente en una secuencia de referencia parental (p. ej., una secuencia de tipo salvaje) con otro residuo de aminoácido. Un aminoácido puede sustituirse en una secuencia parental o de referencia (p. ej., una secuencia polipeptídica de tipo salvaje), por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o mediante procedimientos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, una referencia a una "sustitución en la posición X" se refiere a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X con un residuo de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir según el esquema AnY, en donde A es el código de una letra correspondiente al aminoácido presente naturalmente u originalmente en la posición n e Y es el residuo de aminoácido sustituyente. En otros aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir según el esquema An(YZ), en donde A es el código de una letra correspondiente al residuo de aminoácido que sustituye al aminoácido presente naturalmente u originalmente en la posición X e Y y Z son el residuo de aminoácido sustituyente alternativo.
En el contexto de la presente divulgación, las sustituciones (incluso cuando se refieren como sustitución de aminoácidos) se realizan a nivel de ácido nucleico, es decir, la sustitución de un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido alternativo se realiza sustituyendo el codón que codifica el primer aminoácido con un codón que codifica el segundo aminoácido.
Animal: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunos aspectos, "animal" se refiere a seres humanos en cualquier estadio del desarrollo. En algunos aspectos, "animal" se refiere a animales no humanos en cualquier estadio del desarrollo. En determinados aspectos, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunos aspectos, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunos aspectos, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.
Aproximadamente: Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión “aproximadamente” según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinados aspectos, el término "aproximadamente" se refiere a un rango de valores que se encuentra dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia establecido, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente de otro modo a partir del contexto (salvo que dicho número exceda el 100 % de un valor posible).
Asociado con: Tal y como se usa en la presente memoria con respecto a una enfermedad, el término "asociado con" significa que el síntoma, medición, característica o estado en cuestión está vinculado al diagnóstico, desarrollo, presencia o progresión de esa enfermedad. Como asociación puede, pero no necesariamente, estar ligada causalmente a la enfermedad.
Cuando se usan con respecto a dos o más restos, los términos “asociado con”, “conjugado”, “ligado”, “unido” y “vinculado”, cuando se usan respecto a dos o más restos, significan que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, bien directamente o a través de uno o más restos adicionales que sirven como un agente de unión, para formar una estructura que es lo suficientemente estable como para que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, p. ej., condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente mediante un enlace químico covalente directo. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de modo que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.
Biocompatible: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "biocompatible" significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por el sistema inmune.
Biodegradable: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "biodegradable" significa que puede ser degradado en productos inocuos por la acción de los seres vivos.
Optimización de Secuencias: El término "optimización de secuencias" se refiere a un proceso o una serie de procesos mediante los cuales las nucleobases en una secuencia de ácido nucleico de referencia se reemplazan con nucleobases alternativas, lo que da como resultado una secuencia de ácido nucleico con propiedades mejoradas, p. ej., expresión de proteínas mejorada o inmunogenicidad disminuida.
En general, el objetivo de la optimización de secuencias es producir una secuencia de nucleótidos sinónima que codifique la misma secuencia polipeptídica codificada por la secuencia de nucleótidos de referencia. Por lo tanto, no hay sustituciones de aminoácidos (como resultado de la optimización de codones) en el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos con codones optimizados con respecto al polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia.
Sustitución de codones: Los términos "sustitución de codones" o "reemplazo de codones" en el contexto de la optimización de secuencias se refieren a reemplazar un codón presente en una secuencia de ácido nucleico de referencia con otro codón. Un codón puede sustituirse en una secuencia de ácido nucleico de referencia, por ejemplo, mediante síntesis química de péptidos o mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, las referencias a una "sustitución" o "reemplazo" en una determinada localización en una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un ARNm) o en una determinada región o subsecuencia de una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un ARNm) se refieren a la sustitución de un codón en dicha localización o región con un codón alternativo.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "región codificante" y "región que codifica" y variantes gramaticales de los mismos, se refieren a un marco de lectura abierto (ORF) en un polinucleótido que tras la expresión produce un polipéptido o proteína.
Compuesto: Tal y como se usa en la presente memoria, el término “compuesto”, pretende incluir todos los estereoisómeros e isótopos de la estructura representada. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "estereoisómero" significa cualquier isómero geométrico (p. ej., isómero cis y trans), enantiómero o diastereómero de un compuesto. La presente divulgación abarca cualquiera y todos los estereoisómeros de los compuestos descritos en la presente memoria, incluyendo las formas estereoméricamente puras (p. ej., geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) y las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, p. ej., racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoméricas de compuestos y los medios para resolverlas en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes son bien conocidas. "Isótopos" se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números másicos resultantes de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos del hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Además, un compuesto, sal, o complejo de la presente divulgación puede prepararse en combinación con moléculas de solvente o agua para formar solvatos e hidratos mediante métodos rutinarios.
Sustitución conservativa de aminoácidos: Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina o histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico o ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina o cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina o triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano o histidina). Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, la sustitución del aminoácido se considera conservativa. En otro aspecto, una cadena de aminoácidos se puede reemplazar de forma conservativa con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de la cadena lateral.
Las sustituciones no conservativas de aminoácidos incluyen aquellas en las que (i) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (p. ej., Arg, His o Lys) se sustituye con, o por, un residuo electronegativo (p. ej., Glu o Asp), (ii) un residuo hidrófilo (p. ej., Ser o Thr) se sustituye con, o por, un residuo hidrófobo (p. ej., Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una cisteína o prolina se sustituye con, o por, cualquier otro residuo, o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral hidrófoba o aromática voluminosa (p. ej., Val, His, Ile o Trp) se sustituye con, o por, uno que tiene una cadena lateral más pequeña (p. ej., Ala o Ser) o no tiene ninguna cadena lateral (p. ej., Gly).
Los trabajadores expertos en la técnica pueden identificar fácilmente otras sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, puede tomarse una sustitución de una cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, un reemplazo puede ser una cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. En general, las sustituciones en regiones funcionalmente importantes de las que se puede esperar que induzcan cambios en las propiedades de los polipéptidos aislados son aquellas en las que (i) un residuo polar, p. ej., serina o treonina, se sustituye con (o por) un residuo hidrófobo, p. ej., leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína se sustituye con (o por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisina, arginina o histidina, se sustituye con (o por) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, p. ej., ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, se sustituye con (o por) uno que no tiene dicha cadena lateral, p. ej., glicina. La probabilidad de que una de las sustituciones no conservativas anteriores pueda alterar las propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la sustitución con respecto a las regiones funcionalmente importantes de la proteína: algunas sustituciones no conservativas pueden, en consecuencia, tener poco o ningún efecto sobre las propiedades biológicas.
Conservado: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conservado" se refiere a residuos de nucleótidos o de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son los que se aparecen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre secuencias más relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.
En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos un 70 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 90 % idénticas o al menos un 95 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos un 30 % idénticas, al menos un 40 % idénticas, al menos un 50 % idénticas, al menos un 60 % idénticas, al menos un 70 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 90 % idénticas, o al menos un 95 % idénticas entre sí. En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30 % idénticas, aproximadamente un 40 % idénticas, aproximadamente un 50 % idénticas, aproximadamente un 60 % idénticas, aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 % idénticas, aproximadamente un 98 % idénticas, o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un polinucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica de la misma.
Poner en contacto: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "poner en contacto" significa establecer una conexión física entre dos o más entidades. Por ejemplo, poner en contacto una célula de mamífero con una composición de nanopartículas significa que la célula de mamífero y una nanopartícula están hechas para compartir una conexión física. Los métodos para poner en contacto células con entidades externas tanto in vivo como ex vivo son bien conocidos en las técnicas biológicas. Por ejemplo, el contacto de una composición de nanopartículas y una célula de mamífero dispuesta dentro de un mamífero puede realizarse por varias vías de administración (p. ej., intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea) y puede implicar cantidades variadas de composiciones de nanopartículas. Además, más de una célula de mamífero puede ponerse en contacto con una composición de nanopartículas.
Liberación Controlada: Tal y como se usa en la presente memoria, el término “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para lograr un resultado terapéutico.
Derivado Covalente: El término "derivado covalente" cuando se refiere a polipéptidos, incluyen modificaciones de una proteína natural o de partida con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo orgánico, y/o modificaciones posteriores a la traducción. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente mediante la reacción de residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con residuos terminales o cadenas laterales seleccionadas, o mediante mecanismos de aprovechamiento de modificaciones posteriores a la traducción que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para verificar la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de anticuerpos anti-proteína para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Dichas modificaciones se encuentran dentro del conocimiento de la técnica y se llevan a cabo sin experimentación innecesaria.
Cíclico o Ciclado: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, solo estar unidas para formar una cadena ininterrumpida de subunidades. Las moléculas cíclicas tales como el ARN o ARNm modificado por ingeniería genética de la presente divulgación pueden ser unidades únicas o multímeros o comprender uno o más componentes de una estructura compleja o de orden superior.
Citotóxico: Tal y como se usa en la presente memoria, "citotóxico" se refiere a matar o causar un efecto nocivo, tóxico o mortal en una célula (p. ej., una célula de mamífero (p. ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prion, o una combinación de los mismos.
Administrar: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administrar" significa proporcionar una entidad a un destino. Por ejemplo, la administración de un polinucleótido a un sujeto puede implicar la administración de una composición de nanopartículas que incluye el polinucleótido al sujeto (p. ej., por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea). La administración de una composición de nanopartículas a un mamífero o célula de mamífero puede implicar poner en contacto una o más células con la composición de nanopartículas.
Agente de Administración: Tal y como se usa en la presente memoria, "agente de administración" se refiere a cualquier sustancia que facilita, al menos en parte, la administración in vivo, in vitro o ex vivo de un polinucleótido a células diana.
Desestabilizado: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "desestabilizado", "desestabilizar" o "región desestabilizadora" significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo salvaje o nativa de la misma región o molécula.
Etiqueta detectable: Tal y como se usa en la presente memoria, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia y similares. Las etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Las etiquetas detectables pueden estar localizadas en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritos en la presente memoria. Pueden estar en los aminoácidos, los péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N o C.
Diastereómero: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diastereómero", significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no se pueden superponer entre sí.
Digerir: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "digerir" significa romper en piezas o componentes más pequeños. Cuando se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.
Distal: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.
Dominio: Tal y como se usa en la presente memoria, cuando hace referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un resto de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (p. ej., capacidad de unión, servir como sitio para interacciones proteína-proteína).
Régimen de dosificación: Tal y como se usa en la presente memoria, un "régimen de dosificación" o un "régimen de dosificación" es un programa de administración o régimen de tratamiento, profilaxis o cuidados paliativos determinado por el médico.
Cantidad Efectiva: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cantidad efectiva" de un agente es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto donde se esté aplicando. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata un tumor, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o para inhibir el crecimiento de un tumor, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente. El término "cantidad efectiva" se puede usar de manera intercambiable con "dosis efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva".
Enantiómero: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "enantiómero" significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la divulgación, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (según se determina mediante métodos estándar en la técnica) de al menos un 80 % (es decir, al menos un 90 % de un enantiómero y como máximo un 10 % del otro enantiómero), al menos un 90 % o al menos un 98 %.
Encapsular: Tal como se usa en la presente memoria, el término "encapsular" significa recubrir, encerrar o rodear.
Eficiencia de Encapsulación: Tal y como se usa en la presente memoria, "eficiencia de encapsulación" se refiere a la cantidad de un polinucleótido que se convierte en parte de una composición de nanopartículas, en relación con la cantidad total inicial de polinucleótido utilizada en la preparación de una composición de nanopartículas. Por ejemplo, si se encapsulan 97 mg de polinucleótido en una composición de nanopartículas de un total de 100 mg de polinucleótido proporcionado inicialmente a la composición, la eficiencia de encapsulación se puede dar como el 97 %. Tal y como se usa en la presente memoria, "encapsulación" puede referirse a un encierro, confinamiento, recubrimiento o cerramiento completo, sustancial o parcial.
Señal de escisión de proteína codificada: Tal y como se usa en la presente memoria, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteínas.
Modificado por Ingeniería: Tal y como se usa en la presente memoria, los aspectos de la divulgación están "modificados por ingeniería" cuando se diseñan para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía respecto a una molécula de partida, de tipo salvaje o nativa.
Administración Potenciada: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administración potenciada" significa la administración de más (p. ej., al menos 1,5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido diana de interés (p. ej., hígado de mamífero) en comparación con el nivel de administración de un polinucleótido por una nanopartícula de control a un tejido diana de interés (p. ej., MC3, KC2 o DLinDMA). El nivel de administración de una nanopartícula a un tejido en particular puede medirse comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con la cantidad de proteína total en dicho tejido, o comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con la cantidad de polinucleótido total en dicho tejido. Se entenderá que la administración potenciada de una nanopartícula a un tejido diana no necesita determinarse en un sujeto que se está tratando, puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (p. ej., un modelo de rata).
Exosoma: Tal y como se usa en la presente memoria, "exosoma" es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo implicado en la degradación del ARN.
Expresión: Tal y como se usa en la presente memoria, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un molde de ARN a partir de una secuencia de ADN (p. ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (p. ej., mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza en 5' y/o procesamiento del extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación posterior a la traducción de un polipéptido o proteína.
Ex vivo: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ex vivo" se refiere a eventos que ocurren fuera de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo). Los eventos ex vivo pueden tener lugar en un entorno mínimamente alterado de un entorno natural (p. ej., in vivo).
Característica: Tal y como se usa en la presente memoria, una “característica” se refiere a una característica, una propiedad, o un elemento distintivo. Las "características", cuando se hace referencia a polipéptidos, están definidas como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos de una molécula. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen manifestaciones en la superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.
Formulación: Tal y como se usa en la presente memoria, una "formulación" incluye al menos un polinucleótido y uno o más de un vehículo, un excipiente y un agente de administración.
Fragmento: Un "fragmento", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas. En algunos aspectos, un fragmento es una subsecuencia de una proteína de longitud completa (p. ej., una de las subunidades de IL-23) en donde se han delecionado las subsecuencias N-terminales, y/o C-terminales, y/o internas. En algunos aspectos preferidos de la presente divulgación, los fragmentos de una proteína de la presente divulgación son fragmentos funcionales.
Funcional: Tal y como se usa en la presente memoria, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que presenta una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza. Por lo tanto, un fragmento funcional de un polinucleótido de la presente divulgación es un polinucleótido capaz de expresar un fragmento de interleuquina funcional. Tal y como se usa en la presente memoria, un fragmento funcional de una interleuquina se refiere a un fragmento de una interleuquina de tipo salvaje (es decir, un fragmento de una forma natural de la interleuquina), o un mutante o variante de la misma, en donde el fragmento retiene al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de la actividad biológica de la correspondiente proteína de longitud completa.
Lípido Auxiliar: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "lípido auxiliar" se refiere a un compuesto o molécula que incluye un resto lipídico (para la inserción en una capa lipídica, p. ej., bicapa lipídica) y un resto polar (para la interacción con la solución fisiológica en la superficie de la capa lipídica). Típicamente, el lípido auxiliar es un fosfolípido. Una función del lípido auxiliar es "complementar" el aminolípido y aumentar la fusogenicidad de la bicapa y/o ayudar a facilitar el escape endosomal, p. ej., del ácido nucleico administrado a las células. También se cree que los lípidos auxiliares son un componente estructural clave para la superficie de la LNP.
Homología: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "homología" se refiere a la relación global entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. Generalmente, el término "homología" implica una relación evolutiva entre dos moléculas. Así, dos moléculas que sean homólogas tendrán un ancestro evolutivo común. En el contexto de la presente divulgación, el término homología abarca tanto la identidad como la similitud.
En algunos aspectos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si al menos el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % de los monómeros en la molécula son idénticos (exactamente el mismo monómero) o son similares (sustituciones conservativas). El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos).
Identidad: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "identidad" se refiere a la conservación global de monómeros entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de polinucleótidos (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para propósitos de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas se pueden descartar para propósitos de comparación). En determinados aspectos, la longitud de una secuencia alineada para propósitos de comparación es al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o el 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Al comparar el ADN y ARN, timina (T) y uracilo (U) pueden considerarse equivalentes.
Los programas de software adecuados se encuentran disponibles en diversas fuentes y para la alineación de secuencias tanto de nucleótidos como de proteínas. Un programa adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es bl2seq, parte del paquete BLAST de programas disponibles en el sitio web b La ST del Centro Nacional para la Información Biotecnológica del gobierno de los EE. UU. (blast.ncbi.nlm.nih.gov). B12seq realiza una comparación entre dos secuencias usando bien el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, p. ej., Needle, Stretcher, Water, o Matcher, parte del paquete EMBOSS de programas de bioinformática y también disponibles en el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
Las alineaciones de secuencias se pueden realizar utilizando métodos conocidos en la técnica, como MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X o Clustal Omega), MUSCLE, etc.
Diferentes regiones dentro de una única secuencia diana de polinucleótidos o polipéptidos que se alinea con una secuencia de referencia de polinucleótidos o polipéptidos pueden tener cada una sus propios porcentajes de identidad de secuencia. Se hace notar que el valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea al décimo más cercano. Por ejemplo, 80,11, 80,12, 80,13 y 80,14 se redondean para abajo a 80,1, mientras que 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 y 80,19 se redondean hacia arriba a 80,2. También se hace notar que el valor de la longitud será siempre un número entero.
En determinados aspectos, se calcula el porcentaje de identidad "%ID" de una primera secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) respecto a una segunda secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) como %ID = 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos aminoácidos (o nucleobases) calificados como concordancias idénticas en la alineación de la primera y segunda secuencias (tal como se alinean mediante inspección visual o un programa de alineación de secuencia particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la de la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto a la primera secuencia.
Un experto en la técnica apreciará que la generación de una alineación de secuencias para el cálculo de un porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones binarias secuencia-secuencia impulsadas exclusivamente por datos de secuencias primarias. También se apreciará que esas alineaciones de secuencias se pueden generar mediante la integración de datos de secuencias con datos de fuentes heterogéneas tales como datos estructurales (p. ej., estructuras de proteínas cristalográficas), datos funcionales (p. ej., localización de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar una alineación de secuencias múltiples es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org y disponible de manera alternativa, p. ej., en el EBI. También se apreciará que la alineación final usada para calcular el porcentaje de identidad de secuencia se puede curar ya se automática o manualmente.
Inhibidor de puntos de control inmunes: Un "inhibidor de puntos de control inmunes" o simplemente "inhibidor de puntos de control" se refiere a una molécula que evita que las células cancerosas desactiven las células inmunes. Tal y como se usa en la presente memoria, el término inhibidor de puntos de control se refiere a polipéptidos (p. ej., anticuerpos) o polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos (p. ej., ARNm) que neutralizan o inhiben moléculas de puntos de control inhibidores, como la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), receptor de muerte programada 1 (PD-1) o ligando 1 de PD-1 (PD-L1).
Respuesta inmune: El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas y complemento) que da lugar a un daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
Señal coestimuladora de la respuesta inmune: El término "señal coestimuladora de la respuesta inmune" se refiere a una molécula inmunoestimuladora que promueve el reclutamiento, proliferación, activación, supervivencia o una combinación de los mismos de células T y/o células NK. En algunos aspectos, la señal coestimuladora de la respuesta inmune es un polipéptido que potencia la expansión, función y formación de memoria de las células T (p. ej., OX40L). En algunos aspectos, la señal coestimuladora promueve el desarrollo de Th1, Th2 y/o Th9, suprime el desarrollo o la actividad de Treg, potencia la expansión y/o supervivencia de células T CD4 y/o CD8 y/o promueve las células de memoria. En aspectos específicos, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste en: OX40L, CD80 e IL-15. En algunos aspectos específicos, el polipéptido señal coestimulador de la respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste en OX40L y CD80.
Cebador de la respuesta inmune: El término "cebador de la respuesta inmune" se refiere a una molécula inmunoestimuladora que potencia la presentación y/o el reconocimiento de antígenos. En algunos aspectos, un cebador de la respuesta inmune es un polipéptido que ceba las células dendríticas, promueve la maduración de las células dendríticas, promueve la producción de citoquinas/quimioquinas de las células presentadoras de antígenos, expande y/o mantiene las células Thl7, potencia la proliferación de células T y/o potencia la diferenciación de Th1 y/o Th9. En algunos aspectos, el cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-12 (p. ej., IL-12, IL-23, subunidad IL-12p40, subunidad IL-23p19, IL-27, IL-35). En otros aspectos, el cebador de la respuesta inmune es un miembro de la familia IL-1 (p. ej., IL-1a, IL-1p, IL-IRa, IL-18, IL-33, IL-36Ra, IL-36a, IL-36p, IL-36y, IL-37, IL-38). En algunos aspectos, el cebador de la respuesta inmune es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: IL-23, subunidad IL-12p40, subunidad IL-23p19, IL-12, IL-36-gamma e IL-18.
Respuesta inflamatoria: "Respuesta inflamatoria" se refiere a respuestas inmunes que implican sistemas de defensa específicos y no específicos. Una reacción específica del sistema de defensa es una reacción específica del sistema inmune frente a un antígeno. Los ejemplos de reacciones específicas del sistema de defensa incluyen respuestas de anticuerpos. Una reacción no específica del sistema de defensa es una respuesta inflamatoria mediada por leucocitos generalmente incapaces de memoria inmunológica, p. ej., macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. En algunos aspectos, una respuesta inmune incluye la secreción de citoquinas inflamatorias, lo que da lugar a niveles elevados de citoquinas inflamatorias.
Citoquinas inflamatorias: El término "citoquina inflamatoria" se refiere a las citoquinas que se elevan en una respuesta inflamatoria. Los ejemplos de citoquinas inflamatorias incluyen interleuquina-6 (IL-6), CXCL1 (ligando de quimioquina (resto C-X-C) 1; también conocido como GROa, interferón-Y (IFNy), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína 10 inducida por interferón y (IP-10) o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). El término citoquinas inflamatorias incluye también otras citoquinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, p. ej., interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-12 (IL-12), interleuquina-13 (IL-13), interferón a (IFN-a), etc.
In Vitro: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p. ej., animal, planta, o microbio).
In Vivo: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).
Variantes de inserción y deleción: Las "variantes de inserción" cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos insertados de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido. Las "variaciones de deleción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida. De manera común, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.
Intacto: Tal y como se usa en la presente memoria, en el contexto de un polipéptido, el término "intacto" significa retener un aminoácido correspondiente a la proteína de tipo salvaje, p. ej., no mutar ni sustituir el aminoácido de tipo salvaje. Por el contrario, en el contexto de un ácido nucleico, el término "intacto" significa retener una nucleobase correspondiente al ácido nucleico de tipo salvaje, p. ej., no mutar ni sustituir la nucleobase de tipo salvaje.
Aminolípido ionizable: El término “aminolípido ionizable” incluye aquellos lípidos que tienen uno, dos, tres o más ácidos grasos o cadenas de alquilos grasos y un grupo de cabeza amino titulable por pH (p. ej., un grupo de cabeza alquilamino o dialquilamino). Un aminolípido ionizable está protonado típicamente (es decir, cargado positivamente) a un pH inferior a la pKa del grupo de cabeza amino y no está sustancialmente cargado a un pH superior a la pKa. Dichos aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a, DLin-MC3-DMA (MC3) y (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1-amina (L608).
In Vitro: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p. ej., animal, planta, o microbio).
In Vivo: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).
Aislado: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aislado" se refiere a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas (p. ej., secuencia de nucleótidos o secuencia de proteínas) pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias a las que estaban asociadas. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o más de los otros componentes con los que estaban inicialmente asociadas. En algunos aspectos, los agentes aislados tienen una pureza de más de aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99 %. Tal y como se usa en la presente memoria, una sustancia es "pura” si carece sustancialmente de otros componentes. El término "sustancialmente aislado" significa que el compuesto está sustancialmente separado del entorno donde se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo.
Un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o cualquier composición divulgada en la presente memoria que está "aislada" es un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o composición que está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta el punto de que ya no están en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, un polinucleótido, vector, polipéptido o composición que está aislado es sustancialmente puro.
Isómero: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "isómero" significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la divulgación. Se reconoce que los compuestos de la divulgación pueden tener uno o más centros quirales y/o enlaces dobles y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de enlace doble (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, isómeros (+) o (-)) o cis/trans). Según la divulgación, las estructuras químicas representadas en la presente memoria, y por lo tanto los compuestos de la divulgación, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (p. ej., geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, p. ej., racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de compuestos de la divulgación pueden resolverse típicamente en sus componentes enantiómeros o estereoisómeros mediante métodos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalización del compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermedios, reactivos y catalizadores estereoméricamente o enantioméricamente puros mediante métodos de síntesis asimétrica bien conocidos.
Conector. Tal y como se usa en la presente memoria, un "conector" se refiere a un grupo de átomos, p. ej., 10­ -1.000 átomos, y puede estar comprendido por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El conector se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga útil, p. ej., un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El conector puede tener una longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El conector se puede usar para cualquier propósito útil, tal como para formar multímeros de polinucleótidos (p. ej., mediante el enlace de dos o más moléculas de polinucleótidos quiméricos o polinucleótidos IVT) o conjugados de polinucleótidos, así como para administrar una carga útil, como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el conector incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente, como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de conectores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (p. ej., unidades monoméricas de etilen o propilenglicol, p. ej., dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y polímeros de dextrano y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles en el conector, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N=N-), que pueden escindirse usando un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitantes de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que se puede escindir, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster puede ser escindido, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.
Métodos de Administración: Tal y como se usa en la presente memoria, los "métodos de administración" pueden incluir métodos intravenosos, intramusculares, intradérmicos, subcutáneos u otros para administrar una composición a un sujeto. Se puede seleccionar un método de administración para dirigir la administración (p. ej., para administrar específicamente) a una región o sistema específico de un cuerpo.
Modificado: Tal y como se usa en la presente memoria, "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiada de una molécula de divulgación. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluyendo química, estructural y funcionalmente. En algunos aspectos, las moléculas de ARNm de la presente divulgación se modifican mediante la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales, p. ej., en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos tales como las estructuras de caperuza no se consideran "modificados" aunque difieren de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.
Composición de Nanopartículas: Tal y como se usa en la presente memoria, una "composición de nanopartículas" es una composición que comprende uno o más lípidos. Las composiciones de nanopartículas suelen tener un tamaño del orden de micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (p. ej., vesículas lipídicas) y lipoplejos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede ser un liposoma que tenga una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.
De origen natural: Tal y como se usa en la presente memoria, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.
Vertebrado no humano: Tal y como se usa en la presente memoria, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto el Homo sapiens, incluyendo las especies salvajes y domesticadas. Los ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, tales como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, venado, perro, burro, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, búfalo de agua, y yak.
Secuencia de ácido nucleico: Los términos "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótidos" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico contigua. La secuencia puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario, p. ej., un ARNm.
El término “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. A menudo, se hace referencia a estos polímeros como polinucleótidos. Los ácidos nucleicos o polinucleótidos ilustrativos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, incluyendo LNA que tienen una configuración p-D-ribo, a-LNA que tiene una configuración a-L-ribo (un diastereómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino y 2'-amino-a-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino) o ácidos nucleicos etilénicos (ENA), ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNa) o híbridos o combinaciones de los mismos.
La frase "secuencia de nucleótidos que codifica" se refiere a la secuencia codificante de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ARNm o ADN) que codifica un polipéptido. La secuencia codificante puede incluir además señales de inicio y terminación unidas operativamente a los elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación que puede dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero al que se le administra el ácido nucleico. La secuencia codificante puede incluir además secuencias que codifican péptidos señal.
Fuera de diana: Tal y como se usa en la presente memoria, "fuera de diana" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una cualquiera o más dianas, genes o transcritos celulares.
Marco de lectura abierto: Tal y como se usa en la presente memoria, "marco de lectura abierto" u "ORF se refiere a una secuencia que no contiene un codón de parada en un marco de lectura dado.
Unido operativamente: Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcritos, entidades, restos o similares.
Sustituido opcionalmente: En la presente memoria, una frase de la forma "X sustituido opcionalmente" (p. ej., alquilo sustituido opcionalmente) pretende ser equivalente a "X, en donde X está sustituido opcionalmente" (p. ej., "alquilo, en donde dicho alquilo está sustituido opcionalmente"). No se pretende que signifique que la característica "X" (p. ej., alquilo) per se sea opcional.
Parte: Tal y como se usa en la presente memoria, una "parte" o "región" de un polinucleótido se define como cualquier porción del polinucleótido que sea menor que la longitud total del polinucleótido.
Paciente: Tal y como se usa en la presente memoria, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, que requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o afección particular.
Farmacéuticamente aceptable: La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
Excipientes farmacéuticamente aceptables: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los compuestos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tenga las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, deslizantes (que mejoran el flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato de sodio, glicolato de almidón sódico, sorbitol, almidón (de maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables: La presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos divulgados en donde se modifica el compuesto parental al convertir un resto básico o ácido existente en su forma de sal (p. ej., haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales de acetato, ácido acético, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, ácido bencenosulfónico, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como también cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, pero no limitado a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto parental formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación se pueden sintetizar a partir del compuesto parental que contiene un resto ácido o básico mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se usan medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (ed.), Wiley-VCH, 2008, y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1­ 19 (1977).
Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal y como se usa en la presente memoria, significa un compuesto de la divulgación en donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina. Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosificación administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono, di y trihidratos), /V-metilpirrolidinona (NMP), dimetil sulfóxido (DMSO), W,W-dimet¡lformam¡da (DMF), W,W-dimet¡lacetam¡da (DmAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo, y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato".
Farmacocinética: Tal y como se usa en la presente memoria, "farmacocinética" se refiere a una cualquiera o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME donde: (A) Absorción es el proceso de una sustancia que entra en la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o Biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; e (E) Excreción (o Eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.
Fisicoquímica: Tal y como se usa en la presente memoria, "fisicoquímica" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.
Polinucleótido: El término "polinudeótido", tal y como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. Este término se refiere a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ácido desoxirribonucleico ("ADN") tri, bi y monocatenario, así como ácido ribonucleico ("ARN") tri, bi y monocatenario. Esto también incluye formas modificadas, por ejemplo, mediante alquilación y/o mediante formación de caperuza, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, el término "polinucleótido" incluye polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonuleótidos (que contienen D-ribosa), incluyendo ARNt, ARNr, ARNh, ARNsi y ARNm, ya sea con corte y empalme o sin corte y empalme, cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- o o C-glucósido de una base de purina o pirimidina y otros polímeros que contienen estructuras principales no nucleotídicas, por ejemplo, poliamida (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos ("PNA") y polímeros de polimorfolino y otros polímeros sintéticos de ácido nucleico específicos de secuencia, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita la formación de emparejamientos de bases y apilamiento de bases, tal como los que se encuentran en el ADN y el ARN. En aspectos particulares, el polinucleótido comprende un ARNm. En otro aspecto, el ARNm es un ARNm sintético. En algunos aspectos, el ARNm sintético comprende al menos una nucleobase no natural. En algunos aspectos, todas las nucleobases de una determinada clase se han reemplazado con nucleobases no naturales (p. ej., todas las uridinas en un polinucleótido divulgado en la presente memoria se pueden reemplazar con una nucleobase no natural, p. ej., 5-metoxiuridina). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., un ARN sintético o un ADN sintético) comprende solo nucleobases naturales, es decir, A, C, T y U en el caso de un ADN sintético, o A, C, T y U en el caso de un ARN sintético.
El experto en la técnica apreciará que las bases T en los mapas de codones divulgados en la presente memoria están presentes en el ADN, mientras que las bases T serían reemplazadas por bases U en los ARN correspondientes. Por ejemplo, una secuencia de codón-nucleótido divulgada en la presente memoria en forma de ADN, p. ej., un vector o un molde de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U basado en su ARNm transcrito correspondiente. A este respecto, tanto las secuencias de ADN con codones optimizados (que comprenden T) como sus correspondientes secuencias de ARN (que comprenden U) se consideran secuencias de nucleótidos con codones optimizados de la presente divulgación. Un experto en la técnica también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes reemplazando una o más bases con bases no naturales. Así, p. ej., un codón Tt C (mapa de ADN) correspondería a un codón UUC (mapa de ARN), que a su vez correspondería a un codón V ^ C (mapa de ARN en el que U se ha reemplazado por pseudouridina).
Los pares de bases A-T y G-C estándar se forman en condiciones que permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre el N3-H y C4-oxi de timidina y el N1 y C6-NH2, respectivamente, de adenosina y entre el C2-oxi, N3 y C4-NH2, de citidina y el C2-NH2, N'-H y C6-oxi, respectivamente, de guanosina. Así, por ejemplo, la guanosina (2-amino-6-oxi-9-p-D-ribofuranosil-purina) puede modificarse para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-p-D-ribofuranosil-purina). Dicha modificación da como resultado una base de nucleósido que ya no formará efectivamente un par de bases estándar con la citosina. Sin embargo, la modificación de la citosina (1-p-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-p-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxipirimidina-) da como resultado un nucleótido modificado que no formará un par de bases efectiva con guanosina, pero formará un par de bases con isoguanosina (Pat. de EE.UU. No. 5.681.702 de Collins et al.). La isocitosina está disponible en Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina se puede preparar mediante el método descrito por Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 y las referencias citadas; la 2'-desoxi-5-metil-isocitidina se puede preparar mediante el método de Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y las referencias citadas; y los nucleótidos de isoguanina se pueden preparar usando el método descrito por Switzer et al., 1993, supra, y Mantsch et al. (1993), Biochem. 14:5593-5601, o por el método descrito en la Pat. de EE. UU. No. 5.780.610 de Collins et al. Se pueden sintetizar otros pares de bases no naturales mediante el método descrito en Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37, para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo-[4,3]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona. Se conocen otras unidades de nucleótidos modificadas de este tipo que forman pares de bases únicos, tales como las descritas en Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer et al., supra.
Secuencia de ácido nucleico: Los términos "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico contigua. La secuencia puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario, p. ej., un ARNm.
La expresión "secuencia de nucleótidos que codifica" y variantes de la misma se refiere a la secuencia codificante de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ARNm o ADN) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o fragmento funcional del mismo como se muestra en la presente memoria. La secuencia codificante puede incluir además señales de inicio y terminación unidas operativamente a los elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación que puede dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero al que se le administra el ácido nucleico. La secuencia codificante puede incluir además secuencias que codifican péptidos señal.
Polipéptido: Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede comprender aminoácidos modificados. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales tales como homocisteína, ornitina, p-acetilfenilalanina, D-aminoácidos y creatina), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.
El término, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser un único polipéptido o puede ser un complejo de múltiples moléculas, tales como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos monocatenarios o multicatenarios. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos multicatenarios. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural. En algunos aspectos, un "péptido" puede tener una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, p. ej., una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos.
Variante de polipéptido: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o de referencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente un 50 % de identidad, al menos aproximadamente un 60 % de identidad, al menos aproximadamente un 70 % de identidad, al menos aproximadamente un 80 % de identidad, al menos aproximadamente un 90 % de identidad, al menos aproximadamente un 95 % de identidad, al menos aproximadamente un 99 % de identidad con una secuencia nativa o de referencia. En algunos aspectos, serán al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % idénticas a una secuencia nativa o de referencia.
Polipéptido por unidad de fármaco (PUD): Tal y como se usa aproximadamente, un PUD o producto por unidad de fármaco, se define como una porción subdividida de la dosis diaria total, generalmente 1 mg, pg, kg, etc., de un producto (como un polipéptido) medido en fluidos o tejidos corporales, generalmente definido en concentración como pmol/mL, mmol/mL, etc dividido por la medida en el fluido corporal.
Prevenir: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "prevenir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.
Profármaco: La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como un agente terapéutico tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera y liberan o se convierten en el resto de fármaco activo antes, durante o después de su administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando los grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, en los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en donde los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y el uso de profármacos se analizan en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
Proliferar: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "proliferar" significa crecer, expandirse o aumentar o hacer crecer, expandirse o aumentar rápidamente. "Proliferativo" significa que tiene la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa que tiene propiedades contrarias u opuestas a las propiedades proliferativas.
Profiláctico: Tal y como se usa en la presente memoria, "profiláctico" se refiere a un agente terapéutico o curso de acción usado para prevenir la diseminación de una enfermedad.
Profilaxis: Tal y como se usa en la presente memoria, una "profilaxis" se refiere a una medida tomada para mantener la salud y prevenir la diseminación de una enfermedad. Una "profilaxis inmune" se refiere a una
medida para producir inmunidad activa o pasiva para prevenir la diseminación de una enfermedad.
Sitio de escisión de proteínas: Tal y como se usa en la presente memoria, "sitio de escisión de proteínas" se
refiere a un sitio donde se puede lograr la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.
Señal de escisión de proteínas: Tal y como se usa en la presente memoria, "señal de escisión de proteínas"
se refiere al menos a un aminoácido que marca o señala un polipéptido para la escisión.
Proteína de interés: Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen las proporcionadas en la presente memoria y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de las mismas.
Proximal: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "proximal" significa situado muy cerca del
centro o de un punto o región de interés.
Pseudouridina: Tal y como se usa en la presente memoria, pseudouridina se refiere al isómero C-glucósido del nucleósido uridina. Un "análogo de pseudouridina" es cualquier modificación, variante, isoforma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen pero no se limitan a 1-carboximetilpseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 1-metilpseudouridina (m1^ ), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metilpseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ) y 2-O-metil-pseudouridina (^m).
Purificado: Tal y como se usa en la presente memoria, "purificar", "purificado", "purificación" significa hacer sustancialmente puro o carente de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.
Secuencia de Ácido Nucleico de Referencia: El término "secuencia de ácido nucleico de referencia" o "ácido
nucleico de referencia" o "secuencia de nucleótidos de referencia" o "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de partida (p. ej., un ARN, p. ej., una secuencia de ARNm) cuya secuencia se
puede optimizar. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de ácido
nucleico de tipo salvaje, un fragmento o una variante de la misma. En algunos aspectos, la secuencia de ácido
nucleico de referencia es una secuencia de ácido nucleico previamente optimizada.
Transfección repetida: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "transfección repetida" se refiere
a la transfección del mismo cultivo celular con un polinucleótido una pluralidad de veces. El cultivo celular se
puede transfectar al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6
veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces, al menos 15 veces, al menos 16 veces, al menos 17
veces, al menos 18 veces, al menos 19 veces, al menos 20 veces, al menos al menos 25 veces, al menos 3 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces, al menos 50 veces o más.
Sales: En algunos aspectos, la composición farmacéutica para administración intratumoral divulgada en la
presente memoria comprende sales de algunos de sus constituyentes lipídicos. El término "sal" incluye
cualquier complejo aniónico y catiónico. Los ejemplos no limitativos de aniones incluyen aniones inorgánicos y orgánicos, p. ej., fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, oxalato (p. ej., hemioxalato), fosfato, fosfonato, hidrógenofosfato, dihidrógenofosfato, óxido, carbonato, bicarbonato, nitrato, nitrito, nitruro, bisulfito, sulfuro,
sulfito, bisulfato, sulfato, tiosulfato, sulfato de hidrógeno, borato, formato, acetato, benzoato, citrato, tartrato,
lactato, acrilato, poliacrilato, fumarato, maleato, itaconato, glicolato, gluconato, malato, mandelato, tiglato, ascorbato, salicilato, polimetacrilato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, bromato, hipobromito, yodato, un alquilsulfonato, un arilsulfonato, arsenato, arsenito, cromato, dicromato, cianuro, cianato, tiocianato, hidróxido, peróxido, permanganato, y mezclas de los mismos.
Muestra: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (p. ej., fluidos corporales, que incluyen, pero no se
limitan a, sangre, mucosidad, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cefalorraquídeo, saliva, fluido amniótico,
sangre del cordón amniótico, orina, fluido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogenado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos,
células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo, pero no limitado a, por
ejemplo, plasma, suero, fluido cefalorraquídeo, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, tal como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o molécula de ácido nucleico.
Secuencia Señal: Tal y como se usa en la presente memoria, las frases "secuencia señal", "péptido señal" y "péptido de tránsito" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína a un determinado orgánulo, compartimento celular, o exportación extracelular. El término abarca tanto el polipéptido de secuencia señal como la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal. Por tanto, las referencias a una secuencia señal en el contexto de un ácido nucleico se refieren de hecho a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de secuencia señal.
Ruta de transducción de señales: Una "ruta de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal desde una parte de una célula a otra parte de una célula. Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "receptor de la superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana plasmática de una célula.
Similitud: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "similitud" se refiere a la relación global entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de polinucleótidos (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservativas como se entiende en la técnica.
Administración específica : Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administración específica", "administrar específicamente" o "administrando específicamente" significa la administración de más (p. ej., al menos 1,5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido diana de interés (p. ej., hígado de mamífero) en comparación con un tejido no diana (p. ej., bazo de mamífero). El nivel de administración de una nanopartícula a un tejido en particular puede medirse comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con la cantidad de proteína total en dicho tejido, o comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con la cantidad de polinucleótido total en dicho tejido. Por ejemplo, para el direccionamiento renovascular, un polinucleótido se proporciona específicamente a un riñón de mamífero en comparación con el hígado y el bazo si se administran 1,5, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces o 20 veces más de polinucleótido por 1 g de tejido a un riñón en comparación con lo que se administra al hígado o al bazo después de la administración sistémica del polinucleótido. Se entenderá que la capacidad de administrar específicamente una nanopartícula a un tejido diana no necesita determinarse en un sujeto que se está tratando, puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (p. ej., un modelo de rata).
Estable: Tal y como se usa en la presente memoria, "estable" se refiere a un compuesto que es suficientemente robusto como para superar el aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y en algunos casos es capaz de formularse en un agente terapéutico efectivo.
Estabilizado: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable.
Estereoisómero: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "estereoisómero" se refiere a todas las posibles formas isoméricas, así como conformacionales diferentes que puede poseer un compuesto (p. ej., un compuesto de cualquier fórmula descrita en la presente memoria), en particular todas las formas estereoquímicamente y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de la estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente divulgación pueden existir en diferentes formas tautoméricas, estando todas las últimas incluidas dentro del alcance de la presente divulgación.
Sujeto: Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se quiere decir cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; osos, animales de alimentación tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; etc. En determinados aspectos, el mamífero es un sujeto humano. En otros aspectos, un sujeto es un paciente humano. En un aspecto particular, un sujeto es un paciente humano que necesita un tratamiento contra el cáncer.
Sustancialmente: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que se producen, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, "sustancialmente" se usa en la presente memoria para capturar la posible falta de compleción inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Sustancialmente igual: Tal y como se usa en la presente memoria en relación con las diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2 %.
Sustancialmente simultáneo: Tal y como se usa en la presente memoria en relación a una pluralidad de dosis, el término significa dentro de 2 segundos.
Que padece de: Un individuo "que padece de" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.
Susceptible a: Un individuo que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno y/o afección no ha sido diagnosticado y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunos aspectos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) la expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición a y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos aspectos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos aspectos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.
Liberación sostenida: Tal y como se usa en la presente memoria, “ liberación sostenida” se refiere a un perfil de liberación de una composición farmacéutica o compuesto que se conforma a una velocidad de liberación durante un período específico de tiempo.
Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos u otras moléculas de la presente divulgación puede ser química o enzimática.
Células diana: Tal y como se usa en la presente memoria, "células diana" se refiere a una cualquiera o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ, o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.
Tejido diana: Tal y como se usa en la presente memoria, "tejido diana" se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejido de interés en los que la administración de un polinucleótido daría como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Los ejemplos de tejidos diana de interés incluyen tejidos, órganos y sistemas específicos o grupos de los mismos. En aplicaciones particulares, un tejido diana puede ser un riñón, un pulmón, un bazo, endotelio vascular en vasos (p. ej., intracoronario o intrafemoral), o tejido tumoral (p. ej., mediante inyección intratumoral). Un "tejido fuera de diana" se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejido en los que la expresión de la proteína codificada no da como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado. En aplicaciones particulares, los tejidos fuera de diana pueden incluir el hígado y el bazo.
Secuencia de direccionamiento: Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "secuencias de direccionamiento" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína o polipéptido.
Extremo: Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptidos de la divulgación pueden caracterizarse como moléculas que tienen tanto un extremo N (terminado en un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como un extremo C (terminado en un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas de la divulgación están compuestas de múltiples cadenas de polipéptidos que están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro o mediante fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Agente Terapéutico: El término “agente terapéutico” se refiere a un agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico y/o incita un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Por ejemplo, en algunos aspectos, un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma puede ser un agente terapéutico.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente a administrar (p. ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra. a un sujeto que padece de o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Resultado terapéuticamente efectivo: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "resultado terapéuticamente efectivo" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece de o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Dosis diaria total: Tal y como se usa en la presente memoria, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. La dosis diaria total se puede administrar como una dosis unitaria única o una dosis dividida.
Factor de transcripción: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, por ejemplo, mediante la activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solos o en un complejo con otras moléculas.
Transcripción: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "transcripción" se refiere a métodos para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula. Los métodos de transfección incluyen, pero no se limitan a, métodos químicos, tratamientos físicos y lípidos catiónicos o mezclas.
Transfección: Tal y como se usa en la presente memoria, "transfección" se refiere a la introducción de un polinucleótido en una célula en donde se expresa un polipéptido codificado por el polinucleótido (p. ej., ARNm) o el polipéptido modula una función celular (p. ej., ARNsi, miARN). Tal y como se usa en la presente memoria, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un polinucleótido (p. ej., un ARNm) en un polipéptido o proteína y/o la modificación posterior a la traducción de un polipéptido o proteína.
Tratar, tratamiento, terapia: Tal y como se usa en la presente memoria, el término "tratar" o "tratamiento" o "terapia" se refiere a aliviar, mitigar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición de, inhibir la progresión de, reducir la gravedad de, y/o reducir la incidencia de, de manera parcial o completa, uno o más síntomas o características de una enfermedad hiperproliferativa, p. ej., cáncer. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de una enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar la patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección.
Microentorno Tumoral': Tal y como se usa en la presente memoria, "microentorno tumoral" se refiere a las composiciones celulares dentro de un tumor con respecto a la presencia o ausencia de células inmunes y/o inflamatorias infiltradas, así como al o a los tipos de dichas células dentro del tumor. En un aspecto, un microentorno tumoral es un "microentorno tumoral inflamado", que se refiere a la presencia de células inmunes y/o inflamatorias infiltradas en el tumor, siendo el tipo celular predominante los granulocitos. En otro aspecto, un microentorno tumoral es un "microentorno tumoral inmunosupresor", que se refiere a la presencia de células inmunes y/o inflamatorias infiltradas en el tumor, siendo los tipos celulares predominantes células monocíticas y macrófagos. En otro aspecto, un microentorno tumoral es un "microentorno tumoral inmunológicamente estéril", que se refiere a la ausencia de infiltración significativa en el tumor de células inmunes y/o inflamatorias.
No modificado: Tal y como se usa en la presente memoria, "no modificado" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. No modificado puede referirse, pero no siempre, al tipo salvaje o a la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden experimentar una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.
Uracilo: El uracilo es una de las cuatro nucleobases en el ácido nucleico del ARN y se representa con la letra U. El uracilo se puede unir a un anillo de ribosa, o más específicamente, a una ribofuranosa a través de un enlace p-Ní-glucosídico para producir el nucleósido uridina. El nucleósido uridina también se abrevia comúnmente de acuerdo con el código de una letra de su nucleobase, es decir, U. Por lo tanto, en el contexto de la presente divulgación, cuando un monómero en una secuencia de polinucleótidos es U, dicha U se designa indistintamente como un "uracilo " o una "uridina".
Contenido de Uridina: Los términos "contenido de uridina" o "contenido de uracilo" son intercambiables y se refieren a la cantidad de uracilo o uridina presente en una determinada secuencia de ácido nucleico. El contenido de uridina o contenido de uracilo se puede expresar como un valor absoluto (número total de uridina o uracilo en la secuencia) o relativo (porcentaje de uridina o uracilo con respecto al número total de nucleobases en la secuencia de ácido nucleico).
Secuencia Modificada en Uridina: Los términos "secuencia modificada en uridina" se refieren a un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con un contenido de uridina global o local diferente (contenido de uridina mayor o menor) o con patrones de uridina diferentes (p. ej., distribución de gradiente o agrupamiento) con respecto al contenido de uridina y/o patrones de uridina de una secuencia candidata de ácido nucleico. En el contenido de la presente divulgación, los términos "secuencia modificada en uridina" y "secuencia modificada en uracilo" se consideran equivalentes e intercambiables.
Un "codón alto en uridina" se define como un codón que comprende dos o tres uridinas, un "codón bajo en uridina" se define como un codón que comprende una uridina, y un "codón sin uridina" es un codón sin ninguna uridina. En algunos aspectos, una secuencia modificada en uridina comprende sustituciones de codones altos en uridina con codones bajos en uridina, sustituciones de codones altos en uridina con codones sin uridina, sustituciones de codones bajos en uridina con codones altos en uridina, sustituciones de codones bajos en uridina con codones sin uridina, sustitución de codones sin uridina con codones bajos en uridina, sustituciones de codones sin uridina con codones altos en uridina, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, un codón alto en uridina se puede reemplazar con otro codón alto en uridina. En algunos aspectos, un codón bajo en uridina se puede reemplazar con otro codón bajo en uridina. En algunos aspectos, un codón sin uridina se puede reemplazar con otro codón sin uridina. Una secuencia modificada en uridina puede estar enriquecida en uridina o enrarecida en uridina.
Enriquecido en Uridina: Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "enriquecido en uridina" y variantes gramaticales se refieren al aumento en el contenido de uridina (expresado en valor absoluto o como valor porcentual) en un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la correspondiente secuencia candidata de ácido nucleico. El enriquecimiento en uridina se puede implementar mediante la sustitución de codones en la secuencia candidata de ácido nucleico con codones sinónimos que contienen menos nucleobases de uridina. El enriquecimiento en uridina puede ser global (es decir, en relación con la longitud total de una secuencia candidata de ácido nucleico) o local (es decir, en relación con una subsecuencia o región de una secuencia candidata de ácido nucleico).
Enrarecido en Uridina: Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "enrarecido en uridina" y variantes gramaticales se refieren a la disminución en el contenido de uridina (expresado en valor absoluto o como valor porcentual) en un ácido nucleico de secuencia optimizada (p. ej., una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la correspondiente secuencia candidata de ácido nucleico. El enrarecimiento en uridina se puede implementar mediante la sustitución de codones en la secuencia candidata de ácido nucleico con codones sinónimos que contienen menos nucleobases de uridina. El enrarecimiento en uridina puede ser global (es decir, en relación con la longitud total de una secuencia candidata de ácido nucleico) o local (es decir, en relación con una subsecuencia o región de una secuencia candidata de ácido nucleico).
Variante: El término variante, tal y como se usa en la presente divulgación, se refiere tanto a las variantes naturales (p. ej., polimorfismos, isoformas, etc.) como a las variantes artificiales en las que al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o de partida (p. ej., una secuencia de tipo salvaje) se ha eliminado y se ha insertado un aminoácido diferente en su lugar en la misma posición. Estas variantes se pueden describir como "variantes de sustitución". Las sustituciones pueden ser únicas, donde solo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, cuando se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula. Si se insertan o delecionan aminoácidos, la variante resultante sería una "variante de inserción" o una "variante de deleción", respectivamente.
II. Combinaciones que Comprenden Polinucleótidos que Codifican Polipéptidos Inmunomoduladores
La presente divulgación proporciona composiciones ("composiciones de la divulgación") para el tratamiento del cáncer. En un aspecto, las composiciones comprenden, en una única formulación, al menos dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) o al menos tres polinucleótidos (p. ej., ARNm), cada una de las composiciones seleccionada de un primer polinucleótido que codifica IL-23, un segundo polinucleótido que codifica IL-36-gamma (o, alternativamente, IL-18), y/o un tercer polinucleótido que codifica OX40L. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona, por ejemplo, (i) un primer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, (ii) un segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (o un polipéptido IL-18), y (iii) un tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polipéptido se usan en varias combinaciones. En un aspecto, la composición comprende el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido. El término "polinucleótidos de la divulgación" se refiere al primer polinucleótido, al segundo polinucleótido y al tercer polinucleótido divulgados en la presente memoria.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "combinaciones de la divulgación" comprende, p. ej., la combinación de (i) un primer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; (ii) un primer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y un tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L; (iii) un segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L; o (iv) un primer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L. Debe entenderse que el término "combinaciones de la divulgación" no se limita a la combinación física de un primer polinucleótido, un segundo polinucleótido, y/o un tercer polinucleótido, sino que también abarca la administración separada de estos dos polinucleótidos concurrentemente o secuencialmente.
Por lo tanto, en otro aspecto, la composición de la presente divulgación comprende un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un único polipéptido, IL-23, IL-36-gamma o IL-18, u OX40L, pero cada una de las composiciones (p. ej., una composición que comprende un primer polinucleótido que codifica IL-23, una composición que comprende un segundo polinucleótido que codifica IL-36-gamma o IL-18, y un tercer polinucleótido que codifica OX40L) puede usarse en combinación en los métodos descritos en la presente memoria.
Un experto en la técnica también apreciaría que los aspectos alternativos de la presente divulgación incluyen una terapia de combinación de IL-23, IL-36-gamma o IL-18, y/u OX40 como polinucleótidos y/o proteínas. Por ejemplo, la presente divulgación abarca la terapia de combinación de (i) un primer polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica IL-23 y una segunda proteína que comprende IL-36-gamma o IL-18; una primera proteína que comprende IL-23 y un segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende IL-36 gamma IL-18; o (iii) una primera proteína que comprende IL-23 y una segunda proteína que comprende IL-36 gamma o IL-18. Asimismo, la presente divulgación abarca además la terapia de combinación de un polinucleótido de IL-23 (p. ej., ARNm) o una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un polinucleótido IL-36-gamma o un polinucleótido IL-18 (p. ej., ARNm) o una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, un polinucleótido OX40L (p. ej., ARNm) o una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o combinaciones de los mismos.
Polinucleótidos que Codifican IL-23
IL-23 es una citoquina proinflamatoria que juega un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa. Croxford et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:2263-2273. IL-23 funciona principalmente como una proteína heterodimérica de 60 kDa que consiste en las subunidades p19 y p40 unidas por disulfuro. IL-23 es estructural y funcionalmente similar a la citoquina proinflamatoria IL-12. IL-23 contiene la misma subunidad p40 que IL-12, pero incluye la subunidad p19 en lugar de la p35 de IL-12. Oppman et al. (2000) Immunity 13:715-725. La forma precursora de la subunidad p19 (Secuencia de Referencia de NCBI: n P_057668; NM_016584; Uniprot: Q9NPF7; también conocida como IL-23A y subunidad alfa de IL-23) tiene una longitud de 189 aminoácidos, mientras que su forma madura tiene una longitud de 170 aminoácidos. La forma precursora de la subunidad p40 (Secuencia de Referencia de NCBI: NM_002187; Uniprot:P29460; también conocida como IL-12B, factor estimulador de células asesinas naturales 2 y factor de maduración de linfocitos citotóxicos 2) tiene una longitud de 328 aminoácidos, mientras que su forma madura tiene una longitud de 306 aminoácidos.
Muchas células inmunes diferentes, incluidas las células dendríticas y los macrófagos, producen IL-23 ante estímulos antigénicos. Una diferencia entre IL-12 e IL-23 es que IL-12 está asociada con el desarrollo y la actividad de las poblaciones de células T Th1, mientras que IL-23 está asociada con el desarrollo y la actividad de las poblaciones de células T Th17. Véase, Vignali et al. (2014) Nat. Immunol. 13:722-728.
Aunque algunos estudios iniciales implicaron a IL-23 para la terapia antitumoral (Belladonna et al. (2002) J. Immunol. 168:5448-5454), estudios más recientes indican una posible función protumorigénica para IL-23. Véase, p. ej., Croxford et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:2263-2273. Langowski et al. (2007) Trends Immunol.
28:207-212; Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465; Teng et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8328-8333; Teng et al. (2012) Cancer Res. 72:3987-3996. Langowski (2006) observó un aumento de IL-23 en tumores humanos. Véase también Ngiow et al. (2013) T rends Immunol. 34:548-555; Wilke et al. (2011) Carcinogenesis 32:643-649; Xu et al. (2010) Clin. Dev. Immunol. 2010. Por ejemplo, Wang et al. (2015) Clin. Exp. Rheumatol. 33 (Supl. 92): S87-S90 enseña que la expresión elevada de IL-23 tiene una función patogénica en el cáncer. IL-23 tiene un papel causal en el desarrollo y la progresión de tumores y se ha relacionado con un pronóstico adverso y una progresión rápida a la enfermedad metastásica, lo que sugiere que la inhibición de la expresión de IL-23 puede ser útil para la terapia y la prevención del cáncer, en particular del cáncer colorrectal. Teng et al. (2015) Nature Medicine 21: 719-29 enseña que IL-23 promueve directa o indirectamente la tumorigénesis, el crecimiento y la metástasis, e indica que la inhibición de la expresión de IL-23 podría usarse para la terapia y la prevención del cáncer.
Tal y como se usa en la presente divulgación, el término "polipéptido IL-23" se refiere, p. ej., a una subunidad IL-12p40 de IL-23, a una subunidad IL-23p19 de IL-23, o a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la subunidad IL-12p40 y un polipéptido de la subunidad IL-23p19. En algunos aspectos, la proteína de fusión comprende desde el extremo N hasta el extremo C:
(a) una subunidad IL-12p40 que comprende el péptido señal de IL-12p40, un conector peptídico y una subunidad IL-23p19 madura, o
(b) una subunidad IL-23p19 que comprende el péptido señal de IL-23p19, un conector peptídico y una IL-12p40 madura.
En un aspecto particular, el polipéptido IL-23 comprende, consiste en o consiste esencialmente en un polipéptido IL-23 humano o murino de la Tabla 1 (p. ej., un precursor o IL-12p40 o IL-23p19 maduro) o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, el polinucleótido que codifica el polipéptido IL-23 comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polinucleótido que codifica IL-23 de la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de IL-23 enumerada en la Tabla 1, o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido IL-23 tiene al menos un 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-23 de tipo salvaje correspondiente. En un aspecto particular, el polipéptido IL-23 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 140 y tiene al menos un 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-23 de tipo salvaje correspondiente. En otro aspecto particular, el polipéptido IL-23 consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID No : 140 y tiene al menos un 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-23 de tipo salvaje correspondiente.
En otros aspectos, el polipéptido IL-23 codificado por un polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 1 o mostrada en las SEQ ID NO: 1, 5 o 140 con una o más sustituciones conservativas, en donde las sustituciones conservativas no afectan significativamente la actividad de unión del polipéptido IL-23 a su receptor, es decir, el polipéptido IL-23 se une al receptor de IL-23 después de las sustituciones.
En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23 enumerada en la Tabla 1.En un aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 141 o SEQ ID NO: 142. En otro aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 141 o SEQ ID No : 142. Debe entenderse que la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm, p. ej., la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 141) que codifica un marco de lectura abierto (ORF) del polipéptido IL-23 puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, 5'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 27 o 44), 3'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA.
P o lin u c le ó tid o s que C o d ifica n P o lip é p tid o s IL-12
En algunos aspectos, el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-12. Tal y como se usa en la presente divulgación, el término "polipéptido IL-12" se refiere, p. ej., a una subunidad IL-12p40 de IL-12 (es decir, IL12B), a una subunidad IL-12p35 de IL-12 (es decir, IL12Aa), o a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la subunidad IL-12p40 y un polipéptido de la subunidad IL-12p35. En algunos aspectos, la proteína de fusión comprende un polipéptido IL12B seleccionado de:
(i) el polipéptido IL12B de longitud completa (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que IL12B de tipo salvaje);
(ii) un fragmento funcional del polipéptido IL12B de longitud completa (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., deleción de regiones carboxi, amino terminales o internas) más corta que una IL12B de tipo salvaje, pero que aún retiene la actividad enzimática de IL12B);
(iii) una variante de los mismos (p. ej., proteínas IL12B de longitud completa o truncadas en las que se han reemplazado uno o más aminoácidos, p. ej., variantes que retienen toda o la mayor parte de la actividad de IL12B del polipéptido con respecto al polipéptido IL12B de tipo salvaje (tal como, p. ej., V33I, V298F o cualquier otra variante natural o artificial conocida en la técnica); o
(iv) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12B de longitud completa de tipo salvaje, un fragmento funcional o una variante de la misma, y (ii) una proteína heteróloga;
y/o un polipéptido IL12A seleccionado de:
(i) el polipéptido IL12A de longitud completa (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que la IL12A de tipo salvaje);
(ii) un fragmento funcional del polipéptido IL12A de longitud completa (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., deleción de regiones carboxi, amino terminales o internas) más corta que una IL12A de tipo salvaje, pero que aún retiene la actividad enzimática de IL12A);
(iii) una variante de los mismos (p. ej., proteínas IL12A de longitud completa o truncadas en las que se han reemplazado uno o más aminoácidos, p. ej., variantes que retienen toda o la mayor parte de la actividad IL12A del polipéptido con respecto al polipéptido IL12A de tipo salvaje (tal como variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica); o
(iv) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12A de longitud completa de tipo salvaje, un fragmento funcional o una variante de la misma, y (ii) una proteína heteróloga;
En un aspecto particular, el polipéptido IL-12 comprende, consiste en o consiste esencialmente en un polipéptido IL-12 humano o murino de la Tabla 1 (p. ej., un precursor o IL-12p40 o IL-12p35 maduro) o una combinación de los mismos. En un aspecto particular, el polinucleótido que codifica el polipéptido IL-12 comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polinucleótido que codifica IL-23 de la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-12 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de IL-12 enumerada en la Tabla 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido IL-12 tiene al menos un 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-12 de tipo salvaje correspondiente.
En otros aspectos, el polipéptido IL-12 codificado por un polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 1 con una o más sustituciones conservativas, en donde las sustituciones conservativas no afectan significativamente la actividad de unión del polipéptido IL-12 a su receptor, es decir, el polipéptido IL-12 se une al receptor de IL-12 después de las sustituciones.
En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-12 comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 enumerada en la Tabla 1. En un aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-12 comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 183. Debe entenderse que la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un marco de lectura abierto (ORF) del polipéptido IL-12 puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p.
ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, 5'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 27 o 44), 3'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA.
Polinucleótidos que Codifican Polipéptidos IL-36-gamma
En algunos aspectos, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 se puede combinar con un polinucleótido que codifica un segundo que comprende un polipéptido IL-36.
IL-36-gamma es un miembro de la familia de la interleuquina-1 de citoquinas. Al igual que otros miembros de la familia de la interleuquina-1 de citoquinas, la IL-36-gamma requiere la escisión N-terminal para una bioactividad completa. IL-36-gamma no tiene una secuencia de señal y, por lo tanto, no se secreta a través de la vía de Golgi del retículo endoplásmico. Véase Gresnigt y van de Veerdonk (2013) Seminars in Immunology 25:458-465). No está claro cómo se libera la IL-36-gamma de las células para actuar, p. ej., sobre las células inmunes, otras células epiteliales y fibroblastos (Gabay et al. (2015) Journal of Leukocyte Biology 97:645-652). En aspectos ilustrativos de la divulgación, un polinucleótido que codifica IL-36, p. ej., IL-36-gamma, incluye una secuencia que codifica un péptido señal heterólogo. Sin estar ligado a la teoría, se cree que los polinucleótidos que codifican dichas proteínas quiméricas de péptido señal-interleuquina "preparadas por ingeniería" proporcionan la generación de proteína activa cuando se expresan in vivo, en ausencia de activación del inflamasoma.
En un aspecto, el péptido señal heterólogo se deriva de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. En un aspecto ilustrativo, el péptido señal heterólogo se deriva de una cadena ligera de inmunoglobulina, p. ej., de la región variable de dicha cadena ligera. En un aspecto ilustrativo, el péptido señal heterólogo se deriva de la región variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana, hIGVK4. En aspectos ilustrativos, un polinucleótido de la divulgación codifica un péptido señal heterólogo, unido operativamente a la secuencia que codifica un polipéptido IL-36-gamma.
En un aspecto particular, el polipéptido IL-36-gamma comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polipéptido IL-36-gamma de la Tabla 1. En un aspecto particular, el polinucleótido que codifica el polipéptido IL-36-gamma comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polinucleótido que codifica IL-36-gamma de la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL36-gamma comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de IL-36-gamma enumerada en la Tabla 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido IL-36-gamma tiene al menos el 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-36-gamma de tipo salvaje correspondiente. En un aspecto particular, el polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16, y tiene al menos el 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-36-gamma de tipo salvaje correspondiente. En otro aspecto particular, el polipéptido IL-36-gamma consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 16, y tiene al menos el 10% de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-36-gamma de tipo salvaje correspondiente.
En otros aspectos, el polipéptido IL-36-gamma codificado por un polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 1 o mostrada en la SEQ ID NO: 16 con una o más sustituciones conservativas, en donde las sustituciones conservativas no afectan significativamente la actividad de unión del polipéptido IL-36-gamma a su receptor, es decir, el polipéptido IL-36-gamma se une al receptor de IL-36-gamma después de las sustituciones.
En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido IL-36-gamma enumerada en la Tabla 1. En un aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 144. En otro aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-36-gamma consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 143 o Se Q ID NO: 144. Debe entenderse que la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm, p. ej., la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 143) que codifica un marco de lectura abierto (ORF) del polipéptido IL-23 puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, 5'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 27 o 44), 3'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA.
P o lin u c le ó tid o s que C o d ifica n P o lip é p tid o s IL-18
En algunos aspectos, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 se puede combinar con un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína, en donde la segunda proteína comprende un polipéptido IL-18.
La IL-18, también conocida como factor inductor de interferón-gamma (IGIF) y factor inductor de IFN-y, es un miembro de la familia de interleuquina-1 de citoquinas. IL-18 tiene dos isoformas conocidas, Isoforma 1 e Isoforma 2. La Isoforma 2 difiere de la Isoforma 1 en que le faltan los residuos 27-30. Al igual que otros miembros de la familia de la interleuquina-1 de citoquinas, la IL-18 requiere la escisión N-terminal para una bioactividad completa (Dinarello et al. (2013) Frontiers in Immunology 4:289). IL-18 no tiene una secuencia de señal y, por lo tanto, no se secreta a través de la vía de Golgi del retículo endoplásmico. Véase Gresnigt y van de Veerdonk (2013) Seminars in Immunology 25:458-465).
La IL-18 es un agonista proinflamatorio que envía señales a través de los correceptores IL-18a e IL-18p para inducir una cascada de señalización que activa NPkB y MAPK (Dinarello et al. (2013). Como en el caso de la IL-23, existen informes contradictorios sobre el uso potencial de la IL-18 para la terapia contra el cáncer. Ma et al. (2016) Clin. Cancer Res. 22:2969-2680 enseña que el cotratamiento con IL-18 potencia la actividad antitumoral incitada por anti-PD-Ll y/o anti-CTLA-4. Sin embargo, Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675 enseña que iL-18 puede desempeñar funciones divergentes en el cáncer, teniendo actividades anticancerosas en algunos casos y actividades promotoras de tumores en otros casos. Fabbi indica que, aunque los estudios preclínicos y algunos ensayos clínicos sugieren que IL-18 tiene actividades antitumorales, otros estudios indican que IL-18 puede ejercer actividades proinvasivas, proangiogénicas e inmunorreguladoras en diferentes modelos tumorales. Por ejemplo, Term et al. (2011) Cancer Res. 71: 5393­ 9 enseña que IL-18 es una citoquina inmunosupresora en el cáncer, y que la IL-18 producida por las células tumorales promueve el desarrollo de metástasis controladas por NK de una manera dependiente de PD-1. Kang et al. (2009) Carcinogenesis 30:1987-86 enseña que IL-18 aumenta las metástasis y el escape inmune del cáncer de estómago.
En aspectos ilustrativos de la divulgación, un polinucleótido que codifica IL-18 incluye una secuencia que codifica un péptido señal heterólogo. Sin estar ligado a la teoría, se cree que los polinucleótidos que codifican dichas proteínas quiméricas de péptido señal-interleuquina "preparadas por ingeniería" proporcionan la generación de proteína activa cuando se expresan in vivo, en ausencia de activación del inflamasoma.
En un aspecto, el péptido señal heterólogo se deriva de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. En un aspecto ilustrativo, el péptido señal heterólogo se deriva de una cadena ligera de inmunoglobulina, p. ej., de la región variable de dicha cadena ligera.
En un aspecto ilustrativo, el péptido señal heterólogo se deriva de la región variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana, hIGVK4. En aspectos ilustrativos, un polinucleótido de la divulgación codifica un péptido señal heterólogo, unido operativamente a la secuencia que codifica un polipéptido IL-18.
En un aspecto particular, el polipéptido IL-18 comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polipéptido IL-18 de la Tabla 1. En un aspecto particular, el polinucleótido que codifica el polipéptido IL-18 comprende, consiste en, o consiste esencialmente en un polinucleótido que codifica IL-18 de la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-18 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de IL-18 enumerada en la Tabla 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido IL-18 tiene al menos un 10 % de la actividad (p. ej., unión a su receptor) del polipéptido IL-18 de tipo salvaje correspondiente. En un aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL-18 comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 o SEQ ID NO: 162. En otro aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido IL18 consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 o SEQ ID NO: 162. Debe entenderse que la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm, p. ej., SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 o SEQ ID NO: 162) que codifica un marco de lectura abierto (ORF) del polipéptido IL-18 puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal', 5'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 27 o 44), 3'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA.
P o lin u c le ó tid o s que C o d ifica n P o lip é p tid o s O X 40 L
En algunos aspectos, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 se puede combinar con un tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína, en donde la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L. En otros aspectos, el segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 se puede combinar con un tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína, en donde la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L. En ciertos aspectos, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y el segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 pueden combinarse con un tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína, en donde la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L.
El OX40L humano fue identificado por primera vez en la superficie de linfocitos humanos infectados con el virus de la leucemia de células T humanas tipo I (HTLV-I) por Tanaka et al. (Tanaka et al., International Journal of Cancer (1985), 36(5):549-55). OX40L es el ligando de OX40 (CD134). OX40L también se ha designado CD252 (grupo de diferenciación 252), superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), miembro 4, glicoproteína 1 activada transcripcionalmente por tax, TXGP1 o gp34. El OX40L humano tiene una longitud de 183 aminoácidos y contiene tres dominios: un dominio citoplasmático de los aminoácidos 1-23; un dominio transmembrana de los aminoácidos 24-50, y un dominio extracelular de los aminoácidos 51-183.
En algunos aspectos, el tercer polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de mamífero. En algunos aspectos, el polipéptido OX40L de mamífero es un polipéptido OX40L murino. En algunos aspectos, el polipéptido OX40L de mamífero es un polipéptido OX40L humano. En algunos aspectos, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1A.
En algunos aspectos, cada polinucleótido de la divulgación comprende un ARNm, es decir, un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma y un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido IL-23 codifica un polipéptido IL-23 de mamífero. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma codifica un polipéptido IL-36-gamma de mamífero. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L codifica un polipéptido OX40L de mamífero. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido IL-23 codifica un polipéptido IL-23 murino. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma codifica un polipéptido IL-36-gamma murino. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L codifica un polipéptido OX40L murino. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido iL-23 codifica un polipéptido IL-23 humano. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma codifica un polipéptido IL-36-gamma humano. En algunos aspectos, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L codifica un polipéptido OX40L humano.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una secuencia de aminoácidos humana mostrada en la Tabla 1. En algunos aspectos, el polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia de aminoácidos humana mostrada en la Tabla 1. En otros aspectos, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos humana mostrada en la Tabla 1A.
En algunos aspectos, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 1A o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos enumerada en la Tabla 1A, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a un receptor OX40. En un aspecto, particular el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 21 y es capaz de unirse a un receptor OX40. En otro aspecto particular, el polipéptido OX40L consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 21 y es capaz de unirse a un receptor OX40.
En ciertos aspectos, el polipéptido OX40L codificado por un polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 1A o mostrada en la SEQ ID NO: 21 con una o más sustituciones conservativas, en donde las sustituciones conservativas no afectan significativamente la actividad de unión del polipéptido OX40L a su receptor, es decir, el polipéptido OX40L se une al receptor OX40 después de las sustituciones.
En otros aspectos, una secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico enumerada en la Tabla 1A. En un aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L comprende una secuencia al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146. En otro aspecto particular, la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido OX40L consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 116, SEQ ID No : 145 o SEQ iD NO: 146. Debe entenderse que la secuencia de nucleótidos (es decir, ARNm, p. ej., la SEQ ID NO: 116 o SEQ ID NO: 145) que codifica un marco de lectura abierto (ORF) del polipéptido OX40L puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, 5'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 27 o 44), 3'UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA.
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) útil para los métodos y composiciones comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L. En otros aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio citoplasmático de OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio transmembrana de OX40L. En determinados aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y una transmembrana de OX40L. En otros aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y un dominio citoplasmático de OX40L. En otros aspectos más, el polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L, una transmembrana de OX40L, y un dominio citoplasmático de OX40L.
La Tabla 1 o la Tabla 1A presentan, p. ej., secuencias precursoras y maduras para IL-23, IL-36-gamma y OX40L, así como construcciones que comprenden IL-23 o IL-36-gamma. En el contexto de la presente divulgación, el polinucleótido IL-23 o el polipéptido IL-23 abarcan tanto formas "precursoras" como "maduras". Además, una construcción que comprende un polinucleótido que codifica IL-23, IL-36-gamma y OX40L y que además comprende componentes tales como 3' UTR y 5' UTR se consideraría un polinucleótido que codifica IL-23, IL-36-gamma y OX40L. Un experto en la técnica comprendería que, además de las secuencias señal nativas y las secuencias propeptídicas divulgadas implícitamente en la Tabla 1 o 1A (secuencias presentes en el precursor y ausentes en la forma correspondiente madura) y el péptido señal no nativo divulgado en la Tabla 1 o 1A (péptido señal IgKV4), se pueden usar otras secuencias señal. Por consiguiente, las referencias a un polipéptido o polinucleótido IL-23, IL-36-gamma y OX40L según la Tabla 1 abarcan variantes en las que se ha unido dicho péptido señal alternativo (o secuencia codificante) conocido en la técnica a dicho polipéptido (o polinucleótido) IL-23, IL-36-gamma y OX40L. También se entiende que las referencias a las secuencias divulgadas en la Tabla 1 a lo largo de la solicitud son igualmente aplicables y abarcan ortólogos y variantes funcionales (por ejemplo, variantes polimórficas) e isoformas de aquellas secuencias conocidas en la técnica en el momento en que se presentó la solicitud.
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001

Figure imgf000057_0001

Figure imgf000058_0001

Figure imgf000059_0001

Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001

Figure imgf000068_0001

Figure imgf000069_0001

Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001

Figure imgf000079_0001

Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000089_0001

Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
Tabla 1A: Secuencias de Polipéptidos Polinucleótidos de OX40L
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000102_0001
Figure imgf000103_0001
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
Basándose en las secuencias de ARN proporcionadas en la presente memoria, y en particular en la Tabla 1 y la Tabla 1A, un experto en la técnica comprendería la secuencia de ADN correspondiente (p. ej., conversión de uracilo a timina). Del mismo modo, basándose en las secuencias de ADN proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de ARN correspondiente (p. ej., conversión de timina a uracilo).
En algunos aspectos, el primer polinucleótido comprende un ARNm (p. ej., la SEQ ID NO: 141) que comprende una secuencia con codones optimizados que codifica un polipéptido IL-23. En algunos aspectos, el segundo polinucleótido comprende un ARNm (p. ej., la SEQ ID NO: 143) que comprende una secuencia con codones optimizados que codifica un polipéptido IL-36-gamma. En otros aspectos, el tercer polinucleótido comprende un ARNm (p. ej., la SEQ ID NO: 145) que comprende una secuencia con codones optimizados que codifica un polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 de longitud completa. En algunos aspectos, el primer polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 humano que carece de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14, o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o extremo C del polipéptido IL-23 de tipo salvaje.
En algunos aspectos, el segundo polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma de longitud completa. En algunos aspectos, los segundos polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma humano que carece de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14, o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o extremo C del polipéptido IL-36-gamma de tipo salvaje.
En algunos aspectos, el polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de longitud completa. En algunos aspectos, el polinucleótido comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L humano que tiene una longitud de 183 aminoácidos. En ciertos aspectos, el polipéptido OX40L puede carecer de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14, o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o extremo C del polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación se "modifican estructuralmente" o se "modifican químicamente". Tal y como se usa en la presente memoria, una modificación "estructural" es aquella en la que se insertan, delecionan, duplican, invierten o aleatorizan dos o más nucleósidos unidos en un polinucleótido sin una modificación química significativa de los propios ARNm. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el ARNm "AUCG" puede modificarse químicamente a "AU-5meC-G". El mismo ARNm se puede modificar estructuralmente de "AUCG" a "AUCCCG". Aquí, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.
En algunos aspectos, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, p. ej., pseudouridina o 5-metoxiuridina. En otros aspectos, el polinucleótido (p. ej., un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma y/o un ARNm que codifica un polipéptido OX40L) puede tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (p. ej., ARNm) (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera). Cuando un polinucleótido (p. ej., un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma y/o un ARNm que codifica un polipéptido OX40L) de la presente divulgación se modifica química y/o estructuralmente, el ARNm puede denominarse "ARNm modificado". Los ejemplos no limitantes de modificaciones químicas se describen en otra parte de la presente memoria.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido comprende al menos un nucleósido modificado químicamente. En algunos aspectos, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de los nucleósidos modificados químicamente divulgados en la presente memoria y una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos.
En algunos aspectos, en donde los nucleósidos en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido están modificados químicamente en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
En algunos aspectos, los nucleósidos modificados químicamente en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina, y cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, los nucleósidos de uridina en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido están modificados químicamente en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
En algunos aspectos, los nucleósidos de adenosina en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido están modificados químicamente en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
En algunos aspectos, los nucleósidos de citidina en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido están modificados químicamente en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
En algunos aspectos, los nucleósidos de guanosina en el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido están modificados químicamente en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
En algunos aspectos, cada uno de los ARNm que codifica la primera proteína, el ARNm que codifica la segunda proteína y el ARNm que codifica la tercera proteína comprende un marco de lectura abierto.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una subunidad IL-12p40 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % a una secuencia polipeptídica de IL-23 enumerada en la Tabla 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a una subunidad IL-23p19 y formar IL-23, que tiene una actividad de IL-23.
En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 está codificada por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante del polipéptido IL-23 enumerada en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 comprende una subunidad IL-23p19 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia del polipéptido IL-23 enumerada en la Tabla 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a una subunidad IL-12p40 y formar IL-23, que tiene una actividad de IL-23.
En algunos aspectos, la subunidad IL-23p19 está codificada por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante del polipéptido IL-23 enumerada en la Tabla 1.
En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 y la subunidad IL-23P19 de la proteína IL-23 están en una única cadena polipeptídica o en dos cadenas diferentes. En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 y la subunidad IL-23p19 están fusionadas por un conector. En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 comprende un péptido señal. En algunos aspectos, la subunidad IL-23p19 comprende un péptido señal. En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 es una IL-12p40 madura (es decir, no comprende un péptido señal). En algunos aspectos, la subunidad IL-23p19 es una IL-23p19 madura (es decir, no comprende un péptido señal). En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 comprende un péptido señal no nativo. En algunos aspectos, la subunidad IL-23p19 comprende un péptido señal no nativo.
En algunos aspectos, la IL-23 es un polipéptido de fusión que comprende una subunidad IL-12p40 y una subunidad IL-23p19 según cualquiera de las siguientes fórmulas alternativas:
[péptido señal 1]-[IL-12p40]-[conector] -[IL-23p19]
[péptido señal 2]-[IL-23p19]-[conector]-[IL-12p40]
en donde [péptido señal 1] puede ser un péptido señal de IL-12p40 o un péptido señal no nativo, [péptido señal 2] puede ser un péptido señal de IL-23p19 o un péptido señal no nativo, [IL-12p40] es una IL-12p40 madura, [IL-23p19] es una IL-23p29 madura, y [conector] es un conector peptídico.
En algunos aspectos, el conector peptídico comprende un conector (GS). En algunos aspectos, el conector (GS) comprende una secuencia (GnS)m, en donde n es 1-20 y m es 1-100. En algunos aspectos, el conector (GS) comprende la secuencia GGS, GGGS, GGGGS (SEQ ID NO: 136), GGGGGS (SEQ ID NO: 137), GGGGGGS (SEQ ID NO: 138), GGGGGGGS (SEQ ID NO: 139) GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 183), GGSGGGGG (SEQ ID NO: 184), o GSGSGSGS (SEQ ID NO: 185). En algunos aspectos, el conector puede comprender (EAAAK)q (SEQ ID NO: 163), en donde q es un número entero de 1 a 5. En otros aspectos, el conector puede comprender (EAAAK)3, es decir, EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 164). En algunos aspectos, el conector puede ser un conector rico en Gly, por ejemplo, que comprende (Gly)p, en donde p es un número entero de 1 a 40. En algunos aspectos, un conector rico en Gly puede comprender GGGGG (SEQ ID NO: 165), GGGGGG (SEQ ID NO: 166), GGGGGGG (SEQ ID NO: 167) o GGGGGGGG (SEQ ID NO: 168). Los conectores adicionales ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, GGGGSLVPRGSGGGGS (SEQ ID NO: 169), GSGSGS (SEQ ID NO: 170), GGGGSLVPRGSGGGG (SEQ ID NO: 171), GGSGGHMGSGG (SEQ ID NO: 172), GGSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 173), GGSGG (SEQ ID NO: 174), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 175), GGGSEGGGSEGGGSEGGG (SEQ ID NO: 176), AAGAATAA (SEQ ID NO: 177), GGSSG (SEQ ID NO: 178), GSGGGTGGGSG (SEQ ID NO: 179), GSGSGSGSGGSG (SEQ ID NO: 180), GSGGSGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 181), y GSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 182). Los conectores descritos en la presente memoria se pueden usar en cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 según las fórmulas anteriores (es decir, un polipéptido IL-23 que comprende una subunidad IL-12p40 y una subunidad IL-23p19) comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido IL-23 enumerada en la Tabla 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de tener al menos una actividad de IL-23 (p. ej., unión a un receptor de IL-23).
En algunos aspectos, el polipéptido IL-23 según las fórmulas anteriores (es decir, un polipéptido IL-23 que comprende una subunidad IL-12p40 y una subunidad IL-23p19) está codificado por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100% idéntica a una secuencia enumerada en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-36-gamma comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido IL-36-gamma enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido es capaz de tener una actividad de IL-36-gamma ( p. ej., unión a un receptor de IL-36).
En algunos aspectos, el polipéptido IL-36-gamma está codificado por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante del polipéptido IL-36-gamma enumerada en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el polipéptido IL-18 comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido IL-18 enumerada en la Tabla 1, en donde el polipéptido es capaz de tener una actividad de IL-18 (p. ej., unión a un receptor de IL-18).
En algunos aspectos, el polipéptido IL-18 está codificado por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante del polipéptido IL-18 enumerada en la Tabla 1.
En otros aspectos, la composición de la divulgación comprende además un polinucleótido de tercer aspecto que codifica una tercera proteína. En un aspecto, el tercer polinucleótido comprende un ARNm de aspecto que codifica la tercera proteína. En otros aspectos, el tercer polinucleótido codifica un polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, el polipéptido OX40L comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido OX40L enumerada en la Tabla 1A, en donde el polipéptido es capaz de tener una actividad de OX40L (p. ej., unión a un receptor de OX40L).
En algunos aspectos, el polipéptido OX40L está codificado por una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante del polipéptido OX40L enumerada en la Tabla 1A.
En ciertos aspectos, la composición comprende además un cuarto polinucleótido que codifica la cuarta proteína. En algunos aspectos, el cuarto polinucleótido comprende un ARNm que codifica la cuarta proteína. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que comprende un sitio de unión del miARN.
En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN se une a miR-122. En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN se une a miR-122-3p o miR-122-5p. En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24, en donde el sitio de unión del miARN se une a miR-122 (miR-122-3p, 22 nt - aacgccauuaucacacuaaaua). En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 26, en donde el sitio de unión del miARN se une a miR-122 (miR-122-5p, 22 nt - uggaguguga caaugguguuug). En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende dos sitios de unión de miARN diferentes o el mismo sitio de unión del miARN. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido y/o el cuarto polinucleótido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez sitios de unión de miARN.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende además una 5' UTR. En algunos aspectos, la 5' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia de aspecto 5' UTR enumerada en la Tabla 3. En aspectos particulares, la 5' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 27 o Se Q ID NO: 44. En otros aspectos particulares, la 5' UTR consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 44. Debe entenderse que la 5' UTR puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, OFR (p. ej., las SEQ ID NO: 17, 19, 71, 94 y 116), 3' UTR (p. ej., las SEQ ID NO: 119 o 120), y/o cola poliA. En algunos aspectos, uno o más sitios de unión de miARN se pueden posicionar dentro de la 5' UTR en uno o más sitios de inserción posibles.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende además una 3' UTR. En algunos aspectos, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 % idéntica a un aspecto de secuencia 3' UTR enumerada en la Tabla 4A o 4B.En aspectos particulares, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 119 o Se Q ID NO: 120. En otros aspectos particulares, la 3' UTR consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 119 o SEQ ID NO: 120. Debe entenderse que la 3' UTR puede ser un elemento dentro de una construcción más grande, p. ej., que incluye además una caperuza 5' terminal, 5' UTR (p. ej., SEQ ID NO: 27 o 44), OFR (p. ej., las SEQ ID NO: 17, 19, 71, 94 y 116), y/o cola poliA.
En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN (p. ej., un sitio de unión de miR-122) se inserta dentro de la 3' UTR. En algunos aspectos, se inserta un sitio de unión del miARN (p. ej., sitio de unión de miR-122) dentro de la 3' UTR en 3' del codón de parada de la región codificante en el polirribonucleótido de la divulgación, p. ej., ARNm, en cuyo caso hay bases 3' UTR entre el codón de parada y el o los sitios de unión de miR. En algunos aspectos, si hay múltiples copias de un codón de parada en la construcción, se inserta un sitio de unión del miARN (p. ej., sitio de unión de miR-122) en 3' del codón de parada final. En algunos aspectos, un sitio de unión del miARN (p. ej., sitio de unión de miR-122) se inserta aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 bases en 3' del codón de parada (o el codón de parada final si hay múltiples codones de aspecto de parada en la construcción). En aspectos particulares, un sitio de unión del miARN (p. ej., sitio de unión de miR-122) se inserta en 3' del codón de parada (o el codón de parada final si hay múltiples codones de parada en la construcción) de modo que haya 79 bases 3' UTR entre el codón de parada y el o los sitios de unión de miR.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende además una secuencia espaciadora fusionada al sitio de unión del miARN. En algunos aspectos, la secuencia espaciadora comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100 nucleótidos.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende además una caperuza 5' terminal. En algunos aspectos, la caperuza 5' terminal es una caperuza Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxoguanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, 5' metilG, o un análogo de las mismas. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido comprende una cola poliA en 3'. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido tienen los codones optimizados. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido se transcriben in vitro (IVT). En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido son quiméricos. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, y/o el cuarto polinucleótido son circulares.
En algunos aspectos, la subunidad IL-12p40 del polipéptido IL-23, la subunidad IL-23p19 del polipéptido IL-23, el polipéptido IL-36-gamma, y/o el polipéptido OX40L se fusionan con un polipéptido heterólogo.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido (p. ej., ARNm), el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) y el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una caperuza 5' terminal, una 5 ' UTR, un marco de lectura abierto (ORF), una 3' UTR, aspecto y una cola poliA. En un aspecto, el primer polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de ácido nucleico de la Se Q ID NO: 27 o 44, SEQ ID NO: 19, 71 o aspecto 141, y SEQ ID NO: 119 o 120. En otros aspectos, el segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ iD NO: 27 o 44, aspecto SEQ ID NO: 17, 94 o 143 y SEQ ID NO: 119 o 120. En otros aspectos más, el tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de ácido nucleico de aspecto de la SEQ ID NO: 27 o 44, SEQ ID NO: 116 o 145, y SEQ ID NO: 119 o 120.
En aspectos particulares, el primer polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 142. En otros aspectos particulares, el primer polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 142. En otros aspectos particulares más, el primer polinucleótido consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 142.
En aspectos particulares, el segundo polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 144. En otros aspectos particulares, el aspecto del segundo polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 144. En otros aspectos particulares más, el aspecto del segundo polinucleótido consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 144.
En aspectos particulares, el tercer polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 146. En otros aspectos particulares, el aspecto del tercer polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 146. En otros aspectos particulares más, el tercer polinucleótido consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 146.
En algunos aspectos, el primer polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a cualquiera de las secuencias codificantes de IL-23 divulgadas en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el segundo polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a cualquiera de las secuencias codificantes de IL-36-gamma divulgadas en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el segundo polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante de IL-18, en donde dicha secuencia comprende una secuencia codificante de IL-18 divulgada en la Tabla 1.
En algunos aspectos, el tercer polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100 % idéntica a una secuencia codificante de OX40L o construcción OX40L_miR-122 de la Tabla 1A.
En otros aspectos, la composición para la divulgación comprende una cuarta proteína o un cuarto polinucleótido que codifica la cuarta proteína. Por ejemplo, el cuarto polinucleótido puede comprender un ARNm que codifica la cuarta proteína.
En algunos aspectos, las composiciones divulgadas en la presente memoria se utilizan para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita. En algunos aspectos, las composiciones divulgadas en la presente memoria se utilizan para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita.
En algunos aspectos, las composiciones divulgadas en la presente memoria se administran a un sujeto que las necesita para tratar el cáncer, y la administración de la composición trata o mejora los síntomas del cáncer.
En algunos aspectos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, metástasis óseas, tumores cerebrales, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, linterna de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer, y cualquier combinación de los mismos
En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido se formulan para la administración mediante un dispositivo que comprende una bomba, un parche, un reservorio de fármaco, un dispositivo de aguja corta, un dispositivo de una sola aguja, un dispositivo de múltiples agujas, un dispositivo de microagujas, un dispositivo de inyección a chorro, un dispositivo de administración balístico de polvo/partículas, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía de RF, corriente eléctrica, o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una composición divulgada en la presente memoria está entre aproximadamente 0,10 mg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg. En algunos aspectos, las composiciones divulgadas en la presente memoria se formulan para su administración a un sujeto humano.
En algunos aspectos, las composiciones y formulaciones divulgadas en la presente memoria son para su uso en el tratamiento del cáncer. En algunos aspectos, las composiciones y formulaciones divulgadas se utilizan para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Debe entenderse que no hay intención de limitar las combinaciones de polinucleótidos divulgadas en la presente memoria (p. ej., un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L) a las formas particulares divulgadas. En este sentido, las divulgaciones relacionadas con un polinucleótido particular y su respectivo polipéptido codificado en esta sección son igualmente aplicables a polinucleótidos adicionales y sus respectivos polipéptidos codificados, p. ej., un tercer, cuarto, quinto, etc. polipéptido, para ser combinado con los polinucleótidos que codifican IL-23, IL-36-gamma, IL-18, y/u OX40L divulgados en la presente memoria. Por lo tanto, las divulgaciones relacionadas con un "primer polinucleótido" o "segundo polinucleótido" (o los respectivos polipéptidos codificados) son igualmente aplicables a un "tercer polinucleótido" y polinucleótidos sucesivos (o sus respectivos polipéptidos codificados).
Además, las divulgaciones específicas relacionadas con una proteína particular codificada por el primer o segundo polinucleótido, p. ej., la divulgación de que "los segundos polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma humano que carece de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14 o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o extremo C del polipéptido IL-36-gamma de tipo salvaje”, sería igualmente aplicable a proteínas terceras y sucesivas. Por consiguiente, un experto en la técnica entendería que si la tercera proteína fuera, por ejemplo, OX40L, el tercer polinucleótido podría comprender un ARNm que codifica un polipéptido OX40L humano que carece de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 14 o al menos 15 aminoácidos en el extremo N o extremo C del polipéptido OX40L de tipo salvaje, como se divulga anteriormente con respecto al primer o segundo polipéptido de la presente divulgación.
III. Métodos de Uso de Combinaciones de Polinucleótidos que Codifican Polipéptidos Inmunomoduladores
La inmunoterapia, también conocida como inmunooncología, ha revolucionado el tratamiento del cáncer al introducir terapias que no se dirigen al tumor, sino al sistema inmune del huésped, terapias que poseen perfiles únicos de eventos adversos y terapias que podrían curar muchos tipos de cáncer. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de una enfermedad al inducir, potenciar o suprimir una respuesta inmune. Las inmunoterapias diseñadas para incitar o amplificar una respuesta inmune se denominan "inmunoterapias de activación", mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmune se denominan "inmunoterapias de supresión".
Los cánceres de pulmón, riñón, vejiga y piel se encuentran entre los que obtienen una eficacia sustancial del tratamiento con inmunooncología en términos de supervivencia o respuesta tumoral, siendo el melanoma posiblemente el que muestra los mayores beneficios. La inmunoterapia a menudo presenta un tratamiento con inhibidores de puntos de control con una clase nueva y emocionante de fármacos biológicos conocidos como anticuerpos inhibidores de puntos de control. Las dianas incluyen, por ejemplo, PD-1, PD-L1 y CTLA-4.
Los anticuerpos monoclonales que se dirigen a PD-1, PD-L1 o CTLA4 pueden estimular la respuesta inmune contra las células cancerosas y se han mostrado muy prometedores en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer. Por ejemplo, pembrolizumab (Keytruda®) y nivolumab (Opdivo®) se dirigen a PD-1; atezolizumab (Tecentriq®) se dirige a PD-L1; e ipilimumab (Yervoy®) se une a e inhibe CTLA-4.
Una preocupación con estos fármacos es que pueden permitir que el sistema inmune ataque algunos órganos normales del cuerpo, lo que puede provocar efectos secundarios graves o incluso potencialmente mortales en algunas personas. Una vía para reducir tales efectos secundarios es administrar otros agentes en combinación con estos anticuerpos inhibidores de puntos de control, idealmente permitiendo a los médicos reducir la dosis de tratamiento del anticuerpo.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar el cáncer (p. ej., reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita) que comprenden la administración de cualquiera de las composiciones divulgadas en la Sección II, supra. En particular, la presente divulgación proporciona métodos para tratar el cáncer (p. ej., reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita) que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita:
(i) al menos un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una proteína que comprende un polipéptido IL-23,
(ii) al menos un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y/o
(iii) al menos un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una proteína que comprende un polipéptido OX40L.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor y/o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto al menos dos polinucleótidos, en donde los al menos dos polinucleótidos se seleccionan de un primer polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un tercer polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L. En un aspecto particular, el método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor y/o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, y/o (iv) cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos particulares, el método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor y/o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 141), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 143), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ ID NO: 145), preferiblemente en una relación de masa de 1:2:1 p/p. En algunos aspectos particulares, el método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor y/o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita comprende además administrar al sujeto cantidades efectivas de polinucleótido adicional, p. ej., un cuarto o quinto polinucleótido que codifica una cuarta o quinta proteína.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para promover un efecto antitumoral (p. ej., inducir la proliferación de células T, inducir la infiltración de células T en un tumor, inducir una respuesta de células T de memoria, aumentar el número de células NK, etc.) administrando el primer, segundo, y/o tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) divulgados en la presente memoria.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para activar las células T en un sujeto que lo necesita, inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, inducir la infiltración de células T en un tumor de un sujeto que lo necesita, y/o inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un primer polinucleótido que codifica IL-23, un segundo polinucleótido que codifica IL-36-gamma o IL-18, un tercer polinucleótido que codifica OX40L, o combinaciones de los mismos. En aspectos particulares, el método para activar las células T en un sujeto que lo necesita, inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesita, inducir la infiltración de células T en un tumor de un sujeto que lo necesita, y/o inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 141), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 143), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ ID NO: 145), preferiblemente en una relación de masa de 1:2:1 p/p. En determinados aspectos, la administración intratumoral del primer polinucleótido (p. ej., ARNm), segundo polinucleótido (p. ej., ARNm) y/o tercer polinucleótido (p. ej., ARNm) puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral (p. ej., infiltración de células T en un tumor) en comparación con otras rutas de administración.
En un aspecto, las células T activadas en el sujeto reducen o disminuyen el tamaño de un tumor o inhiben el crecimiento de un tumor en el sujeto. La activación de las células T se puede medir usando aplicaciones en la técnica tales como la medición de la proliferación de las células T; medición de la producción de citoquinas con ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) o ensayos de inmunospot ligados a enzimas (ELISPOT); o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de las células T (p. ej., CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como la citometría de flujo.
En un aspecto, la proliferación de las células T en el sujeto está dirigida a una respuesta inmune antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la proliferación de las células T en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La proliferación de las células T se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como recuento de células, tinción de viabilidad, ensayos de densidad óptica o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de las células T (p. ej., CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como la citometría de flujo.
En un aspecto, la infiltración de las células T en un tumor del sujeto está dirigida a una respuesta inmune antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la infiltración de las células T en un tumor del sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La infiltración de las células T en un tumor se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como el corte de tejidos y la tinción para marcadores celulares, la medición de la producción local de citoquinas en el sitio del tumor, o la detección de marcadores de superficie de células T con técnicas tales como la citometría de flujo.
En un aspecto, la respuesta de las células T de memoria en el sujeto está dirigida a una respuesta inmune antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la respuesta de las células T de memoria en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Una respuesta de células T de memoria se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como la medición de marcadores de células T asociados con células T de memoria, la medición de la producción local de citoquinas relacionada con la respuesta inmune de memoria, o la detección de marcadores de superficie de las células T de memoria con técnicas tales como la citometría de flujo.
En determinados aspectos, las células T activadas por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (células L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T activadas por los presentes métodos son células Th1. En otros aspectos, las células T activadas por los presentes métodos son células Th2. En otros aspectos, las células T activadas por la presente divulgación son células T citotóxicas.
En algunos aspectos, las células T que se infiltran por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40l+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T que se infiltran por los presentes métodos son células Th1. En otros aspectos, las células T que se infiltran por los presentes métodos son células Th2. En otros aspectos, las células T que se infiltran por la presente divulgación son células T citotóxicas.
En algunos aspectos, las células T de memoria inducidas por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, las células T de memoria por los presentes métodos son células Th1. En otros aspectos, las células T de memoria por los presentes métodos son células Th2. En otros aspectos, las células T de memoria por la presente divulgación son células T citotóxicas.
La presente divulgación proporciona además un método para aumentar el número de células asesinas naturales (NK) en un sujeto que lo necesita que comprende administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica IL-23 y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18. En un aspecto particular, el método para aumentar el número de células asesinas naturales (NK) en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 141), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 143), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ ID NO: 145), preferiblemente en una relación de masa de 1:2:1 p/p. En un aspecto, el aumento del número de células NK en el sujeto está dirigido a una respuesta inmune antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, el aumento del número de células NK en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Los aumentos en el número de células NK en un sujeto se pueden medir utilizando aplicaciones en la técnica, tales como la detección de marcadores de superficie de células NK (p. ej., CD335/NKp46; CD336/NKp44; CD337/NPp30) o marcadores de células NK intracelulares (p. ej., perforina; granzimas; granulisina).
En ciertos aspectos, la administración de al menos dos ARNm seleccionados del ARNm que codifica IL-23, el ARNm que codifica IL-36-gamma o el ARNm que codifica IL-18, y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número total de células NK del sujeto en comparación con el número de células NK en un sujeto al que no se le administran los al menos dos ARNm o al que se le administra el ARNm que codifica IL-23 solo, el ARNm que codifica IL-36-gamma solo, el ARNm que codifica IL-18, o el ARNm que codifica OX40L solo. En otros aspectos, la administración de al menos dos ARNm seleccionados del ARNm que codifica IL-23, el ARNm que codifica IL-36-gamma, el ARNm que codifica IL-18 y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número total de células NK en el sujeto en comparación con un sujeto al que se le administra una célula dendrítica transducida con el ARNm que codifica un polipéptido OX40L solo, el ARNm que codifica IL-23 solo, o el ARNm que codifica IL-36-gamma solo, o el ARNm que codifica IL-18. En otros aspectos, la administración de al menos dos ARNm seleccionados del ARNm que codifica IL-23, el ARNm que codifica IL-36-gamma, el ARNm que codifica IL-18, y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número de células NK del sujeto en el microentorno tumoral en comparación con el de un sujeto al que no se le administran los al menos dos ARNm o al que se le administra el ARNm que codifica IL-23 solo, el ARNm que codifica IL-36-gamma solo, el ARNm que codifica IL-18 solo, o el ARNm que codifica el polipéptido OX40L solo. En otros aspectos, la administración de al menos dos ARNm seleccionados del ARNm que codifica IL-23, el ARNm que codifica IL-36-gamma, el ARNm que codifica IL18 y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L aumenta el número de células NK en el sujeto en el microentorno tumoral en comparación con el de un sujeto al que se le administra una célula dendrítica transducida con el ARNm que codifica un polipéptido OX40L solo, el ARNm que codifica IL-23 solo, el ARNm que codifica IL-18 solo, o el ARNm que codifica IL-36-gamma solo. En otros aspectos, la concentración de células NK en el microentorno tumoral aumenta mientras que el número total de células NK en el sujeto permanece igual.
En determinados aspectos de la divulgación, el número de células NK aumenta al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, al menos aproximadamente seis veces, al menos aproximadamente siete veces, al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente nueve veces, o al menos aproximadamente diez veces en comparación con un control (p. ej., solución salina o un ARNm sin expresión de IL-23, IL-36-gamma u OX40L). En aspectos particulares, el número de células NK aumenta por al menos dos ARNm seleccionados del ARNm que codifica IL-23, el ARNm que codifica IL-36-gamma, el ARNm que codifica IL-18 y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L en al menos aproximadamente dos veces en comparación con un control (p. ej., solución salina o un ARNm sin expresión de IL-23, IL-36-gamma, IL-18 u OX40L).
En un aspecto, la administración de las combinaciones divulgadas en la presente memoria reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces, al menos 4,5 veces o al menos 5 veces mejor que (i) una administración del primer polinucleótido que codifica la primera proteína sola (p. ej., un polinucleótido que codifica una proteína que comprende un polipéptido IL-23), (ii) una administración del segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína sola (p. ej., un polinucleótido que codifica una proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18), o (iii) una administración del tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína sola (p. ej., un polinucleótido que codifica una proteína que comprende un polipéptido OX40L). La reducción o disminución de tamaño o la inhibición del crecimiento tumoral se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica sin experimentación indebida.
En algunos aspectos, la reducción o disminución del tamaño del tumor, o la inhibición del crecimiento del tumor es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces, al menos 4,5 veces, o al menos 5 veces mayor que un control (p. ej., tratamiento con PBS, tratamiento con un polinucleótido que codifica una proteína de control o tratamiento con una proteína de control).
En algunos aspectos, el primer polinucleótido administrado de acuerdo con los métodos divulgados en la presente memoria comprende un ARN, p. ej., un ARNm, que codifica la primera proteína (p. ej., una proteína que comprende un polipéptido IL-23). En algunos aspectos, el segundo polinucleótido administrado de acuerdo con los métodos divulgados en la presente memoria comprende un ARN, p. ej., un ARNm, que codifica la segunda proteína (p. ej., una proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18). En algunos aspectos, el tercer polinucleótido administrado de acuerdo con los métodos divulgados en la presente memoria comprende un ARN, p. ej., un ARNm, que codifica la tercera proteína (p. ej., una proteína que comprende un polipéptido OX40L).
Los métodos divulgados en la presente memoria comprenden administrar cualquiera de las composiciones de la presente divulgación por cualquier ruta disponible, incluyendo, pero no limitadas a, intratumoral, enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación en la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraperitoneal (en el peritoneo), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (a través del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosal (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, gotas para los ojos (sobre la conjuntiva), o en gotas para los oídos.
En algunos aspectos, los métodos divulgados en la presente memoria comprenden administrar el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido por la ruta subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, intraventricular, oral, por inhalación de pulverización, por la ruta tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o a través de un reservorio implantado.
En algunos aspectos, los métodos divulgados en la presente memoria comprenden administrar el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y/o el tercer polinucleótido como una formulación para administración intramuscular, subcutánea, intratumoral o intradérmica. En algunos aspectos, la formulación para administración intramuscular, subcutánea, intratumoral o intradérmica comprende polinucleótidos adicionales, p. ej., un tercer, un cuarto o un quinto polinucleótido. En ciertos aspectos, la administración intratumoral del primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y/o el tercer polinucleótido puede aumentar la eficacia del efecto antitumoral en comparación con otras rutas de administración. En algunos aspectos, los polinucleótidos adicionales, p. ej., un tercer, un cuarto o un quinto polinucleótido, se administran por la ruta intratumoral aumentando la eficacia del efecto antitumoral en comparación con otras rutas de administración.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, y/o el tercer polinucleótido se formulan para administración in vivo. En algunos aspectos, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido se pueden coformular en relaciones de peso variables, por ejemplo, con cantidades equivalentes (en peso) de cada polinucleótido o con uno cualquiera de los polinucleótidos presentes en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 veces la cantidad (en peso) de los otros polinucleótidos. En un aspecto, los polinucleótidos de IL-23:IL-36gamma:OX40L se coformulan en una relación en peso (masa) tal que los polinucleótidos de IL-23 y OX40L están en cantidades aproximadamente iguales y el polinucleótido de IL-36-gamma está presente en una cantidad de peso (masa) mayor, tal como una cantidad de peso (masa) 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 veces mayor. En un aspecto particular aspectos, los polinucleótidos de IL-23:IL-36gamma:OX40L se coformulan en una relación en peso (masa) de 1:2:1. En el uso de la presente memoria, la relación de masa también puede referirse, por referencia, a una composición que comprende polinucleótidos (p. ej., ARNm) que codifican OX40L:IL-23:IL-36gamma formulados en una relación de peso (masa) de 1:1:2.
En otros aspectos, los polinucleótidos de IL-23:IL-36gamma:OX40L se coformulan en una relación de peso (masa) de 1:1:1,2:1:1, 1:2:1, 1:1:2, 3:1:1, 1:3:1, 1:1:3, 4:1:1, 1:4:1, 1:1:4, 5:1:1, 1:5:1, 1:1:5, 6:1:1, 1:6:1, 1:1:6, 7:1:1, 1:7:1, 1:1:8, 9:1:1, 1:9:1, 1:1:9, 10:1:1, 1:10:1, 1:1:10, 11:1:1, 1:11:1, 1:1:11, 12:1:1, 1:12:1, 1:1:12, 13:1:1, 1:13:1, 1:1:13, 14:1:1, 1:14:1, 1:1:14, 15:1:1, 1:15:1, 1:1:15, 16:1:1, 1:16:1, 1:1:16, 17:1:1, 1:17:1, 1:1:17, 18:1:1, 1:18:1, 1:1:18, 19:1:1, 1:19:1, 1:1:19, 20:1:1, 1:20:1, 1:1:20, 25:1:1, 1:25:1, 1:1:25, 30:1:1, 1:30:1, 1:1:30, 35:1:1, 1:35:1, 1:1:35, 40:1:1, 1:40:1, 1:1:40, 45:1:1, 1:45:1, 1:1:45, 50:1:1, 1:50:1, o 1:1:50. En otros aspectos, cada uno de los tres polinucleótidos puede estar presente en la coformulación con un peso diferente. Solo como ejemplo, los polinucleótidos de IL-23:IL-36gamma:OX40L se pueden coformular a una relación de peso (masa) de 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, o 3:2:1; o alternativa a una relación de peso (masa) de 1:3:5, 1:5:3, 3:5:1, 3:1:5, 5:1:3, o 5:3:1; o alternativa a una relación de peso (masa) de 1:5:10, 1:10:5, 5:1:10, 5:10:1, 10:1:5, o 10:5:1. En aspectos particulares, (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 140), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 16), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ ID NO: 21) se formulan en una relación de peso (masa) de 1:2:1. Si bien esta es una formulación preferida, el experto en la técnica apreciará fácilmente que las cantidades de uno cualquiera de los tres constituyentes fuera de esta relación también pueden proporcionar formulaciones que son adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos divulgados en la presente memoria.
La coformulación de polinucleótidos se puede administrar como dosis única o como dosis múltiples. Las coformulaciones con relaciones de peso (masa) variables, p. ej., coformulación #1 en la que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están presentes en 1:2:1 p/p y la coformulación #2 en la que el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido están presentes en 1: 1:2 p/p, pueden administrarse cada una, una o múltiples veces de forma secuencial, concurrente o simultánea.
En un aspecto, la coformulación 1:2:1 de (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 140), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 16), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ ID NO: 21) se administra como dosis única o como dosis múltiples.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, la administración de una composición divulgada en la presente memoria trata un cáncer.
En ciertos aspectos del método divulgado en la presente memoria, las composiciones divulgadas en la presente memoria se administran para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, metástasis óseas, tumores cerebrales, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer, y cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y/o el tercer polinucleótido se administra mediante un dispositivo que comprende una bomba, un parche, un reservorio de fármaco, un dispositivo de aguja corta, un dispositivo de una sola aguja, un dispositivo de múltiples agujas, un dispositivo de microagujas, un dispositivo de inyección a chorro, un dispositivo de administración balístico de polvo/partículas, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía de RF, corriente eléctrica, o cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, los polinucleótidos adicionales, p. ej., un tercer, un cuarto o quinto polinucleótido también se administran mediante un dispositivo que comprende una bomba, un parche, un reservorio de fármaco, un dispositivo de aguja corta, un dispositivo de una sola aguja, un dispositivo de múltiples agujas, un dispositivo de microagujas, un dispositivo de inyección a chorro, un dispositivo de administración balístico de polvo/partículas, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía de RF, corriente eléctrica, o cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la cantidad efectiva de las composiciones divulgadas en la presente memoria utilizadas en los métodos de la presente divulgación está entre aproximadamente 0,10 mg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano.
En algunos aspectos, de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L son parte de la misma composición (p. ej., una solución contiene el primer, segundo y tercer polinucleótido). En algunos aspectos, de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L son parte de diferentes composiciones (p. ej., cada polinucleótido puede estar en una solución diferente, o pueden combinarse en diferentes soluciones).
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 se administran simultáneamente.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido iL-18 se administran concurrentemente. En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 y un segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 se administran secuencialmente (es decir, el primer polinucleótido se puede administrar primero, seguido de la administración del segundo polinucleótido, o viceversa).
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido OX40L y el polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 se administran simultáneamente. En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el polinucleótido que codifica la proteína que comprende un polipéptido OX40L y el polinucleótido que codifica la proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 se administran concurrentemente. En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el polinucleótido que codifica la proteína que comprende un polipéptido OX40L y un polinucleótido que codifica la proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma, se administran secuencialmente (es decir, el polinucleótido de OX40L se puede administrar primero, seguido de la administración del polinucleótido de IL-36-gamma o un polinucleótido de IL-18, o viceversa).
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y el tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L se administran simultáneamente. En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido iL-18 y el tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L se administran concurrentemente. En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, el primer polinucleótido que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L se administran secuencialmente (es decir, el primer, segundo y tercer polinucleótido se pueden administrar según cualquier secuencia de administración). En un aspecto particular, la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 140, codificada por la SEQ ID NO: 141), el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 16, codificada por la SEQ ID NO: 143), y el tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ iD NO: 21, codificada por la SEQ ID NO: 145) se administran en una relación final de peso (masa) de 1:2:1 independientemente de la secuencia de administración.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para tratar un tumor (p. ej., reducir el tamaño de un tumor) localizado distalmente con respecto a un tumor tratado (tumor proximal). En algunos aspectos, el tumor proximal se trata con un primer polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos. Los métodos divulgados en la presente memoria se pueden usar, por ejemplo, para tratar tumores en localizaciones donde la administración de una terapia por la ruta intratumoral sería insegura o poco práctica mediante la administración de una composición divulgada en la presente memoria (p. ej., un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO : 141), un ARNm de un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., Se Q ID NO: 143) y un tercer ARNm que codifica un polipéptido OX40L (p. ej., Se Q ID NO: 145) por la ruta intratumoral a uno o más tumores accesibles. En algunos aspectos, la administración de una terapia divulgada en la presente memoria a un tumor proximal puede usarse para tratar metástasis.
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para tratar un tumor que no responde o responde deficientemente a los inhibidores de puntos de control (p. ej., una molécula dirigida a PD-1 o PD-L1, tal como un anticuerpo anti-PD-Ll) que comprende la administración de un primer polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un tercer polinucleótido (p. ej., un ARNm) que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, junto con un inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-Ll y/o un anticuerpo anti-PD-1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4). En un aspecto particular, la primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., s Eq ID NO: 140, codificada por la SEQ ID NO: 141), el segundo polinucleótido que codifica la segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 16, codificada por la SEQ ID NO: 143), y el tercer polinucleótido que codifica la tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., SEQ iD No : 21, codificada por la SEQ ID NO: 145) se administran junto con un inhibidor de puntos de control (p. ej., un anticuerpo anti-PD-LI y/o un anticuerpo anti-PD-1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4).
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "doblete", "terapia de doblete", "terapia de combinación de doblete", "terapia de doblete de ARNm" y las variantes gramaticales de los mismos se refieren a un tratamiento de combinación en el que dos ARNm que codifican dos proteínas seleccionadas de un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L se administran a un paciente que lo necesita. En algunos aspectos, la terapia de doblete consiste esencialmente en o consiste en dos ARNm que codifican un polipéptido IL-23 y un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, respectivamente. La terapia de doblete se puede administrar, p. ej., (i) como una única composición que comprende ambos ARNm, o (ii) como composiciones separadas, comprendiendo cada una un ARNm. En algunos aspectos, los ARNm en la terapia de doblete se administran simultáneamente. En otros aspectos, los ARNm en la terapia de doblete se administran secuencialmente.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "triplete", "terapia de triplete", "terapia de combinación de triplete", "terapia de triplete de ARNm" y las variantes gramaticales de los mismos se utilizan indistintamente y se refieren a un tratamiento de combinación en el que tres ARNm que codifican un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L se administran a un paciente que lo necesita. En algunos aspectos, la terapia de triplete consiste esencialmente en o consiste en tres ARNm que codifican un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un polipéptido OX40L, respectivamente. La terapia de triplete se puede administrar, p. ej., (i) como una única composición que comprende los tres ARNm (p. ej., en una relación final de peso (masa) de 1:2:1 p/p IL-23:IL-36gamma:OX40L), o (ii) como composiciones separadas, comprendiendo cada una uno o dos ARNm (p. ej., en una relación final de peso (masa) de 1:2:1 p/p IL-23:IL-36gamma:OX40L). En algunos aspectos, los ARNm en la terapia de triplete se administran simultáneamente. En otros aspectos, cada ARNm en la terapia de triplete, o combinaciones de los mismos, se administra secuencialmente. En un aspecto particular, la terapia de triplete comprende o consiste esencialmente en (i) un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23 (p. ej., SEQ ID NO: 140, codificada por la SEQ ID NO: 141), (ii) un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma (p. ej., SEQ ID NO: 16, codificada por la SEQ ID NO: 143), y (iii) un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (p. ej., s Eq ID NO: 145, codificada por la SEQ ID NO: 145), formulada preferiblemente en una relación de peso (masa) de 1:2:1, administrado según cualquier secuencia de administración (p. ej., secuencial, concurrente o simultánea).
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento en donde la administración de polinucleótidos o combinación de polinucleótidos (p. ej., ARNm) divulgados en la presente memoria a un sujeto que los necesita (p. ej., un paciente con cáncer) da como resultado:
(a) aumento en el nivel de granulocitos en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o iL-18, o un polipéptido OX40L;
(b) aumento en el nivel de células dendríticas con presentación cruzada en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o IL-18, o un polipéptido OX40L;
(c) aumento en la relación de células T efectoras a supresoras en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con la relación después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(d) aumento en el nivel de células T efectoras de memoria en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(e) aumento en el nivel de expresión de PDL1 en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o lL-18, o un polipéptido OX40L; o
(f) una combinación de los mismos.
La presente divulgación proporciona un método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido interleuquina-23 (IL-23) y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido interleuquina-36-gamma (IL-36-gamma) o un polipéptido IL-18; o (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica un una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma, y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L (OX40L), en donde la administración del doblete o triplete al sujeto da como resultado:
(a) aumento en el nivel de granulocitos en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o iL-18, o un polipéptido OX40L;
(b) aumento en el nivel de células dendríticas con presentación cruzada en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o IL-18, o un polipéptido OX40L;
(c) aumento en la relación de células T efectoras a supresoras en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con la relación después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(d) aumento en el nivel de células T efectoras de memoria en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L;
(e) aumento en el nivel de expresión de PDL1 en una o más muestras obtenidas del sujeto después de la administración de doblete o triplete en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, o OX40L; o
(f) una combinación de los mismos.
Los niveles de granulocitos, células dendríticas de presentación cruzada (p. ej., células CD103+), células T efectoras (p. ej., células CD4+ o CD8+), células T supresoras (p. ej., células Treg), células T efectoras de memoria (p. ej., células CD4+ o CD8+), células CD11b+, expresión de PD-L1, etc. pueden medirse en una o más muestras obtenidas del sujeto según cualquier método conocido en la técnica.
En algunos aspectos, el aumento en el nivel de granulocitos se cuantifica como (i) granulocitos como porcentaje de células CD45+, o (ii) granulocitos por mg de tumor. En algunos aspectos, las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de células dendríticas de presentación cruzada se cuantifica como (i) células dendríticas de presentación cruzada por mg de tumor, (ii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada en el ganglio linfático de drenaje tumoral (TdLN), o (iii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada como porcentaje de células CD45+, o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la relación de células T efectoras a supresoras se cuantifica como relación CD8:Treg. En aspectos, las células T efectoras de memoria son células CD4+ y/o CD8+. En algunos aspectos, el nivel de expresión de PD-L1 se cuantifica como (i) número de células positivas para CD11b+, o (ii) expresión de PD-L1 en células CD11b+.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de granulocitos en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de granulocitos se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de granulocitos se mide como (i) granulocitos como porcentaje de células CD45+, y/o (ii) granulocitos por mg de tumor, en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica IL-23 o un único polinucleótido que codifica lL-36-gamma o un polipéptido IL-18.
También se proporciona un método para aumentar los niveles de células dendríticas de presentación cruzada en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células dendríticas de presentación cruzada se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+. En algunos aspectos, el aumento en el nivel de células dendríticas CD103+ de presentación cruzada se mide como (i) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada por mg de tumor, (ii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada en TdLN, (iii) células dendríticas CD103+ de presentación cruzada como porcentaje de células CD45+, o (iv) una combinación de los mismos, en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica IL-23, un único polinucleótido que codifica IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, o un único polinucleótido que codifica OX40L.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar la relación de células T efectoras a supresoras en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) ) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde la relación de células T efectoras a supresoras se mide en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, la relación de células T efectoras a células T supresoras se mide como la relación entre las células T CD8+ y las células T reguladoras (Treg), es decir, la relación CD8:Treg.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de células T efectoras de memoria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células T efectoras de memoria se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células T efectoras de memoria son células CD4+ y/o CD8+. En algunos aspectos, el aumento en los niveles de células T efectoras de memoria se mide como células T efectoras de memoria dentro del tumor en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica OX40L.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar los niveles de células positivas para PD-L1 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, en donde los niveles de células positivas para PD-L1 se miden en una o más muestras obtenidas del sujeto. En algunos aspectos, las células positivas para PD-L1 son células CD11b+.
En algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, la muestra o muestras obtenidas del sujeto se seleccionan del grupo que consiste en tejido tumoral, infiltrado tumoral, sangre, plasma y cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la una o más muestras de control son una muestra o muestras obtenidas de un sujeto sano o un sujeto con un tumor.
En algunos aspectos, el nivel umbral es un valor predeterminado o un valor obtenido de una o más muestras, p. ej., un valor obtenido de un combinado de muestras de una población de individuos sanos o una población de sujetos con un tumor.
La presente divulgación también proporciona un método para determinar si tratar a un sujeto que tiene una enfermedad tumoral con una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido iL-18 y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o (iii) cualquier composición divulgada en la presente memoria, comprendiendo el método (i) administrar al sujeto una dosis inicial de doblete o triplete, y
(ii) tratar al sujeto si después de la administración de la dosis inicial de doblete o triplete se determina que el sujeto tiene un aumento en
(a) el nivel de granulocitos,
(b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada,
(c) la relación de células T efectoras a supresoras,
(d) el nivel de células T efectoras de memoria,
(e) el nivel de células positivas para PD-L1,
(f) la expresión de PD-L1, o
(g) una combinación de los mismos,
con respecto a un nivel umbral.
También se proporciona un método para seleccionar a un sujeto diagnosticado con un tumor como candidato para tratamiento con una composición que comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las SEQ ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o (iii) cualquier composición divulgada en la presente memoria, comprendiendo el método
(i) administrar al sujeto una dosis inicial de doblete o triplete, y
(ii) seleccionar al sujeto para tratamiento si después de la administración de la dosis inicial de doblete o triplete se determina que el sujeto tiene un aumento en
(a) el nivel de granulocitos,
(b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada,
(c) la relación de células T efectoras a supresoras,
(d) el nivel de células T efectoras de memoria,
(e) el nivel de células positivas para PD-L1,
(f) la expresión de PD-L1, o
(g) una combinación de los mismos,
con respecto a un nivel umbral.
La presente divulgación también proporciona un método para medir la eficacia de una composición para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita, en donde la composición comprende (i) dos polinucleótidos (p. ej., ARNm) en combinación (doblete), en donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, y el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18; o, (ii) tres polinucleótidos (p. ej., ARNm, p. ej., las s Eq ID NO: 141, 143 y 145) en combinación (triplete), donde el primer polinucleótido codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, el segundo polinucleótido codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y el tercer polinucleótido codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, o (iii) cualquier composición divulgada en la presente memoria, en donde el método comprende medir en al menos una muestra tomada del sujeto (a) el nivel de granulocitos, (b) el nivel de células dendríticas de presentación cruzada, (c) la relación de células T efectoras a supresoras, (d) el nivel de células T efectoras de memoria, (e) el nivel de células positivas para PD-L1, (f) la expresión de PD-L1, o (g) una combinación de los mismos, en donde un aumento en al menos una de las mediciones con respecto a un nivel umbral indica que el sujeto está respondiendo al tratamiento con el doblete o triplete.
IV. Enfermedades, trastornos y/o afecciones
En algunos aspectos, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente divulgación, p. ej., un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y/o un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L pueden usarse para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita.
En algunos aspectos, pueden administrarse polinucleótidos adicionales (p. ej., un cuarto polinucleótido) en combinación con un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y/o un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita.
Por consiguiente, en algunos aspectos, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación, es decir, un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L pueden usarse para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesita.
En algunos aspectos, el tumor está asociado con una enfermedad, trastorno y/o afección. En un aspecto particular, la enfermedad, trastorno y/o afección es un cáncer. Así, en un aspecto, la administración de un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y/o un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, trata un cáncer.
En otro aspecto, la administración de un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido iL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y además en combinación con un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una tercera proteína, en donde la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L, trata un cáncer.
Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células anormales en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Un "cáncer" o "tejido canceroso" puede incluir un tumor en diversos estadios. En determinados aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en estadio 0, de modo que, p. ej., el cáncer o tumor se encuentra en una fase muy temprana de desarrollo y no ha hecho metástasis. En algunos aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en estadio I, de modo que, p. ej., el cáncer o tumor tiene un tamaño relativamente pequeño, no se ha diseminado al tejido cercano y no ha hecho metástasis. En otros aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en estadio II o estadio III, de modo que, p. ej., el cáncer o tumor es más grande que en el estadio 0 o estadio I, y ha crecido hacia los tejidos vecinos, pero no ha hecho metástasis, excepto potencialmente a los ganglios linfáticos. En otros aspectos, el cáncer o tumor se encuentra en estadio IV, de modo que, p. ej., el cáncer o tumor ha hecho metástasis. El estadio IV también se puede denominar cáncer avanzado o metastásico.
En algunos aspectos, el cáncer puede incluir, pero no se limita a, cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, metástasis óseas, tumores cerebrales, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, linterna de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe y cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer.
En algunos aspectos, el tumor es un tumor sólido. Un "tumor sólido" incluye, pero no se limita a, sarcoma, melanoma, carcinoma u otro cáncer de tumor sólido. "Sarcoma" se refiere a un tumor compuesto por una sustancia como el tejido conectivo embrionario y está compuesto generalmente por células estrechamente empaquetadas incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abermethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma ameoblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, corio-carcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma con tumor de Wilm, sarcoma de endometrio, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquístico, sarcoma sinovial o sarcoma telangiectásico.
El término "melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma metastásico, melanoma nodular, melanoma subungal o melanoma de diseminación superficial.
El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y producir metástasis. Los carcinomas ilustrativos incluyen, p. ej., carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedocarcinoma, carcinoma de corpus, carcinoma cribriforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de conducto, carcinoma durum, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de la matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medulare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodo, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de riñón de células renales, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma de células de huso, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma en collar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso o carcinoma viflosum.
Los cánceres adicionales que pueden tratarse incluyen, p. ej., leucemia, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer papilar de tiroides, neuroblastoma, cáncer neuroendocrino, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer de próstata, cáncer de Müller, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de las trompas de Falopio o carcinoma seroso papilar uterino.
Los cánceres y/o tumores susceptibles de tratamiento según los métodos de la presente divulgación incluyen aquellos accesibles a través de la administración directa intratumoral y/o regional, es decir, administración en la región de un tumor diana. Por ejemplo, los tumores accesibles para la administración con una simple inyección de jeringa son fácilmente susceptibles de tratamiento. También son susceptibles de tratamiento los tumores en los que la inyección requiere algo de imagenología y/o administración guiada, y/o aquellos en los que es posible la inyección mediante inyección percutánea guiada por imágenes, o catéter/cánula directamente en el sitio, o endoscopia.
Los cánceres y/o tumores ilustrativos susceptibles de tratamiento incluyen melanoma, cáncer de mama, p. ej., TNBC, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma, CTLC, NHL, carcinoma de células basales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma hepatocelular (HCC), glioma, cáncer gástrico y cáncer de páncreas. Particularmente susceptibles de tratamiento son el melanoma, el cáncer de mama, p. ej., TNBC y cáncer de cabeza y cuello
Melanoma
El melanoma es una de las formas más agresivas de cáncer de piel. Además, las tasas de incidencia están aumentando y hay pocas opciones de tratamiento disponibles. El melanoma se detecta a una tasa de 132.000 casos nuevos por año en todo el mundo (76.000 casos nuevos por año en los Estados Unidos), lo que representa aproximadamente 10.000 muertes por año en los Estados Unidos. Alrededor del 25 % se da en pacientes < 40 años. Los inhibidores de PD-1 (p. ej., nivolumab, pembrolizumab) son actualmente el estándar de atención y evidencian una tasa de respuesta duradera del 37 %, y supervivencia libre de progresión del 30 % a los 2 años. Sin embargo, también se observa una progresión rápida para los no respondedores (mediana de 4 m) y se observa una supervivencia global de solo el 40 % a los 3 años sin evidencia de meseta, es decir, los pacientes tratados continúan retrocediendo.
Por lo tanto, existe una clara necesidad de tratamientos nuevos y más efectivos en este entorno. El melanoma también sirve como tumor modelo para comprender la inmunidad frente al cáncer. Los antígenos asociados a tumores de melanoma estuvieron entre los primeros antígenos de cáncer que se identificaron y clasificaron, y estudios posteriores mostraron que muchos de estos también se expresan en otros tipos de tumores. Además, la regresión del melanoma se ha asociado con el vitíligo, lo que confirma visiblemente un papel activo del sistema inmune en este tipo de cáncer, y también se ha observado en algunos casos la regresión espontánea de los melanomas primarios. Estas observaciones, relacionadas con la actividad del sistema inmune en el melanoma, proporcionaron una fuerte evidencia de que este tumor debería ser susceptible a la inmunoterapia. En este contexto, el melanoma ha estado durante mucho tiempo a la vanguardia de la investigación en inmunooncología y es probable que continúe utilizándose como un tumor modelo para aumentar nuestra comprensión de la inmunooncología y para informar de opciones de tratamiento en otros tipos de cánceres que responden a la inmunoterapia.
Cáncer de Mama T riple Negativo
Los cánceres de mama presentan diferentes características que requieren diferentes tipos de tratamiento. La mayoría de los cánceres de mama son positivos para receptores hormonales, lo que significa que las células cancerosas son estimuladas para crecer a partir de la exposición a las hormonas femeninas estrógeno y/o progesterona. Otros cánceres de mama se conocen como positivos para HER2, lo que significa que sobreexpresan el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, una ruta biológica que está implicada en la replicación y el crecimiento de una célula. Los cánceres de mama positivos para HER2 representan aproximadamente el 25 % de los cánceres de mama y se tratan con agentes que se dirigen al receptor para ralentizar el crecimiento y la replicación. Los cánceres de mama que no son estimulados para crecer por la exposición al estrógeno o la progesterona y son negativos para HER2 se denominan cánceres de mama triple negativos. Los cánceres de mama triple negativos tienden a ser más agresivos que otros cánceres de mama y tienen menos opciones de tratamiento en comparación con otros cánceres de mama. Aunque históricamente el cáncer de mama se ha considerado inmunológicamente silencioso, varios estudios preclínicos y clínicos sugieren que la inmunoterapia tiene el potencial de mejorar los resultados clínicos en pacientes con cáncer de mama. En general, la inmunoterapia tiene varias ventajas clave sobre la quimioterapia convencional y los tratamientos dirigidos al tumor mismo. En primer lugar, la inmunoterapia generalmente produce menos efectos secundarios, lo que permite que se administre durante períodos de tiempo más prolongados y/o en combinación con otros agentes sin toxicidad añadida. También es menos probable que los pacientes desarrollen resistencia a la inmunoterapia debido a la capacidad del sistema inmune para tomar como diana múltiples antígenos cancerosos simultáneamente y adaptarse a las células cancerosas cambiantes.
Cáncer de Cabeza y Cuello
El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) induce un estado inmunosupresor a través de varios mecanismos. Los pacientes con HNSCC tienen alterada la homeostasis de los linfocitos (principalmente, niveles reducidos de células T CD3+, CD4+, y CD8+) en comparación con controles sanos. Este desequilibrio se mantiene incluso 2 años después del tratamiento con intención curativa. Consistentemente, un mayor número de linfocitos CD4+ y CD8+ que se infiltran en el tumor se asocia con una mejor supervivencia global en pacientes con HNSCC. Además, la función de las células asesinas naturales (NK) se ve afectada en los pacientes con HNSCC.
Las células de HNSCC aplican ciertas estrategias para escapar de la inmunovigilancia y posterior eliminación. Por ejemplo, interaccionan indirectamente con el sistema inmune para mantener un microentorno inmunosupresor. En esencia, el HNSCC explota el hecho de que el sistema inmune está estrictamente regulado a través de puntos de control inmunes para evitar la autoinmunidad o la sobreactivación del sistema inmune en circunstancias fisiológicas.
Inmunoterapia Dirigida a Tumores
Los objetivos importantes para el campo de la inmunooncología son mejorar la tasa de respuesta y aumentar el número de indicaciones tumorales que responden a la inmunoterapia, sin aumentar los efectos secundarios adversos. Un enfoque para lograr estos objetivos es utilizar la inmunoterapia dirigida a tumores, es decir, centrar la activación inmune en la parte más relevante del sistema inmune. Esto puede mejorar la eficacia antitumoral y reducir los eventos adversos relacionados con el sistema inmune. La activación inmune dirigida a tumores puede lograrse mediante inyecciones locales de inmunomoduladores directamente en el tumor o en el área del tumor. Las terapias enfocadas en la toma como diana de los inhibidores de puntos de control y los receptores coestimuladores pueden generar respuestas de células T específicas de tumores a través de la activación inmune localizada.
Modulación de Microentornos Tumorales
En ciertos aspectos, una composición de la divulgación (p. ej., una composición de ARNm de doblete o triplete) se puede usar para modular los microentornos tumorales y/o puede seleccionarse para el tratamiento basándose en el microentorno tumoral en el sujeto a tratar. En un aspecto, una composición de la divulgación se usa para tratar un tumor que tiene un microentorno tumoral inflamado. En otro aspecto, una composición de la divulgación se usa para tratar un tumor que tiene un microentorno tumoral inmunosupresor. En otro aspecto más, una composición de la divulgación se usa para tratar un tumor que tiene un microentorno tumoral inmunológicamente estéril. En situaciones en las que el tumor tiene un microentorno tumoral inflamado, es decir, el microentorno tumoral ya presenta infiltración de células inmunes y/o inflamatorias, el tratamiento con la terapia de ARNm de doblete puede ser suficiente en lugar del tratamiento con terapia de ARNm de triplete (véase, p. ej., el Ejemplo 23, FIG. 45A-B). Por ejemplo, para el tratamiento de un tumor con un microentorno tumoral inflamado, en un aspecto, el tumor se trata con un polinucleótido que codifica un miembro de la familia de IL-12 (p. ej., IL-23) y un polinucleótido que codifica una señal coestimuladora de respuesta inmune (p. ej., OX40L).
V. Terapias de Combinación
En ciertos aspectos, los métodos de tratamiento divulgados en la presente memoria comprenden administrar un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y/o un tercer polinucleótido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L y comprende además la administración de uno o más agentes anticancerosos al sujeto. En ciertos aspectos, los métodos de tratamiento divulgados en la presente memoria comprenden administrar un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, un tercer polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L y comprende además la administración de uno o más agentes anticancerosos al sujeto.
En algunos aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son un ARNm. En ciertos aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son un ARNm que codifica un antígeno tumoral. En otros aspectos, el uno o más agentes anticancerosos no son un antígeno tumoral o un ARNm que codifica un antígeno tumoral. En algunos aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son agentes aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos. En otros aspectos, el uno o más agentes anticancerosos son un agente preaprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En algunos aspectos, el sujeto para los presentes métodos o composiciones ha sido tratado con una o más terapias estándar de atención. En otros aspectos, el sujeto para los métodos o composiciones no ha respondido a una o más terapias estándar de atención o terapias anticancerosas.
En los últimos años, la introducción de inhibidores de puntos de control inmunes con fines terapéuticos ha revolucionado el tratamiento del cáncer. Son de interés las terapias que presentan combinaciones de inhibidores de puntos de control con otras moléculas inhibidoras o coestimuladoras.
La regulación de las células T, es decir, la activación o la inhibición, está mediada por señales coestimuladoras o coinhibidoras. Esta interacción se ejerce a través de la interacción ligando/receptor. Las células T albergan una miríada de receptores activadores, como OX40, y receptores inhibidores (es decir, puntos de control inmunes) como el receptor de muerte programada 1 (PD-1) o la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) (Mellman et al. 2011 Nature.;480:480-489). La activación de estos puntos de control inmunes da como resultado la desactivación de las células T y el dominio de estas rutas por parte de las células tumorales contribuye a su escape inmune exitoso.
Los inhibidores de puntos de control inmunes tales como pembrolizumab o nivolumab, que se dirigen a la interacción entre el receptor de muerte programada 1/ligando de muerte programada 1 (PD-1/PD-L1) y PD-L2, se aprobaron recientemente para el tratamiento de diversas neoplasias malignas y actualmente se están investigando en ensayos clínicos para cánceres que incluyen melanoma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Los datos disponibles de estos ensayos indican una actividad sustancial acompañada de un perfil favorable de seguridad y toxicidad en estas poblaciones de pacientes.
Por ejemplo, los inhibidores de puntos de control se han ensayado en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma. En particular, los ensayos clínicos de fase III han revelado que terapias tales como ipilimumab y pembrolizumab, que se dirigen a los puntos de control inmunes CTLA4 y PD-1, respectivamente, han aumentado la supervivencia a tres años de los pacientes con melanoma hasta ~70 %, y la supervivencia global (>5 años) hasta ~30 %.
Asimismo, los inhibidores de puntos de control se han ensayado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. En estudios preclínicos, se ha mostrado que ese 45-80 % de tumores HNSCC expresan el ligando 1 de muerte programada (PD-L1) (Zandberg et al. (2014) Oral Oncol. 50:627-632). Actualmente, hay docenas de ensayos clínicos que evalúan la eficacia y seguridad de los inhibidores de puntos de control inmunes como monoterapia o en regímenes de combinación en HNSCC. Por ejemplo, los ensayos clínicos con inhibidores de PD 1, PD-L1 y CTLA-4 se están ensayando en HNSCC. Se generaron datos de que el anticuerpo de PD-1 pembrolizumab podría ser efectivo en pacientes con HNSCC metastásico/recurrente (R/M) en la fase 1b del ensayo de fase I/II Keynote-012 (Cheng. ASCO 2015, presentación oral). Más recientemente, se presentaron los datos del ensayo clínico aleatorizado de fase III CheckMate-141 (Gillison. AACR 2016, presentación oral). Este estudio investigó la eficacia del anticuerpo monoclonal de PD 1 nivolumab administrado cada 2 semanas en pacientes con HNSCC R/M refractario a platino. El estudio se detuvo antes de tiempo debido a la superioridad del brazo de nivolumab del estudio.
En un aspecto, el sujeto ha sido tratado previamente con un antagonista de PD-1 antes del polinucleótido de la presente divulgación. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 antes del polinucleótido de la presente divulgación. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado con una terapia de anticuerpos monoclonales anti-PD-1 antes del polinucleótido de los presentes métodos o composiciones. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 comprende nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-L1 antes del polinucleótido de la presente divulgación. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado con una terapia de anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 antes del polinucleótido de los presentes métodos o composiciones. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 comprende durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, el sujeto ha sido tratado con un antagonista de CTLA-4 antes del tratamiento con las composiciones de la presente divulgación. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado previamente con un anticuerpo monoclonal que se une a CTLA-4 antes de las composiciones de la presente divulgación. En otro aspecto, el sujeto ha sido tratado con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente divulgación. En otros aspectos, la terapia con anticuerpos anti-CTLA-4 comprende ipilimumab o tremelimumab.
En algunos aspectos, la divulgación está dirigida a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto (p. ej., por la ruta intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el primero, segundo, y/o tercer polinucleótido (p. ej., ARN, p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 o un polipéptido IL-36gamma, un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L, respectivamente, en combinación con un antagonista de PD-1, p. ej., un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1.
En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 (o una parte de unión a antígeno del mismo) útil para la divulgación es pembrolizumab. El pembrolizumab (también conocido como "KEYTRUDA®", lambrolizumab y MK-3475) es un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado dirigido contra el receptor de superficie celular humano PD-1 (muerte programada-i o muerte celular programada-i). El pembrolizumab se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. No. 8.900.587; véase también http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 (último acceso: 14 de diciembre de 2014). El pembrolizumab ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma recidivante o refractario y del NSCLC avanzado.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 útil para la divulgación es nivolumab. El nivolumab (también conocido como "OPDIVO®"; anteriormente denominado 5C4, BMS-936558, MDX-1106 u ONO-4538) es un anticuerpo IgG4 completamente humano inhibidor del punto de control inmune PD-1 (S228P) que impide de forma selectiva la interacción con los ligandos de PD-1 (PD-L1 y PD-L2), bloqueando así la regulación a la baja de las funciones de las células T antitumorales (Patente de EE. UU. No. 8.008.449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). El nivolumab ha mostrado actividad en una variedad de tumores sólidos avanzados, incluyendo el carcinoma de células renales (adenocarcinoma renal o hipernefroma), melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Topalian et al., 2012a; Topalian et al., 2014; Drake et al., 2013; WO 2013/173223.
En otros aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es MEDI0680 (anteriormente AMP-514), que es un anticuerpo monoclonal contra el receptor PD-1. MEDI0680 se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. No.
8.609.089B2 o en http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047 (último acceso el 14 de diciembre de 2014) .
En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es BGB-A317, que es un anticuerpo monoclonal humanizado. BGB-A317 se describe en la Publ. de EE. UU. No. 2015/0079109.
En ciertos aspectos, un antagonista de PD-1 es AMP-224, que es una proteína de fusión B7-DC Fc. AMP-224 se analiza en la Publ. de EE. UU. No. 2013/0017199 o en http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=700595 (último acceso el 8 de julio de 2015) .
En otros aspectos, la divulgación incluye un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto (p. ej., por la ruta intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el primer, segundo, y/o tercer polinucleótido (p. ej., ARN, p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 o un polipéptido IL-36gamma, un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L, respectivamente, junto con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 comprende Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la divulgación está dirigida a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto (p. ej., por la ruta intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el primer, segundo, y/o tercer polinucleótido (p. ej., a Rn , p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 o un polipéptido IL-36gamma, un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L, respectivamente, en combinación con un antagonista de PD-L1, p. ej., un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-LI comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.
En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 útil para la divulgación es MSB0010718C (también denominado Avelumab; véase US 2014/0341917) o BMS-936559 (anteriormente 12A4 o MDX-1105) (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 7.943.743; y WO 2013/173223). En otros aspectos, el anticuerpo anti-PD-Ll es MPDL3280A (también conocido como RG7446) (véase, p. ej., Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(supl):3000. Resumen; Patente de EE. UU. No. 8.217.149), MEDI4736 (también denominado Durvalumab; Khleif (2013) En: Proceedings from the European Cancer Congress 2013; 27 de septiembre-1 de octubre, 2013; Amsterdam, Países Bajos.
En otros aspectos, la divulgación está dirigida a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto (p. ej., por la ruta intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el primer, segundo, y/o tercer polinucleótido (p. ej., ARN, p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23 o un polipéptido IL-36gamma, un polipéptido IL-18 y un polipéptido OX40L, respectivamente, en combinación con un antagonista de CTLA-4, p. ej., un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 comprende Ipilimumab o Tremelimumab, o cualquier combinación de los mismos.
Un anticuerpo anti-CTLA-4 clínico ilustrativo es el mAb 10D1 humano (ahora conocido como ipilimumab y comercializado como YERVOY®) como se describe en la Patente de EE. UU. No. 6.984.720. Otro anticuerpo anti-CTLA-4 útil para los presentes métodos es tremelimumab (también conocido como CP-675.206). El tremelimumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 humano anti-CTLA-4. El tremelimumab se describe en WO/2012/122444, la Publ. de EE. UU. No 2012/263677, o la Publ. WO No. 2007/113648 A2.
En un aspecto, un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido gamma IL-36 o un polipéptido IL-18, y un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor PD-1, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor de PD-L1, un polinucleótido que codifica el mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto, un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36 gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un PD-1 o receptor de PD-L1 o un polinucleótido que codifica el mismo.
En otro aspecto, un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, se administran en combinación con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un CTLA-4 o un polinucleótido que codifica el mismo.
En otro aspecto más, un primer polinucleótido que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido iL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y un tercer polipéptido que codifica una tercera proteína que comprende un polipéptido OX40L, se administran en combinación con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un PD-1 o receptor de PD-L1 y un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un CTLA-4 (o polinucleótidos de los mismos).
VI. Secuencias de Polinucleótidos con Secuencia Optimizada que Codifican Polipéptidos Inmunomoduladores
En algunos aspectos, un polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada que codifica un polipéptido divulgado en la presente memoria, p. ej., IL-23 (al menos una subunidad de IL-23 o una proteína de fusión que comprende ambas subunidades de IL-23), IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido IL-23, en donde el ORF tiene la secuencia optimizada (p. ej., SEQ ID NO: 141). En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, en donde el ORF tiene la secuencia optimizada (p. ej., SEQ ID NO: 143). En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido OX40L, en donde el ORF tiene la secuencia optimizada (p. ej., SEQ ID NO: 145).
En algunos aspectos, las secuencias de IL-23, IL-36-gamma o un polipéptido IL-18 y/u OX40L con secuencia optimizada, fragmentos y variantes de los mismos se utilizan para practicar los métodos divulgados en la presente memoria. En algunos aspectos, IL-23, IL-36-gamma o un polipéptido de IL-18 y/u OX40L con secuencia optimizada, fragmentos y variantes de los mismos se combinan con o son alternativas a sus respectivas secuencias de tipo salvaje (mostradas en las TABLAS 1 y 1A).
Las secuencias de nucleótidos con secuencia optimizada divulgadas en la presente memoria son distintas de las secuencias de nucleótidos de tipo salvaje correspondientes y de otras secuencias de nucleótidos con secuencia optimizada conocidas, p. ej., estos ácidos nucleicos con secuencia optimizada tienen características de composición únicas.
En algunos aspectos, el porcentaje de nucleobases de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada (p. ej., que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma o IL-18 y/o polipéptido OX40L, un fragmento funcional o una variante del mismo) se modifica (p. ej., se reduce) con respecto al porcentaje de nucleobases de uracilo o timina en la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje de referencia. Dicha secuencia se denomina secuencia modificada en uracilo o modificada en timina. El porcentaje de contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos se puede determinar dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia por el número total de nucleótidos y multiplicando por 100. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada tiene un contenido de uracilo o timina más bajo que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo salvaje de referencia. En algunos aspectos, el contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada de la divulgación es mayor que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo salvaje de referencia y aún mantiene efectos beneficiosos, p. ej., aumento de la expresión y/o respuesta de señalización en comparación con la secuencia de tipo salvaje de referencia.
En algunos aspectos, las secuencias optimizadas de la presente divulgación contienen rangos únicos de uracilos o timina (si es ADN) en la secuencia. El contenido de uracilo o timina de las secuencias optimizadas se puede expresar de varias maneras, p. ej., el contenido de uracilo o timina de las secuencias optimizadas en relación con el mínimo teórico (%Utm o %Ttm), en relación con el tipo salvaje (%Uwt o %Twt), y en relación con el contenido total de nucleótidos (%Utl o %Ttl). Para el ADN, se reconoce que la timina está presente en lugar de uracilo, y se sustituiría T donde aparece U. Por lo tanto, todas las divulgaciones relacionadas con, p. ej., %Utm, %Uwt, o %Utl, con respecto al ARN son igualmente aplicables a %Ttm, %Twt, o %Ttl con respecto al ADN.
El contenido de uracilo o timina en relación con el mínimo teórico de uracilo o timina se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada por el número total de uracilos o timinas en una hipotética secuencia de nucleótidos en la que todos los codones en la secuencia hipotética se reemplazan con codones sinónimos que tienen el menor contenido posible de uracilo o timina y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como %Utm o %Ttm.
Una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L de la divulgación también se puede describir según su contenido de uracilo o timina en relación con el contenido de uracilo o timina en la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. (%Uwt o %Twt). Las frases "contenido de uracilo o timina en relación con el contenido de uracilo o timina en la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje" se refiere a un parámetro determinado al dividir el número de uracilos o timinas en un ácido nucleico con secuencia optimizada por el número total de uracilos o timinas en la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como %Uwt o %Twt.
En algunos aspectos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L de la divulgación tiene un número reducido de uracilos consecutivos con respecto a la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas pueden estar codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluye un grupo de cuatro uracilos. Dicha subsecuencia se puede sustituir, p. ej., con CUGCUC, que elimina el grupo de uracilos. La fenilalanina puede estar codificada por UUC o UUU. Por lo tanto, incluso si las fenilalaninas codificadas por UUU se reemplazan por UUC, el codón sinónimo aún contiene un par de uracilos (UU). Por consiguiente, el número de fenilalaninas en una secuencia establece un número mínimo de pares de uracilos (UU) que no se pueden eliminar sin alterar el número de fenilalaninas en el polipéptido codificado.
En algunos aspectos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L de la divulgación tiene un número reducido de tripletes de uracilos (UUU) con respecto a la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. En algunos aspectos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L tiene un número reducido de pares de uracilos (UU) con respecto al número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. En algunos aspectos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L de la divulgación tiene un número de pares de uracilos (UU) correspondiente al número mínimo posible de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje.
La frase "pares de uracilos (UU) en relación con los pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje" se refiere a un parámetro determinado al dividir el número de pares de uracilos (UU) en una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada por el total número de pares de uracilos (UU) en la correspondiente secuencia de nucleótidos de tipo salvaje y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como %UUwt. En algunos aspectos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L tiene un %UUwt entre inferior al 100 %.
En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación comprende una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido iL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L divulgado en la presente memoria. En algunos aspectos, la secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, p. ej., 5-metoxiuracilo. En algunos aspectos, al menos el 95 % de una nucleobase (p. ej., uracilo) en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L de la divulgación son nucleobases modificadas. En algunos aspectos, al menos el 95 % del uracilo en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L es 5-metoxiuracilo. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende una secuencia modificada en uracilo comprende además un sitio de unión del miARN, p. ej., un sitio de unión del miARN que se une a miR-122. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende una secuencia modificada en uracilo se formula con un agente de administración, p. ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 o cualquiera de los Compuestos 1-232.
VII. Métodos para la Optimización de Secuencias
En algunos aspectos, un polinudeótido de la divulgación (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L (p. ej., la secuencia de tipo salvaje, fragmento funcional o variante del mismo) tiene una secuencia optimizada.
Una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada (la secuencia de nucleótidos también se denomina "ácido nucleico" en la presente memoria) comprende al menos una modificación de codón con respecto a una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. Por lo tanto, en un ácido nucleico con secuencia optimizada, al menos un codón es diferente de un codón correspondiente en una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje).
En general, los ácidos nucleicos con secuencia optimizada se generan mediante al menos un paso que comprende la sustitución de codones en una secuencia de referencia por codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido). Dichas sustituciones pueden efectuarse, por ejemplo, aplicando un mapa de sustitución de codones (es decir, una tabla que proporciona los codones que codificarán cada aminoácido en la secuencia con codones optimizados), o aplicando un conjunto de reglas (p. ej., si la glicina está cerca de un aminoácido neutro, la glicina estaría codificada por un determinado codón, pero si está cerca de un aminoácido polar, estaría codificada por otro codón). Además de las sustituciones de codones (es decir, "optimización de codones"), los métodos de optimización de secuencias divulgados en la presente memoria comprenden pasos de optimización adicionales que no están estrictamente dirigidos a la optimización de codones, como la eliminación de restos perjudiciales (sustitución de restos desestabilizadores). Las composiciones y formulaciones que comprenden estos ácidos nucleicos con secuencia optimizada (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm) se pueden administrar a un sujeto que lo necesita para facilitar la expresión in vivo de un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L funcionalmente activo.
La expresión recombinante de moléculas grandes en cultivos celulares puede ser una tarea desafiante con numerosas limitaciones (p. ej., niveles bajos de expresión de proteínas, traducción estancada que da como resultado productos de expresión truncados, plegamiento incorrecto de proteínas, etc.). Estas limitaciones pueden reducirse o evitarse administrando los polinucleótidos (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm), que codifican un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L funcionalmente activo o composiciones o formulaciones que comprenden el mismo a un paciente que padece de cáncer, por lo que la síntesis y administración del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, iL-18 y/u OX40L para tratar el cáncer se produce de forma endógena.
El cambio de un sistema de expresión in vitro (p. ej., cultivo celular) a expresión in vivo requiere el rediseño de la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente terapéutico. El rediseño de una secuencia génica de origen natural mediante la elección de diferentes codones sin alterar necesariamente la secuencia de aminoácidos codificada a menudo puede conducir a aumentos drásticos en los niveles de expresión de proteínas (Gustafsson et al., 2004, Journal/Trends Biotechnol 22, 346-53). Se ha mostrado que variables tales como el índice de adaptación de codones (CAI), las estructuras secundarias del ARNm, las secuencias reguladoras en cis, el contenido de GC y muchas otras variables similares se correlacionan de alguna manera con los niveles de expresión de proteínas (Villalobos et al., 2006, "Journal/BMC Bioinformatics 7, 285). Sin embargo, debido a la degeneración del código genético, existen numerosas secuencias de ácidos nucleicos diferentes que pueden codificar, todas, el mismo agente terapéutico. Cada aminoácido está codificado por hasta seis codones sinónimos; y la elección entre estos codones influye en la expresión génica. Además, el uso de codones (es decir, la frecuencia con la que diferentes organismos usan codones para expresar una secuencia polipeptídica) difiere entre organismos (por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpos terapéuticos humanos o humanizados frecuentemente tiene lugar en cultivos de células de hámster).
En algunos aspectos, se puede optimizar la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de referencia aplicando un mapa de codones. El experto en la técnica apreciará que las bases T en los mapas de codones divulgados a continuación están presentes en el ADN, mientras que las bases T serían reemplazadas por bases U en los ARN correspondientes. Por ejemplo, un ácido nucleico con secuencia optimizada divulgado en la presente memoria en forma de ADN, p. ej., un vector o un molde de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U en su ARNm transcrito correspondiente. A este respecto, tanto las secuencias de ADN con secuencia optimizada (que comprenden T) como sus correspondientes secuencias de ARN (que comprenden U) se consideran ácido nucleico con secuencia optimizada de la presente divulgación. Un experto en la técnica también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes reemplazando una o más bases con bases no naturales. Así, p. ej., un codón Tt C (mapa de ADN) correspondería a un codón UUC (mapa de ARN), que a su vez puede corresponder a un codón ^ ^ C (mapa de ARN en el que U se ha reemplazado por pseudouridina).
En un aspecto, una secuencia de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se puede optimizar reemplazando todos los codones que codifican un determinado aminoácido con solo uno de los codones alternativos proporcionados en un mapa de codones. Por ejemplo, todas las valinas en la secuencia optimizada estarían codificadas por GTG, GTC o GTT.
Los polinucleótidos con secuencia optimizada de la divulgación pueden generarse usando uno o más métodos de optimización de codones, o una combinación de los mismos. Los métodos de optimización de secuencias que se pueden usar para optimizar las secuencias de ácidos nucleicos con secuencia optimizada se describen en detalle en la presente memoria. Esta lista de métodos no es exhaustiva ni limitativa.
Se apreciará que los principios y reglas de diseño descritos para cada uno de los métodos de optimización de secuencias discutidos a continuación se pueden combinar de muchas maneras diferentes, por ejemplo, optimización de secuencias con alto contenido de G/C para algunas regiones u optimización de secuencia de contenido de uridina para otras regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia, así como mutaciones de nucleótidos dirigidas para minimizar la estructura secundaria en toda la secuencia o para eliminar restos perjudiciales.
La elección de combinaciones potenciales de métodos de optimización de secuencias puede depender, por ejemplo, de la química específica utilizada para producir un polinucleótido sintético. Dicha elección también puede depender de las características de la proteína codificada por el ácido nucleico con secuencia optimizada, p. ej., una secuencia completa, un fragmento funcional o una proteína de fusión que comprende un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L, etc. En algunos aspectos, dicha elección puede depender del tejido o célula específicos a los que se dirige el ácido nucleico con secuencia optimizada (p. ej., un ARNm sintético terapéutico).
Los mecanismos de combinación de los métodos de optimización de secuencias o las reglas de diseño derivadas de la aplicación y análisis de los métodos de optimización pueden ser simples o complejos. Por ejemplo, la combinación puede ser:
(i) Secuencia!: Cada método de optimización de secuencias o conjunto de reglas de diseño se aplica a una subsecuencia diferente de la secuencia global, por ejemplo, reduciendo la uridina en las posiciones de codón 1 a 30 y luego seleccionando codones de alta frecuencia para el resto de la secuencia;
(ii) Jerárquica: Varios métodos de optimización de secuencias o conjuntos de reglas de diseño se combinan de forma jerárquica y determinista. Por ejemplo, el uso de los codones más ricos en GC, rompiendo los lazos (que son comunes) eligiendo el más frecuente de esos codones.
(iii) Multifactoria! / Multiparamétrico: El aprendizaje automático u otras técnicas de modelado se utilizan para diseñar una secuencia única que satisfaga mejor múltiples requisitos superpuestos y posiblemente contradictorios. Este enfoque requeriría el uso de una computadora que aplicara una serie de técnicas matemáticas, por ejemplo, algoritmos genéticos.
En última instancia, cada uno de estos enfoques puede dar como resultado un conjunto específico de reglas que, en muchos casos, se pueden resumir en una única tabla de codones, es decir, una lista ordenada de codones para cada aminoácido en la proteína diana (es decir, un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L), con una regla específica o un conjunto de reglas que indican cómo seleccionar un codón específico para cada posición de aminoácido.
a Optimización del Contenido de Uridina
La presencia de altas concentraciones locales de uridina en una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales sobre la traducción, p. ej., traducción lenta o terminada prematuramente, especialmente cuando se usan análogos de uridina modificados en la producción de ARNm sintéticos. Además, el alto contenido de uridina también puede reducir la semivida in vivo de los ARNm sintéticos debido a la activación de TLR.
Por consiguiente, se puede optimizar la secuencia de una secuencia de ácido nucleico usando un método que comprende al menos un paso de optimización del contenido de uridina. Dicho paso comprende, p. ej., sustituir al menos un codón en el ácido nucleico de referencia con un codón alternativo para generar una secuencia modificada en uridina, en donde la secuencia modificada en uridina tiene al menos una de las siguientes propiedades:
(i) aumento o disminución del contenido global de uridina;
(ii) aumento o disminución del contenido local de uridina (es decir, los cambios en el contenido de uridina se limitan a subsecuencias específicas);
(iii) cambios en la distribución de uridina sin alterar el contenido global de uridina;
(iv) cambios en la agrupación de uridina (p. ej., número de agrupaciones, localización de agrupaciones o distancia entre agrupaciones); o
(v) combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el proceso de optimización de secuencias comprende optimizar el contenido global de uridina, es decir, optimizar el porcentaje de nucleobases de uridina en el ácido nucleico con secuencia optimizada con respecto al porcentaje de nucleobases de uridina en la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, el 30 % de las nucleobases pueden ser uridinas en la secuencia de referencia y el 10 % de las nucleobases pueden ser uridinas en el ácido nucleico con secuencia optimizada.
En otros aspectos, el proceso de optimización de secuencias comprende reducir el contenido local de uridina en regiones específicas de una secuencia de ácido nucleico de referencia, es decir, reducir el porcentaje de nucleobases de uridina en una subsecuencia del ácido nucleico con secuencia optimizada con respecto al porcentaje de nucleobases de uridina en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de referencia puede tener una región en el extremo 5' (p. ej., 30 codones) con un contenido local de uridina del 30 %, y el contenido de uridina en esa misma región podría reducirse al 10 % en el ácido nucleico con secuencia optimizada.
En aspectos específicos, los codones pueden reemplazarse en la secuencia de ácido nucleico de referencia para reducir o modificar, por ejemplo, el número, el tamaño, la localización o la distribución de agrupaciones de uridina que podrían tener efectos perjudiciales en la traducción de proteínas. Aunque como regla general es deseable reducir el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia, en ciertos aspectos se puede aumentar el contenido de uridina, y en particular el contenido local de uridina, de algunas subsecuencias de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
La reducción del contenido de uridina para evitar efectos adversos en la traducción se puede realizar en combinación con otros métodos de optimización divulgados aquí para lograr otros objetivos de diseño. Por ejemplo, la optimización del contenido de uridina se puede combinar con el diseño de rampa, ya que el uso de los codones más raros para la mayoría de los aminoácidos, con algunas excepciones, reducirá el contenido de U.
En algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina está diseñada para inducir una respuesta menor del receptor similar a Toll (TLR) en comparación con la secuencia de ácido nucleico de referencia. Varios TLR reconocen y responden a los ácidos nucleicos. Se ha mostrado que el ARN bicatenario (ds), un constituyente viral frecuente, activa TLR3. Véase Alexopoulou et al. (2001) Nature, 413:732-738 y Wang et al. (2004) Nat. Med., 10:1366-1373. El ARN monocatenario (ss) activa TLR7. Véase Diebold et al. (2004) Science 303 : 1529­ 1531. Los oligonucleótidos de ARN, por ejemplo, ARN con enlaces internucleotídicos de fósforotioato, son ligandos de TLR8 humano. Véase Heil et al. (2004) Science 303:1526-1529. El ADN que contiene restos CpG no metilados, característicos del ADN bacteriano y viral, activa TLR9. Véase Hemmi et al. (2000) Nature, 408: 740-745.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "respuesta TLR" se define como el reconocimiento de ARN monocatenario por un receptor TLR7 y, en algunos aspectos, abarca la degradación del ARN y/o respuestas fisiológicas causadas por el reconocimiento del ARN monocatenario por el receptor. Los métodos para determinar y cuantificar la unión de un ARN a un TLR7 son conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar si un ARN ha desencadenado una respuesta fisiológica mediada por TLR7 (p. ej., secreción de citoquinas) son bien conocidos en la técnica. En algunos aspectos, una respuesta TLR puede estar mediada por TLR3, TLR8 o TLR9 en lugar de TLR7.
La supresión de la respuesta mediada por TLR7 se puede lograr mediante la modificación de nucleósidos. El ARN experimenta más de cien modificaciones de nucleósidos diferentes en la naturaleza (véase la base de datos de modificación de ARN, disponible en mods.rna.albany.edu). El ARNr humano, por ejemplo, tiene diez veces más pseudouridina (^ ) y 25 veces más nucleósidos 2'-O-metilados que el ARNr bacteriano. El ARNm bacteriano no contiene modificaciones de nucleósidos, mientras que los ARNm de mamíferos tienen nucleósidos modificados como 5-metilcitidina (m5C), N6-metiladenosina (m6A), inosina y muchos nucleósidos 2'-O-metilados además de N7-metilguanosina (m7G).
El uracilo y la ribosa, las dos características definitorias del ARN, son ambos necesarios y suficientes para la estimulación de TLR7, y el ARN monocatenario corto (ARNss) actúa como agonista de TLR7 de manera independiente de la secuencia, siempre que contenga varias uridinas en estrecha proximidad. Véase Diebold et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36:3256-3267. Por consiguiente, uno o más de los métodos de optimización divulgados en la presente memoria comprende reducir el contenido de uridina (localmente y/o localmente) y/o reducir o modificar la agrupación de uridina para reducir o suprimir una respuesta mediada por TLR7.
En algunos aspectos, la respuesta TLR (p. ej., una respuesta mediada por TLR7) causada por la secuencia modificada en uridina es al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 100 % inferior que la respuesta TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, la respuesta TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia es al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 1,1 veces, al menos aproximadamente 1,2 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 1,9 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, o al menos aproximadamente 10 veces mayor que la respuesta TLR causada por la secuencia modificada en uridina.
En algunos aspectos, el contenido de uridina (contenido global de uridina promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es mayor que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100 % más uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En otros aspectos, el contenido de uridina (contenido global de uridina promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es menor que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100 % menos uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el contenido de uridina (contenido global de uridina promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es menor del 50 %, 49 %, 48 %, 47 %, 46 %, 45 %, 44 %, 43 %, 42 %, 41 %, 40 %, 39 %, 38 %, 37 %, 36 %, 35 %, 34 %, 33 %, 32 %, 31 %, 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de las nucleobases totales en la secuencia modificada en uridina. En algunos aspectos, el contenido de uridina de la secuencia modificada en uridina está entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 20 %. En algunos aspectos particulares, el contenido de uridina de la secuencia modificada en uridina está entre aproximadamente el 12 % y aproximadamente el 16 %.
En algunos aspectos, el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede medir utilizando una ventana deslizante. En algunos aspectos, la longitud de la ventana deslizante es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunos aspectos, la ventana deslizante tiene una longitud de más de 40 nucleobases. En algunos aspectos, la ventana deslizante tiene una longitud de 20 nucleobases. En función del contenido de uridina medido con una ventana deslizante, es posible generar un histograma que represente el contenido de uridina a lo largo de la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia y los ácidos nucleicos con secuencia optimizada.
En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para reducir o eliminar picos en el histograma que están por encima o por debajo de un cierto valor porcentual. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para eliminar picos en la representación de ventana deslizante que están por encima del 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, o 30 % de uridina. En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para que ningún pico esté por encima del 30 % de uridina en el ácido nucleico con secuencia optimizada, medido usando una ventana deslizante de 20 nucleobases. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para que no más ni menos que un número predeterminado de picos en la secuencia nucleica con secuencia optimizada, medida usando una ventana deslizante de 20 nucleobases, estén por encima o por debajo de un cierto valor umbral. Por ejemplo, en algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para que no haya picos o no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 picos en el ácido nucleico con secuencia optimizada estén por encima del 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 30 % de uridina. En otro aspecto, el ácido nucleico con secuencia optimizada contiene entre 0 picos y 2 picos con contenidos de uridina del 30 % o más.
En algunos aspectos, se puede optimizar la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de referencia para reducir la incidencia de uridinas consecutivas. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas pueden estar codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluiría una agrupación de cuatro uridinas. Dicha subsecuencia podría sustituirse por CUGCUC, que eliminaría efectivamente la agrupación de uridinas. Por consiguiente, se puede optimizar la secuencia de una secuencia nucleica de referencia reduciendo o eliminando pares de uridinas (Uu ), tripletes de uridinas (UUU) o cuadrupletes de uridinas (UUUU). Las combinaciones de orden superior de U no se consideran combinaciones de combinaciones de orden inferior. Así, por ejemplo, UUUU se considera estrictamente un cuadruplete, no dos pares de U consecutivos; o UUUUUU se considera un sextuplete, no tres pares de U consecutivos, o dos tripletes de U consecutivos, etc.
En algunos aspectos, todos los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) pueden eliminarse de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otros aspectos, los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) pueden reducirse por debajo de cierto umbral, p. ej., no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 apariciones en el ácido nucleico con secuencia optimizada. En un aspecto particular, el ácido nucleico con secuencia optimizada contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 pares de uridinas. En otro aspecto particular, el ácido nucleico con secuencia optimizada no contiene pares y/o tripletes de uridinas.
Los codones de fenilalanina, es decir, UUC o UUU, comprenden un par o triplete de uridinas y, por lo tanto, la optimización de la secuencia para reducir el contenido de uridina puede reducir como máximo el triplete U de fenilalanina a un par U de fenilalanina. En algunos aspectos, la aparición de pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) se refieren únicamente a los pares o tripletes U que no son de fenilalanina. Por consiguiente, en algunos aspectos, los pares de uridinas (Uu ) y/o tripletes de uridinas (UUU) no de fenilalanina pueden reducirse por debajo de un cierto umbral, p. ej., no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 apariciones en el ácido nucleico con secuencia optimizada. En un aspecto particular, el ácido nucleico con secuencia optimizada contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 pares y/o tripletes de uridinas no de fenilalanina. En otro aspecto particular, el ácido nucleico con secuencia optimizada no contiene pares y/o tripletes de uridinas no de fenilalanina.
En algunos aspectos, la reducción en combinaciones de uridina (p. ej., pares, tripletes, cuadrupletes) en el ácido nucleico con secuencia optimizada puede expresarse como una reducción porcentual con respecto a las combinaciones de uridina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada puede contener aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, o 65 % del número total de pares de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada puede contener aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, o 65 % del número total de tripletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada puede contener aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, o 65 % del número total de cuadrupletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada puede contener aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, o 65 % del número total de pares de uridinas no de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada puede contener aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, o 65 % del número total de tripletes de uridinas no de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el contenido de uridina en la secuencia con secuencia optimizada puede expresarse con respecto al contenido mínimo teórico de uridina en la secuencia. El término "contenido mínimo teórico de uridina" se define como el contenido de uridina de una secuencia de ácido nucleico como un porcentaje de la longitud de la secuencia después de que todos los codones de la secuencia hayan sido reemplazados por codones sinónimos con el contenido de uridina más bajo. En algunos aspectos, el contenido de uridina del ácido nucleico de secuencia optimizada es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje). En algunos aspectos, el contenido de uridina del ácido nucleico con secuencia optimizada es aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente un 105 %, aproximadamente un 110 %, aproximadamente un 115 %, aproximadamente un 120 %, aproximadamente un 125 %, aproximadamente un 130 %, aproximadamente un 135 %, aproximadamente un 140 %, aproximadamente un 145 %, aproximadamente un 150 %, aproximadamente un 155 %, aproximadamente un 160 %, aproximadamente un 165 %, aproximadamente un 170 %, aproximadamente un 175 %, aproximadamente un 180 %, aproximadamente un 185 %, aproximadamente un 190 %, aproximadamente un 195 % o aproximadamente un 200 % del contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje).
En algunos aspectos, el contenido de uridina del ácido nucleico con secuencia optimizada es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje).
La secuencia de ácido nucleico de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje) puede comprender agrupaciones de uridinas que, debido a su número, tamaño, localización, distribución o combinaciones de las mismas, tienen efectos negativos sobre la traducción. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agrupación de uridinas" se refiere a una subsecuencia en una secuencia de ácido nucleico de referencia o una secuencia nucleica con secuencia optimizada que contiene un contenido de uridina (normalmente descrito como un porcentaje) que está por encima de un cierto umbral. Así, en ciertos aspectos, si una subsecuencia comprende más de aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 % de contenido de uridina, dicha subsecuencia se consideraría una agrupación de uridinas.
Los efectos negativos de las agrupaciones de uridinas pueden ser, por ejemplo, incitar una respuesta TLR7. Por lo tanto, en algunas implementaciones de los métodos de optimización de secuencias de ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria, es deseable reducir el número de agrupaciones, el tamaño de las agrupaciones, la localización de las agrupaciones (p. ej., cerca del extremo 5' y/o 3' de una secuencia de ácido nucleico), distancia entre agrupaciones o distribución de agrupaciones de uridinas (p. ej., un cierto patrón de agrupación a lo largo de una secuencia de ácido nucleico, distribución de agrupaciones con respecto a elementos de estructura secundaria en el producto expresado, o distribución de agrupaciones con respecto a la estructura secundaria de un ARNm).
En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos una agrupación de uridinas, en donde dicha agrupación de uridinas es una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia en donde el porcentaje de nucleobases de uridina totales en dicha subsecuencia está por encima de un umbral predeterminado. En algunos aspectos, la longitud de la subsecuencia es al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o aproximadamente 100 nucleobases. En algunos aspectos, la subsecuencia es más larga que 100 nucleobases. En algunos aspectos, el umbral es un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 % de contenido de uridina. En algunos aspectos, el umbral está por encima del 25 %.
Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que comprende A, D, G, S y R podría estar codificada por la secuencia de ácido nucleico GCU, GAU, GGU, AGU, CGU. Aunque dicha secuencia no contiene ningún par, triplete o cuadruplete de uridinas, un tercio de las nucleobases sería uridinas. Dicha agrupación de uridinas podría eliminarse usando codones alternativos, por ejemplo, usando GCC, GAC, GGC, a Gc y CGC, que no contendrían uridinas.
En otros aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos una agrupación de uridinas, en donde dicha agrupación de uridinas es una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia en donde el porcentaje de nucleobases de uridina de dicha subsecuencia se mide usando una ventana deslizante que está por encima de un umbral predeterminado. En algunos aspectos, la longitud de la ventana deslizante es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunos aspectos, la ventana deslizante tiene una longitud de más de 40 nucleobases. En algunos aspectos, el umbral es el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 % de contenido de uridina. En algunos aspectos, el umbral está por encima del 25 %.
En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos dos agrupaciones de uridinas. En algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene menos agrupaciones ricas en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene más agrupaciones ricas en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene agrupaciones ricas en uridina con una longitud más corta que las correspondientes agrupaciones ricas en uridina en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otros aspectos, la secuencia modificada en uridina contiene agrupaciones ricas en uridina con una longitud más larga que las correspondientes agrupaciones ricas en uridina en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
Véase, Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kormann et al. (2010) Nature Biotechnology 29:154-157; o Sahin et al. (2014) Nature Reviews Drug Discovery | AOP, publicado en línea el 19 de septiembre de 2014m doi:10.1038/nrd4278;
b. Contenido en Guanina/Citosina (G/C)
Se puede optimizar la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de referencia usando métodos que comprenden alterar el contenido en Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Dicha optimización puede comprender alterar (p. ej., aumentar o disminuir) el contenido global de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia; introducir cambios locales en el contenido de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia (p. ej., aumento o disminución de G/C en regiones o subsecuencias seleccionadas en la secuencia de ácido nucleico de referencia); alterar la frecuencia, el tamaño y la distribución de las agrupaciones de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia, o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L comprende un aumento global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) relativo al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, el aumento global del contenido de G/C (absoluto o relativo) es al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100 % en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L comprende una disminución global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) en relación al contenido de G/C de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, la disminución global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100 % en relación al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L comprende un aumento local del contenido de Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia de G/C modificada) en relación al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, el aumento local del contenido de G/C (absoluto o relativo) es al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100 % en relación al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L comprende una disminución local en el contenido de Guanosina/Citosina (GC)
(absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia de G/C modificada) en relación al
contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico
de referencia. En algunos aspectos, la disminución local en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es al
menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %,
al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30
%, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un
45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente
un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al
menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 100
% en relación al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de
ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, el contenido de G/C (absoluto o relativo) aumenta o disminuye en una subsecuencia que
tiene una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95
o 100 nucleobases.
En algunos aspectos, el contenido de G/C (absoluto o relativo) aumenta o disminuye en una subsecuencia que
tiene una longitud de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 2 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 4 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 6 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 8 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1.000 nucleobases.
En algunos aspectos, el contenido de G/C (absoluto o relativo) aumenta o disminuye en una subsecuencia que
tiene una longitud de aproximadamente 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000,
2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600,
3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000, 5100, 5.200,
5.300, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900, 6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800,
6.900, 7.000, 7.100, 7.200, 7.300, 7.400, 7.500, 7.600, 7.700, 7.800, 7.900, 8.000, 8.100, 8.200, 8.300, 8.400,
8.500, 8.600, 8.700, 8.800, 8.900, 9.000, 9.100, 9.200, 9.300, 9.400, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900 o 10.000 nucleobases.
Los aumentos o disminuciones en el contenido de G y C (absoluto o relativo) descritos en la presente memoria
pueden realizarse reemplazando codones sinónimos con bajo contenido de G/C con codones sinónimos que
tienen un mayor contenido de G/C, o viceversa. Por ejemplo, L tiene 6 codones sinónimos: dos de ellos tienen
2 G/C (CUC, CUG), 3 tienen una sola G/C (UUG, Cu U, CUA), y uno no tiene G/C (UUA). Entonces, si el ácido
nucleico de referencia tuviera un codón CUC en cierta posición, el contenido de G/C en esa posición podría
reducirse reemplazando CUC con cualquiera de los codones que tienen un solo G/C o el codón sin G/C.
Véanse, las Publ. EE. UU. No. US20140228558, US20050032730 A1; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46;
c. Frecuencia de Codones - Sesgo en el Uso de Codones
Numerosos métodos de optimización de codones conocidos en la técnica se basan en la sustitución de codones
en una secuencia de ácido nucleico de referencia por codones que tienen frecuencias más altas. Por lo tanto,
en algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18
y/u OX40L divulgado en la presente memoria puede optimizarse en secuencia usando métodos que comprenden el uso de modificaciones en la frecuencia de uso de uno o más codones en relación con otros
codones sinónimos en el ácido nucleico con secuencia optimizada con respecto a la frecuencia de uso en la
secuencia sin codones optimizados.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "frecuencia de codones" se refiere al sesgo en el uso de
codones, es decir, las diferencias en la frecuencia de aparición de codones sinónimos en el ADN/ARN codificante. En general, se reconoce que las preferencias de codones reflejan un equilibrio entre los sesgos mutacionales y la selección natural para la optimización de la traducción. Los codones óptimos ayudan a lograr
tasas de traducción más rápidas y alta precisión. Como resultado de estos factores, se espera que la selección
de la traducción sea más fuerte en genes altamente expresados. En el campo de la bioinformática y la biología computacional, se han propuesto y utilizado muchos métodos estadísticos para analizar el sesgo en el uso de
codones. Véase, p. ej.,, Comeron y Aguadé (1998) J. Mol. Evol. 47: 268-74. Se usan métodos tales como la
'frecuencia de codones óptimos' (Fop) (Ikemura (1981) J. Mol. Biol. 151 (3): 389-409), la Adaptación Relativa
de Codones (RCA) (Fox y Eril (2010) ADN Res. 17 (3): 185-96) o el 'Índice de adaptación de codones' (CAI)
(Sharp y Li (1987) Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95) para predecir los niveles de expresión génica, mientras
que métodos tales como el 'número efectivo de codones' (Nc) y la entropía de Shannon de la teoría de la información se usan para medir la uniformidad en el uso de codones. Los métodos estadísticos multivariados, tales como el análisis de correspondencia y el análisis de componentes principales, se utilizan ampliamente para analizar las variaciones en el uso de codones entre genes (Suzuki et al. (2008) DNA Res. 15 (6): 357-65; Sandhu et al., In Silico Biol. 2008;8(2):187-92).
La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L divulgado en la presente memoria (p. ej., una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje, una secuencia de ácido nucleico mutante, una secuencia de ácido nucleico quimérica, etc. que puede ser, por ejemplo, un ARNm), se puede optimizar por codones usando métodos que comprenden sustituir al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia con un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón superior o inferior en el conjunto de codones sinónimos; en donde el ácido nucleico con secuencia optimizada resultante tiene al menos una propiedad optimizada con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunos aspectos, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 % de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se sustituye con codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón superior a la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se sustituye con un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón superior a la frecuencia del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye con un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón inferior a la frecuencia del codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 75 % de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se sustituye con codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón superior a la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta tiene la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otros aspectos, todos los codones alternativos que tienen una frecuencia de codón más alta tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más baja tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunos aspectos, todos los codones alternativos que tiene una frecuencia de codón más alta tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos específicos, al menos un codón alternativo tiene la segunda frecuencia más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta en el conjunto de codones sinónimos. En algunos aspectos específicos, al menos un codón alternativo tiene la segunda frecuencia más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja en el conjunto de codones sinónimos.
La optimización basada en la frecuencia de codones se puede aplicar globalmente, como se describe anteriormente, o localmente a la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. En algunos aspectos, cuando se aplican localmente, las regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia pueden modificarse en función de la frecuencia de codones, sustituyendo todos o un cierto porcentaje de codones en una determinada subsecuencia con codones que tienen frecuencias más altas o más bajas en sus respectivos conjuntos de codones sinónimos. Por tanto, en algunos aspectos, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 % de los codones en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituyen con codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón en una secuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, y/u OX40L se sustituye con un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta que la frecuencia del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye con un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más baja que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 75 % de los codones en una subsecuencia de la secuencia del ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 se sustituyen con codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y que tiene una frecuencia de codones más alta tiene la frecuencia de codones más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otros aspectos, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una frecuencia de codones más baja tienen la frecuencia de codones más baja en el conjunto de codones sinónimos.
En algunos aspectos, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y que tiene una frecuencia de codón más baja tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunos aspectos, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una frecuencia de codones más alta tienen la frecuencia de codones más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En aspectos específicos, un ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede comprender una subsecuencia que tiene una frecuencia de codones global más alta o más baja que la frecuencia de codones global en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia en una localización específica, por ejemplo, en el extremo 5' o 3' de la secuencia de ácido nucleico optimizada, o a una distancia predeterminada de esa región (p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 codones desde el extremo 5' o el extremo 3' del ácido nucleico con secuencia optimizada).
En algunos aspectos, un ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede comprender más de una subsecuencia que tiene una frecuencia de codones global más alta o más baja que la frecuencia de codones global en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Un experto en la técnica comprendería que las subsecuencias con frecuencias de codones globales más altas o más bajas se pueden organizar en innumerables patrones, dependiendo de si la frecuencia de codones global es más alta o más baja, la longitud de la subsecuencia, la distancia entre las subsecuencias, la localización de las subsecuencias, etc.
Véanse, las Pat. de EE. UU. No. US5082767, US8126653, US7561973, US8401798; Publ. EE. UU. No. US 20080046192, US 20080076161; Publ. Int. No. WO2000018778; Welch et al. (2009) PLoS ONE 4(9): e7002; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46; Chung et al. (2012) BMC Systems Biology 6:134;
d. Sustitución de Restos Desestabilizadores
Hay una variedad de restos que pueden afectar la optimización de la secuencia, que se encuentran en varias categorías no exclusivas, por ejemplo:
(i) Restos basados en secuencias primarias: Restos definidos por una disposición simple de nucleótidos.
(ii) Restos estructurales: Restos codificados por una disposición de nucleótidos que tiende a formar una cierta estructura secundaria.
(iii) Restos locales: Restos codificados en una subsecuencia contigua.
(iv) Restos distribuidos: Restos codificados en dos o más subsecuencias disjuntas.
(v) Restos ventajosos: Restos que mejoran la estructura o función de los nucleótidos.
(vi) Restos desventajosos: Restos con efectos perjudiciales sobre la estructura o función de los nucleótidos.
Hay muchos restos que encajan en la categoría de restos desventajosos. Algunos ejemplos incluyen, por ejemplo, restos de enzimas de restricción, que tienden a ser secuencias exactas relativamente cortas, tales como los restos del sitio de restricción para Xbal (TCTAGA), EcoRI (GAATTC), EcoRII (CCWGG, en donde W significa A o T, según los códigos de ambigüedad de la IUPAC), o HindIII (AAGCTT); sitios enzimáticos, que tienden a ser más largos y basados en una secuencia consenso no exacta, tal como en la ARN polimerasa T7 (GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD, en donde n significa cualquier nucleótido, R significa A o G, W significa A o T, D significa A o G o T pero no C); restos estructurales, tales como las repeticiones GGGG (Kim et al. (1991) Nature 351(6324):331-2); u otros restos tales como repeticiones del triplete CUG (Querido et al. (2014) J. Cell Sci. 124:1703-1714).
Por consiguiente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L divulgado en la presente memoria puede optimizarse en secuencia usando métodos que comprenden sustituir al menos un resto desestabilizador en una secuencia de ácido nucleico de referencia y eliminar dicho resto desventajoso o reemplazarlo por un resto ventajoso.
En algunos aspectos, el proceso de optimización comprende la identificación de restos ventajosos y/o desventajosos en la secuencia nucleica de referencia, en donde dichos restos son, p. ej., subsecuencias específicas que pueden provocar una pérdida de estabilidad en la secuencia de ácido nucleico de referencia antes o durante el proceso de optimización. Por ejemplo, la sustitución de bases específicas durante la optimización puede generar una subsecuencia (resto) reconocida por una enzima de restricción. Por consiguiente, durante el proceso de optimización, la aparición de restos desventajosos puede monitorizarse comparando la secuencia con secuencia optimizada con una biblioteca de restos que se sabe que son desventajosos. Entonces, la identificación de los restos desventajosos podría usarse como un filtro post-hoc, es decir, para determinar si una determinada modificación que potencialmente podría introducirse en la secuencia de ácido nucleico de referencia debería implementarse realmente o no.
En algunos aspectos, la identificación de restos desventajosos se puede utilizar antes de la aplicación de los métodos de optimización de secuencias divulgados en la presente memoria, es decir, la identificación de restos en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y su reemplazo con secuencias de ácido nucleico alternativas pueden usarse como una etapa de preprocesamiento, por ejemplo, antes de la reducción de uridina.
En otros aspectos, la identificación de restos desventajosos y su eliminación se utiliza como una técnica de optimización de secuencias adicional integrada en un método de optimización de ácidos nucleicos multiparamétrico que comprende dos o más de los métodos de optimización de secuencias divulgados en la presente memoria. Cuando se usa de esta manera, se eliminaría un resto desventajoso identificado durante el proceso de optimización, por ejemplo, al sustituir el menor número posible de nucleobases con el fin de preservar lo más fielmente posible el o los principios de diseño originales (p. ej., U baja, frecuencia alta, etc).
Véanse, p. ej., las Publ. EE. UU. No. US20140228558, US20050032730, o US20140228558
e. Optimización de Conjuntos Limitados de Codones
En algunos aspectos particulares, la optimización de secuencias de una secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido iL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se puede realizar utilizando un conjunto de codones limitado, p. ej., un conjunto de codones en donde se usa un número de codones inferior al nativo para codificar los 20 aminoácidos naturales, un subconjunto de los 20 aminoácidos naturales o un conjunto ampliado de aminoácidos incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales.
El código genético es altamente similar entre todos los organismos y se puede expresar en una tabla simple con 64 entradas que codificarían los 20 aminoácidos estándar involucrados en la traducción de proteínas más los codones de inicio y parada. El código genético está degenerado, es decir, en general, más de un codón especifica cada aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido leucina se especifica mediante los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA o CUG, mientras que el aminoácido serina se especifica mediante los codones UCA, UCG, UCC, UCU, AGU o AGC (diferencia en la primera, segunda o tercera posición). Los códigos genéticos nativos comprenden 62 codones que codifican aminoácidos naturales. Por lo tanto, en algunos aspectos de los métodos divulgados en la presente memoria, los conjuntos de codones optimizados (códigos genéticos) que comprenden menos de 62 codones para codificar 20 aminoácidos pueden comprender 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, o 20 codones.
En algunos aspectos, el conjunto limitado de codones comprende menos de 20 codones. Por ejemplo, si una proteína contiene menos de 20 tipos de aminoácidos, dicha proteína podría estar codificada por un conjunto de codones con menos de 20 codones. Por consiguiente, en algunos aspectos, un conjunto de codones optimizado comprende tantos codones como diferentes tipos de aminoácidos están presentes en la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos aspectos, el conjunto de codones optimizado comprende 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o incluso 1 codón.
En algunos aspectos, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, y Val, es decir, los aminoácidos que están codificados naturalmente por más de un codón, está codificado con menos codones que el número natural de codones sinónimos. Por ejemplo, en algunos aspectos, Ala puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 3, 2 o 1 codones; Cys puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Asp puede estar codificado en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Glu puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Phe puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Gly puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 3 codones, 2 codones o 1 codón; His puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Ile puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 2 codones o 1 codón; Lys puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Leu puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codon; Asn puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Pro puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 3 codones, 2 codones o 1 codón; Gln puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón; Arg puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; Ser puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; Thr puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 3 codones, 2 codones o 1 codón; Val puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 3 codones, 2 codones o 1 codón; y Tyr puede estar codificada en el ácido nucleico con secuencia optimizada por 1 codón.
En algunos aspectos, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, y Val, es decir, los aminoácidos que están codificados naturalmente por más de un codón, está codificado por un único codón en el conjunto limitado de codones.
En algunos aspectos específicos, el ácido nucleico con secuencia optimizada es un ADN y el conjunto limitado de codones consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de 20 aminoácidos. En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada es un ADN y el conjunto limitado de codones comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en g Ct , GCC, GCA y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en c Gt , CGC, CGA, CGG, AGA y AGG; al menos un codón seleccionado de AAT o ACC; al menos un codón seleccionado de GAT o GAC; al menos un codón seleccionado de TGT o TGC; al menos un codón seleccionado de CAA o CAG; al menos un codón seleccionado de GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGT, GGC, GGA y GGG; al menos un codón seleccionado de CAT o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ATT, ATC y ATA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG; al menos un codón seleccionado de AAA o AAG; un codón ATG; al menos un codón seleccionado de TTT o TTC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCT, CCC, CCA y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TCT, TCC, TCA, TCG, AGT y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACT, ACC, ACA y ACG; un codón TGG; al menos un codón seleccionado de TAT o TAC; y al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GTT, GTC, GTA y GTG.
En otros aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada es un ARN (p. ej., un ARNm) y el conjunto limitado de codones consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de 20 aminoácidos. En algunos aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada es un ARN y el conjunto limitado de codones comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GCU, GCC, GCA, y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en c Gu , CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG; al menos un codón seleccionado de AAU o ACC; al menos un codón seleccionado de GAU o GAC; al menos un codón seleccionado de UGU o UGC; al menos un codón seleccionado de CAA o CAG; al menos un codón seleccionado de GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGU, GGC, GGA, y GGG; al menos un codón seleccionado de CAU o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en AUU, AUC, y AUA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, y CUG; al menos un codón seleccionado de AAA o AAG; un codón AUG; al menos un codón seleccionado de UUU o UUC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCU, CCC, CCA, y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACU, ACC, ACA, y ACG; un codón UGG; al menos un codón seleccionado de UAU o UAC; y, al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GUU, GUC, GUA, y GUG.
En algunos aspectos específicos, el conjunto limitado de codones se ha optimizado para la expresión in vivo de un ácido nucleico con secuencia optimizada (p. ej., un ARNm sintético) después de la administración a un determinado tejido o célula.
En algunos aspectos, el conjunto de codones optimizado (p. ej., un conjunto de 20 codones que codifican 20 aminoácidos) cumple al menos con una de las siguientes propiedades:
(i) el conjunto de codones optimizado tiene un promedio más alto de contenido de G/C que el conjunto de codones original o nativo; o,
(ii) el conjunto de codones optimizado tiene un promedio más bajo de contenido de U que el conjunto de codones original o nativo; o,
(iii) el conjunto de codones optimizado está compuesto por codones con la frecuencia más alta; o,
(iv) el conjunto de codones optimizado está compuesto por codones con la frecuencia más baja; o,
(v) una combinación de los mismos.
En algunos aspectos específicos, al menos un codón en el conjunto de codones optimizado tiene la segunda frecuencia más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta en el conjunto de codones sinónimos. En algunos aspectos específicos, al menos un codón en el conjunto de codones optimizado tiene la segunda frecuencia más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja en el conjunto de codones sinónimos.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de codones nativos" se refiere al conjunto de codones usados de forma nativa por el organismo fuente para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de codones original" se refiere al conjunto de codones usado para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia antes del comienzo de la optimización de la secuencia, o a un conjunto de codones usado para codificar una variante optimizada de la secuencia de ácido nucleico de referencia al comienzo de una nueva iteración de optimización cuando la optimización de secuencia se aplica de forma iterativa o recursiva.
En algunos aspectos, el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los codones en el conjunto de codones son los que tienen la frecuencia más alta. En otros aspectos, el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los codones en el conjunto de codones son los que tienen la frecuencia más baja.
En algunos aspectos, el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los codones en el conjunto de codones son los que tienen el contenido de uridina más alto. En algunos aspectos, el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los codones en el conjunto de codones son los que tienen el contenido de uridina más bajo.
En algunos aspectos, el promedio de contenido de G/C (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más alto que el promedio de contenido de G/C (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunos aspectos, el promedio de contenido de G/C (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más bajo que el promedio de contenido de G/C (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.
En algunos aspectos, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más alto que el promedio de contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunos aspectos, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más bajo que el promedio de contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.
Véase también la Publ. de Solic. de EE. UU. No. 2011/0082055 y la Publ. Int. No. WO2000018778,
VIII. Caracterización de Ácidos Nucleicos con Secuencia Optimizada
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm) que comprende un ácido nucleico con secuencia optimizada divulgado en la presente memoria que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede ensayarse para determinar si al menos una propiedad de la secuencia de ácido nucleico (p. ej., la estabilidad cuando se expone a nucleasas) o propiedad de expresión ha mejorado con respecto al ácido nucleico sin secuencia optimizada.
Tal y como se usa en la presente memoria, "propiedad de expresión" se refiere a una propiedad de una secuencia de ácido nucleico ya sea in vivo (p. ej., eficacia de traducción de un ARNm sintético después de la administración a un sujeto que lo necesita) o in vitro (p. ej., eficacia de traducción de un ARNm sintético ensayada en un sistema modelo in vitro). Las propiedades de expresión incluyen, pero no se limitan a, la cantidad de proteína producida por un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L después de la administración, y la cantidad de proteína soluble o de otra forma funcional producida. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos con secuencia optimizada divulgados en la presente memoria pueden evaluarse según la viabilidad de las células que expresan una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico con secuencia optimizada (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, IL- 36-gamma, IL-18 y/u OX40L divulgado en la presente memoria.
En un aspecto particular, una pluralidad de ácidos nucleicos con secuencia optimizada divulgados en la presente memoria (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm) que contienen sustituciones de codones con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia no optimizada pueden caracterizarse funcionalmente para medir una propiedad de interés, por ejemplo, una propiedad de expresión en un sistema modelo in vitro, o in vivo en un tejido o célula diana.
a. Optimización de las Propiedades Intrínsecas de la Secuencia de Ácido Nucleico
En algunos aspectos de la divulgación, la propiedad deseada del polinucleótido es una propiedad intrínseca de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos (p. ej., un ARN, p.ej., un ARNm) puede tener una secuencia optimizada para la estabilidad in vivo o in vitro. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos puede optimizarse en secuencia para la expresión en un tejido o célula diana particular. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en secuencia para aumentar su semivida plasmática evitando su degradación por endo y exonucleasas.
En otros aspectos, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en secuencia para aumentar su resistencia a la hidrólisis en solución, por ejemplo, para alargar el tiempo en el que el ácido nucleico con secuencia optimizada o una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico con secuencia optimizada pueden almacenarse en condiciones acuosas con una degradación mínima.
En otros aspectos, el ácido nucleico con secuencia optimizada puede optimizarse para aumentar su resistencia a la hidrólisis en condiciones de almacenamiento en seco, por ejemplo, para alargar el tiempo en el que el ácido nucleico con secuencia optimizada puede almacenarse después de la liofilización con una degradación mínima.
b. Ácidos Nucleicos con Secuencia Optimizada para la Expresión de Proteínas
En algunos aspectos de la divulgación, la propiedad deseada del polinucleótido es el nivel de expresión de un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L codificado por una secuencia con secuencia optimizada divulgada en la presente memoria. Los niveles de expresión de proteínas se pueden medir usando uno o más sistemas de expresión. En algunos aspectos, la expresión puede medirse en sistemas de cultivo celular, p. ej., células CHO o células HEK293. En algunos aspectos, la expresión puede medirse usando sistemas de expresión in vitro preparados a partir de extractos de células vivas, p. ej., lisados de reticulocitos de conejo, o sistemas de expresión in vitro preparados mediante ensamblaje de componentes individuales purificados. En otros aspectos, la expresión de la proteína se mide en un sistema in vivo, p. ej., ratón, conejo, mono, etc.
En algunos aspectos, puede ser deseable la expresión de proteínas en forma de solución. Por consiguiente, en algunos aspectos, una secuencia de referencia puede optimizarse en secuencia para rendir una secuencia de ácido nucleico con secuencia optimizada que tiene niveles optimizados de proteínas expresadas en forma soluble. Los niveles de expresión de proteínas y otras propiedades tales como solubilidad, niveles de agregación y presencia de productos de truncamiento (es decir, fragmentos debidos a proteólisis, hidrólisis o traducción defectuosa) se pueden medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando electroforesis (p. ej., nativa o SDS-PAGE) o métodos cromatográficos (p. ej., HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño, etc.).
c. Optimización de la Viabilidad del Tejido Diana o de la Célula Diana
En algunos aspectos, la expresión de proteínas terapéuticas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales en el tejido o célula diana, reduciendo el rendimiento de proteínas o reduciendo la calidad del producto expresado (p. ej., debido a la presencia de fragmentos de proteínas o precipitación de la proteína expresada en cuerpos de inclusión), o causando toxicidad.
Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, la optimización de la secuencia de una secuencia de ácido nucleico divulgada en la presente memoria, p. ej., una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L, se puede utilizar para aumentar la viabilidad de las células diana que expresan la proteína codificada por el ácido nucleico con secuencia optimizada.
La expresión de proteínas heterólogas también puede ser perjudicial para las células transfectadas con una secuencia de ácido nucleico para el trasplante autólogo o heterólogo. Por consiguiente, en algunos aspectos de la presente divulgación, la optimización de la secuencia de una secuencia de ácido nucleico divulgada en la presente memoria puede usarse para aumentar la viabilidad de las células diana que expresan la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico con secuencia optimizada. Los cambios en la viabilidad celular o tisular, la toxicidad y otras reacciones fisiológicas pueden medirse según métodos conocidos en la técnica.
d. Reducción de la Respuesta Inmune y/o Inflamatoria
En algunos casos, la administración de un ácido nucleico con secuencia optimizada que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L o un fragmento funcional del mismo puede desencadenar una respuesta inmune, que podría estar causada por (i) el agente terapéutico (p. ej., un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L), o (ii) el producto de expresión de dicho agente terapéutico (p. ej., el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L codificado por el ARNm), o (iv) una combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunos aspectos de la presente divulgación, la optimización de la secuencia de la secuencia de ácido nucleico (p. ej., un ARNm) divulgada en la presente memoria puede usarse para disminuir una respuesta inmune o inflamatoria desencadenada por la administración de un ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L o por el producto de expresión del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L codificado por dicho ácido nucleico.
En algunos aspectos, se puede medir una respuesta inflamatoria detectando niveles aumentados de una o más citoquinas inflamatorias utilizando métodos conocidos en la técnica, p. ej., ELISA. El término "citoquina inflamatoria" se refiere a las citoquinas que se elevan en una respuesta inflamatoria.
Los ejemplos de citoquinas inflamatorias incluyen interleuquina-6 (IL-6), CXCL1 (ligando de quimioquina (resto C-X-C) 1; también conocido como GROa, interferón-Y (IFNy), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína 10 inducida por interferón y (IP-10) o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). El término citoquinas inflamatorias incluye también otras citoquinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, p. ej., interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-13 (IL-13), interferón a (IFN-a), etc.
IX. Polinucleótidos que Codifican Polipéptidos Inmunomoduladores que Comprenden Sitios de Unión de microARN
El polinucleótido (p. ej., ARNm), que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede comprender además uno o más sitios de unión de microARN. Los microARN (o miARN) son ARN no codificantes de 19-25 nucleótidos de longitud que se unen a la 3'UTR de las moléculas de ácido nucleico y regulan a la baja la expresión génica, ya sea reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o inhibiendo la traducción.
La presente divulgación también proporciona composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los polirribonucleótidos descritos anteriormente. En algunos aspectos, la composición o formulación comprende además un agente de administración.
En algunos aspectos, la composición o formulación puede contener un polirribonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico con secuencia optimizada divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido. En algunos aspectos, la composición o formulación puede contener un polirribonucleótido (p. ej., un ARN, p. ej., un ARNm) que comprende un polirribonucleótido (p. ej., un ORF) que tiene una identidad de secuencia significativa con una secuencia de ácido nucleico con secuencia optimizada divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido. En algunos aspectos, el polirribonucleótido comprende además un sitio de unión del miARN, p. ej., un sitio de unión del miARN que se une a miR-122.
Mediante la ingeniería de secuencias diana de microARN en los polinucleótidos (p. ej., en una región similar a 3'UTR u otra región) de la divulgación, se puede dirigir la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el microARN en cuestión esté disponible. Esto puede reducir los efectos fuera de la diana después de la administración del polirribonucleótido. Por ejemplo, si un polirribonucleótido de la divulgación no está destinado a ser administrado a un tejido o célula, pero termina en dicho tejido o célula, entonces un miARN abundante en el tejido o célula puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o múltiples sitios de unión del miARN se modifican por ingeniería en la 5'UTR y/o 3'UTR del polirribonucleótido. Por lo tanto, en algunos aspectos, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN en un ARNm de la divulgación puede reducir el riesgo de efectos fuera de la diana después de la administración de moléculas de ácido nucleico y/o permitir la regulación específica de tejido de la expresión de un polipéptido codificado por el ARNm. En otros aspectos más, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN en un ARNm de la divulgación puede modular las respuestas inmunes después de la administración de ácidos nucleicos in vivo. En aspectos adicionales, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN en un ARNm de la divulgación puede modular el aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC) de los compuestos y composiciones que comprenden lípidos descritos en la presente memoria.
A la inversa, los sitios de unión de miARN se pueden eliminar de las secuencias de polirribonucleótidos en las que se encuentran de forma natural para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, se puede eliminar un sitio de unión para un miARN específico de un polirribonucleótido para mejorar la expresión de proteínas en tejidos o células que contienen el miARN.
Los microARN se derivan enzimáticamente de regiones de transcritos de ARN que se pliegan sobre sí mismos para formar estructuras cortas en horquilla, a menudo denominadas pre-miARN (miARN precursor). Un premiARN tiene típicamente una protuberancia de dos nucleótidos en su extremo 3' y tiene grupos hidroxilo en 3' y fosfato en 5'. Este ARNm precursor se procesa en el núcleo y, posteriormente, se transporta al citoplasma, donde DICER (una enzima ARNasa III) lo procesa aún más para formar un microARN maduro de aproximadamente 22 nucleótidos. Luego, el microARN maduro se incorpora a una partícula ribonuclear para formar el complejo de silenciamiento inducido por ARN, RISC, que media el silenciamiento génico. La nomenclatura reconocida en la técnica para los miARN maduros típicamente designa el brazo del pre-miARN del que deriva el miARN maduro; "5p" significa que el microARN proviene del brazo principal 5 de la horquilla de pre-miARN y "3p" significa que el microARN proviene del extremo principal 3 de la horquilla de pre-miARN. Un miR denominado por número en la presente memoria puede referirse a cualquiera de los dos microARN maduros que se originan en los brazos opuestos del mismo pre-miARN (p. ej., el microARN 3p o 5p). Todos los miR a los que se hace referencia en la presente memoria están destinados a incluir tanto los brazos/secuencias 3p como 5p, a menos que se especifique particularmente por la designación 3p o 5p.
En un aspecto, el sitio de unión del miARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) se une al miARN maduro correspondiente que forma parte de un complejo de silenciamiento inducido por ARN activo (RISC) que contiene Dicer. En otro aspecto, la unión del sitio de unión del miARN al miARN correspondiente en RISC degrada el ARNm que contiene el sitio de unión del miARN o impide que se traduzca el ARNm.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sitio de unión de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que un microARN se une o se asocia. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en, o de manera adyacente a, el sitio de microARN.
Algunos microARN, p. ej., miR-122, son abundantes en el tejido normal, pero están presentes en niveles mucho más bajos en tejido canceroso o tumoral. Por lo tanto, la modificación por ingeniería de secuencias diana de microARN (es decir, el sitio de unión de microARN) en los polinucleótidos que codifican una proteína IL-23 y/o IL-36-gamma, IL-18 y/o una tercera proteína (p. ej., un polipéptido OX40L) (p. ej., en una región similar a 3'UTR u otra región) puede dirigirse eficazmente a la molécula para degradación o traducción reducida en tejido normal (donde el microARN es abundante) mientras proporciona altos niveles de traducción en el tejido canceroso o tumoral (donde el microARN está presente en niveles mucho más bajos). Esto proporciona una estrategia dirigida al tumor para los métodos y composiciones de la divulgación.
En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es totalmente complementario al miARN (p. ej., miR-122), degradando así el ARNm fusionado con el sitio de unión del miARN. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN no es completamente complementario al miARN correspondiente. En determinados aspectos, el sitio de unión del miARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene la misma longitud que el miARN correspondiente (p. ej., miR-122). En otros aspectos, el sitio de unión de microARN (p. ej., sitio de unión de miR-122) es un nucleótido más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122, que tiene 22 nt) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos más, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es dos nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos más, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es tres nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es cuatro nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es cinco nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos.
En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es seis nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es siete nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es ocho nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es nueve nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es diez nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es once nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es doce nucleótidos más corto que el microARN correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. Los sitios de unión de miARN que son más cortos que los miARN correspondientes aún son capaces de degradar el ARNm incorporando uno o más de los sitios de unión de miARN o evitando que el ARNm se traduzca.
En algunos aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene suficiente complementariedad con el miARN (p. ej., miR-122) de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (p. ej., miR-122) escinde el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (p. ej., miR-122) induce inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN. En otros aspectos, el sitio de unión del microARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miARN (p. ej., miR-122) reprime la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión del microARN.
Un sitio de unión del miARN que tiene suficiente complementariedad con un miARN se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la regulación mediada por miARN de un polirribonucleótido, p. ej., represión traduccional o degradación del polirribonucleótido mediada por el miARN. En aspectos ilustrativos de la divulgación, un sitio de unión del miARN que tiene suficiente complementariedad con el miARN se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la degradación del polirribonucleótido mediada por miARN, p. ej., escisión mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) guiado por miARN de ARNm. El sitio de unión del miARN puede tener complementariedad, por ejemplo, con una secuencia de miARN con una longitud de 19-25 nucleótidos, con una secuencia de miARN con una longitud de 19-23 nucleótidos, o con una secuencia de miARN con una longitud de 22 nucleótidos. Un sitio de unión del miARN puede ser complementario solo a una parte de un miARN, p. ej., a una parte de menos de 1,2, 3 o 4 nucleótidos de la longitud completa de una secuencia de miARN natural, o a una parte de menos de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos más corta que una secuencia de miARN natural (tal como un sitio de unión del miARN tiene "complementariedad imperfecta"). Se prefiere la complementariedad total o completa (p. ej., la complementariedad total o la complementariedad completa sobre la totalidad o una parte significativa de la longitud de un miARN de origen natural) cuando la regulación deseada es la degradación del ARNm.
En un aspecto, el sitio de unión del miARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene un emparejamiento erróneo con respecto al miARN correspondiente (p. ej., miR-122). En otro aspecto, el sitio de unión del miARN tiene dos emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene tres emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene cuatro emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En algunos aspectos, el sitio de unión del miARN tiene cinco emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene seis emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En determinados aspectos, el sitio de unión del miARN tiene siete emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene ocho emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene nueve emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene diez emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene once emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente. En otros aspectos, el sitio de unión del miARN tiene doce emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente.
En determinados aspectos, el sitio de unión del miARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) tiene al menos aproximadamente diez nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente diez nucleótidos contiguos del miARN correspondiente (p. ej., miR-122), al menos aproximadamente once nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente once nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente doce nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente doce nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente trece nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente trece nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, o al menos aproximadamente catorce nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente catorce nucleótidos contiguos del miARN correspondiente. En algunos aspectos, los sitios de unión de miARN tienen al menos aproximadamente quince nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente quince nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, al menos aproximadamente veinte nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente veinte nucleótidos contiguos del miARN correspondiente, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios al menos a aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos del miARN correspondiente.
En algunos aspectos, los polinucleótidos comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y al menos un sitio de unión de miR-122, al menos dos sitios de unión de miR-122, al menos tres sitios de unión de miR-122, al menos cuatro sitios de unión de miR-122, o al menos cinco sitios de unión de miR-122. En un aspecto, el sitio de unión del miARN se une a miR-122 o es complementario a miR-122. En otro aspecto, el sitio de unión del miARN se une a miR-122-3p o miR-122-5p. En un aspecto particular, el sitio de unión del miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24, en donde el sitio de unión del miARN se une a miR-122. En otro aspecto particular, el sitio de unión del miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 26, en donde el sitio de unión del miARN se une a miR-122. Estas secuencias se muestran en la TABLA 2 a continuación.
Tabla 2. miR-122 sitios de unión de miR-122
Figure imgf000149_0001
En algunos aspectos, un sitio de unión del miARN (p. ej., el sitio de unión de miR-122) se inserta en el polinucleótido de la divulgación en cualquier posición del polinucleótido (p. ej., 3'UTR); el sitio de inserción en el polinucleótido puede estar en cualquier parte del polinucleótido siempre que la inserción del sitio de unión del miARN en el polinucleótido no interfiera con la traducción del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L funcional en ausencia del miARN correspondiente (p. ej., miR-122); y en presencia del miARN (p. ej., miR-122), la inserción del sitio de unión del miARN en el polinucleótido y la unión del sitio de unión del miARN al miARN correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del polinucleótido. En un aspecto, se inserta un sitio de unión del miARN en una 3'UTR del polinucleótido.
En determinados aspectos, se inserta un sitio de unión del miARN en al menos aproximadamente 30 nucleótidos en 3' del codón de parada del ARNm que codifica el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. En otros aspectos, un sitio de unión del miARN se inserta en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100 nucleótidos en 3' del codón de parada del polinucleótido, p. ej., el ARNm que codifica el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. En otros aspectos, un sitio de unión del miARN se inserta en aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, aproximadamente 45 nucleótidos a aproximadamente 65 nucleótidos en 3' del codón de parada del polinucleótido, p. ej., el ARNm que codifica el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L.
Arquitectura de Polinucleótidos IVT
En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente divulgación que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L es un polinucleótido IVT. Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm incluyen al menos una región codificante, una 5'UTR, una 3'UTR, una caperuza 5' y una cola de poli-A. Los polinucleótidos IVT de la presente divulgación pueden funcionar como ARNm, pero se distinguen del ARNm de tipo salvaje en sus características de diseño estructural y/o funcional que sirven, p. ej., para superar problemas existentes de producción eficaz de polipéptidos utilizando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos.
La construcción primaria de un polinucleótido IVT comprende una primera región de nucleótidos unidos que está flanqueada por una primera región flanqueante y una segunda región flanqueante. Esta primera región puede incluir, pero no se limita a, el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L codificado. La primera región flanqueante puede incluir una secuencia de nucleósidos unidos que funcionan como una región no traducida (UTR) en 5' tal como la 5' UTR de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la 5' UTR nativa del polipéptido o una 5'UTR no nativa tal como, pero no limitada a, una 5' UTR heteróloga o una 5' UTR sintética. El IVT que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede comprender en su extremo 5 una región de secuencia señal que codifica una o más secuencias señal. La región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos unidos que comprende una o más secuencias 5' UTR completas o incompletas. La región flanqueante también puede comprender una caperuza en el extremo 5'. La segunda región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos unidos que comprenden una o más 3' UTR completas o incompletas que pueden codificar la 3' UTR nativa del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L o una 3' UTR no nativa tal como, pero no limitada a, una 3' UTR heteróloga o una 3' UTR sintética. La región flanqueante también puede comprender una secuencia de cola en 3'. La secuencia de cola en 3' puede ser, pero no se limita a, una cola de poliA, un cuarteto poliA-G y/o una secuencia de bucle tallo.
La unión en puente del extremo 5' de la primera región y la primera región flanqueante es una primera región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de la traducción que incluya un codón de inicio.
La unión en puente del extremo 3' de la primera región y la segunda región flanqueante es una segunda región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de parada. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de parada. También se pueden usar múltiples codones de parada en serie en el polinucleótido IVT. En algunos aspectos, la región operativa de la presente divulgación puede comprender dos codones de parada. El primer codón de parada puede ser "TGA" o "UGA" y el segundo codón de parada puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" o "UAG".
La construcción primaria de polinucleótidos IVT comprende una primera región de nucleótidos unidos que está flanqueada por una primera región flanqueante y una segunda región flanqueante. Tal y como se usa en la presente memoria, la "primera región" puede denominarse "región codificante" o "región que codifica" o simplemente la "primera región". Esta primera región puede incluir, pero no se limita a, el polipéptido codificado de interés. En un aspecto, la primera región puede incluir, pero no se limita a, el marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido de interés. El marco de lectura abierto puede optimizarse por codones en su totalidad o en parte. La región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos unidos que comprenden una o más secuencias 5' UTR completas o incompletas que puede estar completamente optimizadas por codones o parcialmente optimizadas por codones. La región flanqueante puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico incluyendo, pero no limitada a, secuencias miR, secuencias TERZAK™ y secuencias de control de la traducción. La región flanqueante también puede comprender una caperuza en el extremo 5' 138. La región de caperuza de extremo terminal 5' puede incluir una caperuza de origen natural, una caperuza sintética o una caperuza optimizada. La segunda región flanqueante puede comprender una región de nucleótidos unidos que comprenden una o más 3'UTR completas o incompletas. La segunda región flanqueante puede estar completamente optimizada por codones o parcialmente optimizada por codones. La región flanqueante puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico incluyendo, pero no limitadas a, secuencias miR y secuencias de control de la traducción. Después de la segunda región flanqueante, la construcción primaria de polinucleótidos puede comprender una secuencia de cola 3'. La secuencia de cola en 3' puede incluir una región de cola sintética y/o un nucleósido de terminación de cadena. Los ejemplos no limitantes de una región de cola sintética incluyen una secuencia poliA, una secuencia poliC, o un cuarteto poliA-G. Los ejemplos no limitantes de nucleósidos de terminación de cadena incluyen 2'-O metilo, F y ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
La unión en puente del extremo 5' de la primera región y la primera región flanqueante es una primera región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de la traducción que incluya un codón de inicio.
La unión en puente del extremo 3' de la primera región y la segunda región flanqueante es una segunda región operativa. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de parada. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de parada. Según la presente divulgación, también se pueden usar múltiples codones de parada en serie.
En algunos aspectos, la primera y segunda región flanqueante del polinucleótido IVT pueden variar independientemente de 15-1.000 nucleótidos de longitud (p. ej., más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 y 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500 nucleótidos).
En algunos aspectos, la secuencia de cola del polinucleótido IVT puede variar desde ausente hasta 500 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 nucleótidos). Cuando la región de cola es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en unidades de o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En este aspecto, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión de poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos y 160 nucleótidos son funcionales.
En algunos aspectos, la región de caperuza del polinucleótido IVT puede comprender una sola caperuza o una serie de nucleótidos que forman la caperuza. En este aspecto, la región de caperuza puede tener una longitud de 1 a 10, p. ej., 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos. En algunos aspectos, la caperuza está ausente.
En algunos aspectos, la primera y segunda región operativa del polinucleótido IVT puede variar de 3 a 40, p. ej., 5-30, 10-20, 15, o al menos 4, o 30 o menos nucleótidos de longitud y puede comprender, además de un codón de inicio y/o parada, una o más señales y/o secuencias de restricción.
En algunos aspectos, los polinucleótidos IVT pueden modificarse estructuralmente o modificarse químicamente. Cuando los polinucleótidos IVT se modifican química y/o estructuralmente, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos IVT modificados".
En algunos aspectos, si los polinucleótidos IVT se modifican químicamente, pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, p. ej., pseudouridina o 5-metoxiuridina. En otro aspecto, los polinucleótidos IVT pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido a lo largo del polinucleótido completo (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera).
En algunos aspectos, los polinucleótidos IVT pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en la presente memoria, tal como, pero no limitado a, el péptido 2A. La secuencia de polinucleótido del péptido 2A en el polinucleótido IVT puede modificarse u optimizarse por codones mediante los métodos descritos en la presente memoria y/o son conocidos en la técnica. En algunos aspectos, esta secuencia puede usarse para separar la región codificante de dos o más polipéptidos de interés en el polinucleótido IVT.
Arquitectura de Polinucleótidos Quiméricos
En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente divulgación es un polinucleótido quimérico. Los polinucleótidos quiméricos o construcciones de ARN divulgados en la presente memoria mantienen una organización modular similar a los polinucleótidos IVT, pero los polinucleótidos quiméricos comprenden una o más modificaciones o alteraciones químicas y/o estructurales que imparten propiedades útiles al polinucleótido. Como tales, los polinucleótidos quiméricos que son moléculas de ARNm modificadas de la presente divulgación se denominan "ARNm quimérico modificado" o "ARNm quimérico".
Los polinucleótidos quiméricos tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores.
Los ejemplos de partes o regiones, donde el polinucleótido quimérico funciona como un ARNm y codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR, tales como 5'UTR o 3' UTR), regiones codificantes, regiones de caperuza, regiones de cola de poliA, regiones de inicio, regiones de parada, regiones de secuencia de señal, y combinaciones de las mismas. Las regiones o partes que se unen o se encuentran entre otras regiones también pueden diseñarse para tener subregiones.
En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos de la divulgación tienen una estructura que comprende la Fórmula X.
5' [An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L3 3' Fórmula X
en donde:
cada uno de A y B comprende independientemente una región de nucleósidos unidos;
ya sea A o B o tanto A como B codifican un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L descrito en otra parte de la presente memoria;
C es una región opcional de nucleósidos unidos;
al menos una de las regiones A, B o C está modificada posicionalmente, en donde dicha región modificada posicionalmente comprende al menos dos nucleósidos modificados químicamente de uno o más del mismo tipo de nucleósido de adenosina, timidina, guanosina, citidina o uridina, y en donde al menos dos de las modificaciones químicas de nucleósidos del mismo tipo son modificaciones químicas diferentes;
n, o y p son independientemente un número entero entre 15-1.000;
x e y son independientemente 1-20;
z es 0-5;
L1 y L2 son independientemente restos conectores opcionales, estando dichos restos conectores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico; y
L3 es un conjugado opcional o un resto conector opcional, estando dicho resto conector basado en ácido nucleico o no basado en ácido nucleico.
En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de A comprende una secuencia de nucleósidos unidos que pueden funcionar como una región no traducida (UTR) en 5'. La secuencia de nucleósidos unidos puede ser una 5' UTR natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y la secuencia de nucleósidos unidos de A puede codificar la 5' UTR nativa del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L o una 5' UTR no heteróloga tal como, pero no limitada a, una UTR sintética.
En otro aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de A es una región de caperuza. La región de caperuza puede estar localizada en 5' con respecto a una región de nucleósidos unidos de A que funcionan como una 5' UTR. La región de caperuza puede comprender al menos una caperuza tal como, pero no limitada a, Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxoguanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2 y Cap4.
En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación comprende una 5'UTR Cap1. En algunos aspectos, un polinucleótido que comprende la secuencia 5'UTR, p. ej., Cap1, para codificar un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L divulgado en la presente memoria aumenta la expresión del polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L en comparación con los polinucleótidos que codifican el polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L que comprenden una 5'UTR diferente (p. ej., CapO, ARCA, inosina, N1-metilguanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2 o Cap4). En algunos aspectos, un polinucleótido comprende la 5'UTR Cap1, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende la 5'UTR Cap1 aumenta la expresión del polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L.
En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de B comprende al menos un marco de lectura abierto de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. La secuencia de ácido nucleico puede tener codones optimizados y/o comprender al menos una modificación.
En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de C comprende una secuencia de nucleósidos unidos que pueden funcionar como una 3' UTR. La secuencia de nucleósidos unidos puede ser
una 3' UTR natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L y la secuencia de nucleósidos unidos de C puede codificar la
3' UTR nativa de un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L o una 3'UTR no heteróloga tal como,
pero no limitada a, una UTR sintética.
En algunos aspectos, al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de A comprende una secuencia de nucleósidos unidos que funciona como una 5'UTR y al menos una de las regiones de nucleósidos unidos de C comprende una secuencia de nucleósidos unidos que funciona como una 3'UTR. En algunos aspectos, la
5'UTR y la 3'UTR pueden ser de la misma o diferentes especies. En otros aspectos, la 5'UTR y la 3'UTR pueden
codificar las regiones nativas no traducidas de diferentes proteínas de la misma o diferentes especies.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación
pueden clasificarse como hemímeros, gápmeros, wíngmeros o blóckmeros.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "hemímero" es un polinucleótido quimérico que comprende una
región o parte que comprende la mitad de un patrón, porcentaje, posición o población de una modificación o modificaciones químicas y la mitad de un segundo patrón, porcentaje, posición o población de una modificación
o modificaciones químicas. Los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación también pueden comprender subregiones de hemímeros. En algunos aspectos, una parte o región es un 50 % de una y un 50
% de otra.
En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico completo es el 50 % de una y el 50 % de la otra. Cualquier
región o parte de cualquier polinucleótido quimérico de la divulgación puede ser un hemímero. Los tipos de hemímeros incluyen hemímeros de patrón, hemímeros de población o hemímeros de posición. Por definición,
los hemímeros son 50:50 por ciento hemímeros.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "gápmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos
tres partes o regiones con un hueco entre las partes o regiones. El "hueco" puede comprender una región de nucleósidos unidos o un solo nucleósido que difiere de la naturaleza quimérica de las dos partes o regiones
que lo flanquean. Las dos partes o regiones de un gápmero pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "wíngmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos
tres partes o regiones con un hueco entre las partes o regiones. A diferencia de un gápmero, las dos partes o
regiones flanqueantes que rodean el hueco en un wíngmero son iguales en grado o tipo. Tal similitud puede
estar en la longitud del número de unidades de diferentes modificaciones o en el número de modificaciones.
Las alas de un wíngmero pueden ser más largas o más cortas que el hueco. Las partes o regiones del ala
pueden ser un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % más largas o más cortas que la región que comprende el
hueco.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "blóckmero" es un polinucleótido con patrón donde las partes o
regiones tienen un tamaño o número y tipo de modificaciones equivalentes. Las regiones o subregiones en un
blóckmero pueden tener una longitud de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,
120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 2 230, 231, 232, 233,
Figure imgf000153_0001
234, 235, 236,
Figure imgf000153_0002
237, 238, 239, 240,
Figure imgf000153_0003
241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 2 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258,
Figure imgf000153_0004
259, 260, 261, 262,
Figure imgf000153_0005
263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 2 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280,
Figure imgf000153_0006
281, 282, 283, 284,
Figure imgf000153_0007
285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 2 296, 297, 298, 299, 300, 310, 320,
Figure imgf000153_0008
330, 340, 350, 360,
Figure imgf000153_0009
370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 4 480, 490 o 500 nucleósidos.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación que
tienen un patrón de modificación química se denominan "quimeras de patrón". Las quimeras de patrón también
pueden denominarse blóckmeros. Las quimeras de patrón son aquellos polinucleótidos que tienen un patrón
de modificaciones en, a lo largo de o entre regiones o partes.
Los patrones de modificaciones dentro de una parte o región son aquellos que comienzan y terminan dentro
de una región definida. Los patrones de modificaciones a lo largo de una parte o región son aquellos patrones
que comienzan en una parte o región y terminan en otra parte o región adyacente. Los patrones de modificaciones entre partes o regiones son aquellos que comienzan y terminan en una parte o región y se repiten en una parte o región diferente, que no es necesariamente adyacente a la primera región o parte.
Las regiones o subregiones de quimeras de patrón o blóckmeros pueden tener patrones alternos simples tales como ABAB[AB]n donde cada "A" y cada "B" representan diferentes modificaciones químicas (al menos una de la base, el azúcar o el conector de la estructura principal), diferentes tipos de modificaciones químicas (p. ej., de origen natural y no natural), diferentes porcentajes de modificaciones o diferentes poblaciones de modificaciones. El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300. Además, cada A o B puede representar de 1-2.500 unidades (p. ej., nucleósidos) en el patrón. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos tales como patrón AABBAABB[AABB]n (un dobje múltiplo alterno) o AAABBBAAABBB[AAABBB]n (un triple múltiplo alterno). El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300.
También se pueden mezclar diferentes patrones para formar un patrón de segundo orden. Por ejemplo, un único patrón alterno se puede combinar con un patrón alterno triple para formar un patrón alterno A'B' de segundo orden. Un ejemplo sería [ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB][ABABAB][AAABBBAAABBB], donde [ABABAB] es A' y [AAABBBAAABBB] es B'. De manera similar, estos patrones pueden repetirse n número de veces, donde n=3-300.
Los patrones pueden incluir tres o más modificaciones diferentes para formar un patrón ABCABC[ABC]n. Estos patrones de tres componentes también pueden ser múltiplos, tales como AABBCCAABBCC[AABBCC]n y pueden diseñarse como combinaciones con otros patrones tales como ABCABCAABBCCABCABCAABBCC, y pueden ser patrones de orden superior.
Las regiones o subregiones de modificaciones de posición, porcentaje y población no necesitan reflejar una contribución igual de cada tipo de modificación. Pueden formar series tales como "1-2-3-4", "1-2-4-8", donde cada número entero representa el número de unidades de un tipo de modificación particular. Alternativamente, pueden ser solo impares, tales como "1-3-3-1-3-1-5" o solo pares "2-4-2-4-6-4-8" o una mezcla de números de unidades impares y pares tales como "1-3-4-2-5-7-3-3-4".
Las quimeras de patrón pueden variar en su modificación química por grado (tales como las descritas anteriormente) o por tipo (p. ej., diferentes modificaciones).
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación que tienen al menos una región con dos o más modificaciones químicas diferentes de dos o más miembros nucleósidos del mismo tipo de nucleósidos (A, C, G, T o U) se denominan quimeras "posicionalmente modificadas". Las quimeras posicionalmente modificadas también se denominan en la presente memoria quimeras de "colocación selectiva" o "polinucleótidos de colocación selectiva". Como su nombre lo indica, la colocación selectiva se refiere al diseño de polinucleótidos que, a diferencia de los polinucleótidos en la técnica, donde la modificación de cualquier A, C, G, T o U es la misma en virtud del método de síntesis, pueden tener diferentes modificaciones para los A, C, G, T o U individuales en un polinucleótido o región del mismo. Por ejemplo, en un polinucleótido quimérico posicionalmente modificado, puede haber dos o más modificaciones químicas diferentes en cualquiera de los tipos de nucleósidos de A, C, G, T o U. También puede haber combinaciones de dos o más a cualesquiera dos o más del mismo tipo de nucleósido. Por ejemplo, un polinucleótido quimérico de colocación selectiva o posicionalmente modificado puede comprender 3 modificaciones diferentes de la población de adeninas en la molécula y también tener 3 modificaciones diferentes de la población de citosinas en la construcción, todas las cuales pueden tener una única colocación, no aleatoria.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación que tienen un porcentaje de modificación química se denominan "quimeras porcentuales". Las quimeras porcentuales pueden tener regiones o partes que comprenden al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 8 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 99 % de modificaciones posicionales, de patrón o de población. Alternativamente, la quimera porcentual puede modificarse completamente en cuanto a la posición, el patrón o la población de modificación. El porcentaje de modificación de una quimera porcentual puede dividirse entre modificaciones naturales y no naturales.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación que tienen una población de modificación química se denominan "quimeras de población". Una quimera de población puede comprender una región o parte donde los nucleósidos (su enlace de base, azúcar o estructura principal, o una combinación de los mismos) tienen una población seleccionada de modificaciones. Tales modificaciones pueden seleccionarse de entre poblaciones funcionales tales como modificaciones que inducen, alteran o modulan un resultado fenotípico. Por ejemplo, una población funcional puede ser una población o una selección de modificaciones químicas que aumentan el nivel de una citoquina. Otras poblaciones funcionales pueden funcionar individual o colectivamente para disminuir el nivel de una o más citoquinas. El uso de una selección de estas modificaciones de función similar en un polinucleótido quimérico constituiría por lo tanto una "quimera de población funcional". Tal y como se usa en la presente memoria, una "quimera de población funcional" puede ser una cuya característica funcional única está definida por la población de modificaciones como se ha descrito anteriormente o el término puede aplicarse a la función general del polinucleótido quimérico en sí. Por ejemplo, en su conjunto, el polinucleótido quimérico puede funcionar de una manera diferente o superior en comparación con un polinucleótido no modificado o no quimérico.
Cabe señalar que los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, p. ej., pseudouridina o 5-metoxiuridina, no se consideran polinucleótidos quiméricos. Asimismo, los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (tales como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera) no se consideran polinucleótidos quiméricos. Un ejemplo de un polinucleótido que no es quimérico es el polinucleótido canónico modificado con pseudouridina/5-metil citosina. Estos polinucleótidos uniformes se obtienen en su totalidad a través de la síntesis enzimática de transcripción in vitro (IVT); y debido a las limitaciones de las enzimas sintetizadoras, contienen solo un tipo de modificación cuando se produce cada uno del mismo tipo de nucleósido, es decir, adenosina (A), timidina (T), guanosina (G), citidina (C) o uridina (U), que se encuentra en el polinucleótido. Dichos polinucleótidos se pueden caracterizar como polinucleótidos IVT.
Los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación pueden modificarse estructuralmente o modificarse químicamente. Cuando los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación están químicamente y/o estructuralmente modificados, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos quiméricos modificados".
Las regiones o partes de los polinucleótidos quiméricos pueden estar separadas por un resto conector o espaciador. Dichos conectores o espacios pueden estar basados en ácidos nucleicos o ser no nucleosídicos.
En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en la presente memoria, tal como, pero no limitado a, un péptido 2A. La secuencia polinucleotídica del péptido 2A en el polinucleótido quimérico puede modificarse u optimizarse por codones mediante los métodos descritos en la presente memoria y/o conocidos en la técnica.
No obstante de lo anterior, los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación pueden comprender una región o parte que no está modificada posicionalmente o no es quimérica como se define en la presente memoria. Por ejemplo, una región o parte de un polinucleótido quimérico puede modificarse uniformemente en una o más A, T, C, G o U, pero los polinucleótidos no se modificarán uniformemente en toda la región o parte.
Los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación pueden estar completamente modificados en posición o parcialmente modificados en posición. También pueden tener subregiones que pueden tener cualquier patrón o diseño.
En algunos aspectos, las regiones o subregiones de los polinucleótidos pueden variar desde ausentes hasta 500 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 nucleótidos). Cuando la región es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en unidades o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En este aspecto, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión de poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos son funcionales. Los polinucleótidos quiméricos de la presente divulgación que funcionan como un ARNm no necesitan comprender una cola de poliA.
Según la presente divulgación, los polinucleótidos quiméricos que funcionan como un ARNm pueden tener una región de caperuza. La región de caperuza puede comprender una única caperuza o una serie de nucleótidos que forman la caperuza. En este aspecto, la región de caperuza puede tener de 1 a 10, por ejemplo, 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunos aspectos, la caperuza está ausente.
La presente divulgación contempla polinucleótidos quiméricos que son circulares o cíclicos. Como su nombre indica, los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación.
Los polinucleótidos quiméricos, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos quiméricos, y los métodos de fabricación, uso y administración de polinucleótidos quiméricos también se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/53907.
En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L. En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos de la divulgación comprenden una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de IL-23 y/o IL-36-gamma, IL-18 enumeradas en la TABLA 1 y/o una secuencia de ácido nucleico de OX40L enumerada en la TABLA 1A. En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico de la divulgación codifica uno cualquiera de los polipéptidos IL-23 y/o IL-36-gamma, IL-18 enumerados en la TABLA 1 y/u OX40L enumerados en la TABLA 1A.
Polinucleótido Circular
El polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L puede ser circular o cíclico. Tal y como se usa en la presente memoria, "polinucleótidos circulares" o "circP" significa un polinucleótido circular monocatenario que actúa sustancialmente como, y tiene las propiedades de, un ARN. El término "circular" también pretende abarcar cualquier configuración secundaria o terciaria del circP. Los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación.
Los polinucleótidos circulares, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos circulares, y los métodos de fabricación, uso y administración de polinucleótidos circulares también se divulgan en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/53904 (publicada como WO2015034925, véase también, US 2016-0194368).
En algunos aspectos, el polinucleótido circular codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, o un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, los polinucleótidos circulares de la divulgación comprenden una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de IL-23, IL-36-gamma, IL-18 enumeradas en la TABLA 1 o secuencias de ácido nucleico de OX40L enumeradas en la TABLA 1A. En algunos aspectos, los polinucleótidos circulares de la divulgación codifican uno cualquiera del polipéptido IL-23, polipéptidos IL-36-gamma, IL-18 enumerados en la TABLA 1, o polipéptidos OX40L enumerados en la TABLA 1A. En algunos aspectos, el polinucleótido circular aumenta la expresión del polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, IL-18 o polipéptido OX40L.
Multímeros de Polinucleótidos
En algunos aspectos, múltiples polinucleótidos quiméricos distintos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí a través del extremo 3' usando nucleótidos que están modificados en el extremo 3'. Puede usarse conjugación química para controlar la estequiometría de la administración en las células. Esto puede controlarse mediante la unión química de polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT usando un nucleótido terminado en 3'-azido en una especie de polinucleótido y un nucleótido que contiene C5-etinilo o alquinilo en la especie de polinucleótido opuesta. El nucleótido modificado se añade después de la transcripción usando transferasa terminal (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. Después de la adición del nucleótido modificado en 3', las dos especies de polinucleótidos pueden combinarse en una solución acuosa, en presencia o ausencia de cobre, para formar un nuevo enlace covalente a través de un mecanismo de química clic como se describe en la bibliografía.
En otro ejemplo, más de dos polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí usando una molécula conectora funcionalizada. Por ejemplo, una molécula de sacárido funcionalizada puede modificarse químicamente para contener múltiples grupos reactivos químicos (SH-, NH2-, N3, etc.) para reaccionar con el resto afín en una molécula de ARNm funcionalizada en 3' (es decir, un éster 3'-maleimida, éster 3'-NHS, alquinilo). El número de grupos reactivos en el sacárido modificado se puede controlar de forma estequiométrica para controlar directamente la relación estequiométrica de polinucleótidos quiméricos conjugados y/o polinucleótidos IVT.
En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos y/o los polinucleótidos IVT pueden unirse juntos en un patrón. El patrón puede ser un patrón alterno simple tal como CD[CD]x donde cada "C" y cada "D" representan un polinucleótido quimérico, polinucleótido IVT, diferentes polinucleótidos quiméricos o diferentes polinucleótidos IVT. El patrón puede repetirse x número de veces donde x=1-300. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos tales como patrón CCDD[CCDD] x (un múltiplo doble alterno) o CCCDDD[CCCDDD] x (un múltiplo triple alterno). El múltiplo doble alterno o el múltiplo triple alterno pueden repetirse x número de veces, donde x= 1-300.
Conjugados y Combinaciones de Polinucleótidos
El polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18 o un polipéptido OX40L de la presente divulgación puede diseñarse para conjugarse con otros polinucleótidos, tintes, agentes intercalantes (p. ej., acridinas), reticulantes (p. ej., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safrina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p. ej., EDTA), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej., biotina), facilitadores de transporte/absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas, proteínas, p. ej., glicoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea, hormonas y receptores de hormonas, especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores o un fármaco.
La conjugación puede dar lugar a una mayor estabilidad y/o semivida y puede ser particularmente útil para dirigir los polinucleótidos a sitios específicos en la célula, tejido u organismo.
Un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L de la divulgación puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos heterólogos. En un aspecto, el uno o más polipéptidos heterólogos mejoran una propiedad farmacocinética o una propiedad farmacodinámica del polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18 o polipéptido OX40L, o un polinucleótido (p. ej., al menos un ARNm) que codifica el polipéptido iL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18 o polipéptido OX40L. En otro aspecto, el uno o más polipéptidos heterólogos comprenden un polipéptido que puede extender la semivida del polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o polipéptido OX40L.
Un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L de la presente divulgación puede comprender además una o más regiones o partes que actúan o funcionan como una región no traducida. Por definición, las regiones no traducidas (UTR) de tipo salvaje de un gen se transcriben, pero no se traducen. En ARNm, la 5'UTR comienza en el sitio de inicio de la transcripción y continúa hasta el codón de inicio, pero no incluye el codón de inicio; mientras que la 3'UTR comienza inmediatamente después del codón de parada y continúa hasta la señal de finalización de la transcripción. Cada vez hay más evidencia sobre las funciones reguladoras que desempeñan las UTR en términos de estabilidad de la molécula de ácido nucleico y traducción. Las características reguladoras de una UTR se pueden incorporar en los polinucleótidos de la presente divulgación para, entre otras cosas, mejorar la estabilidad de la molécula. Las características específicas también se pueden incorporar para asegurar una regulación a la baja controlada del transcrito en caso de que estén mal dirigidas a sitios de órganos no deseados. La TABLA 3 y las TABLAS 4A y 4B proporcionan una lista de UTR ilustrativos que pueden utilizarse en los polinucleótidos de la presente divulgación.
5'UTR e Inicio de la Traducción
En determinados aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L de la presente divulgación comprende además una 5'UTR y/o una secuencia de inicio de la traducción. Las 5'UTR naturales tienen características que desempeñan un papel en el inicio de la traducción. Albergan firmas como las secuencias de Kozak, que comúnmente se sabe que están implicadas en el proceso por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. También se sabe que las 5'UTR forman estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de elongación.
Mediante la ingeniería de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los polinucleótidos de la divulgación. Por ejemplo, la introducción de 5'UTR de ARNm que se sabe que está regulado al alza en cánceres, tales como c-myc, podría usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, tal como un polinucleótido, en células cancerosas. Las regiones no traducidas útiles en el diseño y la fabricación de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, las divulgadas en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2014/164253 (véase también, US20160022840).
En la TABLA 3 se muestra una lista de una región no traducida 5' de la divulgación. Pueden utilizarse variantes de 5'UTR en donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.
Tabla 3. Regiones no Traducidas 5'
Figure imgf000158_0001
También pueden usarse otras secuencias que no sean UTR como regiones o subregiones en los polinudeótidos. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones en regiones de los polinucleótidos. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteínas, así como los niveles de polinucleótidos.
Las combinaciones de características pueden incluirse en regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una 5'UTR que puede contener una fuerte señal de inicio de la traducción de Kozak y/o una 3’UTR que puede incluir una secuencia de oligo(dT) para la adición de molde de una cola de poli-A. La 5'UTR puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido del mismo y/o diferentes genes, tales como las 5'UTR descritas en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2010-0293625.
Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en el transcrito de la que fueron seleccionadas o pueden alterarse en orientación o localización. Por lo tanto, una 5' o 3'UTR puede invertirse, acortarse, alargarse, prepararse con una o más de otras 5'UTR o 3'UTR.
En algunos aspectos, las secuencias UTR se pueden cambiar de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una 3' o 5'UTR puede alterarse con respecto a una UTR de tipo salvaje o nativa por el cambio en la orientación o localización como se ha enseñado anteriormente o puede alterarse por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprende una UTR variante. En algunos aspectos, se puede utilizar una UTR doble, triple o cuádruple, tal como una 5' o 3'UTR. Tal y como se usa en la presente memoria, una UTR "doble" es aquella en la que dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una 3'UTR doble beta-globina como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 2010-0129877.
En algunos aspectos, las regiones flanqueantes pueden ser heterólogas. En algunos aspectos, la región no traducida 5' puede derivar de una especie diferente a la región no traducida 3'. La región no traducida también puede incluir elementos potenciadores de la traducción (TEE). Como ejemplo no limitante, el TEE puede incluir los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2009-0226470.
3’UTR y los Elementos Ricos en AU
En determinados aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L comprende además una 3'UTR. 3'-UTR es la sección de ARNm que sigue inmediatamente al codón de terminación de la traducción y, a menudo, contiene regiones reguladoras que influyen después de la transcripción en la expresión génica. Las regiones reguladoras dentro de la 3'-UTR pueden influir en la poliadenilación, la eficiencia de la traducción, la localización y la estabilidad del ARNm. En una realización, la 3'-UTR útil para la divulgación comprende un sitio de unión para las proteínas reguladoras o microARN. En algunos aspectos, la 3'-UTR tiene una región silenciadora, que se une a las proteínas represoras e inhibe la expresión del ARNm. En otros aspectos, la 3'-UTR comprende un elemento rico en AU. Las proteínas se unen a los ARE para afectar la estabilidad o la tasa de descomposición de los transcritos de manera localizada o afectar el inicio de la traducción. En otros aspectos, la 3'-UTR comprende la secuencia AAUAAA que dirige la adición de varios cientos de residuos de adenina llamados la cola de poli(A) al final del transcrito de ARNm.
La TABLA 4A muestra una lista de regiones no traducidas 3' útiles para los ARNm que codifican un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, o un polipéptido OX40L. Pueden utilizarse variantes de las 3'UTR en donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, U, C o G.
Tabla 4A. Re iones no Traducidas 3' Ilustrativas
Figure imgf000159_0001
Figure imgf000160_0001
Figure imgf000161_0001
Figure imgf000162_0001
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000164_0001
Figure imgf000165_0001
Figure imgf000166_0001
En determinados aspectos, la secuencia 3'UTR útil para la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o aproximadamente un 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45-62 y cualquier combinación de las mismas. En un aspecto particular, la secuencia 3'UTR comprende además un sitio de unión del miARN, p. ej., sitio de unión de miR-122. En otros aspectos, una secuencia 3'UTR útil para la divulgación comprende 3'Ut R-018 (SEQ ID NO: 62).
En determinados aspectos, la secuencia 3'UTR comprende uno o más sitios de unión de miARN, p. ej., sitios de unión de miR-122, o cualquier otra secuencia de nucleótidos heteróloga en el mismo, sin alterar la función de la 3'UTR. En la TABLA 4B se enumeran algunos ejemplos de secuencias 3'UTR que comprenden un sitio de unión del miARN.
Tabla 4B. 3'UTR Ilustrativo con Sitios de Unión de miARN
Figure imgf000166_0002
Figure imgf000167_0001
En determinados aspectos, la secuencia 3'UTR útil para la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o aproximadamente un 100 % idéntica a la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 63 o 64.
Regiones que tienen una Caperuza en 5'
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18 o un polipéptido OX40L de la presente divulgación puede comprender además una caperuza en 5'. La caperuza en 5' útil para el ARNm que codifica el polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o polipéptido OX40L puede unirse a la proteína de unión de la caperuza (CBP) del ARNm, aumentando así la estabilidad del ARNm. La caperuza puede ayudar además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el corte y empalme del ARNm.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L de la presente divulgación comprende una estructura de caperuza no hidrolizable que evita la eliminación de la caperuza y, por lo tanto, aumenta la semivida del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la caperuza requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de formación de caperuza. Por ejemplo, se puede usar una enzima de formación de caperuza de Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, mA) con nucleótidos de a-tio-guanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fósforotioato en la caperuza 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y seleno-fosfato.
En determinados aspectos, la caperuza en 5' comprende la 2'-O-metilación de los azúcares de ribosa de los nucleótidos terminales en 5' y/o anteterminales en 5' en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. En otros aspectos, las caperuzas para el ARNm que codifica el polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, o un polipéptido OX40L incluyen análogos de caperuza, que también se denominan en la presente memoria análogos de caperuza sintéticos, caperuzas químicas, análogos de caperuza química o análogos de caperuza estructurales o funcionales, que difieren de las caperuzas en 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo salvaje o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de caperuza. Los análogos de caperuza pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/o unirse a los polinucleótidos de la divulgación.
Por ejemplo, la caperuza Análogo de Caperuza Antiinverso (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, en donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido 5' terminal del polinucleótido con caperuza. La guanina N7 y 3'-O-metilada proporciona el resto terminal del polinucleótido con caperuza.
Otra caperuza ilustrativa es mCAP, que es similar a ARCA, pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).
En algunos aspectos, la caperuza es un análogo de caperuza de dinucleótido. Como ejemplo no limitante, el análogo de caperuza de dinucleótido puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fósforoselenoato, tal como los análogos de caperuza de dinucleótido descritos en la Patente de EE. UU. No. 8.519.110.
En otro aspecto, la caperuza es un análogo de caperuza que es una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza conocido en la técnica y/o descrito en la presente memoria. Los ejemplos no limitantes de una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza incluyen un análogo de caperuza N7-(4-clorofenoxietil)-G(5')ppp(5')G y N7-(4-clorofenoxietil)-m3' OG(5')ppp(5')G. Véanse, p. ej., los diversos análogos de caperuza y los métodos para sintetizar análogos de caperuza descritos en Kore et al. (2013) Bioorganic & Medicinal Chemistry 21:4570-4574. En otro aspecto, un análogo de caperuza de la presente divulgación es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.
Si bien los análogos de caperuza permiten la inclusión concomitante de una caperuza en un polinucleótido o una región del mismo, en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de los transcritos permanecen sin caperuza. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de caperuza de una estructura endógena de caperuza en 5' de ácidos nucleicos producidos por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y a una estabilidad celular reducida.
En el ARNm que codifica el polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L de la presente divulgación también se puede incluir una caperuza después de la fabricación (ya sea IVT o síntesis química), usando enzimas, para generar estructuras con caperuza en 5' más auténticas. Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo salvaje. Es decir, una característica "más auténtica" representa mejor una función y/o estructura celular endógena, de tipo salvaje, natural o fisiológica en comparación con características o análogos sintéticos, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo salvaje, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos.
Los ejemplos no limitantes de estructuras de caperuza en 5' más auténticas de la presente divulgación son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la caperuza, una semivida aumentada, una susceptibilidad reducida a las 5' endonucleasas y/o eliminación de caperuza en 5' reducida, en comparación con las estructuras de caperuza en 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de caperuza en 5' de tipo salvaje, natural o fisiológica). Por ejemplo, la enzima de formación de caperuza del virus vaccinia recombinante y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5' terminal de un polinucleótido y un nucleótido de caperuza de guanina en donde la caperuza de guanina contiene una metilación en N7 y el nucleótido 5' terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Dicha estructura se denomina estructura Cap1. Esta caperuza da como resultado una mayor competencia de traducción y estabilidad celular y una activación reducida de citoquinas proinflamatorias celulares, en comparación, p. ej., con otras estructuras análogas de caperuza en 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1), y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2).
Según la presente divulgación, las caperuzas 5' terminales pueden incluir caperuzas endógenas o análogos de caperuza. Según la presente divulgación, una caperuza 5' terminal puede comprender un análogo de guanina. Los análogos de guanina útiles incluyen, pero no se limitan a, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoroguanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.
Colas de Poli-A
En algunos aspectos, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18 o un polipéptido OX40L de la presente divulgación comprende además una cola poli A. En aspectos adicionales, se pueden incorporar grupos terminales en la cola de poli-A para la estabilización. En otros aspectos, una cola de poli-A comprende colas des-3' hidroxilo. Las colas de poli-A útiles también pueden incluir restos estructurales o modificaciones de 2'-Ometilo como enseñan Li et al. (2005) Current Biology 15:1501-1507.
En un aspecto, la longitud de una cola de poli-A, cuando está presente, es mayor de una longitud de 30 nucleótidos. En otro aspecto, la cola de poli-A tiene una longitud de más de 35 nucleótidos (p. ej., al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, y 3.000 nucleótidos).
En algunos aspectos, el polinucleótido o región del mismo incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1.500, de 50 a 2.000, de 50 a 2.500, de 50 a 3.000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1.000, de 100 a 1.500, de 100 a 2.000, de 100 a 2.500, de 100 a 3.000, de 500 a 750, de 500 a 1.000, de 500 a 1.500, de 500 a 2.000, de 500 a 2.500, de 500 a 3.000, de 1.000 a 1.500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 2.500, de 1.000 a 3.000, de 1.500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).
En algunos aspectos, la cola de poli-A se diseña en relación con la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región particular del polinucleótido. Este diseño puede basarse en la longitud de una región codificante, la longitud de una característica o región particular o se basa en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos.
En este contexto, la cola de poli-A puede tener una longitud un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor que la del polinucleótido o característica del mismo. La cola de poli-A también puede diseñarse como una fracción de los polinucleótidos a los que pertenece. En este contexto, la cola de poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción, una región de construcción o la longitud total de la construcción menos la cola de poli-A. Además, los sitios de unión diseñados por ingeniería y la conjugación de polinucleótidos para proteína de unión a poli-A pueden mejorar la expresión.
Además, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir entre sí mediante la PABP (proteína de unión a poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola de poli-A. Los experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12h, 24h, 48h, 72h y en el día 7 después de la transfección.
En algunos aspectos, los polinucleótidos de la presente divulgación están diseñados para incluir una región de cuarteto de poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que puede formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En este aspecto, el cuarteto G se incorpora al final de la cola de poli-A. El polinucleótido resultante se somete a ensayo en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluida la semivida en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto de poliA-G da como resultado una producción de proteínas a partir de un ARNm equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una cola de poli-A de 120 nucleótidos sola.
Región de codón de inicio
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L de la presente divulgación comprende además regiones que son análogas a o funcionan como una región de codón de inicio.
En algunos aspectos, la traducción de un polinucleótido se inicia en un codón que no es el codón de inicio AUG. La traducción del polinucleótido puede iniciarse en un codón de inicio alternativo tal como, pero no limitado a, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG. Véase, Touriol et al. (2003) Biology of the Cell 95:169-178 y Matsuda y Mauro (2010) PLoS ONE 5:11. Como ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitante, la traducción de polinucleótidos comienza en el codón de inicio alternativo CTG o CUG. Como otro ejemplo no limitante más, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo GTG o GUG.
Se sabe que los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción, tales como, pero no limitados a, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo, afectan la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido. Véase, p. ej., Matsuda y Mauro PLoS ONE, 2010 5:11. El enmascaramiento de cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción puede usarse para alterar la posición de inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura de un polinucleótido.
En algunos aspectos, se usa un agente de enmascaramiento cerca del codón de inicio o codón de inicio alternativo para enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de inicio de la traducción en el codón de inicio o codón de inicio alternativo enmascarado. Los ejemplos no limitantes de agentes de enmascaramiento incluyen polinucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) antisentido y complejos de unión de exón (EJC). Véase, p. ej., Matsuda y Mauro (2010) PLoS ONE 5:11, que describen agentes de enmascaramiento, polinucleótidos LNA y EJC.
En otro aspecto, se usa un agente de enmascaramiento para enmascarar un codón de inicio de un polinucleótido con el fin de aumentar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio alternativo. En algunos aspectos, se usa un agente de enmascaramiento para enmascarar un primer codón de inicio o un codón de inicio alternativo con el fin de aumentar la posibilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio o un codón de inicio alternativo en 3' del codón de inicio o codón de inicio alternativo enmascarado.
En algunos aspectos, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo está ubicado dentro de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR. El complemento perfecto de un sitio de unión de miR puede ayudar a controlar la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como ejemplo no limitante, el codón de inicio o el codón de inicio alternativo está ubicado en el medio de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR-122. El codón de inicio o codón de inicio alternativo puede estar localizado después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido, decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.
En otro aspecto, el codón de inicio de un polinucleótido se elimina de la secuencia polinucleotídica con el fin de que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no es el codón de inicio. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón que sigue al codón de inicio eliminado o en un codón de inicio en 3' o un codón de inicio alternativo. En un ejemplo no limitante, el codón de inicio ATG o AUG se elimina como los primeros 3 nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos para que se inicie la traducción en un codón de inicio en 3' o un codón de inicio alternativo. La secuencia de polinucleótidos donde se eliminó el codón de inicio puede comprender además al menos un agente de enmascaramiento para el codón de inicio en 3' y/o codones de inicio alternativos para controlar o intentar controlar el inicio de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.
Región de Codón de Parada
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40 de la presente divulgación puede comprender además al menos un codón de parada o al menos dos codones de parada antes de la región no traducida (UTR) 3'. El codón de parada se puede seleccionar de UGA, UAA y uAg . En algunos aspectos, los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen el codón de parada UGA y un codón de parada adicional. En un aspecto adicional, el codón de parada de la adición puede ser UAA. En otro aspecto, los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen tres codones de parada, cuatro codones de parada o más.
X. Métodos de Preparación de Polinucleótidos
La presente divulgación también proporciona métodos para preparar un polinucleótido divulgado en la presente memoria o un complemento del mismo. En algunos aspectos, un polinucleótido (p. ej., un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, o un polipéptido OX40L puede construirse usando transcripción in vitro.
En otros aspectos, un polinucleótido (p. ej., un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L puede construirse mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. En otros aspectos, un polinucleótido (p. ej., un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L se prepara utilizando una célula huésped. En determinados aspectos, un polinucleótido (p. ej., un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L se prepara mediante una o más combinaciones de IVT, síntesis química, expresión en células huésped, o cualquier otro método conocido en la técnica.
Los nucleósidos de origen natural, los nucleósidos de origen no natural, o combinaciones de los mismos, pueden reemplazar total o parcialmente a los nucleósidos de origen natural presentes en la secuencia de nucleótidos candidata y pueden incorporarse en una secuencia de nucleótidos con secuencia optimizada (p. ej., un ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, o un polipéptido OX40L. Los ARNm resultantes pueden examinarse a continuación para determinar su capacidad para producir proteínas y/o producir un resultado terapéutico.
Síntesis enzimática-Transcripción In Vitro
Un polinucleótido divulgado en la presente memoria se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de ARNasa y una polimerasa. Los NTP pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, los descritos en esta memoria, incluyendo los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero no limitadas a, polimerasas capaces de incorporar ácidos nucleicos modificados. Véase la Publ. de EE. UU. No. US2013-0259923.
El sistema IVT típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de ARNasa y una polimerasa. Los NTP pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, los descritos en la presente memoria, incluyendo los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero no limitadas a, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos divulgados en la presente memoria.
Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en la síntesis de los polinucleótidos de la presente divulgación.
Las ARN polimerasas se pueden modificar por inserción o deleción de aminoácidos de la secuencia de la ARN polimerasa. Como ejemplo no limitante, la ARN polimerasa se modifica para mostrar una mayor capacidad para incorporar un nucleótido trifosfato modificado en 2' en comparación con una ARN polimerasa no modificada. Véase la Publicación Internacional WO2008078180 y la Patente de EE. UU. 8.101.385.
Las variantes pueden obtenerse desarrollando una ARN polimerasa, optimizando la secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de la ARN polimerasa y/o usando otros métodos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 se desarrollan utilizando el sistema de evolución dirigida continua establecido por Esvelt et al. ((2011) Nature 472:499-503) donde los clones de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación tal como, pero no limitadas a, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las Pub. de EE. UU. No. 20100120024 y 20070117112. Las variantes de la ARN polimerasa también pueden incluir, pero no se limitan a, variantes de sustitución, sustitución conservativa de aminoácidos, variantes de inserción, variantes de deleción y/o derivados covalentes.
En un aspecto, el polinucleótido puede diseñarse para ser reconocido por las ARN polimerasas de tipo salvaje o variantes. Al hacerlo, el polinucleótido puede modificarse para que contenga sitios o regiones de cambios de secuencia del polinucleótido quimérico de tipo salvaje o parental.
Las reacciones de síntesis de polinucleótidos o ácidos nucleicos pueden llevarse a cabo mediante métodos enzimáticos que utilizan polimerasas. Las polimerasas catalizan la creación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en una cadena de polinucleótido o ácido nucleico. Las ADN polimerasas conocidas actualmente se pueden dividir en diferentes familias basándose en la comparación de la secuencia de aminoácidos y el análisis de la estructura cristalina. La ADN polimerasa I (pol I) o la familia de polimerasas A, incluidos los fragmentos Klenow de E. coli, la ADN polimerasa I de Bacillus, las ADN polimerasas de Thermus aquaticus (Taq) y las ADN y ARN polimerasas T7, se encuentran entre las mejor estudiadas de estas familias. Otra gran familia es la ADN polimerasa a (pol a) o la familia de polimerasas B, que incluye todas las ADN polimerasas de replicación eucariotas y las polimerasas de los fagos T4 y RB69. Aunque emplean un mecanismo catalítico similar, estas familias de polimerasas difieren en la especificidad de sustrato, la eficacia de incorporación de análogos de sustrato, el grado y la velocidad de extensión del cebador, el modo de síntesis de ADN, la actividad exonucleasa y la sensibilidad frente a los inhibidores.
Las ADN polimerasas también se seleccionan en función de las condiciones de reacción óptimas que requieren, como la temperatura de reacción, el pH y las concentraciones de molde y cebador. A veces se emplea una combinación de más de una ADN polimerasa para lograr el tamaño de fragmento de ADN y la eficacia de síntesis deseados. Por ejemplo, Cheng et al. aumentan el pH, añaden glicerol y dimetilsulfóxido, disminuyen los tiempos de desnaturalización, aumentan los tiempos de extensión y utilizan una ADN polimerasa termoestable secundaria que posee una actividad exonucleasa de 3' a 5' para amplificar eficazmente las dianas largas de los insertos clonados y el ADN genómico humano. Cheng et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699. Las ARN polimerasas de los bacteriófagos T3, T7 y SP6 se han utilizado ampliamente para preparar ARN para estudios bioquímicos y biofísicos. Las ARN polimerasas, las enzimas de formación de caperuza y las poli-A polimerasas se describen en la Publicación internacional No. WO2014028429 (véase también US20150211039.
En un aspecto, la ARN polimerasa que puede usarse en la síntesis de los polinucleótidos descritos en la presente memoria es una ARN polimerasa Syn5. Véase Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552. La ARN polimerasa Syn5 se caracterizó recientemente a partir del cianófago marino Syn5 por Zhu et al. donde también identificaron la secuencia promotora. Véase Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552. Zhu et al. encontraron que la ARN polimerasa Syn5 catalizaba la síntesis de ARN en un rango más amplio de temperaturas y salinidad en comparación con la ARN polimerasa T7. Además, se encontró que el requisito del nucleótido iniciador en el promotor era menos estricto para la ARN polimerasa Syn5 en comparación con la ARN polimerasa T7, lo que hace que la ARN polimerasa Syn5 sea prometedora para la síntesis de ARN.
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Como ejemplo no limitante, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis del polinucleótido que requiere un extremo 3' preciso.
En un aspecto, se puede usar un promotor Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, el promotor Syn5 puede ser 5'-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3' como se describe por Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de polinucleótidos que comprenden al menos una modificación química descrita en la presente memoria y/o conocida en la técnica. (véase, p. ej., la incorporación de pseudo-UTP y 5Me-CTP descritas en Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
En un aspecto, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse usando una ARN polimerasa Syn5 que se ha purificado usando el procedimiento de purificación mejorado y modificado descrito por Zhu et al. (2013) Nucleic Acids Research 288:3545-3552.
Varias herramientas en ingeniería genética se basan en la amplificación enzimática de un gen diana que actúa como molde. Para el estudio de secuencias de genes individuales o regiones específicas de interés y otras necesidades de investigación, es necesario generar múltiples copias de un gen diana a partir de una pequeña muestra de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Dichos métodos se pueden aplicar en la fabricación de los polinucleótidos de la divulgación.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene amplias aplicaciones en la amplificación rápida de un gen diana, así como en el mapeo (cartografía) y secuenciación del genoma. Los componentes clave para la síntesis de ADN comprenden moléculas de ADN diana como molde, cebadores complementarios a los extremos de las cadenas de ADN diana, desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP) como bloques de construcción y una ADN polimerasa. A medida que la PCR avanza a través de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión, las moléculas de ADN recién producidas pueden actuar como molde para el siguiente círculo de replicación, logrando una amplificación exponencial del ADN diana. La PCR requiere un ciclo de calentamiento y enfriamiento para la desnaturalización e hibridación. Las variaciones de la PCR básica incluyen PCR asimétrica (Innis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436-9440), PCR inversa (Ochman et al. (1988) Genetics 120:621-623), Pc R con transcripción inversa (RT-PCR) (Freeman et al. (1999) BioTechniques 26:112-22, 124­ 5). En la RT-PCR, un ARN monocatenario es la diana deseada y se convierte primero en un ADN bicatenario mediante transcriptasa inversa.
Se han desarrollado una variedad de técnicas isotérmicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro como alternativas o complementos de la PCR. Por ejemplo, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) se basa en la capacidad de una enzima de restricción para formar una mella. Walker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396
Se inserta una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en una secuencia de cebador hibridada. Los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa y dNTP para formar un dúplex. La enzima de restricción escinde solo una cadena del dúplex. Cada cadena monocatenaria está a continuación disponible como molde para la síntesis posterior. La SDA no requiere el complicado ciclo de control de temperatura de la PCR.
La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), también llamada amplificación mediada por transcripción (TMA), es también un método de amplificación isotérmica que utiliza una combinación de ADN polimerasa, transcriptasa inversa, ARNasa H y ARN polimerasa T7. Compton (1991) Nature 350:91-92. Se utiliza un ARN diana como molde y una transcriptasa inversa sintetiza su cadena de ADN complementaria. La ARNasa H hidroliza el molde de ARN, dejando espacio para que una ADN polimerasa sintetice una cadena de ADN complementaria a la primera cadena de ADN que es complementaria a la diana de ARN, formando un dúplex de a Dn . La ARN polimerasa de T7 genera continuamente cadenas de ARN complementarias de este dúplex de ADN. Estas cadenas de ARN actúan como moldes para nuevos ciclos de síntesis de ADN, lo que da lugar a la amplificación del gen diana.
La amplificación de círculo rodante (RCA) amplifica un polinucleótido circular monocatenario e implica numerosas rondas de síntesis enzimática isotérmica donde la ADN polimerasa 029 extiende un cebador al progresar continuamente alrededor del círculo de polinucleótidos para replicar su secuencia una y otra vez. Por lo tanto, se consigue una copia lineal del molde circular. A continuación, se puede hibridar un cebador con esta copia lineal y se puede sintetizar su cadena complementaria. Véase Lizardi et al. (1998) Nature Genetics 19:225-232. Un ADN circular monocatenario también puede servir como molde para la síntesis de ARN en presencia de una ARN polimerasa. Daubendiek et al. (1995) JACS 117:7818-7819. Polidoros et al. describen una amplificación rápida inversa de extremos de ADNc (RACE) RCA. Un ARN mensajero (ARNm) se transcribe de forma inversa en ADNc, seguido de un tratamiento con ARNasa H para separar el ADNc. A continuación, la CircLigasa circulariza el ADNc en un ADN circular. La amplificación del ADN circular resultante se logra con RCA. Polidoros et al. (2006) BioTechniques 41:35-42.
Cualquiera de los métodos anteriores se puede utilizar en la fabricación de una o más regiones de los polinucleótidos de la presente divulgación.
También se usa ampliamente el ensamblaje de polinucleótidos o ácidos nucleicos mediante una ligasa. Las ADN o ARN ligasas promueven la ligación intermolecular de los extremos 5' y 3' de las cadenas de polinucleótidos mediante la formación de un enlace fosfodiéster. La reacción en cadena de la ligasa (LCR) es una técnica de diagnóstico prometedora basada en el principio de que dos sondas de polinucleótidos adyacentes se hibridan con una cadena de un gen diana y se acoplan entre sí mediante una ligasa. Si un gen diana no está presente, o si hay un emparejamiento erróneo en el gen diana, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), las sondas no pueden ligarse. Wiedmann et al. (1994) PCR Methods and Application 3(4):s51-s64. La LCR se puede combinar con diversas técnicas de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección o para aumentar la cantidad de productos si se usa en la síntesis de polinucleótidos y ácidos nucleicos.
Actualmente, se encuentran disponibles en el mercado varios kits de preparación de bibliotecas para ácidos nucleicos. Incluyen enzimas y tampones para convertir una pequeña cantidad de muestras de ácido nucleico en una biblioteca indexada para aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los fragmentos de ADN pueden colocarse en un kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBn Ex T® ULTRATM de NEWEn GlAND BIOLABS® para preparación final, ligación, selección de tamaño, limpieza, amplificación por PCR y limpieza final.
Se está realizando un desarrollo continuo para mejorar las técnicas de amplificación. Por ejemplo, la Pat. de EE. UU. 8,367,328 de Asada et al., enseña la utilización de un potenciador de la reacción para aumentar la eficiencia de las reacciones de síntesis de ADN por las ADN polimerasas. El potenciador de la reacción comprende una sustancia ácida o complejos catiónicos de una sustancia ácida. La Pat. de EE. UU. 7,384,739 de Kitabayashi et al., enseña una sustancia suministradora de iones carboxilato que promueve la síntesis enzimática de ADN, en donde la sustancia suministradora de iones carboxilato se selecciona de ácido oxálico, ácido malónico, ésteres de ácido oxálico, ésteres de ácido malónico, sales de ácido malónico y ésteres de ácido maleico. La Pat. de EE. UU. 7,378,262 de Sobek et al., divulga una composición enzimática para aumentar la fidelidad de las amplificaciones de ADN. La composición comprende una enzima con actividad 3' exonucleasa, pero sin actividad polimerasa y otra enzima que es una polimerasa. Ambas enzimas son termoestables y se modifican reversiblemente para permanecer inactivas a temperaturas más bajas.
La Pat. de EE. UU. No. 7,550,264 de Getts et al. enseña que se realizan múltiples rondas de síntesis de moléculas de ARN con sentido uniendo colas de oligodesoxinucleótidos en el extremo 3' de moléculas de ADNc e iniciando la transcripción de ARN usando ARN polimerasa. La Publicación de Pat. de EE. UU. No.
2013/0183718 de Rohayem enseña la síntesis de ARN mediante ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRp) que muestran una actividad ARN polimerasa en moldes de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos con nucleótidos no estándar se pueden sintetizar con polimerización enzimática poniendo en contacto un molde que comprende nucleótidos no estándar con una mezcla de nucleótidos que son complementarios a los nucleótidos del molde como se describe en la Pat. de EE. UU. No. 6,617,106 de Benner.
Síntesis química
Pueden aplicarse métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L. Por ejemplo, se puede sintetizar un solo oligómero de ADN o ARN que contiene una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica el polipéptido aislado particular. En otros aspectos, se pueden sintetizar y a continuación ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado. En algunos aspectos, los oligonucleótidos individuales típicamente contienen protuberancias en 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Un polinucleótido divulgado en la presente memoria (p. ej., ARNm) puede sintetizarse químicamente utilizando métodos de síntesis química y posibles sustituciones de nucleobases conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales No. WO2014093924 (véase también US20150307542), WO2013052523 (véase también US20130115272); WO2013039857, WO2012135805 (véase también US20120251618), WO2013151671 (véase también US20150044277); Publ. de EE. UU. No. US20130115272; o Pat. de EE. UU. No. US8999380, US8710200.
Purificación
La purificación de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) que codifican un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L descrito en la presente memoria puede incluir, pero no se limita a, limpieza de polinucleótidos, garantía de calidad y control de calidad. La limpieza se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a, perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas poli-T, sondas de captura oligo-T LNA™ (EXIQON® Inc, Vedbaek, Dinamarca) o métodos de purificación basados en HPLC tales como, pero no limitados a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC). El término "purificado" cuando se usa en relación con un polinucleótido tal como un "polinucleótido purificado" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal y como se usa en la presente memoria, un "contaminante" es cualquier sustancia que hace que otra sea inadecuada, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado (p. ej., ADN y a Rn ) está presente en una forma o entorno diferente de aquel en el que se encuentra en la naturaleza, o en una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un tratamiento o método de purificación.
En algunos aspectos, la purificación de un polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L de la divulgación elimina las impurezas que pueden reducir o eliminar una respuesta inmune no deseada, p. ej., reduciendo la actividad de las citoquinas.
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., ARNm) que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L de la divulgación se purifica antes de la administración usando cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-h PlC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC) o (LCMS)). En algunos aspectos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC) o (LCMS)), que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L divulgado en la presente memoria aumenta la expresión del polipéptido IL-23, el polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L en comparación con los polinucleótidos que codifican el polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L purificado mediante un método de purificación diferente.
En algunos aspectos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC) o (LCMS)) codifica un polipéptido IL-23 de mamífero, un polipéptido IL-36-gamma de mamífero, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L de mamífero. En algunos aspectos, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido purificado codifica un polipéptido IL-23 humano, un polipéptido IL-36-gamma humano, un polipéptido IL-18 y/o un polipéptido OX40L humano.
En algunos aspectos, el polinucleótido purificado tiene una pureza de al menos aproximadamente el 80 %, una pureza de al menos aproximadamente el 85 %, una pureza de al menos aproximadamente el 90 %, una pureza de al menos aproximadamente el 95 %, una pureza de al menos aproximadamente el 96 %, una pureza de al menos aproximadamente el 97 %, una pureza de al menos aproximadamente el 98 %, una pureza de al menos aproximadamente el 99 %, o una pureza de aproximadamente el 100 %.
Se puede realizar una garantía de calidad y/o verificación del control de calidad utilizando métodos tales como, pero no limitados a, electroforesis en gel, absorbancia UV o HPLC analítica.
En otro aspecto, los polinucleótidos pueden secuenciarse mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, PCR con transcriptasa inversa.
XI. Modificaciones Químicas
Tal y como se usa en la presente memoria en polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o combinaciones de los mismos según la presente divulgación, los términos "modificación química" o, según corresponda, "modificado químicamente" se refieren a la modificación con respecto a los ribo o desoxirribonucleósidos de adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) en una o más de su posición, patrón, porcentaje o población. En general, en la presente memoria, no se pretende que estos términos hagan referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de caperuza de ARNm 5' terminales de origen natural.
En un polipéptido, el término “modificación” se refiere a una modificación en comparación con el conjunto canónico de 20 aminoácidos.
Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. En algunos aspectos, las regiones pueden contener una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos (nucleobase). En algunos aspectos, un polinucleótido modificado, introducido en una célula, puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido no modificado. En otros aspectos, la modificación está en la nucleobase y/o la estructura del azúcar. En otros aspectos más, la modificación está en la estructura principal.
Modificaciones Químicas
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, o un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en donde el ARNm incluye al menos una modificación química.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, y un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en donde el ARNm incluye al menos una modificación química.
En algunos aspectos, la modificación química se selecciona de pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina.
Un "nucleósido", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (p. ej., una pentosa o ribosa) o un derivado del mismo en combinación con una base orgánica (p. ej., una purina o pirimidina) o un derivado de la misma (a la que también se denomina en la presente memoria "nucleobase"). Un "nucleótido" tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un nucleósido, incluido un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier método útil, tal como, por ejemplo, de forma química, enzimática o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos no naturales o modificados. Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos unidos. Dichas regiones pueden tener enlaces de estructura principal variables. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándar, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.
El emparejamiento de bases de nucleótidos modificados engloba no solo los pares de bases estándar de adenosina-timina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases no estándar o modificadas, en donde la disposición de los donantes de enlace de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar o entre dos estructuras de base no estándar complementarias. Un ejemplo de dicho emparejamiento de bases no estándar es el emparejamiento de bases entre el nucleótido modificado inosina y adenina, citosina o uracilo. Cualquier combinación de base/azúcar o conector puede incorporarse en los polinucleótidos de la presente divulgación.
El experto en la técnica apreciará que, salvo que se indique otra cosa, las secuencias de polinucleótidos mostradas en la presente solicitud indicarán "T" en una secuencia de ADN representativa, pero cuando la secuencia representa ARN, se debería sustituir las "T" con "U".
Las modificaciones de polinucleótidos (p. ej., polinucleótidos de ARN, tal como polinucleótidos de ARNm) que son útiles en los polinucleótidos, composiciones, métodos y procesos sintéticos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los siguientes nucleótidos, nucleósidos, y nucleobases: 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina; 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); Isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-deazaadenosina; N1-metil-adenosina; N6, N6 (dimetil) adenina; N6-cis-hidroxi-isopenteniladenosina; a-tio-adenosina; 2 (amino)adenina; 2 (aminopropil)adenina; 2 (metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2'-Amino-2'-desoxi-ATP; 2'-Azido-2'-desoxi-ATP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil)adenina; 6 (metil)adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7 (deaza)adenina; 8 (alquenil)adenina; 8 (alquinil)adenina; 8 (amino)adenina; 8 (tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; deaza adenina; N6 (metil) adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-deaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-Deazaadenosina TP; 2'Fluoro-N6-Bz-deoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bzdeoxiadenosina TP; 2'-a-Etiniladenosina TP; 2-aminoadenina; 2-Aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-Trifluorometiladenosina TP; 2-Azidoadenosina TP; 2'-b-Etiniladenosina TP; 2-Bromoadenosina TP; 2'-b-Trifluorometiladenosina TP; 2-Cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-amercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxiadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-bfluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-btiometoxiadenosina TP; 2-Fluoroadenosina TP; 2-Yodoadenosina TP; 2-Mercaptoadenosina TP; 2-metoxiadenina; 2-metiltio-adenina; 2-Trifluorometiladenosina TP; 3-Deaza-3-bromoadenosina TP; 3-Deaza-3-cloroadenosina TP; 3-Deaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Deaza-3-yodoadenosina TP; 3-Deazaadenosina TP; 4'-Azidoadenosina TP; 4'-Adenosina carbocíclica TP; 4'-Etiniladenosina TP; 5'-Homo-adenosina TP; 8-Aza-ATP; 8-bromo-adenosina TP; 8-Trifluorometiladenosina TP; 9-Deazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-deaza-2,6 diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; Lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-Dimetil-2'-OMe-Citidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; Pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-Amino-2'-desoxi-CTP; 2'-Azido-2'-desoxi-CTP; 2'-Desoxi-2'-a-aminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidocitidina TP; 3 (deaza) 5 (aza)citosina; 3 (metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(deaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5 (halo)citosina; 5 (metil)citosina; 5 (propinil)citosina; 5 (trifluorometil)citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromocitidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; deaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metiM-deaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4-tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; Zebularina; (E)-5-(2-Bromo-vinil)citidina TP; hidrocloruro de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Bz-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-Trifluorometilcitidina TP; 2'-b-Etinilcitidina TP; 2'-b-Trifluorometilcitidina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-atiometoxicitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-bbromocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxicitidina TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-Etinilcitidina TP; 4'-Azidocitidina TP; 4'-Citidina carbocíclica TP; 4'-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-Cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-Amino-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-Aminoalil-CTP; 5-Cianocitidina TP; 5-Etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; 5'-Homo-citidina TP; 5-Metoxicitidina TP; 5-Trifluorometil-Citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-Benzoil-citidina TP; Pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wiosina; 1,2'-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-deazaguanosina; 7-ciano-7-deazaguanosina; Arqueosina; Metilwiosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; 6-tioguanosina; 7-deaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; Nl-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2 (propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2'-Amino-2'-desoxi-GTP; 2'-Azido-2'-desoxi-GTP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidoguanosina TP; 6 (metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7 (alquil)guanina; 7 (deaza)guanina; 7 (metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(deaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8 (alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8 (tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8-(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; deaza guanina; N (metil)guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-deaza-guanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-deaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxo-guanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina TP; 2'-a-Etinilguanosina TP; 2'-a-Trifluorometilguanosina TP; 2'-b-Etinilguanosina TP; 2'-b-Trifluorometilguanosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxiguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-bmercaptoguanosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiometoxiguanosina TP; 4'-Azidoguanosina TP; 4'-Guanosina carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-Deazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; Inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; Epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; Manosilqueuosina; Queuosina; aliamino-timidina; aza timidina; deaza timidina; desoxi-timidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-carboximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taurinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; Dihidrouridina; Pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpseduouridina; 1-etil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-Metil-pseudo-Uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina metil ester; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidro-uridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina metil ester; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-Carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metiluridina,), 5-metoxiuridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-Metildihidrouridina; 5-Ácido oxiacético-Uridina TP; 5-Éster metílico del ácido oxiacético-Uridina TP; N1-metilpseudo-uracilo; Nl-etil-pseudo-uracilo; uridina 5-ácido oxiacético; uridina 5-éster metílico del ácido oxiacético; 3-(3-Amino-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)- 2-tiouridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2'-O-metiluridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 substituted 2(tio)pseudouracilo; 2,4-(ditio)pseudouracilo sustituido en 1; 4 (tio)pseudouracilo sustituido en 1; pseudouracilo sustituido en 1; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina TP; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-Metil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracilo; 2' deoxi uridina; 2'-fluorouridina; 2-(tio)uracilo; 2,4-(ditio)pseudouracilo; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluoro-guanosina; 2'-Amino-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-deoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2' desoxi uridina; 2' fluorouridina; 2'-Desoxi-2'-a-aminouridina TP; 2'-Desoxi-2'-aazidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3 (3 amino-3 carboxipropil)uracilo; 4 (tio)pseudouracilo; 4-(tio )pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5 (aminoalquil)uracilo; 5 (dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinioalquil)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)uracilo; 5-(metil) 2 (tio)uracilo; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5-(metil) 4 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5-(alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinioalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5-(metoxi)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4 (ditio )uracilo; 5-(metil) 4 (tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio )uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoaliluridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6 (azo)uracilo; 6-(azo)uracilo; 6-aza-uridina; alilaminouracilo; aza uracilo; deaza uracilo; N3 (metil)uracilo; Pseudo-UTP-1-2-ácido etanoico; Pseudouracilo; 4-Tiopseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-deaza-pseudouridina; 1-propinil-uridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1 -taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tio-pseudouridina; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina; 2-tio-1-metil-pseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tio-dihidropseudouridina; 2-tiodihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1-metilpseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-aza-uridina; Dihidropseudouridina; (±)1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina Tp ; (E)-5-(2-Bromovinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromovinil)uridina TP; 1-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-Trimetil-fenil)pseudo-UTp; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-Hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-(3-Aminopropil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseudouridina TP; 1-(4-Amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metanesulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudo-UTP; 1-(4-Metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Metilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metil-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Nitrobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Nitrobencil)pseudo-UTP; 1(4-Nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-propionil } pseudouridina TP; 1-Acetilpseudouridina TP; 1-Alquil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-alil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-etinil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-Alilpseudouridina TP; 1-Aminometil-pseudo-UTP; 1-Benzoilpseudouridina TP; 1-Benciloximetilpseudouridina TP; 1-Bencilpseudo-UTP; 1-Biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-Biotinilpseudouridina TP; 1-Butil-pseudo-UTP; 1-Cianometilpseudouridina TP; 1-Ciclobutilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclobutil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptilmetilpseudo-UTP; 1-Cicloheptil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1 -Ciclooctil-pseudo-UTP; 1 -Ciclopentilmetil-pseudo-UTP; 1 -Ciclopentil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-UTP; 1-Hexil-pseudo-UTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-Hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alpha-tio-pseudo-UTP; 1-Metanesulfonilmetilpseudouridina TP; 1-Metoximetilpseudouridina TP; 1-Metil-6-(2,2,2-Trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(fenilo sustituido)pseudo-UTP; 1-Metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-azido-pseudo-UTP; 1-Metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-cloropseudo-UTP; 1-Metil-6-ciano-pseudo-UTP; 1-Metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etilcarboxilato-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-hidroxiamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-hidroxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-yodopseudo-UTP; 1 -Metil-6-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-trifluorometoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentilpseudo-UTP; 1-Fenil-pseudo-UTP; 1-Pivaloilpseudouridina TP; 1-Propargilpseudouridina TP; 1-Propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-tert-Butil-pseudo-UTP; 1-Tiometoximetilpseudouridina TP; 1-Tiomorfolinometilpseudouridina TP; 1-Trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-Trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-deoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-deoxi-UTP; 2'-OMe-5Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'-a-Trifluorometiluridina TP; 2'-b-Etiniluridina TP; 2'-b-Trifluorometiluridina TP; 2'-Deoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-Deoxi-2'-atiometoxiuridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-bromouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-fluorouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-yodouridina TP; 2'-Deoxi-2'-bmercaptouridina TP; 2'-Deoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-Alquil-pseudo-UTP; 4'-Azidouridina TP; 4'-Uridina carbocíclica TP; 4'-Etiniluridina TP; 5-(l-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-Furanil)uridina TP; 5-Cianouridina TP; 5-Dimetilaminouridina TP; 5'-Homouridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-deoxiuridina TP; 5-Feniletiniluridina TP; 5-Trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-Trifluorometil-Uridina TP; 5-Vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-Morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-Tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(Fenilo Sustituido)-pseudo-UTP; 6-Amino-pseudo-UTP; 6-Azidopseudo-UTP; 6-Bromo-pseudo-UTP; 6-Butil-pseudo-UTP; 6-Cloro-pseudo-UTP; 6-Ciano-pseudo-UTP; 6-Dimetilamino-pseudo-UTP; 6-Etoxi-pseudo-UTP; 6-Etilcarboxilato-pseudo-UTP; 6-Etil-pseudo-UTP; 6-Fluoropseudo-UTP; 6-Formil-pseudo-UTP; 6-Hidroxiamino-pseudo-UTP; 6-Hidroxi-pseudo-UTP; 6-Yodo-pseudo-UTP; 6-iso-Propil-pseudo-UTP; 6-Metoxi-pseudo-UTP; 6-Metilamino-pseudo-UTP; 6-Metil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Propil-pseudo-UTP; 6-terc-Butil-pseudo-UTP; 6-Trifluorometoxipseudo-UTP; 6-Trifluorometil-pseudo-UTP; Alpha-tio-pseudo-UTP; Pseudouridina 1-(4-ácido metilbencenosulfónico) TP; Pseudouridina 1-(4-ácido metilbenzoico) TP; Pseudouridina TP ácido 1-[3-(2-etoxi)]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi )-etoxi]-etoxi )-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-[2-(2-[2-[2(2-etoxi )-etoxi}-etoxi]-etoxi )-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-[2-etoxi ]-etoxi)-etoxi}]propiónico; Pseudouridina TP ácido 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}]propiónico; Pseudouridina Tp ácido 1-metilfosfónico; Pseudouridina TP éster dietílico del ácido 1-metilfosfónico; Pseudo-UTP-N1-3-ácido propiónico; Pseudo-UTP-N1-4-ácido butanoico; Pseudo-UTP-N1-5-ácido pentanoico; Pseudo-UTP-N1-6-ácido hexanoico; Pseudo-UTP-N1-7-ácido heptanoico; Pseudo-UTP-N1-metil-p-ácido benzoico; Pseudo-UTP-NI-pácido benzoico; Wibutosina; Hidroxiwibutosina; Isowiosina; Peroxiwibutosina; hidroxiwibutosina submodificada; 4-demetilwiosina; 2,6-(diamino)purina;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo: 1,3-( diaza)-2-(oxo)- fentiazin-1-ilo;1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno; 2 (amino)purina; 2,4,5-(trimetil)fenil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-citidina;2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-adenina; 2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-uridina; 2'-amino-2'-desoxirribosa; 2-amino-6-Cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'fluoro-2'-desoxirribosa; bases modificadas con 2'-fluoro; 2'-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxo-piridopirimidina-3-ilo; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)isocarbostirililo; 3-(metil)isocarbostirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; pirimidinas sustituidas en 5; 5-(metil)isocarbostirililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidin; 6- (azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio )-3-(aza-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio )-3-(aza)-fenoxazinl-ilo; 7-( guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza-fentiazin-1-ilo; 7-( guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(propinil)isocarbostirililo; 7-(propinil)isocarbostirililo, propinil-7-(aza)indolilo; 7- deaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo sustituido en 7; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo sustituido en 7; 9-(metil)-imidizopiridinilo; Aminoindolilo; Antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; bis-orto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Difluorotolilo; Hipoxantina; Imidizopiridinilo; Inosinilo; Isocarbostirililo; Isoguanisina; purinas sustituidas en N2; N6-metil-2-amino-purina; purinas sustituidas en N6; derivado N-alquilado; Naptalenilo; Nitrobencimidazolilo; Nitroimidazolilo; Nitroindazolilo; Nitropirazolilo; Nubularina; purinas sustituidas en O6; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; orto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo sustituido en para; Pentacenilo; Fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; Pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3-ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pirrolopirimidinilo; Pirrolopirizinilo; Estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; Tetracenilo; Tubercidina; Xantina; Xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-deaza-2-amino-purina; ribonucleósido piridin-4-ona; 2-Amino-ribósido-TP; Formicina A TP; Formicina B TP; Pirrolosina TP; 2'-OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-ara-citidina TP; 2'-OH-ara-uridina TP; 2'-OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6-(19-Aminopentaoxanonadecil)adenosina TP.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, incluyen una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunos aspectos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se seleccionan del grupo que consiste en pseudouridina (y ), 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-metil-pseudouridina (m1Y), 1-etil-pseudouridina (e1Y), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), a-tio-guanosina, a-tio-adenosina, 5-ciano uridina, 4'-tio uridina 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metilguanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 2,8-dimetiladenosina, 2-geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-selenouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)-5,6-dihidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 3-metilpseudouridina, éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)-2'-O-metiluridina, 5-aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5-aminometiluridina, 5-carbamoilhidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5-cianometiluridina, 5-hidroxicitidina, 5-metilaminometil-2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-demetilwiosina, 7-aminocarboxipropilwiosina, éster metílico de 7-aminocarboxipropilwiosina, 8-metiladenosina, N4,N4-dimetilcitidina, N6-formiladenosina, N6-hidroximetiladenosina, agmatidina, N6-treonilcarbamoiladenosina cíclica, glutamil-queuosina, hidroxiwibutosina sin modificar metilada, N4,N4,2'-O-trimetilcitidina, 5-metilaminometil-2-tiouridina geranilada, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina geranilada, Qbase, preQObase, preQIbase y dos o más combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, 1-metil-pseudouridina, 1-etilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
Modificaciones de Bases
En ciertos aspectos, la modificación química se encuentra en las nucleobases de los polinucleótidos (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm). En algunos aspectos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) se seleccionan del grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (m1Y), 1-etil-pseudouridina (e1Y), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metilcitidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m1Y). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 1-etilpseudouridina (e1Y). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m1Y) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 1-etilpseudouridina (e1Y) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina (s2U). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende metoxi-uridina (mo5U). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina. En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende N6-metil-adenosina (m6A). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) se modifica en forma uniforme (p. ej., completamente modificado, modificado a lo largo de toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido con 5-metilcitidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los residuos citosina en la secuencia de ARNm con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como cualquiera de los establecidos anteriormente.
En algunos aspectos, los nucleósidos modificados químicamente en el marco de lectura abierto se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina, y cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una uridina modificada incluyen 5-ciano uridina o 4'-tio uridina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metiladenina (m2A), N6-metil-adenina (m6A) y 2,6-diaminopurina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metilinosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deazaguanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxoguanosina.
En algunos aspectos, los nucleótidos con nucleobase modificada en el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) son 5-metoxiuridina.
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) nucleobases modificadas.
En algunos aspectos, al menos el 95 % de un tipo de nucleobases (p. ej., uracilo) en un polinucleótido de la divulgación (p. ej., un polinucleótido de ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L) son nucleobases modificadas. En algunos aspectos, al menos el 95 % del uracilo en un polinucleótido de la presente divulgación (p. ej., un polinucleótido de ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, y/o un polipéptido OX40L) es 5-metoxiuracilo.
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 5-metoxiuridina (5mo5U) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) se modifica en forma uniforme (p. ej., completamente modificado, modificado a lo largo de toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de forma uniforme un polinucleótido con 5-metoxiuridina, lo que significa que se reemplazan sustancialmente todos los residuos uridina en la secuencia de ARNm con 5-metoxiuridina. De manera similar, es posible modificar de forma uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como cualquiera de los establecidos anteriormente.
En algunos aspectos, la nucleobase modificada es una citosina modificada.
En algunos aspectos, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen un uracilo modificado incluyen 5-metoxiuracilo.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una adenina modificada.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una guanina modificada.
En algunos aspectos, las nucleobases, el azúcar, el esqueleto o cualquier combinación de los mismos en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos, se modifican químicamente en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100%.
En algunos aspectos, los nucleósidos de uridina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos se modifican químicamente en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100%.
En algunos aspectos, los nucleósidos de adenina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos se modifican químicamente en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100%.
En algunos aspectos, las nucleobases de citidina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos, se modifican químicamente en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100%.
En algunos aspectos, las nucleobases de guanosina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido IL-23, un polipéptido IL-36-gamma, un polipéptido IL-18, un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos, se modifican químicamente en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, o un 100%.
En algunos aspectos, los polinucleótidos pueden incluir cualquier conector útil entre los nucleósidos. Dichos conectores, incluidas las modificaciones del esqueleto, que son útiles en la composición de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: 3'-alquilenfosfonatos, 3'-aminofosforamidato, esqueletos que contienen alqueno, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres, boranofosfatos, -CH2-O-N(CHa)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CHs)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, fosfonatos quirales, fósforotioatos quirales, esqueletos de formacetilo y tioformacetilo, metileno (metilimino), esqueletos de metileno formacetilo y tioformacetilo, esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino, enlaces morfolino, -N(CH3)-CH2-CH2-, oligonucleósidos con enlace heteroátomo internucleósido, fosfinatos, fósforamidatos, fósforoditioatos, enlaces internucleósidos fósforotioato, fósforotioatos, fosfotriésteres, PNA, esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfamato, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona, esqueletos de sulfonato y sulfonamida, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y tionofosforamidatos.
En algunos aspectos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L o cualquier combinación de los mismos, se seleccionan del grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina ( it i 1y ), 5-metoxiuridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprenden pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina ( it i 1y ). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprenden 1-metil-pseudouridina ( it i 1y ) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende 2-tiouridina (s2U). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C).
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende metoxi-uridina (mo5U). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende aspectos de 2'-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende N6-metiladenosina (m6A). En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprende N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L polipéptido, o cualquier combinación de los mismos, se modifican de forma uniforme (p. ej., se modifican completamente, se modifican a lo largo de toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los residuos citosina en la secuencia de ARNm con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como cualquiera de los establecidos anteriormente.
En algunos aspectos, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una uridina modificada incluyen 5-ciano uridina o 4'-tio uridina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-deaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metiladenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A) y 2,6-diaminopurina.
En algunos aspectos, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metilinosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-deazaguanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, o 7-metil-8-oxoguanosina.
Otras modificaciones que pueden ser útiles en el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación se enumeran en la TABLA 5.
Tabla 5. Tipos de Modificaciones Adicionales
Figure imgf000182_0001
Figure imgf000183_0001
Figure imgf000184_0001
Figure imgf000185_0001
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación puede incluir cualquier conector útil entre los nucleósidos. Dichos conectores, incluyendo las modificaciones de la estructura principal, se proporcionan en la TABLA 6.
Tabla 6. Modificaciones de conectores
Figure imgf000185_0002
Figure imgf000186_0001
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación, o cualquier combinación de los mismos, puede incluir cualquier modificación útil, tal como en el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleósido (p. ej., en un enlace fosfato / en un enlace fosfodiéster / en el esqueleto de fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (p. ej., metilo o etilo) o halo (p. ej., cloro o flúor). En determinados aspectos, están presentes modificaciones (p. ej., una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar e internucleósidos. Las modificaciones según la presente divulgación pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de hexitol (HNA), o híbridos de los mismos. En la presente memoria se describen modificaciones adicionales. Los ácidos nucleicos modificados y su síntesis se divulgan en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052523 (véase también US20130115272).
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación, o cualquier combinación de los mismos, no induce sustancialmente una respuesta inmune innata de una célula en la que se introduce el ARNm. Las características de una respuesta inmune innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citoquinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc. y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.
Cualquiera de las regiones del polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación, o cualquier combinación de los mismos, puede modificarse químicamente como se enseña en la presente memoria o como se enseña en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052523 (véase también US20130115272).
En algunos aspectos, un polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en esta invención, de la divulgación codifica una IL-23, IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y/u OX40L. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en la presente memoria, de la divulgación codifica una IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L humano.
En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en la presente memoria, de la divulgación codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 1. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en la presente memoria, de la divulgación codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la TABLA 1.
En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en la presente memoria, de la divulgación codifica al menos una IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L mutante, un fragmento o una variante del mismo, p. ej., un fragmento funcional de IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L de IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L.
En algunos aspectos, el polinucleótido modificado, p. ej., ARNm que comprende al menos una modificación descrita en la presente memoria, de la divulgación se selecciona de las secuencias de ácido nucleico de IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L enumeradas en la TABLA 1.
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación también pueden incluir bloques de construcción, p. ej., ribonucleósidos modificados y ribonucleótidos modificados, de moléculas polinucleotídicas. Por ejemplo, estos bloques de construcción pueden ser útiles para preparar los polinucleótidos de la divulgación. Dichos bloques de construcción se enseñan en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052523 (véase también US20130115272) y Publicación de Solicitud Internacional No. WO2014093924 (véase también US20150307542).
Modificaciones en el Azúcar
Los nucleósidos y nucleótidos modificados (p. ej., moléculas de bloques de construcción), que se pueden incorporar en un polinucleótido (p. ej., ARN o ARNm, como se describe en la presente memoria) que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de IL-23, un polinucleótido (p. ej., ARN o ARNm, como se describe en la presente memoria) que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 o un polinucleótido (p. ej., ARN o ARNm, como se describe en la presente memoria) que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación, pueden modificarse sobre el azúcar del ácido ribonucleico.
Por ejemplo, el grupo 2' hidroxilo (OH) se puede modificar o reemplazar con varios sustituyentes diferentes. Las sustituciones ilustrativas en la posición 2' incluyen, pero no se limitan a, H, halo, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; cicloalquilo C3-8 opcionalmente sustituido; cicloalcoxi C3-8 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; aril C6-10-alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C1-12 opcionalmente sustituido; un azúcar (p. ej., ribosa, pentosa o cualquiera de los descritos en la presente memoria); un polietilenglicol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (p. ej., de 0 a 4, de 0 al 8 , de 0 a 10, de 0 a 16 , de 1 a 4, de 1 a 8 , de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8 , de 2 a 10 , de 2 a 16, de 2 a 2 0 , de 4 a 8 , de 4 a 10 , de 4 a 16, y de 4 a 2 0 ); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los que el 2'-hidroxilo está conectado por un puente de alquileno C1-6 o heteroalquileno C1-6 al carbono 4' del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ilustrativos incluyen puentes de metileno, propileno, éter o amino; aminoalquilo, como se define en la presente memoria; aminoalcoxi, como se define en la presente memoria; amino como se define en la presente memoria; y aminoácido, como se define en la presente memoria.
Generalmente, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene un oxígeno. Los nucleótidos modificados no limitantes ilustrativos incluyen el reemplazo del oxígeno en la ribosa (p. ej., con S, Se o alquileno, tales como metileno o etileno); adición de un doble enlace (p. ej., para reemplazar la ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino que también tiene una estructura principal de fosforamidato); formas multicíclicas (p. ej., triciclo; y formas "desbloqueadas", tales como ácido nucleico de glicol (GNA) (p. ej., R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treósico (TNA, donde la ribosa se reemplaza con a-L-treofuranosil-(3'^-2')) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces 2-aminoetil-glicina reemplazan la estructura principal de ribosa y fosfodiéster). El grupo de azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, p. ej., arabinosa, como azúcar. Dichas modificaciones de azúcar se enseñan en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052523 (véase también US20130115272) y Publicación de Solicitud Internacional No. WO2014093924 (véase también US20150307542).
Combinaciones de Azúcares, Nucleobases y Enlaces Internucleosídicos Modificados
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la divulgación, o cualquier combinación de los mismos, puede incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase, y/o el enlace internucleósido. Estas combinaciones pueden incluir una cualquiera o más modificaciones descritas en la presente memoria.
Los ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados se proporcionan a continuación en la TABLA 7. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los polinucleótidos de la divulgación. A menos que se indique otra cosa, los nucleótidos modificados pueden sustituirse completamente por los nucleótidos naturales de los polinucleótidos de la divulgación. Como ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede sustituirse con un nucleósido modificado descrito en la presente memoria. En otro ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede estar parcialmente sustituido (p. ej., aproximadamente el 0,1 %, el 1 %, el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99,9 %) con al menos uno de los nucleósidos modificados divulgados en la presente memoria. Cualquier combinación de base/azúcar o conector puede incorporarse en los polinucleótidos de la divulgación y dichas modificaciones se enseñan en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052523 (véase también US20130115272) y Publicación de Solicitud Internacional No. WO2014093924 (véase también US20150307542). Tabla 7. Combinaciones
Figure imgf000188_0001
Figure imgf000189_0001
Los ejemplos adicionales de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados se proporcionan a continuación en la TABLA 8.
Tabla 8. Combinaciones adicionales
Figure imgf000189_0002
Figure imgf000190_0001
Figure imgf000191_0001
Figure imgf000192_0001
Figure imgf000193_0001
Figure imgf000194_0001
Figure imgf000195_0001
XII. Composiciones Farmacéuticas: Formulación, Administración, Suministro y Dosificación
La presente divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las composiciones divulgadas en la presente memoria, p. ej., un primer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una primera proteína que comprende un polipéptido IL-23, un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una segunda proteína que comprende un polipéptido IL-36-gamma, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un tercer polinucleótido que comprende un ARNm que codifica una tercera proteína, en donde la tercera proteína comprende un polipéptido OX40L como se describe en otra parte de la presente memoria.
En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido se formula en composiciones y complejos en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, p. ej., sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden ser estériles y/o estar libres de pirógenos. Se pueden encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2 0 O5.
En algunos aspectos, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. Para los propósitos de la presente divulgación, la expresión "ingrediente activo" se refiere, en general, a los polinucleótidos que se van a suministrar como se describe en la presente memoria.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria están dirigidas principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para la administración a cualquier otro animal, p. ej., a animales no humanos, p. ej., a mamíferos no humanos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos con el fin de hacer las composiciones adecuadas para su administración a diversos animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario con experiencia habitual puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación, si es que la hay, meramente habitual. Los sujetos para los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos.
En algunos aspectos, el polinucleótido de la presente divulgación se formula para administración subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, intraventricular, oral, inhalación de pulverización, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, intratumoral o intramuscular a través de un reservorio implantado, subcutánea, intratumoral o intradérmica. En otros aspectos, el polinucleótido se formula para administración intratumoral, intraperitoneal o intravenosa. En un aspecto particular, el polinucleótido de la presente divulgación se formula para administración intratumoral.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier método conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes auxiliares y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, moldear y/o envasar el producto en una unidad monodosis o multidosis deseada.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la divulgación variarán dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la afección del sujeto tratado y adicionalmente dependiendo de la vía mediante la que se administra la composición. Como ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 %, p. ej., entre el 0,5 % y el 50 %, entre el 1 % y el 30 %, entre el 5 % y el 80 %, o al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.
Formulaciones
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la divulgación puede formularse usando uno o más excipientes.
La función del uno o más excipientes es, p. ej.,: (1) aumentar la estabilidad, (2) aumentar la transfección de células; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (p. ej., a partir de una formulación de depósito del polinucleótido; (4) alterar la biodistribución (p. ej., dirigir el polinucleótido a tejidos o tipos celulares específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente divulgación pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo-coraza, péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótidos (p. ej., para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, miméticos de nanopartículas y combinaciones de los mismos. Por consiguiente, las formulaciones de la divulgación pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que en conjunto aumenta la estabilidad del polinucleótido, aumenta la transfección celular por el polinucleótido, aumenta la expresión de la proteína codificada por polinucleótidos, y/o altera el perfil de liberación de las proteínas codificadas por polinucleótidos. Además, los polinucleótidos de la presente divulgación pueden formularse utilizando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más de otros ingredientes auxiliares.
Una composición farmacéutica según la presente divulgación puede prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Tal y como se usa en la presente memoria, una "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación pueden variar, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la afección del sujeto que se está tratando y adicionalmente dependiendo de la vía mediante la que se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 99 % (p/p) de ingrediente activo. Como ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 %, p. ej., entre el 0,5 % y el 50 %, entre el 1-30 %, entre el 5-80 %, al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.
En algunos aspectos, las formulaciones descritas en la presente memoria contienen al menos un polinucleótido. Como ejemplo no limitante, las formulaciones contienen 1, 2, 3, 4 o 5 polinucleótidos. En otros aspectos, el polinucleótido de la divulgación se formula para la administración intratumoral en un tumor de un paciente que lo necesita.
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, tal y como se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). El uso de un medio excipiente convencional puede contemplarse en el alcance de la presente divulgación, salvo que cualquier medio excipiente convencional no sea compatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de un efecto biológico no deseado o, de otro modo, interaccionando de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el tamaño de partícula de la nanopartícula lipídica se aumenta y/o disminuye. El cambio en el tamaño de partícula puede ayudar a contrarrestar una reacción biológica tal como, pero no limitada a, la inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del ARNm modificado suministrado a mamíferos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes y/o aceites. Dichos excipientes pueden incluirse opcionalmente en las formulaciones farmacéuticas de la divulgación.
En algunos aspectos, los polinucleótidos se administran en o con, se formulan en o se suministran con nanoestructuras que pueden secuestrar moléculas tales como el colesterol. Se describen ejemplos no limitantes de estas nanoestructuras y métodos para preparar estas nanoestructuras en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130195759. Las estructuras ilustrativas de estas nanoestructuras se muestran en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130195759, y pueden incluir un núcleo y una coraza que rodea el núcleo.
Lipidoides
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L puede formularse con lipidoides. La síntesis de lipidoides se ha descrito ampliamente y las formulaciones que contienen estos compuestos son particularmente adecuadas para el suministro de polinucleótidos (véase Mahon et al., Bioconjug Chem. 201021:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001).
Si bien estos lipidoides se han utilizado para administrar eficazmente pequeñas moléculas de ARN interferente bicatenario en roedores y primates no humanos (véase Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), la presente divulgación describe su formulación y uso en el suministro de polinucleótidos.
Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contengan estos lipidoides y, por lo tanto, pueden dar lugar a un suministro efectivo del polinucleótido, a juzgar por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación de lipidoide a través de vías de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos de lipidoides de polinucleótidos pueden administrarse por diversos medios, incluyendo, pero no limitados a, las vías intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular o subcutánea.
La administración in vivo de ácidos nucleicos puede verse afectada por muchos parámetros, incluyendo, pero no limitados a, la composición de la formulación, la naturaleza de la PEGilación de las partículas, el grado de carga, la relación entre polinucleótidos y lípidos y parámetros biofísicos tales como, pero no limitados a, el tamaño de las partículas (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879). Como ejemplo, pequeños cambios en la longitud de la cadena de anclaje de los lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) pueden dar lugar a efectos significativos sobre la eficacia in vivo.
Las formulaciones con los diferentes lipidoides, que incluyen, pero no se limitan a, hidrocloruro de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilenetetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluidos derivados y variantes) y MD1, se pueden ensayar para determinar la actividad in vivo.
El lipidoide al que se hace referencia en la presente memoria como "98N12-5" se describe en Akinc et al., Mol Ther. (2009) 17:872-879.
El lipidoide al que se hace referencia en la presente memoria como "C12-200" se describe en Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 y Liu y Huang (2010), Molecular Therapy. 2010 669-670. Las formulaciones de lipidoides pueden incluir partículas que comprenden 3 o 4 o más componentes además de los polinucleótidos.
Las formulaciones de lipidoides y polinucleótidos que comprenden lipidoides se describen en la Publicación de Solicitud Internacional No. WO2014093924 (véase también US20150307542).
Liposomas, Lipoplejos y Nanopartículas Lipídicas
Los polinucleótidos de la divulgación pueden formularse usando uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En un aspecto, las composiciones farmacéuticas del polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L incluyen liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículo de suministro para la administración de formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños tales como, pero no limitados a, una vesícula multilaminar (MLV) que puede tener cientos de nanómetros de diámetro y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos, una pequeña vesícula unicelular (SUV) que puede ser menor de 50 nm de diámetro y una gran vesícula unilamelar (LUV) que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligandos con el fin de mejorar la unión de los liposomas a tejidos enfermos o para activar eventos tales como, pero no limitados a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH alto o bajo con el fin de mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.
La formación de liposomas puede depender de las características fisicoquímicas tales como, pero no limitadas a, la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en el que las vesículas lipídicas se dispersan, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su potencial toxicidad, cualquier proceso adicional involucrado durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño de optimización, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad entre lotes y la posibilidad de una producción a gran escala de productos liposomales eficientes y seguros.
Como ejemplo no limitante, los liposomas tales como vesículas de membrana sintética se preparan mediante los métodos, aparatos y dispositivos descritos en la Publicación de Patente de EE. UU No. US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 y US20130183372.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen, sin limitación liposomas tales como los formados a partir de liposomas de 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), liposomas de DiLa2 de Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) y MC3 (como se describe en US20100324120), y liposomas que pueden suministrar fármacos de molécula pequeña tales como, pero no limitados a, DOXIL® de Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden incluir, sin limitación, liposomas tales como los formados a partir de la síntesis de partículas lipídicas de plásmido estabilizadas (SPLP) o partículas lipídicas de ácido nucleico estabilizadas (SNALP) que se han descrito previamente y han mostrado ser adecuadas para la administración de oligonucleótidos in vitro e in vivo (véase Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res. 200522:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 20052:1002-1007; Zimmermann et al., Nature.
2006 441:111-114; Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Publicación de Patente de EE. UU. No US20130122104). El método de fabricación original de Wheeler et al. fue un método de diálisis con detergente, que fue mejorado más adelante por Jeffs et al. y se denomina método de formación espontánea de vesículas. Las formulaciones de liposomas están compuestas por 3 a 4 componentes lipídicos además del polinucleótido. Como ejemplo, un liposoma puede contener, pero no se limita a, el 55 % de colesterol, el 20 % de disteroilfosfatidilcolina (DSPC), el 10 % de PEG-S-DSG y el 15 % de 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), según lo descrito por Jeffs et al. Como otro ejemplo, determinadas formulaciones de liposomas contienen, pero no se limitan a, el 48 % de colesterol, el 20 % de DSPC, el 2 % de PEG-c-DMA y el 30 % de lípido ionizable, donde el lípido ionizable puede ser 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetilaminopropano (DSDMA), d Od MA, DLin-DMA, o 1,2-dilinoleniloxi-3-dimetilaminopropano (DLenDMA), según lo descrito por Heyes et al.
En algunos aspectos, las formulaciones de liposomas comprenden de aproximadamente el 25,0 % de colesterol a aproximadamente el 40,0 % de colesterol, de aproximadamente el 30,0 % de colesterol a aproximadamente el 45,0 % de colesterol, de aproximadamente el 35,0 % de colesterol a aproximadamente el 50,0 % de colesterol y/o de aproximadamente el 48,5 % de colesterol a aproximadamente el 60 % de colesterol. En otros aspectos, las formulaciones comprenden un porcentaje de colesterol seleccionado del grupo que consiste en el 28,5 %, el 31,5 %, el 33,5 %, el 36,5 %, el 37,0 %, el 38,5 %, el 39,0 % y el 43,5 %. En algunos aspectos, las formulaciones comprenden de aproximadamente el 5,0 % a aproximadamente el 10,0 % de DSPC y/o de aproximadamente el 7,0 % a aproximadamente el 15,0 % de DSPC.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas que se forman para administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. Los polinucleótidos pueden encapsularse por el liposoma y/o pueden estar contenidos en un núcleo acuoso, el cual puede encapsularse luego por el liposoma. Véanse las Pub. Internacionales No. WO2012031046 (véase también US20130189351), WO2012031043 (véase también US20130202684), WO2012030901 (véase también US20130195969) y WO2012006378 (véase también US20130171241) y la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130189351, US20130195969 y US20130202684).
En otro aspecto, los liposomas se formulan para una administración dirigida. Como ejemplo no limitante, el liposoma se formula para la administración dirigida al hígado. El liposoma utilizado para la administración dirigida puede incluir, pero no se limita a, los liposomas descritos en, y los métodos de preparación de liposomas descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130195967.
En otro aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprende un núcleo de aceite y un lípido catiónico que puede interaccionar con el polinucleótido que ancla la molécula a la partícula de emulsión. Véase la Pub. Internacional No. WO2012006380 (véase también US20160256541).
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una emulsión de aceite en agua que comprende una fase hidrófoba continua en la que se dispersa la fase hidrófila. Como ejemplo no limitante, la emulsión puede prepararse mediante los métodos descritos en la Publicación Internacional No. WO2013087791 (véase también US20140294904).
En otro aspecto, la formulación lipídica incluye al menos un lípido ionizable, un lípido que puede mejorar la transfección, y al menos un lípido que contiene un grupo de cabeza hidrófilo unido a un resto lipídico. Véase la Pub. Internacional No. WO2011076807 y la Pub. de EE. UU. No. 20110200582. En otro aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una vesícula lipídica que puede tener reticulaciones entre bicapas lipídicas funcionalizadas (véase la Pub. de EE. UU. No. 20120177724).
En un aspecto, los polinucleótidos se formulan en un liposoma como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013086526 (véase también US20140356416). Los polinucleótidos pueden encapsularse en un liposoma usando gradientes de pH inversos y/o composiciones de tampón interno optimizadas como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013086526.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas de polinucleótidos se formulan en liposomas tales como, pero no limitados a, liposomas de DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), liposomas basados en DOPC neutro (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) (p. ej., suministro de ARNsi para cáncer de ovario (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 20065(12)1708-1713)) y liposomas recubiertos de hialuronano (Quiet Therapeutics, Israel).
En un aspecto, el lípido catiónico es un lípido catiónico de bajo peso molecular tales como los descritos en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130090372. En otro aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una vesícula lipídica que puede tener reticulaciones entre bicapas lipídicas funcionalizadas.
En otros aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un liposoma que comprende un lípido catiónico. El liposoma puede tener una relación molar de átomos de nitrógeno en el lípido catiónico con respecto a los fosfatos en el polinucleótido (relación N:P) de entre 1:1 y 20:1 como se describe en la Publicación Internacional No. WO2013006825. En otro aspecto, el liposoma puede tener una relación N:P mayor de 20:1 o menor de 1:1.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un complejo lípido-policatión. La formación del complejo lípido-policatión puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Pub. de EE. UU. No. 20120178702. Como ejemplo no limitante, el policatión incluye un péptido catiónico o un polipéptido, tal como, pero no limitados a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en la Pub. Internacional No. WO2012013326 o la Pub. de Patente de EE. UU. No. US20130142818. En otro aspecto, los polinucleótidos se formulan en un complejo de lípido-policatión que puede incluir además un lípido no catiónico tal como, pero no limitado a, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE).
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un lipidoide de aminoalcohol. Los lipidoides de aminoalcohol que se pueden usar en la presente divulgación se pueden preparar mediante los métodos descritos en la Patente de EE. UU. No.
8.450.298.
La formulación de liposomas puede verse afectada por, pero no limitado a, la selección del componente lipídico ionizable, el grado de saturación del lípido ionizable, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176), la formulación de liposomas estaba compuesta por el 57,1 % de lípido ionizable, 7,1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, 34,3 % de colesterol y 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, el cambio de la composición del lípido ionizable podría administrar el ARNsi de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-2200). En algunos aspectos, las formulaciones de liposomas comprenden de aproximadamente el 35 a aproximadamente el 45 % de lípido ionizable, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 % de lípido ionizable, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 % de lípido ionizable y/o de aproximadamente el 55 % a aproximadamente el 65 % de lípido ionizable. En algunos aspectos, la relación de lípido a ARNm en liposomas es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1 y/o al menos 30:1.
En algunos aspectos, la relación de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) aumenta o disminuye y/o la longitud de la cadena de carbonos del lípido PEG se modifica de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de LNP. Como ejemplo no limitante, las formulaciones de LNP contienen de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 3,0 %, de aproximadamente el 1,0 % a aproximadamente el 3,5 %, de aproximadamente el 1,5 % a aproximadamente el 4,0 %, de aproximadamente el 2,0 % a aproximadamente el 4,5 %, de aproximadamente el 2,5 % a aproximadamente el 5,0 % y/o de aproximadamente el 3,0 % a aproximadamente el 6,0 % de la relación molar lipídica de PEG-c-DOMG (R-3-[(u>-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina) (también denominada en la presente memoria PEG-DOMG) en comparación con el lípido ionizable, DSPC y colesterol. En otro aspecto, el PEG-c-DOMG se puede reemplazar con un lípido PEG tal como, pero no limitado a, PEG-DSG (1,2-Diestearoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol), PEG-DMG (1,2-Dimiristoil-sn-glicerol) y/o PEG-DPG (1,2-Dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido ionizable se puede seleccionar de cualquier lípido conocido en la técnica tal como, pero no limitado a, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula lipídica como las descritas en la Publicación Internacional No. WO2012170930 (véase también US20140294938).
En otro aspecto, la formulación que comprende el o los polinucleótidos es una nanopartícula que puede comprender al menos un lípido. El lípido se puede seleccionar de, pero no se limita a, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos PEGilados y lípidos de aminoalcoholes. En otro aspecto, el lípido es un lípido catiónico tal como, pero no limitado a, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA y lípidos de aminoalcoholes. El lípido catiónico de aminoalcohol puede ser los lípidos descritos en y/o preparados mediante los métodos descritos en la Publicación de Solicitud Patente de EE. UU. No. US20130150625. Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 1 en US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 4 en US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas con propiedades ventajosas. En particular, la presente solicitud proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:
(i) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23; o,
(ii) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18; o,
(iii) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18; o,
(iv) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L; o,
(v) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido
que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y un polinucleótido que comprende un ARNm que
codifica un polipéptido OX40L; o
(vi) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o un polinucleótido que comprende un ARNm
que codifica un polipéptido IL-18, y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido
OX40L; y,
(b) un agente de administración.
En algunos aspectos, el agente de administración comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)
Figure imgf000201_0001
en donde
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C 2-14, -R*YR",
-YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y
alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -Or , -O(CH2)nN(R)2 , -C(O)OR,
-OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2 , -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2 , -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)Rs, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
Rs se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C 6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14;
cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br, e I; y m se selecciona de 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En a lg u n o s aspec tos , un su b co n ju n to de co m p u e s to s de F ó rm u la (I) in c luye aq u e llo s en los que R i se se le cc io n a de l g ru po que co n s is te en a lq u ilo C 5-20, a lq u e n ilo C 5-20, -R *Y R ", -Y R ", y -R "M 'R ';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3 , -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5; cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos, en donde los grupos alquilo y alquenilo pueden ser lineales o ramificados.
En algunos aspectos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que cuando R4 es -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHq R, o -CQ(R)2, entonces (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1,2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es un heterocicloalquilo de 5, 6, o 7- miembros cuando n es 1 o 2.
En otros aspectos, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N( R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C( S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R) OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino, y alquilo C1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R 7 se s e le cc io n a de l g ru po que con s is te en a lqu ilo C 1-3 , a lqu e n ilo C 2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14;
cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR",
-YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino, y alquilo
C1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste
Figure imgf000203_0001
n alquilo
Figure imgf000203_0002
C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste
Figure imgf000203_0003
n alquilo
Figure imgf000203_0004
C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste
Figure imgf000203_0005
n alquilo
Figure imgf000203_0006
C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste
Figure imgf000203_0008
alquilo
Figure imgf000203_0007
C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N( R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N (R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)O R, y -C(=NRg)N(R)2, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(CH2)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
Rg se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(CH2)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros;
cada R 5 se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru po que con s is te en a lqu ilo C 1-3 , a lq u e n ilo C 2-3, y H; cada R 6 se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru po que con s is te en a lqu ilo C 1-3 , a lq u e n ilo C 2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14;
cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2 , y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N( R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N (R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)O R, y -C(=NRg)N(R)2, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
Rg se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es in d e p e n d ie n te m e n te un ca rb o c ic lo C 3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2 , y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te del g ru po que co n s is te en a lqu ilo C 1-18 , a lq u e n ilo C 2-18, -R *Y R ", YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14;
cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo
Figure imgf000207_0001
C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo
Figure imgf000207_0002
C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo
Figure imgf000207_0003
4 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo
Figure imgf000207_0004
2 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 1, 2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R 7 se s e le cc io n a de l g ru po que co n s is te en a lqu ilo C 1-3, a lq u e n ilo C 2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En otros aspectos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3 , junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 1,2, 3, 4, y 5;
cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos.
En determinados aspectos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (IA):
Figure imgf000208_0001
o una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2 , -N H C (O )N (R ) 2 , -N (R )C (O )R , -N (R )S (O ) 2 R, -N (R )R 8 , -N H C (= N R 9 )N (R ) 2 , -N H C (= C H R 9 )N (R ) 2 , -O C (O )N (R ) 2 , -N (R )C (O )O R , he te ro a rilo o h e te ro c ic lo a lq u ilo ; M y M' se se le cc io n a n in d e p e n d ie n te m e n te de -C (O )O -, -O C (O )-, -C (O )N (R ')-, -P (O )(O R ')O -, -S -S -, un g ru p o a rilo y un g ru p o he te roa rilo ; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (IA), o una sal o estereoisómero de los mismos,
en donde
1 se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2;
M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. En determinados aspectos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (II):
Figure imgf000209_0001
o una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, donde n es 2, 3, o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)2 , -NHC(O)N(R)2 , -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -Oc (O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (II), o una sal 0 estereoisómero de los mismos, en donde
1 se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que n es 2, 3, o 4 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2; M y M’ se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14. En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (I) tiene la fórmula (IIa),
Figure imgf000209_0002
En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (I) tiene la fórmula (IIb),
Figure imgf000210_0001
En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (I) tiene la fórmula (IIc),
Figure imgf000210_0002
En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (I) tiene la fórmula (IIe),
Figure imgf000210_0003
En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IIe) comprende un R4 que se selecciona de -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR, en donde Q, R y n son como se han definido anteriormente.
En algunos aspectos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3 , -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2 , -N(H)C(S)N(H)(R), y un heterociclo, en donde R es como se ha definido anteriormente. En algunos aspectos, n es 1 o 2. En algunos aspectos, Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2.
En algunos aspectos, el compuesto de fórmula (I) tiene la fórmula (IId),
Figure imgf000210_0004
o una sal del mismo, en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14, n se selecciona de 2, 3 y 4, y R', R", R5, R6 y m son como se han definido anteriormente En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), R2 es alquilo C8. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), R3 es alquilo C5-C9. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), m es 5, 7 o 9. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), cada R5 es H. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), cada R6 es H.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una composición lipídica (p. ej., una nanopartícula lipídica (LNP)) que comprende: (1) un compuesto que tiene la fórmula (I); (2) opcionalmente, un lípido auxiliar (p. ej., un fosfolípido); (3) opcionalmente, un lípido estructural (p. ej., un esterol); (4) opcionalmente, un conjugado lipídico (p. ej., un PEG-lípido); y (5) opcionalmente, un compuesto de amina cuaternaria. En aspectos ilustrativos, la composición lipídica (p. ej., LNP) comprende además un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, p. ej., un polinucleótido o polinucleótidos encapsulados en ella.
En un aspecto particular, la composición lipídica (p. ej., LNP) comprende además un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En otro aspecto particular, la composición lipídica (p. ej., LNP) comprende además un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alquilo" o "grupo alquilo" significa un hidrocarburo saturado, lineal o ramificado, que incluye uno o más átomos de carbono (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono).
La notación "alquilo C1-14" significa un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que incluye 1-14 átomos de carbono. Un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alquenilo" o "grupo alquenilo" significa un hidrocarburo lineal o ramificado, que incluye dos o más átomos de carbono (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un enlace doble.
La notación "alquenilo C2-14" significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye de 2-14 átomos de carbono y al menos un enlace doble. Un grupo alquenilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más enlaces dobles. Por ejemplo, el alquenilo C18 puede incluir uno o más enlaces dobles. Un grupo alquenilo C18 que incluye dos enlaces dobles puede ser un grupo linoleílo. Un grupo alquenilo puede estar opcionalmente sustituido.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "carbociclo" o "grupo carbocíclico" significa un sistema mono o multicíclico que incluye uno o más anillos de átomos de carbono. Los anillos pueden tener tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince miembros en el anillo.
La notación "carbociclo C3-6" significa un carbociclo que incluye un solo anillo que tiene 3-6 átomos de carbono. Los carbociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles y pueden ser aromáticos (p. ej., grupos arilo). Los ejemplos de carbociclos incluyen grupos ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo y 1,2-dihidronaftilo. Los carbociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "heterociclo" o "grupo heterocíclico" significa un sistema mono o multicíclico que incluye uno o más anillos, donde al menos un anillo incluye al menos un heteroátomo. Los heteroátomos pueden ser, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden tener tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce miembros en el anillo. Los heterociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles y pueden ser aromáticos (p. ej., grupos heteroarilo). Los ejemplos de heterociclos incluyen grupos imidazolilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tiofenilo, piridinilo, piperidinilo, quinolilo e isoquinolilo. Los heterociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "grupo biodegradable" es un grupo que puede facilitar un metabolismo más rápido de un lípido en un sujeto. Un grupo biodegradable puede ser, pero no se limita a, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo, y un grupo heteroarilo.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "grupo arilo" es un grupo carbocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "grupo heteroarilo" es un grupo heterocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo y tiazolilo. Tanto los grupos arilo como heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Por ejemplo, M y M' pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en fenilo, oxazol y tiazol opcionalmente sustituidos. En las fórmulas de la presente memoria, M y M' pueden seleccionarse independientemente de la lista anterior de grupos biodegradables.
Los grupos alquilo, alquenilo y ciclilo (p. ej., carbociclilo y heterociclilo) pueden estar opcionalmente sustituidos a no ser que se especifique otra cosa. Los sustituyentes opcionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en, pero no se limitan a, un átomo de halógeno (p. ej., un grupo cloruro, bromuro, fluoruro o yoduro), un ácido carboxílico (p. ej., -C(O)OH), un alcohol (p. ej., un hidroxilo, -OH), un éster (p. ej., -C(O)OR o -OC(O)R), un aldehído (p. ej.,-C(O)H), un carbonilo (p. ej., -C(O)R, representado alternativamente por C=O), un haluro de acilo (p. ej., -C(O)X, en el que X es un haluro seleccionado de bromuro, fluoruro, cloruro y yoduro), un carbonato (p. ej., -OC(O)OR), un alcoxi (p. ej., -OR), un acetal (p. ej., -C(OR)2R", en el que cada OR son grupos alcoxi que pueden ser iguales o diferentes y R" es un grupo alquilo o alquenilo), un fosfato (p. ej., P(O)43'), un tiol (p. ej., -SH), un sulfóxido (p. ej., -S(O)R), un ácido sulfínico (p. ej., -S(O)OH), un ácido sulfónico (p. ej., -S(O)2OH), un tial (p. ej., -C(S)H), un sulfato (p. ej., S(O)42'), un sulfonilo (p. ej., -S(O)2-), una amida (p. ej., -C(o )n R2, o -N(R)C(O)R), un azido (p. ej., -N3), un nitro (p. ej., -NO2), un ciano (p. ej., -CN), un isociano (p. ej., -NC), un aciloxi (p. ej., -OC(O)R), un amino (p. ej., -NR2, -Nr H o -NH2), un carbamoílo (p. ej., -OC(O)n R2, -Oc (O)NRH, o -OC(O)NH2), una sulfonamida (p. ej., -S(O)2NR2, -S(O)2NRH, -S(O)2NH2, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)S(O)2H, o -N(H)S(O)2H), un grupo alquilo, un grupo alquenilo y un grupo ciclilo (p. ej., carbociclilo o heterociclilo).
En cualquiera de los anteriores, R es un grupo alquilo o alquenilo, como se define en la presente memoria. En algunos aspectos, los propios grupos sustituyentes pueden estar sustituidos adicionalmente con, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se define en la presente memoria. Por ejemplo, un grupo alquilo C1-6 puede estar sustituido adicionalmente con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se describe en la presente memoria.
Los compuestos de una cualquiera de las fórmulas (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe) incluyen una o más de las siguientes características cuando sea aplicable.
En algunos aspectos, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S, y P, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3 , -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5.
En otro aspecto, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino, y alquilo C1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5.
En otro aspecto, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R4 es -CH2)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros.
En otro aspecto, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q se selecciona de un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, y 5.
En otro aspecto, R4 es alquilo C1-4 no sustituido, p. ej., metilo no sustituido.
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R4 es -CH2)nQ o
-CH2)nCHQR, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 3, 4, y 5.
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en -CH2)nQ, -CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q es -N(R)2, y n se selecciona de 1,2, 3, 4, y 5.
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo, y R4 es -CH2)nQ o -CH2)nCHQR, donde Q es -N(R)2 , y n se selecciona de 3, 4, y 5.
En ciertos aspectos, R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo.
En algunos aspectos, R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20 y alquenilo C5-20.
En otros aspectos, R1 se selecciona del grupo que consiste en -R*YR", -YR", y -R"M'R'.
En ciertos aspectos, R1 se selecciona de -R*YR" y -YR". En algunos aspectos, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos aspectos, R* es alquilo C8 o alquenilo C8. En ciertos aspectos, R" es alquilo C3-12. Por ejemplo, R" puede ser alquilo C3. Por ejemplo, R" puede ser alquilo C4-8 (p. ej., alquilo C4, C5 , C6, C7, o C8).
En algunos aspectos, R1 es alquilo C5-20. En algunos aspectos, R1 es alquilo C6. En algunos aspectos, R1 es alquilo C8. En otros aspectos, R1 es alquilo C9. En ciertos aspectos, R1 es alquilo C14. En otros aspectos, R1 es alquilo C18.
En algunos aspectos, R1 es alquenilo C5-20. En ciertos aspectos, R1 es alquenilo C18. En algunos aspectos, R1 es linoleílo.
En ciertos aspectos, R1 está ramificado (p. ej., decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo, o heptadeca-9-ilo). En ciertos aspectos, R1 es
Figure imgf000213_0001
En ciertos aspectos, R1 es alquilo C5-20 o alquenilo C5-20 no sustituido. En ciertos aspectos, R' es alquilo C5-20 sustituido o alquenilo C5-20 (p. ej., sustituido con un carbociclo C3-6 tal como 1-ciclopropilnonilo).
En otros aspectos, R1 es -R"M'R'.
En algunos aspectos, R' se selecciona de -R*YR" y -YR". En algunos aspectos, Y es cicloalquilo C3-8. En algunos aspectos, Y es arilo C6-10. En algunos aspectos, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos aspectos, Y es un grupo ciclohexilo. En ciertos aspectos, R* es alquilo C1.
En algunos aspectos, R" se selecciona del grupo que consiste en alquilo C3-12 y alquenilo C3-12. En algunos aspectos, R” adyacente a Y es alquilo C1. En algunos aspectos, R" adyacente a Y es alquilo C4-9 (p. ej., alquilo C4, C5, C6, C7 o C8 o C9).
En algunos, R' se selecciona de alquilo C4 y alquenilo C4. En ciertos aspectos, R' se selecciona de alquilo C5 y alquenilo C5. En algunos aspectos, R' se selecciona de alquilo C6 y alquenilo C6. En algunos aspectos, R' se selecciona de alquilo C7 y alquenilo C7. En algunos aspectos, R' se selecciona de alquilo C9 y alquenilo C9.
En otros aspectos, R' se selecciona de alquilo C11 y alquenilo C11. En otros aspectos, R' se selecciona de alquilo C12, alquenilo C12, alquilo C13, alquenilo C13, alquilo C14, alquenilo C14, alquilo C15, alquenilo C15, alquilo C16, alquenilo C16, alquilo C17, alquenilo C17, alquilo C18, y alquenilo C18. En ciertos aspectos, R' está ramificado (p. ej., decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo, o heptadeca-9-ilo). En ciertos aspectos, R' es
Figure imgf000213_0002
En ciertos aspectos, R' es alquilo C1-18 no sustituido. En ciertos aspectos, R' es alquilo C1-18 sustituido (p. ej., alquilo C1-15 sustituido con un carbociclo C3-6 tal como 1-ciclopropilnonilo).
En algunos aspectos, R" se selecciona del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14. En algunos aspectos, R'' es alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5, alquilo C6, alquilo C7, o alquilo C8. En algunos aspectos, R" es alquilo C9, alquilo C10, alquilo C11, alquilo C12, alquilo C13, o alquilo C14.
En algunos aspectos, M' es -C(O)O-. En algunos aspectos, M' es -OC(O)-.
En otros aspectos, M' es un grupo arilo o un grupo heteroarilo. Por ejemplo, M' puede seleccionarse del grupo que consiste en fenilo, oxazol, y tiazol.
En algunos aspectos, M es -C(O)O- En algunos aspectos, M es -OC(O)-. En algunos aspectos, M es -C(O)N(R')-. En algunos aspectos, M es -P(O)(OR')O-.
En otros aspectos, M es un grupo arilo o un grupo heteroarilo. Por ejemplo, M puede seleccionarse del grupo que consiste en fenilo, oxazol, y tiazol.
En algunos aspectos, M es lo mismo que M'. En otros aspectos, M es diferente de M'.
En algunos aspectos, cada R5 es H. En ciertos de dichos aspectos, cada R6 también es H.
En algunos aspectos, R7 es H. En otros aspectos, R7 es alquilo C1-3 (p. ej., metilo, etilo, propilo o i-propilo). En algunos aspectos, R2 y R3 son independientemente alquilo C5-14 o alquenilo C5-14.
En algunos aspectos, R2 y R3 son iguales. En algunos aspectos, R2 y R3 son alquilo C8. En ciertos aspectos, R2 y R3 son alquilo C2. En otros aspectos, alquilo. En algunos aspectos, R2 y R3 son alquilo C4. En ciertos aspectos, R2 y R3 son alquilo C5. En otros aspectos, R2 y R3 son alquilo C6. En algunos aspectos, R2 y R3 son alquilo C7.
En otros aspectos, R2 y R3 son diferentes. En ciertos aspectos, R2 es alquilo C8. En algunos aspectos, R3 es alquilo C1-7 (p. ej., alquilo C1, C2, C3, C4, C5, C6, o C7) o C9.
En algunos aspectos, R7 y R3 son H.
En ciertos aspectos, R2 es H.
En algunos aspectos, m es 5, 7 o 9.
En algunos aspectos, R4 se selecciona de -(CH2)nQ y -(CH2 )nCHQR.
En algunos aspectos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3 , -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), -C(R)N(R)2C(O)OR, un carbociclo, y un heterociclo.
En ciertos aspectos, Q es -OH.
En ciertos aspectos, Q es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido, p. ej., Q es un imidazol, una pirimidina, una purina, 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-ona-9-ilo (o guanin-9-ilo), adenin-9-ilo, citosin-1-ilo o uracil-1-ilo. En ciertos aspectos, Q es un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros sustituido, p. ej., sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino y alquilo C1-3. Por ejemplo, Q es 4-metilpiperazinilo, 4-(4-metoxibencil)piperazinilo o isoindolin-2-il-1,3-diona.
En ciertos aspectos, Q es un arilo C6-10 sustituido o no sustituido (tal como fenilo) o cicloalquilo C3-6.
En algunos aspectos, n es 1. En otros aspectos, n es 2. En aspectos adicionales, n es 3. En ciertos otros aspectos, n es 4. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)2OH. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)3OH. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)4OH. Por ejemplo, R4 puede ser bencilo. Por ejemplo, R4 puede ser 4-metoxibencilo. En algunos aspectos, R4 es un carbociclo C3-6. En algunos aspectos, R4 es un cicloalquilo C3-6. Por ejemplo, R4 puede ser ciclohexilo opcionalmente sustituido con, p. ej., OH, halo, alquilo C1-6, etc. Por ejemplo, R4 puede ser 2-hidroxiciclohexilo.
En algunos aspectos, R es H.
En algunos aspectos, R es alquilo C1-3 no sustituido o alquenilo C2-3 no sustituido. Por ejemplo, R4 puede ser -CH2CH(OH)CH3 o -CH2CH(OH)CH2CH3.
En algunos aspectos, R es alquilo C1-3 sustituido, p. ej., CH2OH. Por ejemplo, R4 puede ser -CH2CH(OH)CH2OH.
En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S y P. En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-20 opcionalmente sustituido (p. ej., carbociclo C3-18, carbociclo C3-15, carbociclo C3-12, o carbociclo C3-10), ya sea aromático o no aromático. En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-6. En otros aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C6, tal como un grupo ciclohexilo o fenilo. En ciertos aspectos, el heterociclo o carbociclo C3-6 está sustituido con uno o más grupos alquilo (p. ej., en el mismo átomo del anillo o en átomos del anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo o fenilo que porta una o más sustituciones de alquilo C5. En ciertos aspectos, el heterociclo o carbociclo C3-6 formado por R2 y R3 está sustituido con grupos carbociclo. Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo o fenilo que está sustituido con ciclohexilo. En algunos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C7-15, tal como un grupo cicloheptilo, ciclopentadecanilo o naftilo.
En algunos aspectos, R4 se selecciona de -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR. En algunos aspectos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3 , -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), y un heterociclo. En otros aspectos, Q se selecciona del grupo que consiste en un imidazol, una pirimidina y una purina.
En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos aspectos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-6, tal como un grupo fenilo. En ciertos aspectos, el heterociclo o carbociclo C3-6 está sustituido con uno o más grupos alquilo (p. ej., en el mismo átomo del anillo o en átomos del anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo fenilo que porta una o más sustituciones de alquilo C5.
En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000216_0001
Figure imgf000217_0001
Figure imgf000218_0001
Figure imgf000219_0001
,
Figure imgf000220_0001
Figure imgf000221_0001
}
Figure imgf000222_0001
57),
Figure imgf000223_0001
,
Figure imgf000223_0002
Figure imgf000224_0001
).
Figure imgf000225_0001
Figure imgf000226_0001
Figure imgf000227_0001
.
Figure imgf000228_0001
Figure imgf000229_0001
).
Figure imgf000230_0001
,
Figure imgf000231_0001
,
Figure imgf000232_0001
.
Figure imgf000233_0001
Figure imgf000234_0001
Figure imgf000235_0001
Figure imgf000236_0001
Figure imgf000237_0001
Figure imgf000238_0001
.
Figure imgf000239_0001
Figure imgf000240_0001
.
Figure imgf000241_0001
,
Figure imgf000242_0001
Figure imgf000243_0001
Figure imgf000244_0001
En otros aspectos, el compuesto de Fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en Compuesto 1-Compuesto 147, o sales o estereoisómeros de los mismos.
Los restos de amina de los compuestos lipídicos divulgados en la presente memoria se pueden protonar en determinadas condiciones. Por ejemplo, el resto amina central de un lípido según la fórmula (I) típicamente
está protonado (es decir, cargado positivamente) a un pH por debajo del pKa del resto amino y sustancialmente
no está cargado a un pH por encima del pKa. Dichos lípidos pueden denominarse aminolípidos ionizables. En
algunos aspectos, el lípido ionizable es un aminolípido ionizable, al que a veces se hace referencia en la técnica
como "lípido catiónico ionizable".
En algunos aspectos, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), varía de 1 % en
moles a 99 % en moles en la composición lipídica.
En un aspecto, la cantidad de aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I) es al menos aproximadamente un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 5 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 8 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % en moles en la composición lipídica.
En un aspecto, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), varía de aproximadamente 30 % en moles a aproximadamente 70 % en moles, de aproximadamente 35 % en moles a aproximadamente 65 % en moles, de aproximadamente 40 % en moles a aproximadamente 60 % en moles, y
de aproximadamente 45 % en moles a aproximadamente 55 % en moles en la composición lipídica.
En un aspecto específico, la cantidad del aminolípido ionizable, p, ej., el compuesto de fórmula (I), es de aproximadamente 50 % en moles en la composición lipídica.
Además del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula I, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria puede comprender componentes adicionales
tales como fosfolípidos, lípidos estructurales, compuestos de amina cuaternaria, PEG-lípidos y cualquier combinación de los mismos.
Componentes Adicionales en la Composición Lipídica
A. Fosfolípidos
La composición lipídica de la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más fosfolípidos, por ejemplo, uno o más fosfolípidos saturados o (poli)insaturados o una combinación de los mismos. En general, los fosfolípidos comprenden un resto de fosfolípido y uno o más restos de ácidos grasos. Por ejemplo, un fosfolípido puede ser un lípido según la fórmula (VII):
Figure imgf000245_0001
en la que Rp representa un resto de fosfolípido y R1 y R2 representan restos de ácido graso con o sin insaturación que pueden ser iguales o diferentes.
Se puede seleccionar un resto de fosfolípido, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidilcolina y una esfingomielina.
Un resto de ácido graso puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico.
Los fosfolípidos particulares pueden facilitar la fusión a una membrana. Por ejemplo, un fosfolípido catiónico puede interaccionar con uno o más fosfolípidos cargados negativamente de una membrana (p. ej., una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido a una membrana puede permitir que uno o más elementos (p. ej., un agente terapéutico) de una composición que contiene lípidos (p. ej., LNP) pasen a través de la membrana permitiendo, p. ej., la administración de uno o más elementos a un tejido diana (p. ej., tejido tumoral).
También se contemplan especies de fosfolípidos no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclación y alquinos. Por ejemplo, un fosfolípido puede funcionalizarse o reticularse con uno o más alquinos (p. ej., un grupo alquenilo en el que uno o más enlaces dobles se reemplazan por un enlace triple). En condiciones de reacción apropiadas, un grupo alquino puede sufrir una cicloadición catalizada por cobre al exponerse a una azida. Dichas reacciones pueden ser útiles para funcionalizar una bicapa lipídica de una composición de nanopartículas para facilitar la permeación de la membrana o el reconocimiento celular o para conjugar una composición de nanopartículas con un componente útil tal como un resto de direccionamiento o de imagenología (p. ej., un tinte).
Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tal como esfingomielina. En algunos aspectos, una composición farmacéutica para administración intratumoral divulgada en la presente memoria puede comprender más de un fosfolípido. Cuando se usa más de un fosfolípido, dichos fosfolípidos pueden pertenecer a la misma clase de fosfolípidos (p. ej., MSPC y DSPC) o clases diferentes (p. ej., MSPC y MSPE).
Los fosfolípidos pueden ser de tipo simétrico o asimétrico. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fosfolípido simétrico" incluye glicerofosfolípidos que tienen restos de ácido graso coincidentes y esfingolípidos en los que el resto de ácido graso variable y la cadena de hidrocarburo del esqueleto de esfingosina incluyen un número comparable de átomos de carbono. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fosfolípido asimétrico" incluye lisolípidos, glicerofosfolípidos que tienen diferentes restos de ácidos grasos (p. ej., restos de ácidos grasos con diferentes números de átomos de carbono y/o insaturaciones (p. ej., enlaces dobles)) y esfingolípidos en los que el resto de ácido graso variable y la cadena hidrocarbonada del esqueleto de la esfingosina incluyen un número diferente de átomos de carbono (p. ej., el resto de ácido graso variable incluye al menos dos átomos de carbono más que la cadena hidrocarbonada o al menos dos átomos de carbono menos que la cadena hidrocarbonada).
En algunos aspectos, la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria comprende al menos un fosfolípido simétrico. Los fosfolípidos simétricos pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en 1,2-dipropionil-sn-glicero-3-fosfocolina (03:0 PC), 1,2-dibutiril-sn-glicero-3-fosfocolina (04:0 PC), 1,2-dipentanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (05:0 PC), 1,2-dihexanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (06:0 PC), 1,2-diheptanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (07:0 PC), 1,2-dioctanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (08:0 PC), 1,2-dinonanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (09:0 PC), 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (10:0 PC), 1.2- diundecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (11:0 PC, DUPC), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (12:0 PC), 1,2-ditridecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (13:0 PC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0 PC, DMPC), 1,2-dipentadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0 PC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0 PC, DPPC), 1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (4ME 16:0 PC), 1,2-diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC), 1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 PC, DSPC), 1,2-dinonadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (19:0 PC), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:0 PC), 1,2-dihenaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (21:0 PC), 1.2- dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22:0 PC), 1,2-ditricosanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (23:0 PC), 1,2-dilignoceroil-sn-glicero-3-fosfocolina (24:0 PC), 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC), 1.2- dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC), 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC), 1,2-dipalmitelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC), 1,2-dipetroselenoil-snglicero-3-fosfocolina (18:1 (A6-Cis) PC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (A9-Cis) Pc , DOPC), 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (A9-Trans) PC), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC, DLPC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC, DLnPC), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC), 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:4 (Cis) PC, DAPC), 1,2-dierucoil-snglicero-3-fosfocolina (22:1 (Cis) PC), 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC, DHAPC), 1.2- dinervonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (24:1 (Cis) PC), 1,2-dihexanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (06:0 PE), 1,2-dioctanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (08:0 PE), 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (10:0 PE), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (12:0 PE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (14:0 PE), 1,2-dipentadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0 PE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0 PE), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (4ME 16:0 PE), 1,2-diheptadecanoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (17:0 PE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0 PE, DSPE), 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:1 PE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (A9-Cis) PE, DOPE), 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (A9-Trans) PE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:2 PE, DLPE), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:3 PE, DLnPE), 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (20:4 PE, DAPE), 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (22:6 PE, DHAPE), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), sal sódica de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), y cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria comprende al menos un fosfolípido simétrico seleccionado del grupo no limitante que consiste en DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 Diéter PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE,DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG, y cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria comprende al menos un fosfolípido asimétrico. Los fosfolípidos asimétricos se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en
1-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-16:0 PC, MPPC),
1-miristoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-18:0 PC, MSPC),
1-palmitoil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-02:0 PC),
1-palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-14:0 PC, PMPC),
1-palmitoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:0 PC, PSPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:1 PC, POPC),
1-palmitoil-2-linoleil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:2 PC, PLPC),
1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-20:4 PC),
1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-22:6 PC),
1-estearoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-14:0 PC, SMPC),
1-estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-16:0 PC, SPPC),
1-estearo¡l-2-oleo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:0-18:1 PC, SOPC),
1-estearo¡l-2-l¡noleo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:0-18:2 PC),
1-estearo¡l-2-araqu¡dono¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:0-20:4 PC),
1-estearo¡l-2-docosahexaeno¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:0-22:6 PC),
1-oleo¡l-2-m¡risto¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:1-14:0 PC, OMPC),
1-oleo¡l-2-palm¡to¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (18:1-16:0 PC, OPPC),
1-oleo¡l-2-estearo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (18:1-18:0 PC, OSPC),
1-palm¡to¡l-2-oleo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (16:0-18:1 PE, POPE),
1-palm¡to¡l-2-l¡nole¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolamma (16:0-18:2 PE),
1-palm¡to¡l-2-araqu¡dono¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolamma (16:0-20:4 PE),
1-palm¡to¡l-2-docosahexaeno¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolamma (16:0-22:6 PE),
1-estearo¡l-2-oleo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (18:0-18:1 PE),
1-estearo¡l-2-l¡noleo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (18:0-18:2 PE),
1-estearo¡l-2-araqu¡dono¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolamma (18:0-20:4 PE),
1-estearo¡l-2-docosahexaeno¡l-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (18:0-22:6 PE),
1-oleo¡l-2-colestenlhem¡succ¡no¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (OChemsPC), y
cualqu¡er comb¡nac¡ón de los m¡smos.
Los líp¡dos as¡métr¡cos út¡les en la compos¡c¡ón l¡píd¡ca tamb¡én pueden ser l¡solíp¡dos. Los l¡solíp¡dos pueden selecc¡onarse del grupo no l¡m¡tante que cons¡ste en
1-hexano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (06:0 L¡so PC),
1-heptano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (07:0 L¡so PC),
1-octano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (08:0 L¡so PC),
1-nonano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (09:0 L¡so PC),
1-decano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (10:0 L¡so PC),
1-undecano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (11:0 L¡so PC),
1-lauro¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (12:0 L¡so PC),
1-tridecano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (13:0 L¡so PC),
1-mmsto¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (14:0 L¡so PC),
1-pentadecano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (15:0 L¡so PC),
1-palm¡to¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (16:0 L¡so PC),
1-heptadecano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (17:0 L¡so PC),
1-estearo¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (18:0 L¡so PC),
1-oleo¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocolma (18:1 L¡so PC),
1-nonadecano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (19:0 Liso PC),
1-araqu¡do¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (20:0 Lyso PC),
1-beheno¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (22:0 L¡so PC),
1-l¡gnocero¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (24:0 L¡so PC),
1-hexacosano¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (26:0 L¡so PC),
1-m¡r¡sto¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (14:0 L¡so PE),
1-palm¡to¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (16:0 L¡so PE),
1-estearo¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (18:0 L¡so PE),
1-oleo¡l-2-h¡drox¡-sn-gl¡cero-3-fosfoetanolam¡na (18:1 L¡so PE),
1-hexadec¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (C16 L¡so PC), y
cualqu¡er comb¡nac¡ón de los m¡smos.
En algún aspecto, la compos¡c¡ón l¡píd¡ca de una compos¡c¡ón farmacéut¡ca d¡vulgada en la presente memor¡a comprende al menos un fosfolíp¡do as¡métr¡co selecc¡onado del grupo que cons¡ste en MPPC, MSPC, PMPC, PSPC, SMPC, SPPC y cualqu¡er comb¡nac¡ón de los m¡smos. En algunos aspectos, el fosfolíp¡do as¡métr¡co es 1-m¡r¡sto¡l-2-estearo¡l-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (MSPC).
En algunos aspectos, las compos¡c¡ones l¡píd¡cas d¡vulgadas en la presente memor¡a pueden contener uno o más fosfolíp¡dos s¡métr¡cos, uno o más fosfolíp¡dos as¡métr¡cos o una comb¡nac¡ón de los m¡smos. Cuando están presentes múlt¡ples fosfolíp¡dos, pueden estar presentes en relac¡ones equ¡molares o relac¡ones no equ¡molares.
En un aspecto, la compos¡c¡ón l¡píd¡ca de una compos¡c¡ón farmacéut¡ca d¡vulgada en la presente memor¡a comprende una cant¡dad total de fosfolíp¡do (p. ej., MSPC) que varía de aprox¡madamente 1 % en moles a aprox¡madamente 20 % en moles, de aprox¡madamente 5 % en moles a aprox¡madamente 20 % en moles, de aprox¡madamente 10 % en moles a aprox¡madamente 20 % en moles, de aprox¡madamente 15 % en moles a aprox¡madamente 20 % en moles, de aprox¡madamente 1 % en moles a aprox¡madamente 15 % en moles, de aprox¡madamente 5 % en moles a aprox¡madamente 15 % en moles, de aprox¡madamente 10 % en moles a aprox¡madamente 15 % en moles, de aprox¡madamente 5 % en moles a aprox¡madamente 10 % en moles en la compos¡c¡ón l¡píd¡ca. En un aspecto, la cant¡dad del fosfolíp¡do es de aprox¡madamente 8 % en moles a aprox¡madamente 15 % en moles en la compos¡c¡ón l¡píd¡ca. En un aspecto, la cant¡dad del fosfolíp¡do (p. ej., MSPC) es aprox¡madamente 10 % en moles en la compos¡c¡ón l¡píd¡ca.
En algunos aspectos, la cant¡dad de un fosfolíp¡do específ¡co (p. ej., MSPC) es al menos aprox¡madamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 % en moles en la compos¡c¡ón l¡píd¡ca.
B. Compuestos de Am¡na Cuaternar¡a
La compos¡c¡ón l¡píd¡ca de una compos¡c¡ón farmacéut¡ca d¡vulgada en la presente memor¡a puede comprender uno o más compuestos de am¡na cuaternar¡a (p. ej., DOTAP). El térm¡no "compuesto de am¡na cuaternar¡a" se usa para ¡nclu¡r aquellos compuestos que t¡enen uno o más grupos de am¡na cuaternar¡a (p. ej., grupos tr¡alqu¡lam¡no) y que llevan permanentemente una carga pos¡t¡va y ex¡sten en forma de una sal. Por ejemplo, el uno o más grupos de am¡na cuaternar¡a pueden estar presentes en un líp¡do o un polímero (p. ej., p Eg ). En algunos aspectos, el compuesto de am¡na cuaternar¡a comprende (1) un grupo de am¡na cuaternar¡a y (2) al menos un grupo de cola h¡drófobo que comprende (¡) una cadena h¡drocarbonada, l¡neal o ram¡f¡cada, y saturada o ¡nsaturada, y (¡¡) opc¡onalmente, un enlace éter, éster, carbon¡lo o cetal entre el grupo de am¡na cuaternar¡a y la cadena h¡drocarbonada. En algunos aspectos, el grupo de am¡na cuaternar¡a puede ser un grupo tr¡met¡lamon¡o. En algunos aspectos, el compuesto de am¡na cuaternar¡a comprende dos cadenas h¡drocarbonadas ¡dént¡cas. En algunos aspectos, el compuesto de am¡na cuaternar¡a comprende dos cadenas h¡drocarbonadas d¡ferentes.
En algunos aspectos, la compos¡c¡ón l¡píd¡ca de una compos¡c¡ón farmacéut¡ca d¡vulgada en la presente memor¡a comprende al menos un compuesto de am¡na cuaternar¡a. El compuesto de am¡na cuaternar¡a puede selecc¡onarse del grupo no l¡m¡tante que cons¡ste en
1.2- dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP),
cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA),
cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM),
trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB),
bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE),
bromuro de N-(1,2-dioleoiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE),
cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC),
1.2- dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLePC),
1.2- diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP),
1.2- dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP),
1.2- dilinoleoil-3-trimetilamonio-propano (DLTAP),
1.2- dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP)
1.2- diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSePC)
1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DPePC),
1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMePC),
1.2- dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOePC),
1.2- di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfocolina (14:1 EPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (16:0-18:1 EPC),
y cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto, el compuesto de amina cuaternaria es 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).
Los compuestos de amina cuaternaria son conocidos en la técnica, tales como los descritos en las Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US2013/0245107 y US2014/0363493, Pat. de EE. UU. No. 8.158.601, y Publ. Int. No. WO2015/123264 y WO2015/148247,
En un aspecto, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 0,01 % en moles a aproximadamente 20 % en moles.
En un aspecto, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 3 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 3 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 3 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 4 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 4 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 4 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 5 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 5 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 5 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 6 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 6 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 6 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 7 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 7 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 7 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 8 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 8 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 8 % en moles a aproximadamente 10 % en moles, de aproximadamente 9 % en moles a aproximadamente 20 % en moles, de aproximadamente 9 % en moles a aproximadamente 15 % en moles, de aproximadamente 9 % en moles a aproximadamente 10 % en moles.
En un aspecto, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 5 % en moles a aproximadamente 10 % en moles.
En un aspecto, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente 5 % en moles. En un aspecto, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente 10 % en moles.
En algunos aspectos, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) es al menos aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 % en moles en la composición lipídica divulgada en la presente memoria.
En algunos aspectos, la composición lipídica del aspecto de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria comprende un compuesto de fórmula (I). En un aspecto, la relación molar del compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTA) es aproximadamente 100:1 a aproximadamente 2,5:1. En un aspecto, la relación molar del compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) es aproximadamente 90:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 5:1, o aproximadamente 2,5:1. En un aspecto, la relación molar del compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente 10:1.
En algunos aspectos, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria no comprende un compuesto de amina cuaternaria. En algunos aspectos, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria no comprende DOTAP.
C. Lípidos Estructurales
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más lípidos estructurales. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "lípido estructural" se refiere a esteroles y también a lípidos que contienen restos de esteroles. En algunos aspectos, el lípido estructural se selecciona del grupo que consiste en colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y mezclas de los mismos. En algunos aspectos, el lípido estructural es colesterol.
En un aspecto, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 20 % en moles a aproximadamente 60 % en moles, de aproximadamente 25 % en moles a aproximadamente 55 % en moles, de aproximadamente 30 % en moles a aproximadamente 50 % en moles, o de aproximadamente 35 % en moles a aproximadamente 45 % en moles.
En un aspecto, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 25 % en moles a aproximadamente 30 % en moles, de aproximadamente 30 % en moles a aproximadamente 35 % en moles, o de aproximadamente 35 % en moles a aproximadamente 40 % en moles.
En un aspecto, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente 23,5 % en moles, aproximadamente 28,5 % en moles, aproximadamente 33,5 moles %, o aproximadamente 38,5 % en moles.
En algunos aspectos, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es al menos aproximadamente 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 % en moles.
En algunos aspectos, el componente de la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas para administración intratumoral divulgadas no comprende colesterol.
D. Polietilenglicol (PEG)-Lípidos
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más de polietilenglicol (PEG)-lípido.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "PEG-lípido" se refiere a lípidos modificados con polietilenglicol (PEG). Los ejemplos no limitantes de PEG-lípidos incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de ceramida con PEG (p. ej., PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Dichos lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un lípido PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido PEG-DSPE.
En algunos aspectos, el PEG-lípido incluye, pero no se limita a, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diesteril glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-c-Dm A).
En un aspecto, el PEG-lípido se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG, y mezclas de los mismos.
En algunos aspectos, el resto lipídico de los PEG-lípidos incluye aquellos que tienen longitudes de aproximadamente C14 a aproximadamente C22, preferiblemente de aproximadamente C14 a aproximadamente C16. En algunos aspectos, un resto de PEG, por ejemplo, un mPEG-NH2, tiene un tamaño de aproximadamente 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 15.000 o 20.000 daltons. En un aspecto, el PEG-lípido es PEG2k-DMG.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender un lípido PEG que es un PEG no difundible. Los ejemplos no limitantes de PEG no difundibles incluyen PEG-DSG y PEG-DSPE.
Los PEG-lípidos son conocidos en la técnica, tales como los descritos en la Patente de EE. UU. No. 8158601 y la Publ. Internacional No. WO2015/130584
En un aspecto, la cantidad de PEG-lípido en la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente 0,1 % en moles a aproximadamente 5 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 5 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 5 % en moles, de aproximadamente 1,5 % en moles a aproximadamente 5 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 5 % en moles, de aproximadamente 0,1 % en moles a aproximadamente 4 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 4 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 4 % en moles, de aproximadamente 1,5 % en moles a aproximadamente 4 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 4 % en moles, de aproximadamente 0,1 % en moles a aproximadamente 3 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 3 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 3 % en moles, de aproximadamente 1,5 % en moles a aproximadamente 3 % en moles, de aproximadamente 2 % en moles a aproximadamente 3 % en moles, de aproximadamente 0,1 % en moles a aproximadamente 2 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 2 % en moles, de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 2 % en moles, de aproximadamente 1,5 % en moles a aproximadamente 2 % en moles, de aproximadamente 0,1 % en moles a aproximadamente 1,5 % en moles, de aproximadamente 0,5 % en moles a aproximadamente 1,5 % en moles, o de aproximadamente 1 % en moles a aproximadamente 1,5 % en moles.
En un aspecto, la cantidad de PEG-lípido en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente 1,5 % en moles.
En un aspecto, la cantidad de PEG-lípido en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2.1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o 5 % en moles.
En algunos aspectos, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria no comprende un PEG-lípido.
En algunos aspectos, la composición lipídica divulgada en la presente memoria comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I), y un fosfolípido asimétrico. En algunos aspectos, la composición lipídica comprende el Compuesto 18 y MSPC.
En algunos aspectos, la composición lipídica divulgada en la presente memoria comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I), y un compuesto de amina cuaternaria. En algunos aspectos, la composición lipídica comprende el Compuesto 18 y DOTAP.
En algunos aspectos, la composición lipídica divulgada en la presente memoria comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I), un fosfolípido asimétrico, y un compuesto de amina cuaternaria. En algunos aspectos, la composición lipídica comprende el Compuesto 18, MSPC y DOTAP.
En un aspecto, la composición lipídica comprende aproximadamente 50 % en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), aproximadamente 10 % en moles de DSPC o MSPC, aproximadamente 33,5 % en moles de colesterol, aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-DMG, y aproximadamente 5 % en moles de DOTAP. En un aspecto, la composición lipídica comprende aproximadamente 50 % en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), aproximadamente 10 % en moles de DSPC o MSPC, aproximadamente 28,5 % en moles de colesterol, aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-DMG, y aproximadamente 10 % en moles de DOTAP.
Los componentes de la nanopartícula lipídica se pueden adaptar para una administración óptima de los polinucleótidos en función del resultado deseado. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica puede comprender 40-60 % en moles de un aminolípido ionizable (p. ej., un compuesto de fórmula (I)), 8-16 % en moles de fosfolípido, 30-45 % en moles de colesterol, 1-5 % en moles de lípido PEG, y opcionalmente, 1-15 % en moles de compuesto de amina cuaternaria.
En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica puede comprender 45-65 % en moles de un aminolípido ionizable (p. ej., un compuesto de fórmula (I)), 5-10 % en moles de fosfolípido, 25-40 % en moles de colesterol, 0,5-5 % en moles de lípido PEG, y opcionalmente, 1-15 % en moles de compuesto de amina cuaternaria.
Los ejemplos no limitantes de partículas lipídicas de ácido nucleico se divulgan en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20140121263
E. Otros Aminolípidos Ionizables
La composición lipídica de la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más aminolípidos ionizables además de un lípido según la fórmula (I).
Los lípidos ionizables pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinetanamina (KL10), N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1 ,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazindietanamina (KL22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino)butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODmA), (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1-amina (L608), 2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)), y (2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)). Además de estos, un aminolípido ionizable también puede ser un lípido que incluya un grupo de amina cíclica.
Los lípidos ionizables también pueden ser los compuestos divulgados en la Publicación Internacional No. WO2015/199952 (véase también US20150376115) Por ejemplo, los aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a:
Figure imgf000252_0001
Figure imgf000253_0001
IJ53
Figure imgf000254_0001
F. Otros Componentes de la Composición Lipídica
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede incluir uno o más componentes además de los descritos anteriormente. Por ejemplo, la composición lipídica puede incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes de alteración de la superficie (p. ej., tensioactivos) u otros componentes. Por ejemplo, una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No.
2005/0222064. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (p. ej., glucosa) y polisacáridos (p. ej., glucógeno y derivados y análogos del mismo). La composición lipídica puede incluir un tampón tal como, pero no limitado a, citrato o fosfato a un pH de 7, sal y/o azúcar. La sal y/o azúcar se puede incluir en las formulaciones descritas en la presente memoria para la isotonicidad.
Se puede incluir un polímero en y/o utilizarse para encapsular o encapsular parcialmente una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria (p. ej., una composición farmacéutica en forma de nanopartículas lipídicas). Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero puede seleccionarse de, pero no está limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.
La relación entre la composición lipídica y el polinucleótido varía de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1 (p/p).
En algunos aspectos, la relación entre la composición lipídica y el polinucleótido puede ser de aproximadamente 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1,47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 o 60:1 (p/p). En algunos aspectos, la relación p/p de la composición lipídica y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, es aproximadamente 20:1 o aproximadamente 15:1.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede contener más de un polipéptido, p. ej., dos, tres o más polipéptidos. Por ejemplo, una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede contener dos, tres o más polinucleótidos (p. ej., ARNm).
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender polinucleótidos (p. ej., ARNm) en una relación en peso de lípido:polinucleótido de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1,35:1,40:1,45:1,50:1,55:1,60:1 o 70:1, o un rango o cualquiera de estas relaciones tales como, pero no limitado a, 5:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 60:1 o de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 70:1.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender el polinucleótido en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 2 mg/ml tal como, pero no limitado a, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml o mayor de 2,0 mg/ml.
En un aspecto, las formulaciones que comprenden los polinucleótidos y las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender 0,15 mg/ml a 2 mg/ml del polinucleótido descrito en la presente memoria (p. ej., ARNm). En algunos aspectos, la formulación puede comprender además 10 mM de tampón de citrato y la formulación puede comprender adicionalmente hasta un 10 % p/p de sacarosa (p. ej., al menos un 1 % p/p, al menos un 2 % p/p, al menos un 3 % p/p, al menos un 4 % p/p, al menos 5 % p/p, al menos un 6 % p/p, al menos un 7 % p/p, al menos un 8 % p/p, al menos un 9 % p/p o un 10 % p/p).
Composiciones de Nanopartículas
En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria se formulan como nanopartículas lipídicas (LNP). Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona composiciones de nanopartículas que comprenden (i) una composición lipídica que comprende un agente de administración tal como un compuesto de fórmula (I) como se describe en la presente memoria, y (ii) un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos. En dicha composición de nanopartículas, la composición lipídica divulgada en la presente memoria puede encapsular el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto particular, (i) el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan por separado (es decir, en dos poblaciones de nanopartículas). En otro aspecto particular, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan por separado (es decir, en tres poblaciones de nanopartículas). En un aspecto particular, (i) el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, (ii) el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o (iii) el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan juntos (es decir, en una única población de nanopartículas). En otro aspecto particular, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan juntos (es decir, en una única población de nanopartículas).
Las composiciones de nanopartículas suelen tener un tamaño del orden de micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas engloban nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (p. ej., vesículas lipídicas) y lipoplejos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede ser un liposoma que tenga una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.
Las composiciones de nanopartículas incluyen, por ejemplo, nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas y lipoplejos. En algunos aspectos, las composiciones de nanopartículas son vesículas que incluyen una o más bicapas lipídicas. En ciertos aspectos, una composición de nanopartículas incluye dos o más bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos. Las bicapas lipídicas pueden funcionalizarse y/o reticularse entre sí. Las bicapas lipídicas pueden incluir uno o más ligandos, proteínas o canales.
Las composiciones de nanopartículas de la presente divulgación comprenden al menos un compuesto según la fórmula (I). Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir uno o más de los Compuestos 1­ 147, o uno o más de los Compuestos 1-232. Las composiciones de nanopartículas también pueden incluir una variedad de otros componentes. Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir uno o más de otros lípidos además de un lípido según la fórmula (I), (II) o (Ma)-(Md), tal como (i) al menos un fosfolípido, (ii) al menos un compuesto de amina cuaternaria, (iii) al menos un lípido estructural, (iv) al menos un PEG-lípido, o (v) cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC), y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP).
En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende una composición lipídica que consiste o consiste esencialmente en el compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende una composición lipídica que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende una composición lipídica que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC), y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP). En algunos aspectos, la composición de nanopartículas comprende una composición lipídica que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48), y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP).
En un aspecto, la composición de nanopartículas comprende (1) una composición lipídica que comprende aproximadamente 50 % en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10 % en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 33,5 % en moles de colesterol; aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG2k-DMG); aproximadamente 5 % en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.
En un aspecto, la composición de nanopartículas comprende (1) una composición lipídica que comprende aproximadamente 50 % en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10 % en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 28,5 % en moles de colesterol; aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG2k-DMG); aproximadamente 10 % en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.
En un aspecto, la composición de nanopartículas comprende (1) una composición lipídica que comprende aproximadamente 50 % en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., los Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10 % en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 23,5 % en moles de colesterol; aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG2k-DMG); aproximadamente 15 % en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.
Tal como se define en general en la presente memoria, el término "lípido" se refiere a una molécula pequeña que tiene propiedades hidrófobas o anfifílicas. Los lípidos pueden ser naturales o sintéticos. Los ejemplos de clases de lípidos incluyen, pero no se limitan a, grasas, ceras, metabolitos que contienen esteroles, vitaminas, ácidos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos y policétidos y lípidos de prenol. En algunos casos, las propiedades anfifílicas de algunos lípidos los llevan a formar liposomas, vesículas o membranas en medios acuosos.
En algunos aspectos, una nanopartícula lipídica (LNP) puede comprender un lípido ionizable. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "lípido ionizable" tiene su significado habitual en la técnica y puede referirse a un lípido que comprende uno o más restos cargados. En algunos aspectos, un lípido ionizable puede estar cargado positivamente o cargado negativamente. Un lípido ionizable puede estar cargado positivamente, en cuyo caso puede denominarse "lípido catiónico". Por ejemplo, una molécula ionizable puede comprender un grupo amina, denominados aminolípidos ionizables. Tal y como se usa en la presente memoria, un "resto cargado" es un resto químico que lleva una carga electrónica formal, p. ej., monovalente (+1, o -1), divalente (+2, o -2), trivalente (+3, o -3), etc. El resto cargado puede ser aniónico (es decir, cargado negativamente) o catiónico (es decir, cargado positivamente). Los ejemplos de restos cargados positivamente incluyen grupos amina (p. ej., amina primaria, secundaria, y/o terciaria), grupos amonio, grupo piridinio, grupos guanidina y grupos imidizolio. En un aspecto particular, los restos cargados comprenden grupos amina. Los ejemplos de grupos cargados negativamente o precursores de los mismos incluyen grupos carboxilato, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfonato, grupos fosfato, grupos hidroxilo y similares. La carga del resto cargado puede variar, en algunos casos, con las condiciones ambientales, por ejemplo, los cambios en el pH pueden alterar la carga del resto, y/o hacer que el resto se convierta en cargado o no cargado. En general, la densidad de carga de la molécula se puede seleccionar como se desee.
Debe entenderse que los términos "cargado" o "resto cargado" no se refieren a una "carga negativa parcial" o "carga positiva parcial" en una molécula. A los términos "carga negativa parcial" y "carga positiva parcial" se les da su significado ordinario en la técnica. Una "carga negativa parcial" puede resultar cuando un grupo funcional comprende un enlace que se polariza de tal manera que la densidad electrónica es atraída hacia un átomo del enlace, creando una carga negativa parcial en el átomo. Los expertos en la técnica reconocerán, en general, enlaces que pueden polarizarse de esta manera.
En algunos aspectos, el lípido ionizable es un aminolípido ionizable, al que a veces se hace referencia en la técnica como "lípido catiónico ionizable". En un aspecto, el aminolípido ionizable puede tener una cabeza hidrófila cargada positivamente y una cola hidrófoba que están conectadas a través de una estructura conectora.
Las composiciones de nanopartículas se pueden caracterizar por una variedad de métodos. Por ejemplo, puede usarse microscopía (p. ej., microscopía electrónica de transmisión o microscopía electrónica de barrido) para examinar la morfología y distribución de tamaño de una composición de nanopartículas. La dispersión dinámica de la luz o la potenciometría (p. ej., titulaciones potenciométricas) pueden usarse para medir los potenciales zeta. La dispersión dinámica de la luz también se puede utilizar para determinar el tamaño de las partículas. También se pueden utilizar instrumentos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para medir múltiples características de una composición de nanopartículas, tales como el tamaño de las partículas, el índice de polidispersidad y el potencial zeta.
El tamaño de las nanopartículas puede ayudar a contrarrestar reacciones biológicas tales como, pero no limitadas a, inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del polinucleótido.
Tal y como se usa en la presente memoria, "tamaño" o "tamaño medio" en el contexto de las composiciones de nanopartículas se refiere al diámetro medio de una composición de nanopartículas.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en nanopartículas lipídicas. En algunos aspectos, las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, tal como, pero no limitado a, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En un aspecto, las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En un aspecto, la nanopartícula tiene un diámetro mayor de 100 nm, mayor de 150 nm, mayor de 200 nm, mayor de 250 nm, mayor de 300 nm, mayor de 350 nm, mayor de 400 nm, mayor de 450 nm, mayor de 500 nm, mayor de 550 nm, mayor de 600 nm, mayor de 650 nm, mayor de 700 nm, mayor de 750 nm, mayor de 800 nm, mayor de 850 nm, mayor de 900 nm, mayor de 950 nm o mayor de 1.000 nm.
En algunos aspectos, la dimensión más grande de una composición de nanopartículas es de 1 pm o menos (p. ej., 1 pm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, l00 nm, 75 nm, 50 nm o menos).
Una composición de nanopartículas puede ser relativamente homogénea. Se puede usar un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, p. ej., la distribución del tamaño de partículas de la composición de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (p. ej., inferior a 0,3) generalmente indica una distribución de tamaño de partículas estrecha. Una composición de nanopartículas puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,25, tal como 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. En algunos aspectos, el índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas divulgada en la presente memoria puede ser de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,20.
El potencial zeta de una composición de nanopartículas puede usarse para indicar el potencial electrocinético de la composición. Por ejemplo, el potencial zeta puede describir la carga superficial de una composición de nanopartículas. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más altamente cargadas pueden interaccionar de manera indeseable con células, tejidos y otros elementos del cuerpo. En algunos aspectos, el potencial zeta de una composición de nanopartículas divulgada en la presente memoria puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV, o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.
En algunos aspectos, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 60 mV, y de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 50 mV. En algunos aspectos, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 15 mV a aproximadamente 45 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV y de aproximadamente 25 mV a aproximadamente 35 mV. En algunos aspectos, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV, aproximadamente 20 mV, aproximadamente 30 mV, aproximadamente 40 mV, aproximadamente 50 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 70 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 90 mV y aproximadamente 100 mV.
El término "eficiencia de encapsulación" de un polinucleótido describe la cantidad del polinucleótido que se encapsula o se asocia de otro modo con una composición de nanopartículas después de la preparación, en relación con la cantidad inicial proporcionada. Tal y como se usa en la presente memoria, "encapsulación" puede referirse a un encierro, confinamiento, entorno o encapsulamiento completo, sustancial o parcial.
La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (p. ej., cerca del 100 %). La eficiencia de encapsulación puede medirse, por ejemplo, comparando la cantidad de polinucleótido en una solución que contiene la composición de nanopartículas antes y después de romper la composición de nanopartículas con uno o más disolventes orgánicos o detergentes.
La fluorescencia puede usarse para medir la cantidad de polinucleótido libre en una solución. Para las composiciones de nanopartículas descritas en la presente memoria, la eficiencia de encapsulación de un polinucleótido puede ser al menos un 50 %, por ejemplo, un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, aspectos 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %. En algunos aspectos, la eficiencia de los aspectos de encapsulación puede ser al menos un 80 %. En ciertos aspectos, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos un 90 %.
La cantidad de un polinucleótido presente en una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede depender de múltiples factores, tales como el tamaño del polinucleótido, la diana deseada y/o aplicación, u otras propiedades de la composición de nanopartículas, así como de las propiedades del polinucleótido.
Por ejemplo, la cantidad de un ARNm útil en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño (expresado como longitud o masa molecular), la secuencia y otras características del ARNm. Las cantidades relativas de un polinucleótido en una composición de nanopartículas también pueden variar.
Las cantidades relativas de la composición lipídica y el polinucleótido presente en una composición de nanopartículas lipídicas de la presente divulgación pueden optimizarse según consideraciones de eficacia y tolerabilidad. Para las composiciones que incluyen un ARNm como polinucleótido, la relación N:P puede servir como una medida útil.
Como la relación N:P de una composición de nanopartículas controla tanto la expresión como la tolerabilidad, son deseables las composiciones de nanopartículas con bajas relaciones N:P y expresión fuerte. Las relaciones N:P varían según la relación de lípidos a ARN en una composición de nanopartículas.
En general, se prefiere una relación N:P más baja. El uno o más ARN, lípidos y cantidades de los mismos pueden seleccionarse para proporcionar una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1, tal como 2:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1,20:1,22:1,24:1,26:1, 28:1, o 30:1. En ciertos aspectos, la relación N:P puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. En otros aspectos, la relación de aspectos de N:P es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. En ciertos aspectos, la relación N:P es entre 5:1 y 6:1. En un aspecto específico, la relación N:P es aproximadamente es aproximadamente 5,67:1.
Además de proporcionar composiciones de nanopartículas, la presente divulgación también proporciona métodos para producir nanopartículas lipídicas que comprenden encapsular un polinucleótido. Dicho método comprende usar cualquiera de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria y producir nanopartículas lipídicas según los métodos de producción de nanopartículas lipídicas conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Wang (et al. 2015) Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al. (2015) Curr. Pharm. Technol. 16: 940-954; Naseri et al. (2015) Adv. Pharm. Bull. 5:305-13; Silva et al. (2015) Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, y las referencias citadas en estas.
En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación se formula en una nanopartícula lipídica, en donde el polinucleótido comprende un ARNm divulgado en la TABLA 1. En algunos aspectos, el polinucleótido de la divulgación se formula en una nanopartícula lipídica, en donde el polinucleótido comprende una secuencia mostrada en la TABLA 1.
Típicamente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un aminolípido ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), y además comprenden un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un PEG o lípido modificado con PEG.
En un aspecto, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste esencialmente en (i) al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319); (ii) un lípido neutro seleccionado de DSPC, d Pp C, POPC, d Op E y SM; (iii) un esterol, p. ej., colesterol; y (iv) un PEG-lípido, p. ej., PEG-DMG o PEG-cDMA, en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de aminolípido ionizable: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0,5-15 % de PEG-lípido.
En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % en una base molar de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), p. ej., de aproximadamente el 35 a aproximadamente el 65 %, de aproximadamente el 45 a aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 57,5 %, aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 40 % en una base molar.
En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 15 % en una base molar del lípido neutro, p. ej., de aproximadamente el 3 a aproximadamente el 12 %, de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, o aproximadamente el 7,5 % en una base molar. Los lípidos neutros ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 % en una base molar del esterol (p. ej., de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 45 %, de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 38,5 %, aproximadamente el 35 % o aproximadamente el 31 % en una base molar. Un esterol ilustrativo es el colesterol. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 % en una base molar del PEG o lípido modificado con PEG (p. ej., de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 3,5 %, o aproximadamente el 5 % en una base molar. En un aspecto, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio de 2.000 Da. En otros aspectos, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio menor de 2.000 Da, por ejemplo, alrededor de 1.500 Da, alrededor de 1.000 Da, o alrededor de 500 Da. Los lípidos modificados con PEG ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (también denominado en la presente memoria PEG-C14 o C14-PEG), PEG-cDMA (se analiza con más detalle en Reyes et al. (2005) J. Controlled Release, 107, 276-287).
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen el 25-75 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 0,5-15 % del lípido neutro, el 5-50 % del esterol y, el 0,5-20 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen el 35-65 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 3-12 % del lípido neutro, el 15-45 % del esterol, y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen el 45-65 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 5-10 % del lípido neutro, el 25-40 % del esterol, y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 60 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente el 31 % del esterol, y aproximadamente el 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 50 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 10 % del lípido neutro, aproximadamente el 38,5 % del esterol y aproximadamente el 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 50 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 10 % del lípido neutro, aproximadamente el 35 % del esterol, aproximadamente el 4,5 % o aproximadamente el 5 % del PEG o lípido modificado con PEG, y aproximadamente el 0,5 % del lípido de direccionamiento en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 40 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4 dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 15 % del lípido neutro, aproximadamente el 40 % del esterol, y aproximadamente el 5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 57,2 % de un aminolípido ionizable seleccionado de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), aproximadamente el 7,1 % del lípido neutro, aproximadamente el 34,3 % del esterol, y aproximadamente el 1,4 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de la divulgación incluyen aproximadamente el 57,5 % de un aminolípido ionizable seleccionado del lípido PEG que es PEG-cDMA (PEG-cDMA se analiza con más detalle en Reyes et al. (2005) (J. Controlled Release, 107, 276-287), aproximadamente el 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente el 31,5 % del esterol, y aproximadamente el 3,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.
En algunos aspectos, la formulación de nanopartícula lipídica consiste esencialmente en una mezcla de lípidos en relaciones molares de aproximadamente 20-70 % de aminolípido ionizable: 5-45 % de lípido neutro: 20-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG; p. ej., en una relación molar de aproximadamente 20­ 60 % de aminolípido ionizable: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG.
En aspectos particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 50/10/38,5/1,5 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-DMG, PEG-DSG o PEG-DPG), 57,2/7,1134,3/1,4 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DPPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-cDMA), 40/15/40/5 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-DMG), 50/10/35/4,5/0,5 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-Ds G), 50/10/35/5 (aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con Pe G, p. ej., PEG-DMG), 40/10/40/10 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-DMG o PEG-cDMA), 35/15/40/10 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/lípido modificado con PEG, p. ej., Pe G-DMG o PEG-cDMA) o 52/13/30/5 (% en moles de aminolípido ionizable/lípido neutro, p. ej., DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, p. ej., PEG-d Mg o PEG-cDMA).
Se describen composiciones de nanopartículas lipídicas ilustrativas y métodos para prepararlas, por ejemplo, en Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed. 51:8529-8533; y Maier et al. (2013) Molecular Therapy 21:570-1578.
En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria comprenden un aminolípido ionizable, un lípido PEG y un lípido estructural, y opcionalmente comprenden un lípido no catiónico. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 40-60 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 5-15 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1-2 % de un lípido PEG y aproximadamente el 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 10 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1,5 % de un lípido PEG y aproximadamente el 38,5 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 55 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 10 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 2,5 % de lípido PEG y aproximadamente el 32,5 % de lípido estructural. En un aspecto, el aminolípido ionizable es cualquier aminolípido ionizable descrito en la presente memoria, tal como, pero no limitado a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.
En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria son nanopartículas lipídicas de 4 componentes. La nanopartícula lipídica puede comprender un aminolípido ionizable, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 40-60 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 5-15 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1-2 % de un lípido PEG y aproximadamente el 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 50 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 10 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 1,5 % de lípido PEG y aproximadamente el 38,5 % de lípido estructural. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica puede comprender aproximadamente el 55 % de aminolípido ionizable, aproximadamente el 10 % de un lípido no catiónico, aproximadamente el 2,5 % de lípido PEG y aproximadamente el 32,5 % de lípido estructural. En un aspecto, el aminolípido ionizable puede ser cualquier aminolípido ionizable descrito en la presente memoria, tal como, pero no limitado a, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.
En un aspecto, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria comprenden un aminolípido ionizable, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % del aminolípido ionizable DLin-KC2-DMA, aproximadamente el 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 1,5 % del lípido PEG PEG-DOMG y aproximadamente el 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % del aminolípido ionizable DLin-MC3-DMA, aproximadamente el 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 1,5 % del lípido PEG PEG-DOMG y aproximadamente el 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 50 % del aminolípido ionizable DLin-MC3-DMA, aproximadamente el 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 1,5 % del lípido PEG PEG-DMG y aproximadamente el 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente el 55 % del aminolípido ionizable L319, aproximadamente el 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente el 2,5 % del lípido PEG PEG-DMG y aproximadamente el 32,5 % del lípido estructural colesterol.
En un aspecto, el lípido es un lípido escindible tales como los descritos en la Publicación internacional No. WO2012170889. En otro aspecto, el lípido es un lípido catiónico tal como, pero no limitado a, la Fórmula (I) de la Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130064894.
En un aspecto, el lípido se sintetiza mediante métodos conocidos en la técnica y/o como se describe en las Publicaciones Internacionales No. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2013086373 y WO2013086354.
En otro aspecto, el lípido catiónico es un lípido catiónico de trialquilo. Se describen ejemplos no limitantes de lípidos catiónicos de trialquilo y métodos para preparar y usar los lípidos catiónicos de trialquilo en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013126803.
En un aspecto, las formulaciones de LNP de los polinucleótidos contienen PEG-c-DOMG en una relación molar de lípidos del 3 %. En otro aspecto, las formulaciones de LNP de los polinucleótidos contienen PEG-c-DOMG en una relación molar de lípidos del 1,5 %.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas del polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L incluyen al menos uno de los lípidos PEGilados descritos en la Publicación Internacional No. WO2012099755.
En un aspecto, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En un aspecto, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un aminolípido ionizable conocido en la técnica y al menos otro componente adicional. En otro aspecto, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, un aminolípido ionizable conocido en la técnica, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como otro ejemplo no limitante, la formulación de LNP contiene PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una relación molar de 2:40:10:48 (véase, p. ej., Geall et al. (2012) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 109:14604-9).
En un aspecto, la formulación de LNP se formula mediante los métodos descritos en las Publicaciones Internacionales No. WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en la presente memoria se encapsula en formulaciones de LNP como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276; véanse también, las Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130037977 y US20100015218,
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en la presente memoria se formulan en una nanopartícula para administrarse por una vía parenteral como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20120207845.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una nanopartícula lipídica preparada por los métodos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130156845 o Publicación Internacional No. WO2013093648 o WO2012024526.
Las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden prepararse en un entorno estéril mediante el sistema y/o métodos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No.
US20130164400.
En un aspecto, la formulación de LNP se formula en una nanopartícula tal como una partícula de ácido nucleicolípido descrita en la Patente de EE. UU. No. 8.492.359. Como ejemplo no limitante, la partícula lipídica comprende uno o más agentes activos o agentes terapéuticos; uno o más aminolípidos ionizables que comprenden de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula; uno o más lípidos no catiónicos que comprenden de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula; y uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas que comprenden de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles de los lípidos totales presentes en la partícula.
El ácido nucleico en la nanopartícula puede ser los polinucleótidos descritos en la presente memoria y/o son conocidos en la técnica.
En un aspecto, la formulación de LNP se formula mediante los métodos descritos en las Publicaciones internacionales No. WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el ARN modificado descrito en la presente memoria se encapsula en formulaciones de lNp como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276.
En un aspecto, las formulaciones de LNP descritas en la presente memoria comprenden una composición policatiónica. Como ejemplo no limitante, la composición policatiónica se selecciona de aspecto de la fórmula 1-60 de la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20050222064. En otro aspecto, las formulaciones de LNP que comprenden una composición policatiónica se usan para la administración del ARN modificado descrito en la presente memoria in vivo y/o in vitro.
En un aspecto, las formulaciones de LNP descritas en la presente memoria comprenden adicionalmente una molécula potenciadora de la permeabilidad. Las moléculas potenciadoras de la permeabilidad no limitantes se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20050222064.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas de polinucleótidos se formulan en liposomas tales como, pero no limitados a, liposomas de DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), liposomas basados en DOPC neutro (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) (p. ej., administración de ARNsi para cáncer de ovario (Landen et al. (2006) Cancer Biology & Therapy 5: 1708-1713)) y liposomas recubiertos de hialuronano (Quiet Therapeutics, Israel).
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en una composición liposomal en fase de gel liofilizada como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US2012060293.
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulación in vivo y/o aumentar la administración dirigida de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato para su uso con la presente divulgación pueden prepararse mediante los métodos descritos en la Solicitud Internacional No. WO2013033438 o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130196948. Como ejemplo no limitante, los conjugados de fosfato pueden incluir un compuesto de una cualquiera de las fórmulas descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013033438; véase también, la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130066086.
La formulación de nanopartículas puede comprender un conjugado de polímero. El conjugado de polímero puede ser un conjugado soluble en agua. El conjugado de polímero puede tener una estructura como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130059360. En un aspecto, los conjugados de polímero con el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido iL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación pueden prepararse usando los métodos y/o reactivos poliméricos segmentados descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130072709. En otro aspecto, el conjugado de polímero puede tener grupos laterales colgantes que comprenden restos de anillo, tales como, pero no limitados a, los conjugados de polímero descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130196948.
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de nanopartículas de la presente divulgación en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir el aclaramiento fagocítico de las nanopartículas en un sujeto. En un aspecto, el conjugado es un péptido "propio" diseñado a partir de la proteína de la membrana humana CD47, p. ej., las partículas "propias" descritas por Rodriguez et al. (2013) Science 339:971-975. Tal como muestran Rodriguez et al. los péptidos propios retrasaron el aclaramiento mediado por macrófagos de las nanopartículas, lo cual mejoró la administración de las nanopartículas. En otro aspecto, el conjugado es la proteína de membrana CD47. Véase, p. ej., Rodríguez et al. (2013) Science 339:971-975. Rodriguez et al. mostraron que, de manera similar a los péptidos "propios", CD47 puede aumentar la relación de partículas circulantes en un sujeto en comparación con los péptidos de secuencia aleatoria y las nanopartículas recubiertas con PEG.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación se formulan en nanopartículas que comprenden un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente divulgación en un sujeto. El conjugado puede ser la CD47 de membrana o el conjugado puede derivarse de la proteína de membrana CD47, tal como el péptido "propio" descrito anteriormente. En otro aspecto, la nanopartícula puede comprender PEG y un conjugado de CD47 o un derivado del mismo. En otro aspecto más, la nanopartícula comprende tanto el péptido "propio" descrito anteriormente como la proteína de membrana CD47.
En otro aspecto, un péptido "propio" y/o proteína CD47 se conjuga con una partícula similar a virus o pseudovirión, como se describe en la presente memoria, para la administración de los polinucleótidos de la presente divulgación.
En otro aspecto, las composiciones farmacéuticas que comprenden el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación pueden comprender un conjugado con un enlace degradable. Los ejemplos no limitantes de conjugados incluyen un resto aromático que comprende un átomo de hidrógeno ionizable, un resto espaciador y un polímero soluble en agua. Como ejemplo no limitante, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado con un enlace degradable y métodos para administrar dichas composiciones farmacéuticas en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130184443.
Las formulaciones de nanopartículas pueden ser una nanopartícula de carbohidrato que comprende un vehículo de carbohidrato y un polinucleótido. Como ejemplo no limitante, el vehículo de carbohidrato incluye, pero no se limita a, un material similar a glucógeno o fitoglucógeno modificado con anhídrido, octenilsuccinato de fitoglucógeno, fitoglucógeno beta-dextrina, fitoglucógeno beta-dextrina modificado con anhídrido. Véase, p. ej., la Publicación Internacional No. WO2012109121; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20140066363.
Las formulaciones de nanopartículas de la presente divulgación pueden recubrirse con un tensioactivo o polímero con el fin de mejorar la administración de la partícula. En un aspecto, la nanopartícula se recubre con un recubrimiento hidrófilo, tal como, pero no limitado a, recubrimientos de PEG y/o recubrimientos que tienen una carga superficial neutra. Los recubrimientos hidrófilos pueden ayudar a administrar nanopartículas con cargas útiles mayores, tales como, pero no limitadas a, polinucleótidos en el sistema nervioso central. Como ejemplo no limitante, se describen nanopartículas que comprenden un recubrimiento hidrófilo y métodos para preparar dichas nanopartículas en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130183244.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas de la presente divulgación son partículas de polímero hidrófilo. Se describen ejemplos no limitantes de partículas de polímero hidrófilo y métodos para preparar partículas de polímero hidrófilo en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130210991.
En otro aspecto, las nanopartículas lipídicas de la presente divulgación son partículas de polímero hidrófobo. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico ionizable con un lípido catiónico ionizable biodegradable que se conoce como nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP). Se ha mostrado que los lípidos catiónicos ionizables, tales como, pero no limitados a, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, se acumulan en el plasma y los tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. El metabolismo rápido de los lípidos de eliminación rápida puede mejorar la tolerabilidad e índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de una dosis de 1 mg/kg a una dosis de 10 mg/kg en ratas. La inclusión de un enlace de éster degradado de forma enzimática puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, mientras se mantiene la actividad de la formulación de reLNP. El enlace éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede ubicarse en el extremo terminal de la cadena lipídica. El enlace éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.
En un aspecto, el enlace éster interno está localizado en cualquier lado del carbono saturado.
En un aspecto, puede incitarse una respuesta inmune mediante la administración de una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. Véase, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20120189700 y la Publicación Internacional No. WO2012099805. El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie. El inmunógeno puede ser una proteína recombinante, un ARN modificado y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 descrito en la presente memoria, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 descrito en la presente memoria, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L descrito en la presente memoria.
Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse por ingeniería para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está localizada en el tejido mucosal, tal como, pero no limitado a, oral (p. ej., las membranas bucales y esofágicas y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (p. ej., estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (p. ej., membrana nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (p. ej., membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores de 10-200 nm que se prefieren por su mayor eficiencia de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar la administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran demasiado grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras mucosales. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas pueden eliminarse del tejido mucosal en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas grandes (con un diámetro de 200 nm-500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai et al. (2007) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:1482-487; Lai et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61:158-171). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, incluyendo, pero no limitadas a, recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueo (FRAp ) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución. Como ejemplo no limitante, las composiciones que pueden penetrar una barrera mucosal pueden prepararse como se describe en la Pat. de EE.Uu . No. 8.241.670 o la Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028 (véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150297531).
La nanopartícula lipídica diseñada por ingeniería para penetrar la mucosa puede comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero-vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, pero no se limita a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Se describen ejemplos no limitantes de polímeros biocompatibles en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013116804; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130203713. El material polimérico puede además irradiarse. Como ejemplo no limitante, el material polimérico puede irradiarse con rayos gamma. Véase, p. ej., La Solic. Internacional No. WO2012082165; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130101609
Los ejemplos no limitantes de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(L-ácido láctico) (PLLA), poli( ácido glicólico (PGA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(ácido L-láctico-co-ácido glicólico) (PLLGA), poli(D,L-láctido) (PDLA), poli(L-láctido) (PLLA), poli(D,L-láctido-co-caprolactona), poli(D,L-láctido-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L-láctido-co-PEO-co-D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-PPO-co-D,L-láctido), cianoacrilato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), metacrilato de hidroxipropilo (HPMA), polietilenglicol, poli-L-ácido glutámico, poli(hidroxiácidos), polianhídridos, poliortoésteres, poli(amidas de éster), poliamidas, poli(éteres de éster), policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como poli(tereftalato de etileno), alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como poli(acetato de vinilo), haluros de polivinilo, tales como poli(cloruro de vinilo) (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivatizadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(láctido-co-caprolactona), PEG-PLGA-PEG y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona. La nanopartícula lipídica puede recubrirse o asociarse con un copolímero, tal como, pero no limitado a, un copolímero de bloque (tal como un copolímero de bloque de poliéter-poliamida ramificado descrito en la Publicación Internacional No. WO2013012476), y un copolímero de tribloque de (poli(etilenglicol))-(poli(óxido de propileno))-poli(etilenglicol)). Véanse, p. ej., las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20120121718 y US20100003337, y la Pat. de EE. UU. No. 8.263.665.
El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana. Yang et al. (2011) Angew. Chem. Int. Ed. 50:2597-2600. Un método escalable no limitante para producir nanopartículas que pueden penetrar en la mucosa humana se describe por Xu et al. (2013) J. Control Release 170:279-86.
La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados tales como, pero no limitados a, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrófobo o un componente hidrófobo de otros tensioactivos (p. ej., cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).
La nanopartícula lipídica diseñada por ingeniería para penetrar la mucosa puede incluir agentes que alteran la superficie tales como, pero no limitados a, polinucleótidos, proteínas aniónicas (p. ej., albúmina de suero bovino), tensioactivos (p. ej., tensioactivos catiónicos tales como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecilamonio), azúcares o derivados de azúcares (p. ej., ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (p. ej., heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (p. ej., N-acetilcisteína, artemisa, bromelina, papaína, clerodendro, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y varias ADNasas, incluida la ADNasarh. El agente que altera la superficie puede incrustarse o incorporarse en la superficie de la partícula, o disponerse (p. ej., mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro proceso) en la superficie de la nanopartícula lipídica Véanse, p. ej., las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20100215580, US20080166414, y US20130164343.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa comprenden al menos un polinucleótido descrito en la presente memoria. El polinucleótido puede encapsularse en la nanopartícula lipídica y/o disponerse en la superficie de la partícula. El polinucleótido puede acoplarse de forma covalente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender una pluralidad de nanopartículas. Además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interaccionar con la mucosa y alterar las propiedades estructurales y/o adhesivas de la mucosa circundante para disminuir la mucoadhesión, lo cual puede aumentar la administración de las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa en el tejido mucosal.
En otro aspecto, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa son una formulación hipotónica que comprende un recubrimiento que mejora la penetración de la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio al cual se está administrando. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de formulaciones hipotónicas en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150297531.
En un aspecto, con el fin de mejorar la administración a través de la barrera mucosal, la formulación de polinucleótidos comprende o es una solución hipotónica. Se encontró que las soluciones hipotónicas aumentan la velocidad a la cual las partículas mucoinertes tales como, pero no limitadas a, partículas que penetran la mucosa, eran capaces de alcanzar la superficie del epitelio vaginal. Véase, p. ej., Ensign et al. (2013) Biomaterials 34:6922-9.
En un aspecto, el polinucleótido se formula como un lipoplejo, tal como, sin limitación, el sistema ATUPLEX™, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de ARNsi-lipoplejo de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECT™ de STe Mg ENT® (Cambridge, MA), y la administración basada en polietilenimina (PEI) o protamina dirigida o no dirigida de ácidos nucleicos. Véase Aleku et al. (2008) Cancer Res. 68:9788-9798; Strumberg et al. (2012) Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 50:76-78; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1222-1234; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1360-1370; Gutbier et al. (2010) Pulm. Pharmacol. Ther. 23:334-344; Kaufmann et al. (2010) Microvasc. Res. 80:286-293; Weide et al. (2009) J. Immunother. 32:498-507; Weide et al. (2008) J. Immunother. 31:180-188; Pascolo (2004) Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al. (2011) J. Immunother. 34:1-15; Song et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:709-717; Peer et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6:104:4095-4100; deFougerolles (2008) Hum. Gene Ther. 19:125-132).
En un aspecto, dichas formulaciones también se construyen o se alteran las composiciones de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos celulares in vivo, incluyendo, pero no limitados a, hepatocitos, células inmunes, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígeno, y leucocitos (Akinc et al. (2010) Mol. Ther. 18:1357-1364; Song et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:709-717; Judge et al. (2009) J. Clin. Invest. 119:661-673; Kaufmann et al. (2010) Microvasc. Res. 80:286-293; Santel et al. (2006) Gene Ther.
13:1222-1234; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1360-1370; Gutbier et al. (2010) Pulm. Pharmacol. Ther.
23:334-344; Basha et al. (2011) Mol. Ther. 19:2186-2200; Fenske and Cullis (2008) Expert Opin. Drug Deliv.
5:25-44; Peer et al. (2008) Science 319:627-630; Peer y Lieberman (2011) Gene Ther. 18:1127-1133). Un ejemplo de direccionamiento pasivo de formulaciones a células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, que han mostrado unirse a la apolipoproteína E y promover la unión y la captación de estas formulaciones en hepatocitos in vivo (Akinc et al. (2010) Mol Ther. 18:1357-1364).
Las formulaciones también pueden dirigirse de forma selectiva a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, tal como se ejemplifica por, pero no está limitado por, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y enfoques dirigidos por anticuerpos. Véase, p. ej., Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio y Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 20085:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; y, Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la divulgación se formulan como una nanopartícula lipídica sólida.
Una nanopartícula lipídica sólida (SLN) puede ser esférica con un diámetro promedio de entre 10 y 1.000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipófilas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. En un aspecto adicional, la nanopartícula lipídica puede ser una nanopartícula de lípido-polímero autoensamblada. Véase Zhang et al. (2008) ACS Nano 2:1696-1702. Como ejemplo no limitante, la SLN puede ser la SLN descrita en la Publicación de Patente internacional No. WO2013105101. Como otro ejemplo no limitante, la SLN puede prepararse mediante los métodos o procesos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013105101.
Se pueden usar liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para mejorar la eficacia de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, y cualquier combinación de los mismos, ya que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular por los polinucleótidos; y/o aumentar la traducción de IL-23, IL-36, IL-18 y OX40L codificadas. Un ejemplo de esto implica el uso de la encapsulación de lípidos para permitir la administración sistémica efectiva de ADN de plásmido poliplejo. Véase Heyes et al. (2007) Mol. Ther. 15:713-720. También pueden utilizarse los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para aumentar la estabilidad del polinucleótido.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de la presente divulgación se formulan para liberación controlada y/o administración dirigida.
Tal y como se usa en la presente memoria, “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico. En un aspecto, los polinucleótidos se encapsulan en un agente de administración descrito en la presente memoria y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "encapsular" significa encerrar, rodear o envolver. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la divulgación, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. La expresión "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto de la divulgación puede encerrarse, rodearse o envolverse dentro del agente de administración. "Encapsulación parcial" significa que menos del 10, 10, 20, 30, 40, 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la divulgación puede encerrarse, rodearse o envolverse dentro del agente de administración. Ventajosamente, la encapsulación se puede determinar midiendo el escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la divulgación mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos el 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de la composición farmacéutica o compuesto de la divulgación se encapsula en el agente de administración.
En un aspecto, la formulación de liberación controlada incluye, pero no se limita a, copolímeros de tribloque. Como ejemplo no limitante, la formulación incluye dos tipos distintos de copolímeros de tribloque. Véanse las Publ. Internacionales No. WO2012131104 y WO2012131106; véanse también las Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20140219923 y US20150165042
En otro aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se encapsulan en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente se pueden encapsular a continuación en un polímero, hidrogel y/o sellador quirúrgico descrito en la presente memoria y/o conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico es PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG o COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
En otro aspecto, la nanopartícula lipídica se encapsula en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel cuando se inyecta en un sujeto. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula lipídica se encapsula en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.
En un aspecto, la formulación para liberación controlada y/o administración dirigida comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L también incluye al menos un recubrimiento de liberación controlada.
Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, pero no se limitan a, OPADRY®, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa tales como las dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®).
En un aspecto, la formulación de liberación controlada y/o administración dirigida de polinucleótidos comprende al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, pero no se limitan a, poli(éster de serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En un aspecto, la formulación de liberación controlada y/o administración dirigida de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido comprende al menos un PEG y/o derivados de polímeros relacionados con PEG como se describe en la Patente de EE. UU. No. 8.404.222.
En otro aspecto, la formulación de administración de liberación controlada de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido es el sistema polimérico de liberación controlada descrito en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130130348.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, de la presente divulgación se encapsula en una nanopartícula terapéutica
Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a, las Publ. Internacionales No. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, Publ. de Solic. de Pat. EE. UU. No. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 y US20130230567 y las Pat. de EE. UU. No. 8.206.747, 8.293.276, 8.318.208 y 8.318.211. En otro aspecto, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los métodos descritos en la Pub. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20120140790.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan para liberación sostenida.
Tal y como se usa en la presente memoria, "liberación sostenida" se refiere a una composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a una velocidad de liberación en un período de tiempo específico. El período de tiempo puede incluir, pero no se limita a, horas, días, semanas, meses y años. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula de liberación sostenida comprende un polímero y un agente terapéutico tal como, pero no limitado a, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido iL-23 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 de la presente divulgación. Véase la Publ. Internacional No. WO2010075072 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20100216804, US20110217377 y US20120201859. En otro ejemplo no limitante, la formulación de liberación sostenida comprende agentes que permiten una biodisponibilidad persistente, tales como, pero no limitados a, cristales, geles macromoleculares y/o suspensiones de partículas. Véase la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130150295.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L pueden formularse para ser específicos de diana.
Como ejemplo no limitante, las nanopartículas terapéuticas incluyen un corticoesteroide. Véase la Pub. Internacional No. WO2011084518. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas terapéuticas se formulan en nanopartículas descritas en las Publ. Internacionales No. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y en las Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20100069426, US20120004293 y US20100104655.
En un aspecto, las nanopartículas de la presente divulgación comprenden una matriz polimérica. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula comprende dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero dibloque. En un aspecto, el copolímero de dibloque incluye PEG en combinación con un polímero tal como, pero no limitado a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos. En otro aspecto más, el copolímero de dibloque es un copolímero de dibloque de alto X tales como los descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013120052; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150337068
Como ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero de bloque PLGA-PEG. Véase la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20120004293 y la Pat. de EE. UU. No. 8.236.330. En otro ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula furtiva que comprende un copolímero de dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA. Véase la Pat. de EE. UU. No. 8.246.968 y la Publicación Internacional No. WO2012166923. En otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula furtiva o una nanopartícula furtiva específica de la diana tal como se describe en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130172406.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero de multibloque. Véanse, p. ej., las Pat. de EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130195987. En otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG. Véase, p. ej., Lee et al. (2003) Pharmaceutical Research 20:1995-2000; Li et al. (2003) Pharmaceutical Research 20:884-888; y Chang et al. (2007) J. Controlled Release. 118:245-253.
Los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma y/u OX40L de la presente divulgación pueden formularse en nanopartículas lipídicas que comprenden el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero multibloque. Véanse, p. ej., las Pat. de EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130195987.
En un aspecto, los copolímeros de bloque descritos en la presente memoria están incluidos en un complejo de poliiones que comprende una micela no polimérica y el copolímero de bloque. Véase, p. ej., la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20120076836.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, pero no se limitan a, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.
En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero de poli(éster de vinilo). El polímero de poli(éster de vinilo) puede ser un copolímero tal como un copolímero aleatorio. Como ejemplo no limitante, el copolímero aleatorio tiene una estructura tal como las descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013032829 o en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130121954. En un aspecto, los polímeros de poli(éster de vinilo) pueden conjugarse con los polinucleótidos descritos en la presente memoria.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende al menos un copolímero de dibloque. El copolímero de dibloque puede ser, pero no se limita a, un copolímero de poli(ácido láctico-poli(etilen)glicol. Véase, p. ej., la Publicación de Patente Internacional No. WO2013044219).
Como ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica se usa para tratar el cáncer. Véase la Publicación Internacional No. WO2013044219; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150017245,
En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero catiónico descrito en la presente memoria y/o conocido en la técnica.
En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero que contiene amina tal como, pero no limitado a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros poli(amidoamina), poli(beta-amino ésteres) y combinaciones de los mismos. Véase, p. ej., la Pat. de EE. UU. No. 8.287.849.
En otro aspecto, las nanopartículas descritas en la presente memoria comprenden un lípido catiónico de amina tales como los descritos en la Solicitud de Patente internacional No. WO2013059496. En un aspecto, los lípidos catiónicos tienen un resto amino-amina o amino-amida.
En un aspecto, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, pero no se limitan a, poli(éster de serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación con PEG para formar un polímero PEGilado.
En otro aspecto, la nanopartícula terapéutica incluye una conjugación de al menos un ligando de direccionamiento. El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando conocido en la técnica, tal como, pero no limitado a, un anticuerpo monoclonal Véase, Kirpotin et al (2006) Cancer Res. 66:6732-6740.
En un aspecto, la nanopartícula terapéutica se formula en una solución acuosa que se puede utilizar para tomar el cáncer como diana (véase, la Pub Internacional No. WO2011084513 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20110294717).
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, se formulan usando los métodos descritos en la Patente de EE. UU. No.
8.404.799.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, están encapsulados en, unidos a y/o asociados con nanovehículos sintéticos.
Los nanovehículos sintéticos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las Pub. Internacionales No. WO2010005740, WO2010030763, WO201213501, WO2012149252, WO2012149255, WO2012149259, WO2012149265, WO2012149268, WO2012149282, WO2012149301, WO2012149393, WO2012149405, WO2012149411, WO2012149454 y WO2013019669, y en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. Nos. US20110262491, US20100104645, US20100087337 y US20120244222. Los nanovehículos sintéticos se pueden formular utilizando los métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente memoria. Como ejemplo no limitante, los nanovehículos sintéticos pueden formularse mediante los métodos descritos en las Pub. Internacionales No. WO2010005740, WO2010030763 y WO201213501 y en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20110262491, US20100104645, US20100087337 y US2012024422. En otro aspecto, las formulaciones de nanovehículos sintéticos pueden liofilizarse mediante los métodos descritos en la Pub. Internacional No. WO2011072218 y en la Pat. de EE. UU. No. 8.211.473. En otro aspecto más, las formulaciones de la presente divulgación, incluyendo, pero no limitadas a, nanovehículos sintéticos, pueden liofilizarse o reconstituirse mediante los métodos descritos en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. Uu . No. US20130230568.
En un aspecto, los nanovehículos sintéticos contienen grupos reactivos para liberar los polinucleótidos descritos en la presente memoria (véase la Publ. internacional No. WO20120952552 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20120171229).
En un aspecto, los nanovehículos sintéticos contienen un agente inmunoestimulador para mejorar la respuesta inmune a partir de la administración del nanovehículo sintético. Como ejemplo no limitante, el nanovehículo sintético puede comprender un agente inmunoestimulador de Th1 que puede potenciar una respuesta basada en Th1 del sistema inmune (véase la Publ. Internacional No. WO2010123569 y la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20110223201).
En un aspecto, los nanovehículos sintéticos se formulan para la liberación dirigida. En un aspecto, el nanovehículo sintético se formula para liberar los polinucleótidos a un pH especificado y/o después de un intervalo de tiempo deseado. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula sintética se formula para liberar los polinucleótidos después de 24 horas y/o a un pH de 4,5 (véanse las Publ. Internacionales No. WO2010138193 y WO2010138194 y la Publ de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20110020388 y US20110027217).
En un aspecto, los nanovehículos sintéticos se formulan para una liberación controlada y/o sostenida de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Como ejemplo no limitante, los nanovehículos sintéticos para liberación sostenida se formulan mediante métodos conocidos en la técnica, descritos en la presente memoria y/o como se describe en la Pub. Internacional No. WO2010138192 y en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU.
N o.20100303850.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, se formulan para liberación controlada y/o sostenida en donde la formulación comprende al menos un polímero que es un polímero de cadena lateral cristalina (CYSC). Los polímeros CYSC se describen en la Patente de EE. UU. No. 8.399.007.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, están encapsulados en, unidos a y/o asociados con lípidos zwitteriónicos.
Se describen ejemplos no limitantes de lípidos zwitteriónicos y métodos de uso de lípidos zwitteriónicos en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130216607. En un aspecto, los lípidos zwitteriónicos pueden utilizarse en los liposomas y nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, se formulan en nanovehículos coloidales como se describe en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130197100.
En un aspecto, la nanopartícula se optimiza para la administración oral. La nanopartícula puede comprender al menos un biopolímero catiónico tal como, pero no limitado a, quitosano o un derivado del mismo. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula puede formularse mediante los métodos descritos en la Publ. de Solic.
de Pat. de EE. UU. No. US20120282343.
En algunos aspectos, las LNP comprenden el lípido KL52 (un amino-lípido descrito en la Publ. de Solic. de Pat.
de EE. UU. No. US2012/0295832). La actividad y/o seguridad (como se mide al examinar uno o más de ALT/AST, recuento de glóbulos blancos e inducción de citoquinas) de la administración de las LNP puede mejorarse mediante la incorporación de dichos lípidos. Las LNP que comprenden KL52 pueden administrarse por aspectos de vía intravenosa y/o en una o más dosis. En algunos aspectos, la administración de las LNP que comprenden KL52 da lugar a una expresión igual o mejorada de ARNm y/o proteínas en comparación con las LNP que comprenden MC3.
En algunos aspectos, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se administran utilizando LNP más pequeñas. Dichas partículas pueden comprender un diámetro de menos de 0,1 um hasta 100 nm tal como, pero no limitado a, menos de 0,1 um, menos de 1,0 um, menos de 5 um, menos de 10 um, menos de 15 um, menos de 20 um, menos de 25 um, menos de 30 um, menos de 35 um, menos de 40 um, menos de 50 um, menos de 55 um, menos de 60 um, menos de 65 um, menos de 70 um, menos de 75 um, menos de 80 um, menos de 85 um, menos de 90 um, menos de 95 um, menos de 100 um, menos de 125 um, menos de 150 um, menos de 175 um, menos de 200 um, menos de 225 um, menos de 250 um, menos de 275 um, menos de 300 um, menos de 325 um, menos de 350 um, menos de 375 um, menos de 400 um, menos de 425 um, menos de 450 um, menos de 475 um, menos de 500 um, menos de 525 um, menos de 550 um, menos de 575 um, menos de 600 um, menos de 625 um, menos de 650 um, menos de 675 um, menos de 700 um, menos de 725 um, menos de 750 um, menos de 775 um, menos de 800 um, menos de 825 um, menos de 850 um, menos de 875 um, menos de 900 um, menos de 925 um, menos de 950 um, o menos de 975 um.
En otro aspecto, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se administran utilizando LNP más pequeñas que pueden comprender un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm y/o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm.
En algunos aspectos, dichas LNP se sintetizan usando métodos que comprenden mezcladoras de microfluidos. Los ejemplos de mezcladoras de microfluidos pueden incluir, pero no se limitan a, una micromezcladora interdigital de hendidura incluyendo, pero no limitado a, aquellas fabricadas por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o una micromezcladora de espina escalonada (SHM). Véase, Zhigaltsev et al. (2012) Langmuir 28:3633-40; Belliveau et al. (2012) Molecular Therapy-Nucleic Acids 1:e37; Chen et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 134:6948-51.
En algunos aspectos, los métodos para generar LNP que comprenden SHM comprenden además el mezclado de al menos dos corrientes de entrada, en donde el mezclado se produce mediante advección caótica inducida por microestructura (MICA). Según este método, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espina, lo que provoca un flujo rotacional y pliega los fluidos entre sí. Este método también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, en donde la superficie cambia de orientación durante el ciclado de fluido. Los métodos para generar LNP utilizando SHM incluyen los descritos en las Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US2004/0262223 y US2012/0276209.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, de la presente divulgación se formulan en nanopartículas lipídicas creadas utilizando una micromezcladora tal como, pero no limitada a, un mezcladora microestructurada interdigital de hendidura (SIMM-V2) o una micromezcladora interdigital de hendidura estándar (SSIMM) o de oruga (CPMM) o de chorro incidente (IJMM) del Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania).
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, de la presente divulgación se formulan en nanopartículas lipídicas creadas mediante tecnología microfluídica. Véase, Whitesides (2006) Nature 442: 368-373; y Abraham et al. (2002) Science 295:647-651. Como ejemplo no limitante, la formulación de microfluídica controlada incluye un método pasivo para mezclar corrientes de flujos constantes impulsados por presión en microcanales con un número de Reynolds bajo. Véase, p. ej., Abraham et al. (2002) Science 295: 647-651.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, pueden formularse en nanopartículas lipídicas creadas utilizando un chip micromezclador tal como, pero no limitado a, los de Harvard Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, Reino Unido). Un chip micromezclador puede utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de división y recombinación.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan para la administración utilizando las microesferas de encapsulación de fármacos descritas en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468 o la Patente de EE. UU. No. 8.440.614. Las microesferas pueden comprender un compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (V) o (VI) como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468. En otro aspecto, el aminoácido, péptido, polipéptido, lípidos (APPL) son útiles para administrar los polinucleótidos de la divulgación a células. Véase la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130158021
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en nanopartículas lipídicas que tienen un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, tal como, pero no limitado a, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En un aspecto, la nanopartícula lipídica tiene un diámetro mayor de 100 nm, mayor de 150 nm, mayor de 200 nm, mayor de 250 nm, mayor de 300 nm, mayor de 350 nm, mayor de 400 nm, mayor de 450 nm, mayor de 500 nm, mayor de 550 nm, mayor de 600 nm, mayor de 650 nm, mayor de 700 nm, mayor de 750 nm, mayor de 800 nm, mayor de 850 nm, mayor de 900 nm, mayor de 950 nm o mayor de 1.000 nm.
En un aspecto, la nanopartícula lipídica es una nanopartícula lipídica de tamaño limitado descrita en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013059922 (véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20140328759). La nanopartícula lipídica de tamaño limitado puede comprender una bicapa lipídica que rodea un núcleo acuoso o un núcleo hidrófobo; donde la bicapa lipídica puede comprender un fosfolípido tal como, pero no limitado a, diacilfosfatidilcolina, una diacilfosfatidiletanolamina, una ceramida, una esfingomielina, una dihidroesfingomielina, una cefalina, un cerebrósido, una diacilfosfatidilcolina de ácido graso C8-C20 y 1 -palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina (POPC). En otro aspecto, la nanopartícula lipídica de tamaño limitado puede comprender un polietilenglicol-lípido tal como, pero no limitado a, DLPE-PEG, DMPE-PEG, DPPC-PEG y DSPE-PEG.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se administran, localizan y/o concentran en una localización específica usando los métodos de administración descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063530. Véase también, la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20140323907. Como ejemplo no limitante, puede administrarse a un sujeto una partícula polimérica vacía antes de, simultáneamente con o después de la administración de los polinucleótidos al sujeto. La partícula polimérica vacía experimenta un cambio de volumen una vez que entra en contacto con el sujeto y se aloja, incrusta, inmoviliza o queda atrapada en una localización específica en el sujeto.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, se formulan en un sistema de liberación de la sustancia activa (véase, p. ej., la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130102545). El sistema de liberación de sustancia activa puede comprender 1) al menos una nanopartícula unida a una cadena inhibidora de oligonucleótidos que se hibrida con un ácido nucleico catalíticamente activo y 2) un compuesto unido a al menos una molécula de sustrato unida a una sustancia terapéuticamente activa (p. ej., los polinucleótidos descritos en la presente memoria), donde la sustancia terapéuticamente activa se libera mediante escisión de la molécula de sustrato por el ácido nucleico catalíticamente activo.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en una nanopartícula que comprende un núcleo interno que comprende un material no celular y una superficie externa que comprende una membrana celular. La membrana celular puede derivarse de una célula o una membrana derivada de un virus. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula se prepara mediante los métodos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052167. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula descrita en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013052167 se usa para administrar los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130337066,
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en bicapas lipídicas soportadas en nanopartículas porosas (protocélulas). Las protocélulas se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013056132 (véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150272885
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, descritos en la presente memoria se formulan en nanopartículas poliméricas como se describe en o preparan por los métodos descritos en las Patentes de EE. UU. No.
8.420.123 y 8.518.963 y la Patente Europea No. EP2073848B1. Como ejemplo no limitante, la nanopartícula polimérica tiene una temperatura de transición vítrea alta, tal como las nanopartículas descritas en o las nanopartículas preparadas por los métodos descritos en la Patente de EE. UU. No. 8.518.963. Como otro ejemplo no limitante, la nanopartícula polimérica para formulaciones orales y parenterales se prepara por los métodos descritos en la Patente Europea No. EP2073848B1.
En otro aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, descritos en la presente memoria se formulan en nanopartículas usadas en imagenología. Las nanopartículas pueden ser nanopartículas de liposomas, tales como las descritas en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130129636. Como ejemplo no limitante, el liposoma puede comprender ácido gadolinio(III)2-{4,7-bis-carboximetil-10-[(N,N-diestearilamidometil-N'-amido-metil]-1,4,7,10-tetra-azaciclododec-1-il}-acético y un componente de fosfolípido neutro completamente saturado (véase, p. ej., la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130129636).
En un aspecto, las nanopartículas que se pueden usar en la presente divulgación se forman mediante los métodos descritos en la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130130348.
Las nanopartículas de la presente divulgación pueden incluir además nutrientes tales como, pero no limitados a, aquellos cuyas deficiencias pueden dar lugar a riesgos para la salud desde anemia hasta defectos del tubo neural. Véanse, p. ej., las nanopartículas descritas en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013072929; véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150224035. Como ejemplo no limitante, el nutriente es hierro en forma de sales ferrosas, férricas o hierro elemental, yodo, ácido fólico, vitaminas o micronutrientes.
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en una nanopartícula hinchable. La nanopartícula hinchable puede ser, pero no se limita a, las descritas en la Patente de EE. UU. No. 8.440.231. Como un aspecto no limitante, la nanopartícula hinchable se usa para administrar los polinucleótidos de la presente divulgación al sistema pulmonar (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 8.440.231).
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en nanopartículas polianhídridas tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Patente de EE. UU. No. 8.449.916.
Las nanopartículas y micropartículas de la presente divulgación pueden diseñarse geométricamente para modular la respuesta inmune y/o de macrófagos. En un aspecto, las partículas diseñadas geométricamente pueden tener formas, tamaños y/o cargas superficiales variadas con el fin de incorporar los polinucleótidos de la presente divulgación para la administración dirigida tal como, pero no limitada a, administración pulmonar (véase, p. ej., la Publicación Internacional No. WO2013082111). Otras características físicas que las partículas diseñadas geométricamente pueden tener incluyen, pero no se limitan a, fenestraciones, brazos en ángulo, asimetría y rugosidad de la superficie, carga que pudiera alterar las interacciones con las células y los tejidos. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas de la presente divulgación se preparan por los métodos descritos en la Publicación Internacional No. WO2013082111 (véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150037428).
En un aspecto, las nanopartículas de la presente divulgación son nanopartículas solubles en agua tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Publicación Internacional No. WO2013090601 (véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20130184444). Las nanopartículas pueden ser nanopartículas inorgánicas que tienen un ligando zwitteriónico y compacto con el fin de mostrar una buena solubilidad en agua. Las nanopartículas también pueden tener diámetros hidrodinámicos (HD) pequeños, estabilidad con respecto al tiempo, pH, y salinidad y un nivel bajo de unión a proteínas no específicas.
En un aspecto, las nanopartículas de la presente divulgación se desarrollan por los métodos descritos en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130172406.
En un aspecto, las nanopartículas de la presente divulgación son nanopartículas furtivas o nanopartículas furtivas específicas de la diana, tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130172406. Las nanopartículas de la presente divulgación pueden prepararse por los métodos descritos en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130172406.
En otro aspecto, las nanopartículas furtivas o furtivas específicas de la diana comprenden una matriz polimérica. La matriz polimérica puede comprender dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, poliésteres, polianhídridos, poliéteres, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos, policianoacrilatos o combinaciones de los mismos.
En un aspecto, la nanopartícula es una estructura híbrida de nanopartícula-ácido nucleico que tiene una capa de ácido nucleico de alta densidad. Como ejemplo no limitante, la estructura híbrida de nanopartícula-ácido nucleico se prepara por los métodos descritos en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130171646. La nanopartícula puede comprender un ácido nucleico, tal como, pero no limitado a, los polinucleótidos descritos en la presente memoria y/o conocidos en la técnica.
Al menos una de las nanopartículas de la presente divulgación puede estar incluida en el núcleo de una nanoestructura o recubrirse con una estructura 3D porosa de densidad baja o recubrimiento que sea capaz de portar o asociarse con al menos una carga útil dentro o en la superficie de la nanoestructura. Se describen ejemplos no limitantes de nanoestructuras que comprenden al menos una nanopartícula en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013123523. Véase también la Publ. de Solic. de Pat. de EE. UU. No. US20150037249.
Hialuronidasa
La inyección localizada intramuscular, intratumoral o subcutánea de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, puede incluir hialuronidasa, que cataliza la hidrólisis de hialuronano.
Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un constituyente de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del hialuronano, lo que aumenta la permeabilidad del tejido (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Es útil para agilizar su dispersión y distribución sistémica de proteínas codificadas producidas por células transfectadas. Alternativamente, la hialuronidasa puede usarse para aumentar el número de células expuestas a un polinucleótido de la divulgación administrado por vía intramuscular, intratumoral o subcutánea.
Miméticos de Nanopartículas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se puede encapsular en y/o absorberse en un mimético de nanopartículas. Un mimético de nanopartículas puede mimetizar la función de administración de organismos o partículas tales como, pero no limitados a, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos de la divulgación pueden encapsularse en una partícula que no sea un virión que puede mimetizar la función de administración de un virus (véase la Pub. Internacional. No. WO2012006376 y las Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130171241 y US20130195968).
Nanotubos
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se puede ligar o unir de otro modo a al menos un nanotubo tal como, pero no limitado a, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases gemelas con un conector, nanotubos de carbono y/o nanotubos de carbono de pared simple. Los polinucleótidos se pueden unir a los nanotubos a través de fuerzas tales como, pero no limitadas a, fuerzas estéricas, iónicas, covalentes y/u otras. Los nanotubos y las formulaciones de nanotubos que comprenden polinucleótidos se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/027077 (publicada como WO2014152211).
Nanopartículas Autoensambladas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en nanopartículas autoensambladas. Las nanopartículas autoensambladas de ácido nucleico se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/027077 (publicada como WO2014152211), tal como en los párrafos [000740]-[000743]. Las nanopartículas autoensambladas basadas en polímeros se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/027077. Véase también la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20160038612.
Macromoléculas Autoensambladas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en macromoléculas anfifílicas (AM) para su administración. Las AM comprenden polímeros anfifílicos biocompatibles que tienen una estructura principal de azúcar alquilado unida covalentemente a poli(etilenglicol). En solución acuosa, las AM se autoensamblan para formar micelas. Se describen ejemplos no limitantes de métodos para formar AM y AM en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130217753.
Nanopartículas Inorgánicas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en nanopartículas inorgánicas (Pat. de EE. UU. No. 8.257.745). Las nanopartículas inorgánicas pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias arcillosas que se hinchan con agua. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas inorgánicas incluyen arcillas de esmectita sintéticas que se preparan a partir de silicatos simples (Véanse p. ej., las Pat. de EE. UU. No. 5.585.108 y 8.257.745).
En algunos aspectos, las nanopartículas inorgánicas comprenden un núcleo de los polinucleótidos divulgados en la presente memoria y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en la presente memoria y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger a los polinucleótidos en el núcleo.
Nanopartículas Semiconductoras y Metálicas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en nanopartículas dispersables en agua que comprenden un material semiconductor o metálico (Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20120228565) o formarse en una nanopartícula magnética (Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20120265001 y US20120283503). Las nanopartículas dispersables en agua pueden ser nanopartículas hidrófobas o nanopartículas hidrófilas.
En algunos aspectos, las nanopartículas semiconductoras y/o metálicas pueden comprender un núcleo de los polinucleótidos descritos en esta invención y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en la presente memoria y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger a los polinucleótidos en el núcleo.
Selladores Quirúrgicos: Geles e Hidrogeles
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se encapsulan en cualquier hidrogel conocido en la técnica que forma un gel cuando se inyecta en un sujeto. Los selladores quirúrgicos tales como geles e hidrogeles se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2014/027077.
Formulaciones en suspensión
En algunos aspectos, se proporcionan formulaciones en suspensión que comprenden polinucleótidos, depósitos de aceite inmiscibles en agua, tensioactivos y/o cotensioactivos y/o codisolventes. Las combinaciones de aceites y tensioactivos pueden permitir la formulación en suspensión con polinucleótidos. La administración de polinucleótidos en un depósito inmiscible en agua se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad mediante la liberación sostenida de ARNm desde el depósito al entorno fisiológico circundante e impedir la degradación de los polinucleótidos por nucleasas.
En algunos aspectos, las formulaciones en suspensión de ARNm se preparan usando combinaciones de polinucleótidos, soluciones de base oleosa y tensioactivos. Dichas formulaciones se pueden preparar como un sistema de dos partes que comprende una fase acuosa que comprende polinucleótidos y una fase de base oleosa que comprende aceite y tensioactivos. Los aceites ilustrativos para formulaciones en suspensión pueden incluir, pero no se limitan a, aceite de sésamo y Miglyol (que comprende ésteres de ácidos grasos caprílico y cáprico derivados de aceite de coco y palmiste saturado y glicerina o propilenglicol), aceite de maíz, aceite de soja, aceite de cacahuete, cera de abejas y/o aceite de semilla de palma. Los tensioactivos ilustrativos pueden incluir, pero no se limitan a, Cremophor, polisorbato 20, polisorbato 80, polietilenglicol, transcutol, CAPMUL®, labrasol, miristato de isopropilo y/o Span 80. En algunos aspectos, las suspensiones pueden comprender codisolventes incluyendo, pero no limitados a, etanol, glicerol y/o propilenglicol.
Las suspensiones se pueden formar preparando primero una formulación de polinucleótidos que comprende una solución acuosa de polinucleótido y una fase de base oleosa que comprende uno o más tensioactivos. La formación de la suspensión se produce como resultado de la mezcla de las dos fases (acuosa y de base oleosa). En algunos aspectos, dicha suspensión se puede suministrar a una fase acuosa para formar una emulsión de aceite en agua. En algunos aspectos, la administración de una suspensión a una fase acuosa da lugar a la formación de una emulsión de aceite en agua en la que la fase de base oleosa que comprende polinucleótidos forma gotitas que pueden variar en tamaño desde gotitas de tamaño nanométrico hasta gotitas de tamaño micrométrico. En algunos aspectos, se pueden utilizar combinaciones específicas de aceites, tensioactivos, cotensioactivos y/o codisolventes para suspender los polinucleótidos en la fase oleosa y/o para formar emulsiones de aceite en agua tras la administración en un entorno acuoso.
En algunos aspectos, las suspensiones proporcionan la modulación de la liberación de polinucleótidos en el entorno circundante. En dichos aspectos, la liberación de polinucleótidos puede modularse por difusión desde un depósito inmiscible en agua seguido de resolubilización en un entorno circundante (p. ej., un entorno acuoso).
En algunos aspectos, los polinucleótidos en un depósito inmiscible en agua (p. ej., suspendidos en una fase oleosa) dan lugar a una estabilidad alterada de los polinucleótidos (p. ej., degradación alterada por nucleasas).
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan de manera que tras la inyección, se forme una emulsión espontáneamente (p. ej., cuando se administra a una fase acuosa). Dicha formación de partículas puede proporcionar una alta relación de área superficial a volumen para la liberación de polinucleótidos desde una fase oleosa a una fase acuosa.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en una nanoemulsión tal como, pero no limitada a, las nanoemulsiones descritas en la Patente de EE. UU. No. 8.496.945. Las nanoemulsiones pueden comprender nanopartículas descritas en la presente memoria. Como ejemplo no limitante, las nanopartículas pueden comprender un núcleo hidrófobo líquido que puede estar rodeado o recubierto con una capa de lípido o tensioactivo. La capa de lípido o tensioactivo puede comprender al menos un péptido de integración de membrana y también puede comprender un ligando de direccionamiento (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 8.496.945).
Cationes y Aniones
Las formulaciones de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden incluir cationes o aniones. En algunos aspectos, las formulaciones incluyen cationes metálicos tales como, pero no limitados a, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+ y combinaciones de los mismos. Como ejemplo no limitante, las formulaciones incluyen polímeros y polinucleótidos en complejo con un catión metálico (véanse, p. ej., las Pat de EE. UU. No. 6.265.389 y 6.555.525).
En algunos aspectos, las nanopartículas catiónicas que comprenden combinaciones de cationes divalentes y monovalentes se formulan con polinucleótidos. Dichas nanopartículas pueden formarse espontáneamente en solución durante un período determinado (p. ej., horas, días, etc.). Dichas nanopartículas no se forman en presencia de cationes divalentes solos o en presencia de cationes monovalentes solos. El suministro de polinucleótidos en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprenden nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad de los polinucleótidos al actuar como un depósito de acción prolongada y/o reduciendo la tasa de degradación por nucleasas.
Nanopartículas y Micropartículas Moldeadas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en nanopartículas y/o micropartículas. Como ejemplo, las nanopartículas y/o micropartículas se pueden preparar utilizando la tecnología PRINT® de LIQUIDA TECHNOLOGIES® (Morrisville, NC) (véase, p. ej., la Pub. Internacional No. WO2007024323).
En algunos aspectos, las nanopartículas comprenden un núcleo de los polinucleótidos divulgados en la presente memoria y una coraza de polímero. La coraza de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en la presente memoria y son conocidos en la técnica. En un aspecto adicional, la coraza de polímero se puede usar para proteger a los polinucleótidos en el núcleo.
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en micropartículas. Las micropartículas pueden contener un núcleo de los polinucleótidos y una corteza de un polímero biodegradable y/o biocompatible. Como ejemplo no limitante, las micropartículas que se pueden usar con la presente divulgación pueden ser las descritas en la Patente de EE. UU. No. 8.460.709, la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130129830 y Publicación de Patente Internacional No. WO2013075068. Como otro ejemplo no limitante, las micropartículas pueden diseñarse para prolongar la liberación de los polinucleótidos de la presente divulgación durante un período de tiempo deseado (véase, p. ej., liberación prolongada de una proteína terapéutica en la Publ. de Solic. de Patente de EE. UU. No. US20130129830).
NanoJackets y NanoLiposomas
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en NanoJackets y NanoLiposomas por Keystone Nano (State College, PA). Las NanoJackets están hechas de compuestos que se encuentran naturalmente en el cuerpo, incluyendo calcio, fosfato y también pueden incluir una pequeña cantidad de silicatos. Las Nanojackets pueden variar en tamaño de 5 a 50 nm y se pueden usar para administrar compuestos hidrófilos e hidrófobos tales como, pero no limitados a, polinucleótidos.
Los NanoLiposomas están hechos de lípidos tales como, pero no limitados a, lípidos que se encuentran naturalmente en el cuerpo. Los NanoLiposomas pueden variar en tamaño de 60-80 nm y se pueden usar para administrar compuestos hidrófilos e hidrófobos tales como, pero no limitados a, polinucleótidos. En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L se formulan en un NanoLiposoma tal como, pero no limitado a, NanoLiposomas de ceramida.
Minicélulas
En un aspecto, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden formularse en minicélulas bacterianas. Como ejemplo no limitante, las minicélulas bacterianas son las descritas en la Publicación Internacional No. WO2013088250 o la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130177499. Las minicélulas bacterianas que comprenden agentes terapéuticos tales como los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden usarse para administrar los agentes terapéuticos a los tumores cerebrales.
Composiciones Semisólidas
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan con una matriz hidrófoba para formar una composición semisólida. Como ejemplo no limitante, la composición semisólida o la composición similar a una pasta se prepara mediante los métodos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO201307604. La composición semisólida puede ser una formulación de liberación sostenida como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO201307604.
En otro aspecto, la composición semisólida tiene además una membrana microporosa o un polímero biodegradable formado alrededor de la composición (véase p. ej., la Publicación de Patente Internacional No. WO201307604).
La composición semisólida que usa el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, puede tener las características de la mezcla semisólida como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO201307604 (p. ej., un módulo de elasticidad de al menos 10'4 N m irr2, y/o una viscosidad de al menos 100 mPas).
Exosomas
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en exosomas. Los exosomas pueden cargarse con al menos un polinucleótido y administrarse a células, tejidos y/u organismos. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, pueden cargarse en los exosomas descritos en la Publicación Internacional No. W02013084000.
Administración Basada en Seda
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en un sistema de administración basado en seda de liberación sostenida. El sistema de administración basado en seda se puede formar poniendo en contacto una solución de fibroína de seda con un agente terapéutico tal como, pero no limitado a, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos. Como ejemplo no limitante, el sistema de administración basado en seda de liberación sostenida que se puede usar en la presente divulgación y los métodos para preparar dicho sistema se describen en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20130177611.
Micropartículas
En algunos aspectos, las formulaciones que comprenden un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, comprenden micropartículas. Las micropartículas pueden comprender un polímero descrito en la presente memoria y/o conocido en la técnica tal como, pero no limitado a, poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido. La micropartícula puede tener superficies adsorbentes para adsorber moléculas biológicamente activas tales como polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, las micropartículas para usar con la presente divulgación y los métodos para preparar micropartículas se describen en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US2013195923 y US20130195898 y la Patente de EE. UU. No.
8.309.139 y 8.206.749.
En otro aspecto, la formulación es una microemulsión que comprende micropartículas y polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, las microemulsiones que comprenden micropartículas se describen en las Publicaciones de Patente de EE. UU. No. 2013195923 y 20130195898 y las Patentes de EE. UU. No 8.309.139 y 8.206.749.
Lípidos de Aminoácido
En algunos aspectos, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se formulan en lípidos de aminoácidos. Los lípidos de aminoácidos son compuestos lipófilos que comprenden un residuo de aminoácido y una o más colas lipófilas. Los ejemplos no limitantes de lípidos de aminoácidos y métodos para preparar lípidos de aminoácidos se describen en la Patente de EE. UU. No. 8.501.824.
En algunos aspectos, los lípidos de aminoácidos tienen una parte hidrófila y una parte lipófila. La parte hidrófila puede ser un residuo de aminoácido y una parte lipófila puede comprender al menos una cola lipófila.
En algunos aspectos, las formulaciones de lípidos de aminoácidos se usan para administrar los polinucleótidos a un sujeto.
En otro aspecto, las formulaciones de lípidos de aminoácidos administran un polinucleótido en forma liberable que comprende un lípido de aminoácido que se une y libera los polinucleótidos. Como ejemplo no limitante, la liberación de los polinucleótidos puede proporcionarse mediante un conector lábil en ácido tal como, pero no limitado a, los descritos en las Patentes de EE. UU. No. 7.098.032, 6.897.196, 6.426.086, 7.138.382, 5.563.250, y 5.505.931.
Microvesículas
En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/o OX40L se formulan en microvesículas. Los ejemplos no limitantes de microvesículas incluyen las descritas en US20130209544.
En algunos aspectos, la microvesícula es una microvesícula mediada por ARRDC1 (ARMM). Los ejemplos no limitantes de ARMM y métodos para preparar ARMM se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013119602.
Complejos de Interpolielectrolitos
En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se formulan en un complejo de interpolielectrolitos. Los complejos de interpolielectrolitos se forman cuando los polímeros dinámicos de carga forman complejos con una o más moléculas aniónicas. Los ejemplos no limitantes de polímeros de carga dinámica y complejos de interpolielectrolitos y métodos para preparar complejos de interpolielectrolitos se describen en la Patente de EE. UU. No. 8.524.368.
Sistemas Poliméricos Cristalinos
En algunos aspectos, los polinucleótidos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L se formulan en sistemas poliméricos cristalinos. Los sistemas poliméricos cristalinos son polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos. Los ejemplos no limitantes de polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos denominados "polímeros CYC", sistemas de polímeros cristalinos y métodos para preparar dichos polímeros y sistemas se describen en la Patente de EE. UU. No. 8.524.259.
Excipientes
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, tal y como se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, todos y cualquiera de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes, agentes aromatizantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, agentes de ajuste del pH y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). El uso de un medio excipiente convencional puede contemplarse dentro del alcance de la presente divulgación, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como al producir algún efecto biológico indeseable o al interactuar de otra manera de forma nociva con cualquier otro(s) componente(s) de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta divulgación.
En algunos aspectos, un excipiente farmacéuticamente aceptable tiene una pureza de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 %. En algunos aspectos, un excipiente está aprobado para su uso en seres humanos y para uso veterinario. En algunos aspectos, un excipiente puede estar aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE.UU. En algunos aspectos, un excipiente puede ser de calidad farmacéutica. En algunos aspectos, un excipiente puede cumplir con los estándares de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Dichos excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas. La composición también puede incluir excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y/o agentes perfumantes.
Los diluyentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrógenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes de granulación y/o dispersión ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinil-pirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (p. ej., acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (p. ej., bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (p. ej., alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (p. ej., carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (p. ej., carboximetilcelulosa de sodio, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (p. ej., monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEEN®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [SPAN®60], triestearato de sorbitán [SPAN®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (p. ej., monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (p. ej., CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (p. ej., éter laurílico de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, laurilsulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato de sodio, etc. y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes aglutinantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, almidón (p. ej., almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (p. ej., sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol); aminoácidos (p. ej., glicina); gomas naturales y sintéticas (p. ej., acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), y arabogalactano de lárice); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.
Los conservantes ilustrativos pueden incluir, pero no se limitan a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos, y/u otros conservantes. La oxidación es una vía de degradación potencial del ARNm, especialmente para las formulaciones líquidas de ARNm. Para prevenir la oxidación, se pueden agregar antioxidantes a la formulación. Los antioxidantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, EDTA, m-cresol, metionina, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tioglicerol y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes ilustrativos incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Los conservantes antifúngicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero no se limitan a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.
En algunos aspectos, el pH de las soluciones de polinucleótidos se mantiene entre pH 5 y pH 8 para mejorar la estabilidad. Los tampones ilustrativos para controlar el pH pueden incluir, pero no se limitan a, fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, histidina (o histidina-HCl), carbonato de sodio, y/o malato de sodio. En otro aspecto, los tampones ilustrativos enumerados anteriormente pueden usarse con contraiones monovalentes adicionales (que incluyen, pero no se limitan a, potasio). También pueden usarse cationes divalentes como contraiones tampón; sin embargo, estos no son los preferidos debido a la formación de complejos y/o degradación del ARNm.
Los agentes tamponadores ilustrativos también pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes lubricantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.
Los aceites ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, aceites de almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de grosella negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, oliva, naranja, pargo, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, cacahuete, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, satureja, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y germen de trigo. Los aceites ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona, y/o combinaciones de los mismos.
Los excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.
Los aditivos ilustrativos incluyen tampones fisiológicamente biocompatibles (p. ej., hidrocloruro de trimetilamina), adición de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (como por ejemplo calcio DTPA, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio). Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.
Crioprotectores para ARNm
En algunos aspectos, las formulaciones de polinucleótidos comprenden crioprotectores. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "crioprotector" se refiere a uno o más agentes que, cuando se combinan con una sustancia dada, ayudan a reducir o eliminar el daño a esa sustancia que se produce al congelarse. En algunos aspectos, los crioprotectores se combinan con polinucleótidos con el fin de estabilizarlos durante la congelación. El almacenamiento congelado de ARNm entre -20 °C y -80 °C puede ser ventajoso para la estabilidad a largo plazo (p. ej., 36 meses) del polinucleótido. En algunos aspectos, se incluyen crioprotectores en las formulaciones de polinucleótidos para estabilizar el polinucleótido a través de ciclos de congelación/descongelación y en condiciones de almacenamiento congelado. Los crioprotectores de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, lactosa, glicerol, dextrosa, rafinosa y/o manitol. La trehalosa figura en la lista de la Administración de Fármacos y Alimentos como generalmente considerada segura (GRAS) y se usa comúnmente en formulaciones farmacéuticas comerciales.
Agentes de Carga
En algunos aspectos, las formulaciones de polinucleótidos comprenden agentes de carga. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agente de carga" se refiere a uno o más agentes incluidos en las formulaciones para transmitir una consistencia deseada a la formulación y/o estabilización de los componentes de la formulación. En algunos aspectos, se incluyen agentes de carga en formulaciones de polinucleótidos liofilizadas para producir una torta "farmacéuticamente elegante", que estabiliza los polinucleótidos liofilizados durante el almacenamiento a largo plazo (p. ej., 36 meses). Los agentes de carga de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, aspectos de sacarosa, trehalosa, manitol, glicina, lactosa y/o rafinosa. En algunos aspectos, las combinaciones de crioprotectores y agentes de carga (por ejemplo, sacarosa/glicina o trehalosa/manitol) puede incluirse tanto para estabilizar los polinucleótidos durante la congelación como para proporcionar un agente de carga para la liofilización.
También se proporcionan ejemplos no limitantes de formulaciones y métodos para formular los polinucleótidos de la presente divulgación en la Publicación Internacional No. WO2013090648 presentada el 14 de diciembre de 2012.
Administración Desnuda
El polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, pueden administrarse a una célula (p. ej., a una célula tumoral) en forma desnuda. Tal y como se usa en la presente memoria, "desnudo" se refiere a administrar polinucleótidos libres de agentes que promuevan la transfección. Por ejemplo, los polinucleótidos administrados a la célula, p. ej., célula tumoral, pueden no contener modificaciones. Los polinucleótidos desnudos que comprenden un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18, y/u OX40L pueden administrarse a la célula tumoral utilizando rutas de administración conocidas en la técnica, p. ej., administración intratumoral, y descritas en la presente memoria.
Administración Parenteral e Inyectable
Las formas de dosificación líquidas para administración parenteral, p. ej., intratumoral, incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes. En determinados aspectos, para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros, y/o combinaciones de los mismos.
Una composición farmacéutica para administración parenteral, p. ej., administración intratumoral, puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados puede haber sido aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos (FDA) de los EE. UU. Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para su uso en composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluye ácido clorhídrico, manitol, nitrógeno, acetato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio.
Se pueden formular las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida utilizando agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer, U.S.P., y la solución isotónica de cloruro de sodio. Convencionalmente, se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables. La formulación estéril también puede comprender adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores.
Las formulaciones inyectables, p. ej., intratumoral, se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Las formulaciones inyectables, p. ej., intratumoral, pueden ser para inyección directa en una región de un tejido, órgano y/o sujeto, p. ej., tumor.
Con el fin de prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo de la inyección intratumoral. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Formas de Dosificación
Una composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede formularse en una forma de dosificación descrita en la presente memoria, tal como tópica, intranasal, intratraqueal o inyectable (p. ej., intravenosa, intratumoral, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal, subcutánea).
Formas de Dosificación Líquidas
Las formas de dosificación líquidas para administración parenteral (p. ej., intratumoral) incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. En ciertos aspectos, para administración parenteral, las composiciones pueden mezclarse con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros, y/o combinaciones de los mismos.
Inyectables
Se pueden formular las preparaciones inyectables (p. ej., intratumoral), por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida y pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se incluyen, pero no se limitan a, el agua, la solución de Ringer, U.SP., y la solución isotónica de cloruro de sodio. Convencionalmente, se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Con el fin de prolongar el efecto de un ingrediente activo, puede ser deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción de los polinucleótidos depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un polinucleótido administrado por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo los polinucleótidos en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microencapsulación de los polinucleótidos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de polinucleótidos respecto al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberación del polinucleótido. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen, pero no se limitan a, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables pueden prepararse atrapando los polinucleótidos en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Métodos de Administración Intratumoral
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria son adecuadas para la administración a tumores. El término "tumor" se usa en la presente memoria en un sentido amplio y se refiere a cualquier nuevo crecimiento anormal de tejido que no posee ninguna función fisiológica y surge de una proliferación celular incontrolada, normalmente rápida. El término "tumor", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere tanto a tumores benignos como a tumores malignos.
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un método para administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, a un tumor que comprende formular el polinucleótido en la composición farmacéutica descrita en la presente memoria, p. ej., en forma de nanopartículas lipídicas, y administrar la composición farmacéutica a un tumor. La administración de la composición farmacéutica al tumor se puede realizar utilizando cualquier método conocido en la técnica (p. ej., inyección en bolo, perfusión, implantación quirúrgica, etc.).
La administración del polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, solo o en combinación, a un tumor usando composiciones farmacéuticas para administración intratumoral divulgadas en la presente memoria puede:
(i) aumentar la retención del polinucleótido en el tumor;
(ii) aumentar los niveles de polipéptido expresado en el tumor en comparación con los niveles de polipéptido expresado en tejido peritumoral;
(iii) disminuir la fuga del polinucleótido o producto expresado al tejido no diana (p. ej., tejido peritumoral o a localizaciones distantes, p. ej., tejido hepático); o,
(iv) cualquier combinación de los mismos,
en donde el aumento o disminución observado para una determinada propiedad es relativo a una composición de referencia correspondiente (p. ej., una composición en la que los compuestos de fórmula (I) no están presentes o han sido sustituidos por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3).
En un aspecto, una disminución de la fuga se puede cuantificar como un aumento en la relación de la expresión de polipéptido en el tumor respecto a la expresión de polipéptido en tejidos no tumorales, tales como tejido peritumoral u otro tejido u órgano, p. ej., tejido hepático.
La administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o una combinación de los mismos, a un tumor implica la administración de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, p. ej., en forma de nanopartículas, incluyendo el polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, IL-18 y/u OX40L a un sujeto, donde la administración de la composición farmacéutica implica poner en contacto el tumor con la composición.
En el caso de que el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, sea un ARNm, al poner en contacto una célula en el tumor con la composición farmacéutica, un ARNm traducible puede traducirse en la célula para producir un polipéptido de interés. Sin embargo, los ARNm que sustancialmente no son traducibles también se pueden administrar a los tumores. Los ARNm sustancialmente no traducibles pueden ser útiles como vacunas y/o pueden secuestrar componentes de la traducción de una célula para reducir la expresión de otras especies en la célula.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria pueden aumentar la administración específica. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administración específica" significa la administración de más (p. ej., al menos 1,5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, mediante la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria (p. ej., en forma de nanopartículas) a un tejido diana de interés (p. ej., un tumor) en comparación con un tejido no diana (p. ej., hígado de mamífero).
El nivel de administración de una nanopartícula a un tejido particular se puede medir, por ejemplo, comparando
(i) la cantidad de proteína expresada a partir de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en un tejido con el peso de dicho tejido;
(ii) comparando la cantidad del polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido; o
(iii) comparando la cantidad de proteína expresada a partir de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en un tejido con la cantidad total de proteína en dicho tejido.
La administración específica a un tumor o una clase particular de células en el tumor implica que una mayor proporción de la composición farmacéutica que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma, y/u OX40L se administra al destino diana (p. ej., tejido diana) en relación con otros destinos fuera de la diana tras la administración de una composición farmacéutica a un sujeto.
Métodos para Mejorar la Administración Intratumoral
La presente divulgación también proporciona métodos para lograr una administración intratumoral mejorada de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, cuando se administra a un tumor una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria (p. ej., en forma de nanopartículas). La mejora en la administración puede deberse, por ejemplo, a
(i) retención aumentada de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en el tumor;
(ii) niveles aumentados de polipéptido expresado en el tumor en comparación con los niveles de polipéptido expresado en tejido peritumoral;
(iii) fuga disminuida del polinucleótido o producto expresado al tejido no diana (p. ej., tejido peritumoral o a localizaciones distantes, p. ej., tejido hepático); o,
(iv) cualquier combinación de los mismos,
en donde el aumento o disminución observado para una determinada propiedad es relativo a una composición de referencia correspondiente (p. ej., una composición en la que los compuestos de fórmula (I) no están presentes o han sido sustituidos por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3).
En un aspecto, una disminución de la fuga se puede cuantificar como un aumento en la relación de la expresión de polipéptido en el tumor respecto a la expresión de polipéptido en tejidos no tumorales, tales como tejido peritumoral u otro tejido u órgano, p. ej., tejido hepático.
Otra mejora en la administración provocada como resultado del uso de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria es una reducción de la respuesta inmune con respecto a la respuesta inmune observada cuando se utilizan otros componentes lipídicos para administrar el mismo agente terapéutico o polinucleótido que codifica un agente terapéutico.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la retención de un agente terapéutico (p. ej., un polipéptido administrado como parte de la composición farmacéutica) en un tejido tumoral en un sujeto, que comprende administrar intratumoralmente al tejido tumoral una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la retención del agente terapéutico en el tejido tumoral aumenta en comparación con la retención del agente terapéutico en el tejido tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
También se proporciona un método para aumentar la retención de un polinucleótido en un tejido tumoral en un sujeto, que comprende administrar intratumoralmente al tejido tumoral una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la retención del polinucleótido en el tejido tumoral aumenta en comparación con la retención del polinucleótido en el tejido tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
También se proporciona un método para aumentar la retención de un polipéptido expresado en un tejido tumoral en un sujeto, que comprende administrar al tejido tumoral una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido expresado, y en donde la retención del polipéptido expresado en el tejido tumoral aumenta en comparación con la retención del polipéptido en el tejido tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
La presente divulgación también proporciona un método para disminuir la fuga de expresión de un polinucleótido administrado intratumoralmente a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar dicho polinucleótido intratumoralmente al tejido tumoral como una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde el nivel de expresión del polipéptido en tejido no tumoral disminuye en comparación con el nivel de expresión del polipéptido en tejido no tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
También se proporciona un método para disminuir la fuga de expresión de un agente terapéutico (p. ej., un polipéptido administrado como parte de la composición farmacéutica) administrado intratumoralmente a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar dicho agente terapéutico intratumoralmente al tejido tumoral como una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la cantidad de agente terapéutico en tejido no tumoral disminuye en comparación con la cantidad de agente terapéutico en tejido no tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
También se proporciona un método para disminuir la fuga de expresión de un polipéptido expresado en un tumor en un sujeto, que comprende administrar al tejido tumoral una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido expresado, y en donde la cantidad del polipéptido expresado en el tejido no tumoral disminuye en comparación con la cantidad del polipéptido expresado en el tejido no tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente.
En algunos aspectos, el tejido no tumoral es tejido peritumoral. En otros aspectos, el tejido no tumoral es tejido hepático.
La presente divulgación también proporcionó un método para reducir o prevenir la respuesta inmune provocada por la administración intratumoral de una composición farmacéutica, p. ej., una composición farmacéutica que comprende lípidos conocidos en la técnica, reemplazando uno o todos los lípidos en dicha composición con un compuesto de Fórmula (I). Por ejemplo, la respuesta inmune causada por la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en una composición farmacéutica que comprende MC3 (u otros lípidos conocidos en la técnica) se puede prevenir (evitar) o mejorar reemplazando MC3 con un compuesto de Fórmula (I), p. ej., el Compuesto 18.
En algunos aspectos, la respuesta inmune observada después de que se administra un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación del mismo, en una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria no se eleva en comparación con la respuesta inmune observada cuando el agente terapéutico o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un El ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos, se administra en solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otra solución de tampón fisiológico (p. ej., solución de Ringer, solución de Tyrode, solución salina equilibrada de Hank, etc.).
En algunos aspectos, la respuesta inmune observada después de que se administra un agente terapéutico o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación del mismo, en una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria no se eleva en comparación con la respuesta inmune observada cuando se administra solo PBS u otra solución tampón fisiológica.
En algunos aspectos, no se observa una respuesta inmune cuando una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria se administra intratumoralmente a un sujeto.
Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona un método para administrar un agente terapéutico o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar intratumoralmente al sujeto una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria, en donde la respuesta inmune provocada por la administración de la composición farmacéutica no se eleva en comparación con la respuesta inmune provocada por la administración intratumoral de
(i) PBS solo u otra solución tampón fisiológica (p. ej., solución de Ringer, solución de Tyrode, solución salina equilibrada de Hank, etc.);
(ii) el agente terapéutico o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, en PBS u otra solución de tampón fisiológico; o el agente terapéutico o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polinucleótido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L en PBS u otra solución tampón fisiológica; o,
(iii) una composición de referencia correspondiente, es decir, la misma composición farmacéutica en la que el compuesto de Fórmula (I) se sustituye por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3.
XIII. Kits y Dispositivos
Kits
La divulgación proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los métodos o composiciones de la presente divulgación. Típicamente, los kits comprenderán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos y/o realice múltiples experimentos.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden los polinucleótidos de aspectos de la divulgación. En algunos aspectos, el kit comprende uno o más polinucleótidos.
Los kits pueden ser para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, y/o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L. El kit puede comprender además el envase e instrucciones y/o un agente de administración para formar una composición de formulación. El agente de administración puede comprender una solución salina, una solución tamponada, un lipidoide o cualquier agente de administración divulgado en la presente memoria.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un kit que comprende un contenedor que comprende una composición de polinucleótidos (p. ej., un ARNm) o una nanopartícula lipídica que comprende polinucleótidos como (p. ej., ARNm) como se divulga en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración de la nanopartícula lipídica o composición farmacéutica para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En algunos aspectos, el prospecto comprende además instrucciones para la administración de la composición farmacéutica en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo.
En otros aspectos, la divulgación proporciona un kit que comprende un medicamento que comprende una nanopartícula lipídica que comprende polinucleótidos (p. ej., ARNm) como se divulga en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración del medicamento solo o en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de puntos de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En algunos aspectos, el kit comprende además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del primer medicamento y del segundo medicamento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo.
En aspectos relacionados, el polipéptido inhibidor de puntos de control inhibe PD1, PD-L1, CTLA4 o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA4, un anticuerpo anti-PD1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD1, un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, y una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo anti-PD-L1 seleccionado de atezolizumab, avelumab o durvalumab. En algunos aspectos, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo anti-CTLA-4 seleccionado de tremelimumab o ipilimumab. En algunos aspectos, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo anti-PD1 seleccionado de nivolumab o pembrolizumab.
En algunos aspectos, el kit comprende una solución tampón que incluye, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. En otro aspecto, la solución tampón incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5 %, sacarosa al 5 % con calcio 2 mM, manitol al 5 %, manitol al 5 % con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con manosa y calcio 2 mM (Véase, p. ej., la Pub. de EE. UU. No. 20120258046). En un aspecto adicional, la solución tampón se precipita o se liofiliza. La cantidad de cada componente puede variarse para permitir formulaciones tampón consistentes, reproducibles, simples o salinas, con mayor concentración. Los componentes también pueden variarse para aumentar la estabilidad del ARN modificado en la solución tampón durante un período de tiempo y/o en una variedad de condiciones. En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden: un polinucleótido que comprende una región traducible, proporcionado en una cantidad efectiva para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando se introduce en una célula diana; un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico inhibidor, proporcionado en una cantidad efectiva para inhibir sustancialmente la respuesta inmune innata de la célula; y envase e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 polipéptido, y/o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, en donde los polinucleótidos muestran una degradación reducida por una nucleasa celular, y envase e instrucciones.
En algunos aspectos, un único polinucleótido comprende (i) el ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, (ii) el ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o (iii) el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y el ARNm que codifica un polipéptido OX40L. En algunos aspectos, un único polinucleótido comprende el ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el ARNm que codifica una tercera proteína (p. ej., un polipéptido OX40L), o cualquier combinación de los mismos.
Dispositivos
La presente divulgación proporciona dispositivos que pueden incorporar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma. Por ejemplo, el dispositivo puede incorporar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos. Estos dispositivos contienen en una formulación estable los reactivos para sintetizar un polinucleótido en una formulación disponible para administrarse inmediatamente en aspectos a un sujeto que lo necesita, tal como un paciente humano. En algunos, un único polinucleótido comprende el ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma o un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de aspectos IL-18. En algunos, un único polinucleótido comprende el ARNm que codifica un polipéptido IL-23, el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, o el polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18, el ARNm que codifica un polipéptido OX40L, o cualquier combinación de los mismos.
Pueden emplearse dispositivos para la administración para administrar un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma, un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-18 y un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L de acuerdo con los regímenes de dosificación individuales, múltiples o divididos que se enseñan en la presente memoria. Dichos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación Internacional No. WO 2013151666 A2.
Se contempla el uso de métodos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos junto con los métodos y composiciones divulgados en la presente memoria como aspectos de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos métodos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, lúmenes o catéteres, así como dispositivos que utilizan mecanismos accionados por calor, corriente eléctrica o radiación.
Según la presente divulgación, estos dispositivos de administración múltiple pueden utilizarse para administrar las dosis únicas, múltiples o divididas contempladas en la presente memoria. Dichos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación Internacional No. WO 2013151666 A2.
Equivalentes y Alcance
En las reivindicaciones, los artículos tales como “un”, “una”, “el” y “la” pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, son empleados en o, de otra forma, son relevantes para un producto o proceso dado, a no ser que se indique lo contrario o que resulte evidente a partir del contexto. La divulgación incluye aspectos en los que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es de otra forma relevante para un producto o proceso dado. La divulgación incluye aspectos en los que más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otra forma relevantes para un producto o proceso dado.
También se indica que la expresión "que comprende" pretende ser abierta y permite, pero no requiere, la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando la expresión "que comprende" se usa en la presente memoria, también abarca y divulga, por tanto, la expresión "que consiste en".
Cuando se proporcionan rangos, se incluyen los puntos finales. Además, a no ser que se indique lo contrario o resulte evidente de otra manera a partir del contexto y la comprensión de un experto en la materia, se entiende que los valores que se expresan como rangos pueden asumir cualquier valor específico o subrango dentro de los rangos establecidos en diferentes aspectos de la divulgación, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del rango, a no ser que el contexto indique claramente otra cosa.
Además, debe entenderse que cualquier aspecto particular de la presente divulgación que quede comprendido dentro de la técnica anterior puede ser excluido explícitamente de una cualquiera o más de las reivindicaciones. Dado que dichos aspectos se consideran conocidos para un experto en la técnica, pueden excluirse, incluso si la exclusión no se establece explícitamente en la presente memoria. Cualquier aspecto particular de las composiciones de la divulgación (p. ej., cualquier ácido nucleico o proteína codificada por este; y cualquier método de producción; cualquier método de uso, etc.) puede excluirse de una cualquiera o más de las reivindicaciones, por cualquier razón, esté o no relacionado con la existencia de técnica anterior.
En el caso de enunciados contradictorios de una fuente citada y de la presente solicitud, prevalecerá el enunciado de la presente solicitud.
No se pretende que los encabezados de tablas y secciones sean limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Síntesis de Compuestos Según la Fórmula I
A. Consideraciones Generales
Todos los disolventes y reactivos usados se obtuvieron comercialmente y se usaron como tales a no ser que se indique otra cosa. Los espectros de 1H RMN se registraron en CDCb, a 300 K usando un instrumento Bruker Ultrashield 300 MHz. Los desplazamientos químicos se reportan como partes por millón (ppm) en relación con TMS (0,00) para 1H. Las cromatografías en gel de sílice se realizaron en ISCO CombiFlash Rf+ Lumen Instruments utilizando cartuchos ISCO RediSep Rf Gold Flash (tamaño de partícula: 20-40 micrómetros). Las cromatografías de fase inversa se realizaron en ISCO CombiFlash Rf+ Lumen Instruments usando columnas RediSep Rf Gold C18 de alto rendimiento. Se determinó que todos los compuestos finales tenían una pureza superior al 85 % mediante análisis por UPLC-MS de fase inversa (tiempos de retención, RT, en minutos) utilizando el instrumento Waters Acquity UPLC con DAD y ELSD y una columna ZORBAX de resolución rápida y alta definición (RRHD) SB-C18 LC, 2,1 mm, 50 mm, 1,8 pm y un gradiente del 65 al 100 % de acetonitrilo en agua con 0,1 % de TFA durante 5 minutos a 1,2 mL/min. El volumen de inyección fue de 5 pL y la temperatura de la columna fue de 80 °C. La detección se basó en la ionización por electropulverización (ESI) en modo positivo utilizando un espectrómetro de masas Waters SQD (Milford, MA, EE. UU.) y un detector de dispersión de luz evaporativa.
Los procedimientos representativos que se describen a continuación son útiles en la síntesis de los Compuestos 1-232.
En la presente memoria se emplean las siguientes abreviaturas:
THF: Tetrahidrofurano
DMAP: 4-Dimetilaminopiridina
LDA: Diisopropilamida de Litio
rt: Temperatura Ambiente
DME: 1,2-Dimetoxietano
n-BuLi: n-Butil litio
B. Compuesto 2: 8-((2-Hidroxietil)(tetradecil)amino) octanoato de heptadecan-9-ilo
Procedimiento Representativo 1:
Figure imgf000292_0001
S-cromooctancato ce
Figure imgf000292_0002
hectaiecan-s-ilc
S-üi^-hidrcxietiNamiroloctanoato da hectadecan-s-ilo
Figure imgf000292_0003
S-íU-ridrcxietil :tetradac ; a miro; ceta no ato de hepiadecan-s-ilo
8-Bromooctanoato de heptadecan-9-ilo (Método A)
Figure imgf000292_0004
A una solución de ácido 8-bromooctanoico (1,04 g, 4,6 mmoles) y heptadecan-9-ol (1,5 g, 5,8 mmoles) en diclorometano (20 mL) se añadió hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (1,1 g, 5,8 mmoles), N,N-diisopropiletilamina (3,3 mL, 18,7 mmoles) y DMAP (114 mg, 0,9 mmoles). La reacción se dejó con agitación a rt durante 18 h. La reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4. La capa orgánica se filtró y se evaporó in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-10 % de acetato de etilo en hexanos) para obtener 8-bromooctanoato de heptadecan-9-ilo (875 mg, 1,9 mmoles, 41 %).
1H RMN (300 MHz, CDCls) 5: ppm 4,89 (m, 1H); 3,42 (m, 2H); 2,31 (m, 2H); 1,89 (m, 2H); 1,73-1,18 (br. m, 36H); 0,88 (m, 6H).
8-((2-Hidroxietil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (Método B)
Figure imgf000292_0005
Una solución de 8-bromooctanoato de heptadecan-9-ilo (3,8 g, 8,2 mmoles) y 2-aminoetan-1-ol (15 mL, 248 mmoles) en etanol (3 mL) se dejó con agitación a 62 °C durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró in vacuo y el residuo se recogió en acetato de etilo y agua. La capa orgánica se separó y se lavó con agua, salmuera y se secó sobre Na2SO4. La mezcla se filtró y se evaporó in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-100 % (mezcla de 1 % de NH4OH, 20 % de MeOH en diclorometano) en diclorometano) para obtener 8-((2-hidroxietil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (3,1 g, 7 mmoles, 85 %). UPLC/ELSD: RT = 2,67 min. MS (ES): m/z (MH+) 442,68 para C27H55NO3
1H RMN (300 MHz, CDCls) 5: ppm 4,89 (p, 1H); 3,67 (t, 2H); 2,81 (t, 2H); 2,65 (t, 2H); 2,30 (t, 2H); 2,05 (br. m, 2H); 1,72-1,41 (br. m, 8H); 1,40-1,20 (br. m, 30H); 0,88 (m, 6H).
8-((2-Hidroxietil)(tetradecil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (Método C)
Figure imgf000292_0006
Peso Molecular: 638,12
Una solución de 8-((2-hidroxietil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (125 mg, 0,28 mmoles), 1-bromotetradecano (94 mg, 0,34 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (44 mg, 0,34 mmoles) en etanol se dejó con agitación a 65 °C durante 18 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y los solventes se evaporaron in vacuo. El residuo se recogió en acetato de etilo y bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-100 % (mezcla de 1 % de NH4OH, 20 % de MeOH en diclorometano) en diclorometano) para obtener 8-((2-hidroxietil)(tetradecil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (89 mg, 0,14 mmoles, 50 %). UPLC/ELSD: RT = 3,61 min. MS (ES): m/z (MH+) 638,91 para C41H83NO3.1H RMN (300 MHz, CDCI3) 5: ppm 4,86 (p, 1H); 3,72-3,47 (br. m, 2H); 2,78-2,40 (br. m, 5H); 2,28 (t, 2H); 1,70-1,40 (m, 10H); 1,38-1,17 (br. m, 54H); 0,88 (m, 9H).
Síntesis de intermedios:
Intermedio A: Ácido 2-octildecanoico
Figure imgf000293_0001
Una solución de diisopropilamina (2,92 mL, 20,8 mmoles) en THF (10 mL) se enfrió hasta -78 °C y se añadió una solución de n-BuLi (7,5 mL, 18,9 mmoles, 2,5 M en hexanos). La reacción se dejó calentar hasta 0 °C. A una solución de ácido decanoico (2,96 g, 17,2 mmoles) y NaH (754 mg, 18,9 mmoles, 60 % p/p) en THF (20 mL) a 0 °C se añadió la solución de LDA y la mezcla se dejó con agitación a rt durante 30 min. Después de este tiempo, se añadió 1-yodooctano (5 g, 20,8 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 45 °C durante 6 h. La reacción se inactivó con HCl 1N (10 mL). La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-20 % de acetato de etilo en hexanos) para rendir ácido 2-octildecanoico (1,9 g, 6,6 mmoles, 38 %). 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5: ppm 2,38 (br. m, 1H); 1,74-1,03 (br. m, 28H); 0,91 (m, 6H).
Intermedio B: 2-Octildecanoato de 7-bromoheptilo
Figure imgf000293_0002
Se sintetizó 2-octildecanoato de 7-bromoheptilo utilizando el Método A a partir de ácido 2-octildecanoico y 7-bromoheptan-1-ol. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5: ppm 4,09 (br. m, 2H); 3,43 (br. m, 2H); 2,48-2,25 (br. m, 1H); 1,89 (br. m, 2H); 1,74-1,16 (br. m, 36H); 0,90 (m, 6H).
Intermedio C: (2-Hexilciclopropil)metanol
Una solución de dietil zinc (20 mL, 20 mmoles, 1 M en hexanos), en diclorometano (20 mL) se dejó enfriar hasta -40 °C durante 5 min. Luego, se añadió gota a gota una solución de diyodometano (3,22 mL, 40 mmoles) en diclorometano (10 mL). Después de dejar la reacción con agitación durante 1 h a -40 °C, se añadió una solución de ácido tricloroacético (327 mg, 2 mmoles) y DME (1 mL, 9,6 mmoles) en diclorometano (10 mL). La reacción se dejó calentar hasta -15 °C y se agitó a esa temperatura durante 1 h. A continuación, se añadió una solución de (Z)-non-2-en-1-ol (1,42 g, 10 mmoles) en diclorometano (10 mL) a la solución a -15 °C. Luego, la reacción se dejó calentar lentamente hasta rt y se agitó durante 18h. Después de este tiempo, se añadió NH4Cl saturado (200 mL) y la reacción se extrajo con diclorometano (3X), se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4. La capa orgánica se filtró, se evaporó in vacuo y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-50 % de acetato de etilo en hexanos) para rendir (2-hexilciclopropil)metanol (1,43 g, 9,2 mmoles, 92 %). 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5: ppm 3,64 (m, 2H); 1,57-1,02 (m, 12H); 0,99-0,80 (m, 4H); 0,72 (m, 1H), 0,00 (m, 1H).
C. Compuesto 18: 8-((2-Hidroxietil)(8-(noniloxi)-8-oxooctil)amino) octanoato de heptadecan-9-ilo
Figure imgf000293_0003
Peso Molecular: 710,18
El C o m p u e s to 18 se s in te tizó según el p ro ce d im ie n to ge ne ra l y el P ro ce d im ie n to R e p re se n ta tivo 1 de scrito an te rio rm en te .
UPLC/ELSD: RT = 3,59 min. MS (ES): m/z (MH+) 710,89 para C44H87NO5.1H RMN (300 MHz, CDCls) 5: ppm 4,86 (m, 1H); 4,05 (t, 2H); 3,53 (br. m, 2H); 2,83-2,36 (br. m, 5H); 2,29 (m, 4H); 0,96-1,71 (m, 64H); 0,88 (m, 9H).
D. Compuesto 136: 8-((2-Hidroxietil)((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)amino)octanoato de nonilo Procedimiento Representativo 2:
8-Bromooctanoato de nonilo (Método A)
Figure imgf000294_0001
A una solución de ácido 8-bromooctanoico (5 g, 22 mmoles) y nonan-1-ol (6,46 g, 45 mmoles) en diclorometano (100 mL) se añadieron hidrocloruro de N-(3-Dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (4,3 g, 22 mmoles) y DMAP (547 mg, 4,5 mmoles). La reacción se dejó con agitación a rt durante 18 h. La reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4. La capa orgánica se filtró y se evaporó en vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-10 % de acetato de etilo en hexanos) para obtener 8-bromooctanoato de nonilo (6,1 g, 17 mmoles, 77 %).
1H RMN (300 MHz, CDCls) 5: ppm 4,06 (t, 2H); 3,40 (t, 2H); 2,29 (t, 2H); 1,85 (m, 2H); 1,72-0,97 (m, 22H); 0,88 (m, 3H).
8-((2-Hidroxietil)amino)octanoato de nonilo
Figure imgf000294_0002
Una solución de 8-bromooctanoato de nonilo (1,2 g, 3,4 mmoles) y 2-aminoetan-1-ol (5 mL, 83 mmoles) en etanol (2 mL) se dejó con agitación a 62 °C durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró en vacío y el residuo se extrajo con acetato de etilo y agua. La capa orgánica se separó y se lavó con agua, salmuera y se secó sobre Na2SO4. La capa orgánica se filtró y se evaporó in vacuo. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-100 % (mezcla de 1 % de NH4OH, 20 % de MeOH en diclorometano) en diclorometano) para obtener 8-((2-hidroxietil)amino)octanoato de heptadecan-9-ilo (295 mg, 0,9 mmoles, 26 %).
UPLC/ELSD: RT = 1,29 min. MS (ES): m/z (MH+) 330,42 para C19H39NO3
1H RMN (300 MHz, CDCl3) 5: ppm 4,07 (t, 2H); 3,65 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,63 (t, 2H); 2,32-2,19 (m, 4H); 1,73­ 1,20 (m, 24H); 0,89 (m, 3H)
8-((2-Hidroxietil)((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)amino)octanoato de nonilo
Figure imgf000294_0003
Peso Molecular: 577,98
Una solución de 8-((2-hidroxietil)amino)octanoato de nonilo (150 mg, 0,46 mmoles), (6Z,9Z)-18-bromooctadeca-6,9-dieno (165 mg, 0,5 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (65 mg, 0,5 mmoles) en etanol (2 mL) se dejó con agitación a reflujo durante 48 h. La reacción se dejó enfriar hasta rt y los disolventes se evaporaron en vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-10 % de MeOH en diclorometano) para obtener 8-((2-hidroxietil)((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)amino)octanoato de nonilo (81 mg, 0,14 mmoles, 30 %) como sal de HBr.
UPLC/ELSD: RT = 3,24 min. MS (ES): m/z (MH+) 578,64 para C37H71NO3
1H RMN (300 MHz, CDCI3) 5: ppm 10,71 (br., 1H); 5,36 (br. m, 4H); 4,04 (m, 4H); 3,22-2,96 (br. m, 5H); 2,77 (m, 2H); 2,29 (m, 2H); 2,04 (br. m, 4H); 1,86 (br. m, 4H); 1,66-1,17 (br. m, 40H); 0,89 (m, 6H)
E. Compuesto 138: 8,8'-((2-Hidroxietil)azanodiil)dioctanoato de dinonilo
Procedimiento Representativo 3:
8,8'-((2-Hidroxietil)azanodiil)dioctanoato de dinonilo
Figure imgf000295_0001
Peso Molecular: 597,97
Una solución de 8-bromooctanoato de nonilo (200 mg, 0,6 mmoles) y 2-aminoetan-1-ol (16 mg, 0,3 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (74 mg, 0,6 mmoles) en THF/CH3CN (1:1) (3 mL) se dejó con agitación a 63 °C durante 72 h. La reacción se enfrió hasta rt y los disolventes se evaporaron en vacío. El residuo se extrajo con acetato de etilo y bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó en vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-10 % de MeOH en diclorometano) para obtener 8,8'-((2-hidroxietil)azanodiil)dioctanoato de dinonilo (80 mg, 0,13 mmoles, 43 %).
UPLC/ELSD: RT = 3,09 min. MS (ES): m/z (MH+) 598,85 para C36H71NO5
1H RMN (300 MHz, CDCh) 5: ppm 4,05 (m, 4H); 3,57 (br. m, 2H); 2,71-2,38 (br. m, 6H); 2,29 (m, 4H), 1,71­ 1,01 (br. m, 49H), 0,88 (m, 6H).
Todos los demás compuestos lipídicos divulgados en la presente memoria se pueden obtener mediante un método análogo a los Procedimientos Representativos 1-3 como se ha descrito anteriormente y/o un método conocido en la técnica.
Ejemplo 2
Producción de composiciones de nanopartículas
A. Producción de composiciones de nanopartículas
Las nanopartículas se pueden preparar con procesos de mezclado tal como mezclado microfluídico y unión en T de dos corrientes de fluido, una de las cuales contiene el polinucleótido y la otra tiene los componentes lipídicos.
Las composiciones lipídicas se preparan combinando un aminolípido ionizable divulgado en la presente memoria, p. ej., un lípido según la Fórmula (I), un fosfolípido (tal como DOPE o DSPC, que puede obtenerse en Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), un lípido PEG (tal como 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol, también conocido como PEG-DMG, que se puede obtener en Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), y un lípido estructural (tal como colesterol, que se puede obtener en Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania), o un corticosteroide (tal como prednisolona, dexametasona, prednisona e hidrocortisona), o una combinación de los mismos) a concentraciones de aproximadamente 50 mM en etanol. Las soluciones deben refrigerarse para su almacenamiento, por ejemplo, a -20 °C. Los lípidos se combinan para obtener las relaciones molares deseadas y se diluyen con agua y etanol hasta una concentración lipídica final de entre aproximadamente 5,5 mM y aproximadamente 25 mM.
Las composiciones de nanopartículas que incluyen un polinucleótido y una composición lipídica se preparan combinando la solución lipídica con una solución que incluye un polinucleótido a relaciones p:p de composición lipídica a polinucleótido entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 50:1. La solución lipídica se inyecta rápidamente utilizando un sistema basado en microfluidos NanoAssemblr a velocidades de flujo entre aproximadamente 10 ml/min y aproximadamente 18 ml/min en la solución de polinucleótidos para producir una suspensión con una relación de agua a etanol entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 4:1.
Para composiciones de nanopartículas que incluyen un ARN, las soluciones del ARN a concentraciones de 0,1 mg/ml en agua desionizada se diluyen en tampón de citrato de sodio 50 mM a un pH entre 3 y 4 para formar una solución madre.
Las composiciones de nanopartículas se pueden procesar mediante diálisis para eliminar el etanol y lograr el intercambio de tampón. Las formulaciones se dializan dos veces frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, en volúmenes 200 veces mayores que el del producto primario utilizando casetes Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) con un punto de corte de peso molecular de 10 kD. La primera diálisis se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 3 horas. A continuación, las formulaciones se dializan toda la noche a 4 °C. La suspensión de nanopartículas resultante se filtra a través de filtros estériles de 0,2 pm (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) en viales de vidrio y se sella con cierres de presión. Se obtienen generalmente soluciones de composición de nanopartículas de 0,01 mg/ml a 0,10 mg/ml.
El método descrito anteriormente induce la nanoprecipitación y la formación de partículas. Se pueden usar procesos alternativos que incluyen, pero no se limitan a, unión en T e inyección directa, para lograr la misma nanoprecipitación.
B. Caracterización de las composiciones de nanopartículas
Se puede usar un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para determinar el tamaño de las partículas, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta de las composiciones de nanopartículas en IxPBS para determinar el tamaño de las partículas y PBS 15 mM para determinar el potencial zeta.
La espectroscopia ultravioleta-visible se puede utilizar para determinar la concentración de un polinucleótido (p. ej., ARN) en composiciones de nanopartículas. Se añaden 100 pL de la formulación diluida en 1xPBS a 900 pL de una mezcla 4:1 (v/v) de metanol y cloroformo. Después de mezclar, se registra el espectro de absorbancia de la solución, por ejemplo, entre 230 nm y 330 nm en un espectrofotómetro DU 800 (Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). La concentración de polinucleótido en la composición de nanopartículas se puede calcular en función del coeficiente de extinción del polinucleótido utilizado en la composición y de la diferencia entre la absorbancia a una longitud de onda de, por ejemplo, 260 nm y el valor de la línea base a una longitud de onda de, por ejemplo, 330 nm.
Para las composiciones de nanopartículas que incluyen un ARN, se puede utilizar un ensayo de ARN QUANT-IT™ RIBOGREEN® (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) para evaluar la encapsulación de un ARN por la composición de nanopartículas. Las muestras se diluyen a una concentración de aproximadamente 5 pg/mL en una solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). Se transfieren 50 pL de las muestras diluidas a una placa de poliestireno de 96 pocillos y se añaden bien 50 pL de tampón TE o 50 pL de una solución al 2 % de Tritón X-100 a los pocillos. La placa se incuba a una temperatura de 37 °C durante 15 minutos. El reactivo RIBOGREEN® se diluye 1:100 en tampón TE y se añaden 100 pL de esta solución a cada pocillo. La intensidad de la fluorescencia puede medirse utilizando un lector de placas de fluorescencia (Wallac Victor 1420 Multilablel Counter; Perkin Elmer, Waltham, MA) a una longitud de onda de excitación de, por ejemplo, aproximadamente 480 nm y una longitud de onda de emisión de, por ejemplo, aproximadamente 520 nm. Los valores de fluorescencia del blanco de reactivo se restan de los de cada una de las muestras y el porcentaje de ARN libre se determina dividiendo la intensidad de fluorescencia de la muestra intacta (sin la adición de Tritón X-100) por el valor de fluorescencia de la muestra fragmentada (causado por la adición de Tritón X-100).
Las formulaciones ilustrativas de las composiciones de nanopartículas se presentan en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9: Formulaciones ilustrativas de composiciones de nanopartículas
Figure imgf000296_0001
Figure imgf000297_0001
Ejemplo 3
Eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 en modelos A20 (linfoma) y MC38-C (cáncer de colon)
La eficacia de la monoterapia usando monoterapia con ARNm de IL-23 se evaluó en un modelo de linfoma A20 y en un modelo de cáncer de colon MC38-C. Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6. Véase Rosenberg et al., Science 233(4770):1318-21 (1986). Se cultivaron células de linfoma de células B de ratón A20 (A20, ATCC No. TIB-208; a Tc C, Manassas, VA) según las instrucciones del proveedor. Las células A20 se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB/c para generar tumores subcutáneos. Se monitorizó el tamaño y la palpabilidad de los tumores. Véase Kim et al., Journal of Immunology 122(2):549-554 (1979); Donnou et al., Advances in Hematology 2012:701704 (2012)
Los polinucleótidos correspondientes a los ARNm que codifican IL-23 (ARNm sin un sitio de unión de miR-122) y el ARNm de control NST-FIX se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva. Los ARNm se formularon en LNP del Compuesto 18.
Una vez que los tumores MC-38 o A20 alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron con dosis intratumorales únicas de los ARNm (2,5 pg/dosis).
Los animales de control se trataron con una dosis equivalente de ARNm de control negativo. Los controles "NST" son versiones no traducibles de un ARNm que codifica una proteína de control, en donde el ARNm comprende múltiples codones de parada.
El volumen del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados utilizando calibradores manuales. El volumen del tumor se registró en milímetros cúbicos.
La eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 en el modelo de linterna A20 se muestra en las FIG. 1A y 1B. La FIG. 1A muestra el tratamiento con el ARNm de control NST-FIX (2,5 |jg de ARNm). Se observó una respuesta completa ("CR") en 1 de 12 sujetos (8,3 %). La FIG. 1B muestra el tratamiento con ARNm que codifica mIL-23 sin sitio de unión del miARN "sin miR" (2,5 jg de ARNm). El tratamiento con el ARNm de IL-23 incitó respuestas completas en 5 de 12 sujetos (41,6 %). La eficacia de la monoterapia con ARNm de IL-23 en el modelo de cáncer de colon MC38-C se muestra en las FIG. 2A y 2B. La FIG. 2A muestra el tratamiento con el ARNm de control de NST-OXL40 (2,5 jg de ARNm). La FIG. 2B muestra el tratamiento con ARNm que codifica mIL-23 sin sitio de unión de miARN "sin miR" (2,5 jg de ARNm). La administración del ARNm de IL-23 incitó respuestas completas en 4 de 10 sujetos (40 %). Se observó una respuesta parcial en 2 de 10 sujetos (20 %).
Ejemplo 4
La adición de ARNm que codifica IL-36 gamma o IL-18 al ARNm que codifica IL-23 aumenta la eficacia en el modelo MC38-C
El efecto de la adición de los ARNm que codifican interleuquina 36-gamma o interleuquina 18 al tratamiento con ARNm de IL-23 también se evaluó en el modelo de cáncer de colon MC38-C. Como en el ejemplo 3, los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6 para generar tumores subcutáneos.
Los polinucleótidos correspondientes a los ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y el ARNm de IL-18 se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva. Los ARNm se formularon en LNP del Compuesto 18. Una vez que los tumores MC38 alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron con dosis intratumorales únicas de los ARNm. Los animales de control se trataron con una dosis equivalente de ARNm de control negativo.
El volumen tumoral se midió en los puntos de tiempo indicados utilizando calibradores manuales. El volumen tumoral se registró en milímetros cúbicos. El estudio de eficacia in vivo se llevó a cabo hasta el Día 50 después de la dosificación.
Los datos mostraron que la adición de IL-36-gamma o IL-18 a un tratamiento que comprende ARNm que codifica IL-23 aumentó la eficacia del tratamiento en el modelo de cáncer de colon MC38-C. La FIG. 3A muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y ARNm de control NST-FIX (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 3 de 10 sujetos (30 %). Se observó una respuesta parcial en 6 de 10 sujetos (60 %). Los datos extendidos hasta el día 90 se muestran en la FIG. 3E.
La FIG. 3B muestra el tratamiento con ARNm que codifican IL-23 e IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 9 de 10 sujetos (90 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 10 sujetos (10 %). Los datos extendidos hasta el día 90 se muestran en la FIG. 3F.
La FIG. 3C muestra el tratamiento con un ARNm que codifica IL-23 y un segundo ARNm que codifica IL-18 (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 6 de 10 sujetos (60 %). Se observó una respuesta parcial en 3 de 10 sujetos (30 %).
La FIG. 3D muestra el tratamiento con el ARNm de control NST-FIX solo (5 jg de ARNm). Los datos extendidos hasta el día 70 se muestran en la FIG. 3G.
Los datos indican que la combinación de ARNm que codifica IL-23 con un segundo ARNm que codifica IL-36-gamma fue más efectiva que la monoterapia con ARNm de IL-23. Además, la terapia de combinación de IL-23 e IL-36-gamma fue más efectiva que la monoterapia con IL-36-gamma más ARNm de control negativo (no mostrado). Los datos también indican que la combinación de un ARNm que codifica IL-23 con un segundo ARNm que codifica IL-18 fue más efectiva que la monoterapia con un ARNm que codifica IL-23. Además, la combinación de un ARNm que codifica IL-23 con ARNm que codifica IL-18 fue más efectiva que una monoterapia con ARNm que codifica IL-18 más ARNm de control negativo (no mostrado).
Ejemplo 5
Efecto de la Adición del Sitio de Unión de miR-122 a la Terapia de Combinación de IL-36-gamma e IL-18
Se evaluó la eficacia de combinar el ARNm que codifica IL-36-gamma con la terapia de ARNm de IL-23, así como el efecto de añadir un miR-122 a un ARNm que codifica IL-36-gamma utilizado en una terapia de combinación con un ARNm que codifica IL-23.
La eficacia del uso de terapias de combinación de ARNm de IL-23 se evaluó en el modelo de linfoma A20 como se ha descrito anteriormente. Se cultivaron células de linfoma de células B de ratón A20 según las instrucciones del proveedor, se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB/c para generar tumores subcutáneos, y una vez que los tumores A20 alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron con dosis intratumorales únicas de los ARNm.
Los polinucleótidos correspondientes a los ARNm que codifican el control NST-FIX, ARNm que codifica IL-23 o IL-18 sin miR-122 "sin miR" y ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18 con miR-122 se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva. Los ARNm se formularon en LNP del Compuesto 18. El volumen tumoral se midió en los puntos de tiempo indicados utilizando calibradores manuales. El volumen tumoral se registró en milímetros cúbicos. El estudio de eficacia in vivo se llevó a cabo hasta el Día 80 después de la dosificación.
Las FIG. 4A-4C muestran que la adición de ARNm que codifica IL-36-gamma a ARNm que codifica IL-23 aumenta la eficacia en el modelo de linfoma A20. La FIG. 4A muestra el tratamiento con una terapia de combinación que comprende ARNm que codifica IL-23 sin miR-122 "sin miR" y ARNm de NST-FIX (2,5 |jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 8 de 12 sujetos (66,6 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 12 sujetos (8,3 %). La FIG. 4B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 sin miR-122 "sin miR" y ARNm que codifica IL-36-gamma con miR-122 (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 10 de 12 sujetos (83.3%). La FIG. 4C muestra el tratamiento con un ARNm que codifica IL-23 sin sitio de unión de miR122 "sin miR" y un ARNm que codifica IL-18 sin sitio de unión de miR122 "sin miR" (2,5 jg de cada ARNm). Se observó una respuesta completa en 6 de 12 sujetos (50%). La FIG. 4D muestra el tratamiento con ARNm de control NST-FIX (5 jg de ARNm). Las combinaciones de ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18 fueron superiores a los monoconstituyentes más ARNm de control negativo (no se muestran las monoterapias con IL-1). La eficacia de la combinación de ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma que comprende un sitio de unión de mR122 en la región 5' UTR del ARNm fue particularmente alta en comparación con una combinación que comprende ARNm sin miR (es decir, ARNm sin un sitio de unión de miR-122 en la región 5'-UTR).
Ejemplo 6
Eficacia del ARNm que codifica IL-36-gamma más ARNm que codifica IL-23 en el modelo de linfoma A20
La eficacia del ARNm que codifica IL-36-gamma más el ARNm que codifica IL-23 sobre el ARNm que codifica IL-23 solo con una dosis fija de 5 mg de ARNm se evaluó en el modelo de linfoma A20. Los experimentos se llevaron a cabo como se ha detallado anteriormente.
La FIG. 5A muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 (5 jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 1 de 10 sujetos (10 %). Se observó una respuesta parcial en 4 de 10 sujetos (40 %). La FIG. 5B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-36-gamma (5 jg de ARNm). Se observó una respuesta completa en 2 de 10 sujetos (20 %). Se observó una respuesta parcial en 1 de 10 sujetos (10/%). La FIG. 5C muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). La FIG. 5D muestra el tratamiento con ARNm de control NST-FIX (5 jg de ARNm). Los datos indican que la combinación de ARNm de IL-23/IL-36-gamma fue superior a la administración de terapia monoconstituyente a una dosis fija de ARNm de 5 jg .
Ejemplo 7
Eficacia del ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18 en el modelo de cáncer de colon MC38-M
La eficacia de la terapia de combinación que comprende ARNm que codifica IL-23 más ARNm que codifica IL-36-gamma o IL-18 se evaluó en el modelo de cáncer de colon MC38 como se ha descrito anteriormente. Los experimentos de los ejemplos anteriores se realizaron usando un modelo MC38-C (fuertemente inmunogénico). Por el contrario, los experimentos del presente ejemplo se realizaron usando un modelo MC38-M (poco inmunogénico). Las diferencias en los infiltrados inmunes y las diferencias histológicas entre ambos modelos se muestran en las FIG. 6A y 6B.
Las FIG. 7A y 7B muestran la falta de eficacia convincente de la monoterapia con ARNm de IL-23 en el modelo de cáncer de colon MC38-M. La FIG. 7A muestra el tratamiento con ARNm de control NST-OX40L (2,5 jg de ARNm) en LNP basadas en el Compuesto 18. No se observó respuesta. La FIG. 7B muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 sin miR-122 "sin miR" (2,5 jg de ARNm) en LNP basadas en el Compuesto 18. Solo se observó una respuesta parcial (1 de 10, 10 %). MC38-M es un modelo relativamente insensible en el que las monoterapias con OX40L, anticuerpo anti-PD-1 e IL-23 son ineficaces.
La FIG. 7C muestra que la combinación de ARNm que codifica IL-23 con ARNm que codifica IL-36-gamma es eficaz en el cáncer de colon MC38-M poco inmunogénico. La figura muestra el tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma (2,5 jg de cada ARNm). El tratamiento con ARNm que codifica IL-23 y ARNm que codifica IL-36-gamma incitó respuestas completas en 2 de 10 sujetos (20 %) y se observaron respuestas parciales en 5 de 10 sujetos (50 %).
La FIG. 7E muestra que la combinación de un ARNm que codifica IL-23 con un ARNm que codifica IL-18 es eficaz en el cáncer de colon MC38-M poco inmunogénico. La figura muestra el tratamiento con un ARNm que codifica IL-23 y un ARNm que codifica IL-18 (2,5 |jg de cada ARNm). La FIG. 7D muestra el tratamiento con ARNm de control NST-FIX (5 jg de ARNm).
Ejemplo 8
Eficacia de la Combinación T riple de ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L en el modelo de cáncer de colon MC38-M
La eficacia de la terapia de combinación triple que comprende ARNm que codifica IL-23, ARNm que codifica IL-36-gamma y ARNm que codifica OX40L se evaluó en el modelo de cáncer de colon MC38 como se ha descrito anteriormente. Los experimentos del presente ejemplo se realizaron utilizando un modelo MC38-M (poco inmunogénico), véase la FIG. 9C.
La FIG. 8 muestra que OX40L fue eficaz en el modelo de tumor A20. Por el contrario, hubo una falta de eficacia convincente cuando se usó OX40L en el modelo de cáncer de colon MC38-M (FIG. 9A). El efecto observado fue similar al observado cuando el mismo modelo se trató con un anticuerpo anti-PD-1 (FIG. 9B).
Por el contrario, se observó eficacia en el modelo de cáncer de colon MC38-M cuando el ARNm que codifica IL-23 comprendía un sitio de unión de miR-122 (5 jg de ARNm en LNP basadas en el Compuesto 18) (FIG. IOA) . No se observó una respuesta completa, pero se observaron 8 evasores. Los datos experimentales extendidos hasta el día 70 se muestran en la FIG. 10D.
Cuando el ARNm que codifica IL-23 que comprende un sitio de unión de miR-122 (2,5 jg de ARNm) se combinó con el ARNm que codifica IL-36-gamma que comprende un sitio de unión de miR-122 (2,5 jg de ARNm) (FIG. IOB) , se observaron tres respondedores completos (25 %), y el número de evasores se redujo de ocho a seis. Los datos experimentales extendidos hasta el día 70 se muestran en la FIG. 10E.
Cuando el ARNm que codifica IL-23 que comprende un sitio de unión de miR-122 (1,7 jg de ARNm) se combinó con un ARNm que codifica IL-36-gamma que comprende un sitio de unión de miR-122 (1,7 jg de ARNm) y con un ARNm que codifica OX40L que comprende un sitio de unión de miR-122 (1,7 jg de ARNm) (FIG. 10C), se observaron tres respondedores completos (25 %), y el número de evasores se redujo aún más de seis a cuatro. Los datos experimentales extendidos hasta el día 70 se muestran en la FIG. 10F.
Un experimento adicional evaluó la dosificación única del doblete y la dosificación única o múltiple del triplete en el modelo MC38 utilizando células de luciferasa MC38. El ARNm que codifica IL-23 que comprende un sitio de unión de miR-122 se combinó con ARNm que codifica IL-36-gamma que comprende un sitio de unión de miR-122 y se administró en una dosis única (8 jg). El ARNm que codifica IL-23 que comprende un sitio de unión de miR-122, el ARNm que codifica IL-36-gamma que comprende un sitio de unión de miR-122 y el ARNm que codifica OX40L que comprende un sitio de unión de miR-122, se administró en una dosis única o dosis múltiples de 12 jg . En relación con el control, la bioluminiscencia se redujo con la dosis única de la combinación doble, y tanto las dosis únicas como múltiples con la combinación triple, observándose una reducción más significativa en la combinación triple (FIG. 10G). Sin embargo, la supervivencia durante más de 45 días se redujo en ratones tratados con dosis múltiples de la combinación triple, lo que corresponde a muertes relacionadas con el tratamiento (FIG. 10H).
Ejemplo 9
Bioactividad de IL-23 producida a partir de ARNm
La actividad de la proteína IL-23 producida a partir del ARNm introducido en una célula se evaluó en un bioensayo y se comparó con la actividad de la proteína IL-23 recombinante. Los polinucleótidos correspondientes a los ARNm que codifican la IL-23 murina o la IL-23 humana se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva. Las células HeLa se transfectaron con ARNm que codificaba IL-23 murina (ARNm mIL-23), ARNm que codificaba IL-23 humana (ARNm hIL-23), o se transfectaron de forma simulada, y el sobrenadante se recogió de las células transfectadas. La cantidad de proteína IL-23 en los sobrenadantes recogidos se midió mediante ELISA, luego se añadieron niveles variados (simulacro (0 ng/ml), 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 3,3 ng/ml, 10 ng/ml, o 100 ng/ml) de las proteínas producidas a partir de ARNm, o IL-23 murina recombinante (rec mIL-23), o IL-23 humana recombinante (ARNm hIL-23) a esplenocitos primarios de ratón cultivados. Los esplenocitos se cultivaron con sobrenadantes que contenían IL-23 o proteínas recombinantes durante 3 días y luego se midió la cantidad de IL-17 producida por los esplenocitos. La producción de IL-17 sirve como indicador de la bioactividad de IL-23.
La FIG. 11 muestra que la IL-23 producida a partir de ARNm tiene una bioactividad equivalente, es decir, la inducción de la expresión de IL-17 a partir de esplenocitos primarios de ratón, a proteínas IL-23 recombinantes (p. ej., proteína a partir de ARNm de hIL-23 en comparación con rec hIL-23). Además, se determinó que la expresión in vivo del ARNm de IL-23 humana era mayor que la expresión del ortólogo de ratón (datos no mostrados).
Ejemplo 10
Bioactividad de IL-36-gamma producida a partir de ARNm
La actividad de la proteína IL-36-gamma producida a partir del ARNm introducido en una célula se evaluó en un bioensayo y se comparó con la actividad de la proteína IL-36-gamma recombinante. Los polinucleótidos correspondientes a los ARNm que codifican IL-36-gamma murina o IL-36-gamma humana se prepararon como se describe en la presente memoria descriptiva.
Para los experimentos con IL-36-gamma murina, se transfectaron células HeLa con ARNm que codifica la proteína IL-36-gamma murina (mIL-36Y ARNm-_v1) o se transfectaron de forma simulada, y se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) se expusieron a los sobrenadantes recogidos que contenían IL-36-gamma murina madura secretada o IL-36-gamma murina recombinante (rmIL-36Y) en concentraciones variables, y se evaluó la producción de IL6 por parte de las BMDC expuestas. La producción de IL6 sirve como indicador de la actividad de IL-36-gamma murina. La FIG. 12A muestra que el ARNm que codifica la proteína IL-36-gamma murina tiene una bioactividad equivalente a la proteína IL-36-gamma humana recombinante (rmIL-36Y en comparación con mIL-36Y).
Para los experimentos con IL-36-gamma humana, se evaluó la bioactividad de IL-36-gamma utilizando células de carcinoma epidermoide (p. ej., A431). Las células B16F10 se transfectaron con ARNm que codifica IL-36-gamma humana con diferentes péptidos señal (hIL-36Y ARNm_v1; hIL-36Y ARNm_v2; o hIL-36Y ARNm_v3) y se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas. Las concentraciones de hIL-36g en los sobrenadantes se determinaron por ELISA. Se expusieron células A431 a sobrenadantes que contenían hIL-36g o proteína IL-36-gamma humana recombinante (rhIL-36Y) a niveles variables y se midió la producción de IL8 en los sobrenadantes de las células A431 tratadas. La producción de IL8 sirve como indicador de la actividad de IL-36-gamma humana. La FIG. 12B muestra que la proteína IL-36-gamma humana derivada de ARNm tiene una bioactividad equivalente a la proteína IL-36-gamma humana recombinante (hIL-36Y ARNm_v1; hIL-36Y ARNm_v2; o hIL-36Y ARNm_v3 en comparación con rhIL-36Y).
Ejemplo 11
Actividad Biológica In Vitro de OX40L
La activación de células T implica dos eventos de señalización celular concurrentes: una señal primaria del complejo receptor de células T (p. ej., estimulación de CD3) y una segunda señal de una interacción ligandoreceptor coestimuladora (p. ej., interacción OX40L/OX40R). Kober et al., European Journal of Immunology 38:2678-2688 (2008). En este ejemplo, se evaluó la actividad biológica coestimuladora de OX40L expresada en la superficie de las células tratadas con mOX40L_miR-122 o hOX40L_miR-122.
A. Preparación de Células que Expresan OX40L
Se sembraron células de melanoma de ratón (B16F10, ATCC No. CRL-6475; ATCC, Manassas, VA) en placas de 6 pocillos a una densidad de 300.000 células por pocillo. Se sembraron células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa) en placas de 6 pocillos como se ha descrito anteriormente. Un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y que comprende además un sitio de unión de miR-122 (OX40L de ratón, mOX40L_miR-122, SEQ ID NO: 66; OX40L humano, hOX40L_miR-122, SEQ ID NO: 65) se formuló en L2K como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. 24 horas después de sembrar las células, se añadieron a cada pocillo las formulaciones que contenían 3 |jg de ARNm de mOX40L_miR-122 o hOX40L_miR-122. Las células de control se trataron de forma simulada o se trataron con ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm excepto sin codones de inicio). Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C.
B. Preparación de Células T CD4+ Sin Tratamiento Previo
Se extrajeron bazos de ratones Balb/c y se procesaron usando técnicas estándar en la técnica para generar suspensiones de células individuales de esplenocitos. Se aislaron las células T CD4+ totales de las suspensiones de esplenocitos utilizando un kit de aislamiento de células T CD4 de ratón (Miltenyi, San Diego, CA). Se aislaron las células T CD4+ humanas sin tratamiento previo de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) agotando las células que no son CD4 utilizando un kit de aislamiento de células T de perlas magnéticas disponible comercialmente.
C. Ensayo de Activación de Células T
Se añadieron 200.000 células T a cada pocillo de células B16F10 transfectadas o células HeLa en presencia de anticuerpo agonista anti-CD3 de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) o activador de T humanas Dynabeads; y las células se cocultivaron durante 72 horas (de ratón) o 120 horas (humanas). Un esquema de los ensayos se muestra en la FIG. 13A.
Después del cocultivo con células T, se midió la producción de IL-2 de ratón utilizando un ELISA de IL-2 de ratón. (ELISA de IL-2 de ratón DuoSet, R&D Systems, Minneapolis, MN). La cantidad de IL-2 producida por las células T CD4+ sirve como un indicador de la activación de las células T. Los resultados se muestran en la FIG.
13B. La producción de IL-2 humana se midió usando un ELISA de IL-2 humana (ELISA de IL-2 humana DuoSet, R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados se muestran en la FIG. 13A, 13B, y 13C.
D. Resultados
La FIG. 13B muestra que la expresión de OX40L en la superficie de las células B16F10 tratadas con mOX40L_miR-122 incita una respuesta de IL-2 de células T in vitro. El ARNm de mOX40L_miR-122 indujo aproximadamente 12 ng/ml de IL-2. Las células B16F10 tratadas con ARNm de control negativo no traducible mostraron niveles de línea base de activación de células T comparables a las células tratadas de forma simulada (es decir, aproximadamente 6 ng/ml de IL-2). Por lo tanto, el ARNm de mOX40L_miR-122 indujo una expresión de IL-2 aproximadamente dos veces mayor en comparación con un control (tratado de forma simulada o ARNm no traducible).
Las FIG. 13C y 13D muestran que, en presencia de activador de T humanas Dynabeads como activadores primarios de células T, el cocultivo con las células HeLa transfectadas con ARNm de OX40L aumentó enormemente la producción de IL-2. Sin expresión de OX40L, se detectó poca o ninguna producción de IL-2. La FIG. 13E muestra un nivel similar de aumento de la producción de IL-2 humana cuando se realizó el mismo experimento con células T CD4+ preestimuladas (es decir, con tratamiento previo).
Estos resultados muestran que el polipéptido OX40L es biológicamente activo como molécula coestimuladora.
Ejemplo 12
Modulación de poblaciones de células inmunes en tumores tratados con ARNm de OX40L
Dada la actividad demostrada de OX40L en las células asesinas naturales (NK) inmunes innatas y las células T CD4+/CD8+ adaptativas, el objetivo de los siguientes estudios fue evaluar los efectos farmacodinámicos del tratamiento intratumoral con OX40L en las poblaciones de células inmunes asociadas a tumores. Los modelos tumorales de ratón A20 y MC38 se establecieron como se ha descrito anteriormente.
A. Diferenciación celular por citometría de flujo
Los tumores A20 se trataron con una dosis única de 12,5 |jg de ARNm de mOX40L_miR-122 o de control (ARN/LNP) formulado en nanopartículas lipídicas. Las muestras tumorales se analizaron inicialmente 24 horas después del tratamiento. Las células NK se diferenciaron usando un anticuerpo contra el marcador de superficie de células NK maduras, DX5. Los resultados se muestran en la FIG. 14a . Se analizaron otras muestras tumorales 14 días después del tratamiento con mOX40L_miR-122. Las células T CD4+ y CD8+ se identificaron usando anticuerpos anti-CD4 de ratón y anti-CD8 de ratón, respectivamente. Los resultados se muestran en las FIG. 14B-14C.
Se realizó un experimento similar en el modelo de tumor MC38. A los ratones con tumores MC38 se les administró una única inyección intratumoral de mOX40L_miR-122 o NST-OX40L. A algunos animales se les administró una segunda dosis de ARNm 6 días después de la primera dosis. Se evaluó el infiltrado de células inmunes para detectar células CD8+ 24 horas y 72 horas después de cada dosis de ARNm. Los resultados se muestran en la FIG. 14D.
B. Resultados
La FIG. 14A muestra que 24 horas después de la administración de mOX40L_miR-122 a los tumores A20, la infiltración de células Nk aumentó significativamente en los animales dosificados con OX40L en comparación con los controles. Las FIG. 14B-14C muestran que 14 días después de la administración de mOX40L_miR-122 a tumores A20, la infiltración tanto de células T CD4+ (FIG. 14B) como CD8+ (FIG. 14C) en el microentorno tumoral aumentó significativamente en comparación con las muestras tumorales de control.
La FIG. 14D muestra un aumento significativo en la infiltración de células T CD8+ 72 horas después de una segunda dosis de mOX40L_miR-122 en tumores MC38 en comparación con tumores tratados de control. Estos datos de dos modelos tumorales demuestran que la administración de un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L promueve un mayor número de células inmunes tanto innatas como adaptativas en el microentorno tumoral.
Ejemplo 13
Actividad in vivo de un polinucleótido que codifica OX40L después de la administración intratumoral A. Preparación de ARNm de OX40L modificado
Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión del miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR-122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (versión no traducible del mismo ARNm que contiene múltiples codones de parada: NST_OX40L_122).
B. Modelo de Tumor de Leucemia Mieloide Aguda (AML)
Los tumores de leucemia mieloide aguda (AML) se establecieron por vía subcutánea en ratones DBA/2. Se cultivaron células de AML de ratón P388D1, ATCC No. CCL-46, At Cc , Manassas, VA) según las instrucciones del proveedor. Las células se inocularon por vía subcutánea en ratones para generar tumores subcutáneos. Se monitorizó el tamaño y la palpabilidad de los tumores.
Una vez que se establecieron los tumores, los animales se separaron en dos grupos, es decir, un grupo mOX40L_miR-122 y un grupo de control. La dosificación intratumoral para cada grupo fue cada 7 días (Q7D), comenzando 7 días después de la implantación del tumor. El Grupo I se trató con dosis intratumorales de mOX40L_miR-122 a una dosis de 12,5 |jg (dosis fija) de ARNm por kg de peso corporal. El Grupo II se trató con dosis intratumorales de ARNm de NST_OX40L_122 de control en el mismo régimen de dosificación. C. Resultados
Los resultados se muestran en la FIG. 15A y 15B. La FIG. 15A muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de NST_OX40L_122 de control. La FIG. 15B muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR-122. Estos resultados muestran que la administración intratumoral de un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L que comprende un sitio de unión del miARN reduce o inhibe el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento con ARNm de control o PBS.
Ejemplo 14
Eficacia in vivo de la combinación de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un anticuerpo anti-PD-1 A. Preparación de ARNm modificado de OX40L y anti-PD-1
Se preparó un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L (OX40L murino) y que comprende además un sitio de unión del miARN (miR-122) como se ha descrito anteriormente (mOX40L_miR-122; SEQ ID NO: 66). También se preparó un ARNm de control negativo (NST_OX40L_122). Las soluciones de dosificación de anti-PD-1 (BioXcell BE0146, anti-mPD-1, clon RMP1-14, No. de Lote 5792-599016J1) se prepararon diluyendo una parte alícuota de la preparación madre (6,37 mg/mL) a 0,5 mg/mL en PBS estéril. La solución de dosificación de 0,5 mg/mL proporcionó la dosificación de 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 mL/kg. La solución de dosificación de anti-PD-1 se preparó diariamente y se almacenó protegida de la luz a 4 °C.
Las soluciones de dosificación de IgG2a de rata (BioXcell BE0089, IgG2a de rata, clon 2A3, No. de Lote 601416M1) se prepararon diluyendo una parte alícuota de la preparación madre (7,38 mg/mL) a 0,5 mg/mL en PBS estéril. La solución de dosificación de 0,5 mg/mL proporcionó la dosificación de 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 mL/kg. La solución de dosificación de anti-PD-1 se preparó diariamente y se almacenó protegida de la luz a 4 °C.
B. Modelo de adenocarcinoma de colon MC38
Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6 como se ha descrito anteriormente.
Una vez que se establecieron los tumores, los animales se dividieron en grupos y recibieron dosis intratumorales de una de las siguientes terapias de combinación mostradas en la siguiente tabla:
Tabla 10: Dosificación e Intervalo de la Combinación
Figure imgf000304_0001
Los ratones recibieron dosis intratumorales de ARNm cada 7 días (Q7D). Los ratones recibieron dosis intratumorales de anticuerpo cada dos semanas (BIWx2).
C. Resultados
Los resultados se muestran en la FIG. 16A-16E y la FIG. 17. La FIG. 16A muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de NST_OX40L_122 de control combinado con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Hubo 0/15 respondedores completos (CR) en el grupo de control. La FIG. 16B muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR-122 combinado con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Sobre el Día 90 después de la implantación, la CR fue 0/15 para este grupo. La FIG. 16C muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con ARNm de control intratumoral combinado con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD1. Sobre el Día 90 después de la implantación, la CR fue 2/15 para este grupo. La FIG. 16D muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de ARNm de mOX40L_miR-122 combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD-1. Sobre el Día 90 después de la implantación, la CR fue 6/15 para este grupo de combinación dual. La FIG. 16E muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de PBS combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo anti-PD1. Sobre el Día 90 después de la implantación, la CR fue 0/15 para este grupo. La FIG.
16F muestra el crecimiento tumoral individual en animales tratados con dosis intratumorales de PBS combinadas con dosis intratumorales de anticuerpo de control. Sobre el Día 90 después de la implantación, la CR para este grupo de tratamiento fue 0/14.
Estos resultados muestran que la terapia de combinación que comprende un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido OX40L y un agente inmunoterapéutico, tal como un anticuerpo anti-PD-1, es efectiva in vivo para inhibir o reducir el crecimiento tumoral en el modelo tumoral de ratón MC38. La combinación de mOX40L_miR-122 con anti-PD-1 mostró una eficacia antitumoral in vivo sinérgica. Estos resultados también muestran que se pueden usar dosis más bajas de ARNm en la terapia de combinación.
La FIG. 17 muestra las curvas de supervivencia para animales en los mismos grupos de tratamiento. Estos resultados muestran que la combinación de la dosificación intratumoral de un ARNm de OX40L modificado con la dosificación intratumoral de un anticuerpo anti-PD-1 aumenta efectivamente la supervivencia en un modelo de tumor de ratón en comparación con los grupos de tratamiento de control.
Ejemplo 15
Respuesta inmune de memoria in vivo después del tratamiento con la terapia de combinación
Los ratones se trataron con mOX40L_miR-122 combinado con anticuerpo anti-PD-1 como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 14. En el Día 90 después de la inoculación del tumor, cuatro animales con respuesta completa (CR) del grupo de terapia de combinación mOX40L_miR-122 anti-PD-1 se volvieron a pulsar con 5 x 105 células tumorales MC38. Como control, también se inocularon 5 x 105 células MC38 a 10 animales sin tratamiento previo. Los resultados del análisis se muestran en la FIG. 18A y 18B.
La FIG. 18A muestra el crecimiento tumoral individual en animales sin tratamiento previo pulsados con células MC38. Los ratones sin tratamiento previo comenzaron a desarrollar tumores detectables aproximadamente 5 días después de la implantación y los tumores continuaron creciendo durante el estudio. La FIG. 18B muestra el crecimiento tumoral individual en los animales con respuesta completa que recibieron previamente dosis intratumorales de la terapia de combinación de mOX40L_miR-122 y anticuerpo anti-PD-1. Los animales con respuesta completa no mostraron crecimiento tumoral (0/4 animales) durante 23 días después del nuevo pulso con células tumorales. Por el contrario, los animales sin tratamiento previo mostraron un alto porcentaje de crecimiento tumoral. Estos resultados muestran que la dosificación intratumoral de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L combinado con un anticuerpo anti-PD-1 induce una respuesta inmune de memoria con efectos antitumorales.
Ejemplo 16
Eficacia marcada en tumores tanto primarios tratados como distales no tratados con la terapia de triplete de ARNm
Los experimentos se realizaron utilizando el modelo de tumor de ratones MC38-S. Se implantó un tumor en cada flanco de cada animal. Véase la FIG. 19A. Se trató un tumor primario en un flanco con ARNm de control (ARNm no traducible que codifica OX40L), una combinación de ARNm que codifican IL-23 e IL36-gamma, o una combinación triple de ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L. Luego, se midió el efecto del tratamiento del primer tumor en el segundo tumor (no tratado). FIG. 19A. La dosis total de ARNm por tratamiento fue de 5 |jg de ARNm. Los ARNm se administraron como dosis intratumorales únicas.
Las FIG. 19B y 19C muestran grandes volúmenes tumorales tanto en los tumores tratados como en los tumores distales en ratones tratados con ARNm de control. Cuando se administró la terapia de doblete de ARNm al tumor proximal (FIG. 19D), se observaron 9 respuestas completas (50 %) en este tumor distal (FIG. 19E). Cuando se administró la terapia de triplete de ARNm al tumor proximal (FIG. 19F), se observaron 15 respuestas completas (83,3 %) en el tumor distal (FIG. 19G).
Estos datos indican que el tratamiento de un tumor con una composición terapéutica de ARNm puede tratar eficazmente el tumor en otras localizaciones.
Ejemplo 17
El triplete de ARNm más Ab anti-PD-Ll demuestra eficacia mejorada en el modelo tumoral B16F10-AP3 difícil de tratar
Para evaluar la eficacia mejorada de la terapia de triplete (combinación triple de ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L) en un modelo difícil de tratar que no responde a los inhibidores de puntos de control, se usó el modelo de células de melanoma murino B16F10-AP3. Como en el ejemplo anterior, la dosificación de ARNm total fue de 5 ug de ARNm total, administrados intratumoralmente como una dosis única. El anticuerpo anti-PD-Ll se dosificó por vía intraperitoneal dos veces por semana a 10 mg/kg.
La FIG. 20A muestra el volumen tumoral en ratones tratados con ARNm de control. No se observaron respuestas cuando el anticuerpo anti-PD-L1 se administró solo (FIG. 20B). Cuando se administró la terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifican IL23, IL36 gamma y OX40L), tampoco se observaron respuestas completas (FIG. 20C). Por otro lado, cuando se administró la terapia de triplete de ARNm en combinación con el anticuerpo anti-PD-Ll, se observaron 5 respuestas completas de 15 (33 %). Además de las respuestas completas en un ratón, el tamaño del tumor se redujo a menos de 60 mm3 (FIG. 20D).
Estos datos indican que los tumores refractarios al tratamiento con una terapia convencional, p. ej., un anticuerpo anti-PD-Ll, pueden tratarse de manera efectiva combinando dicha terapia con varios ARNm descritos en la presente memoria (p. ej., una terapia triple que comprende ARNm que codifican IL-23, IL -36-gamma y OX40L).
Ejemplo 18
Respuesta Inmune de Memoria Después del Tratamiento con la Terapia de Doblete IL-23:IL-36-gamma y la Terapia de Triplete IL23:IL-36-gamma:OX40L
Se evaluó la respuesta inmune de memoria en animales tratados con una terapia de combinación de doblete. Los ratones inoculados con células tumorales MC38-S se trataron con una terapia de combinación de doblete que consistía en un polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 y un segundo polinucleótido que comprende un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma. Cinco microgramos de ARNm total se inyectaron intratumoralmente semanalmente durante 4 semanas (Q7D).
Diez de diez ratones tuvieron una respuesta completa. Cuando los animales sin tratamiento previo se pulsaron con el mismo cáncer, todos los ratones (quince de quince) fueron evasores (FIG. 21A). Por el contrario, cuando los ratones que tuvieron una respuesta completa se pulsaron de nuevo con mismo cáncer, no se observó crecimiento tumoral en ninguno de los ratones que se pulsaron de nuevo (FIG. 21B).
La generación de memoria anticancerosa después de la terapia local (es decir, el tumor no creció en ratones pulsados de nuevo que tuvieron una respuesta completa al tratamiento inicial) se observó en ratones tratados con terapia de doblete de ARNm (IL-23:IL-36-gamma), como se discutió anteriormente, y también en ratones tratados con terapia de triplete de ARNm (IL23:IL-36-gamma:OX40L) (los tumores no crecieron en 5 de los 5 ratones pulsados de nuevo que tuvieron una respuesta completa al tratamiento inicial; no mostrado).
Ejemplo 19
Efecto de la Terapia de Doblete y Triplete en los Niveles de Células Inmunes
Para evaluar la eficacia de la terapia de doblete (combinación doble de ARNm que codifican IL-23 e IL-36-gamma, respectivamente) y la terapia de triplete (combinación triple de ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L, respectivamente), se evaluaron los niveles de células inmunes.
El tratamiento de ratones inoculados con células tumorales MC38-R con la terapia de doblete provocó un marcado aumento en el nivel de granulocitos Ly6G+ en el tumor MC38-R, medido como granulocitos como porcentaje de células CD45+ (FIG. 22A) o como granulocitos por mg de tumor (FIG. 22B). También se observó un aumento dramático en los granulocitos después del tratamiento con terapia de triplete (FIG. 23).
El tratamiento con la terapia de doblete y triplete aumentó los niveles de células dendríticas de presentación cruzada (véanse las FIG. 24A y 24B).
El tratamiento con terapia de doblete aumentó los niveles de células dendríticas CD103+ de presentación cruzada en tumores MC28-R, medidas como células dendríticas CD103+ como porcentaje de células CD45+ (FIG. 24A) o como células dendríticas CD103+ por mg de tumor (FIG. 24B). El tratamiento de ratones inoculados con células tumorales MC38-R con terapia de triplete mostró aumentos similares en las células dendríticas de presentación cruzada tanto en el tumor como en el ganglio linfático de drenaje (véase la FIG.
25A y FIG. 25b ). Estos aumentos en las células dendríticas se observaron en análisis en los que se cuantificaron las células dendríticas CD103+ por mg de tumor (FIG. 25A), y también en los análisis en los que se cuantificaron las células dendríticas CD8+ en el ganglio linfático de drenaje del tumor (FIG. 25B).
El tratamiento con terapia de triplete aumentó los niveles de células dendríticas CD11b+ en los tumores, medidas como células dendríticas CD11b+ por mg de tumor (FIG. 26A). También se observaron aumentos en las células dendríticas CD11b+ en el ganglio linfático de drenaje (FIG. 26B). La administración de la terapia de triplete provocó la alteración de la activación de CD86 en las células dendríticas CD11b+ en el ganglio linfático de drenaje (véase la FIG. 26C y FIG. 26D).
Las FIG. 27A y FIG. 27B muestran la activación de CD86 en cDC1 CD8 en el ganglio linfático de drenaje 24h y 72h después de la administración intratumoral de la terapia de triplete de ARNm a tumores MC38 medida como porcentaje de células cDC1 CD8 (FIG. 27A) o como intensidad de fluorescencia media (MFI) (FIG. 27B).
Además, después de la administración de las terapias de doblete y triplete, se observaron aumentos tempranos en CD86 y MHCI. CD86 y MHCI estaban más altos en las células dendríticas CD8+ después del tratamiento de doblete a las 7 horas, pero MHCI estaba más alto después del tratamiento con el triplete a los 7 días. En las células dendríticas CD103+ hubo aumentos tempranos en CD86 y MHCI observados después de la administración. En las células DC CD8+ en el ganglio linfático de drenaje también hubo un aumento de CD86 y MHCI después de la administración. CD 86 y el MHCI estaban más altos en los ganglios linfáticos de drenaje CD8+ después del doblete a las 72 horas, pero MHCI estaba más alto después del triplete a los 7 días (datos no mostrados).
La administración de la terapia de triplete también provocó aumentos en las células dendríticas inflamatorias (iDC) tanto en el tumor (FIG. 28A) como en el ganglio linfático de drenaje (FIG. 28B). Después de la administración de la terapia de triplete, también se observaron aumentos en CD86 en las células dendríticas inflamatorias (FIG. 28C y FIG. 28D).
El tratamiento con terapia de doblete o terapia de triplete también aumentó la relación CD8:Treg en los tumores MC38-R, demostrando una relación mejorada de células T efectoras a supresoras (FIG. 29). Este efecto fue más marcado 7 días después de la administración de la terapia de doblete o triplete.
Tras la activación, los subconjuntos de células T sin tratamiento previo experimentan proliferación y diferenciación en células efectoras, seguido de la generación de un conjunto de células T de memoria. Según el patrón y las funciones de migración, se clasifican en subconjuntos de memoria central (predominantemente dirigida a los ganglios linfáticos) y memoria efectora (predominantemente dirigida a sitios extralinfoides). El tratamiento con terapia de doblete o terapia de triplete aumentó las células T de memoria efectoras y centrales CD4+ (FIG. 30A) y CD8+ (FIG. 30B) dentro del tumor. La terapia de triplete de OX40L:IL-23:IL-36-gamma causó mayores aumentos de células de memoria efectoras en los tumores que el doblete IL-23:IL-36-gamma.
La FIG. 31 muestra el efecto de la depleción de las células T citotóxicas sobre la supervivencia de ratones inoculados con células tumorales MC38-R. Los ratones se trataron con dosis de 5 microgramos de triplete de ARNm administrados intratumoralmente. La flecha en el dibujo indicaba la fecha de administración de la terapia de triplete de ARNm. La depleción de anticuerpos (círculos) comenzó 2 días antes de la administración del ARNm. La supervivencia más larga se observó en ratones tratados con el triplete solo, con el triplete más un anticuerpo de control o con el triplete más anticuerpo anti-CD4. La coadministración del triplete más un anticuerpo anti-CD8 dio lugar a una disminución dramática en la tasa de supervivencia, demostrando que las células T citotóxicas eran esenciales para el beneficio de supervivencia de la terapia de triplete de OX40L:IL-23:IL-36-gamma.
Ejemplo 20
Eficacia del Tratamiento de Combinación que Comprende Terapia de Triplete de ARNm y Anticuerpos Anti-PDL1 en el Modelo MC38
La administración de terapia de doblete y triplete aumentó los niveles de PD-L1. Se observaron ligeros aumentos en los niveles de PD-L1 en células cancerosas, p. ej., CD45-, FsChi y MHCII-, después de la administración de la terapia de triplete (FIG. 32A y 32B).
La administración del doblete IL-23:IL-36-gamma también dio lugar a un aumento del porcentaje de células CD11b+ positivas para PD-L1 (FIG. 33A). Esta observación se correlacionó con un aumento en la expresión de PD-L1 en células CD11b+ (FIG. 33B). La administración de la combinación de triplete también dio lugar a un mayor porcentaje de células CD11 b+ positivas para PDL1 (FIG. 34A) y un aumento en la expresión de PDL1 en células CD11b+ (FIG. 34B).
El aumento en la expresión de PD-L1 en el modelo MC38 en respuesta al tratamiento con terapia de triplete de ARNm proporcionó una base racional para combinar la terapia de triplete con anticuerpos anti-PD-Ll. La dosificación de ARNm total fue de 5 ug de ARNm total, administrados intratumoralmente como una dosis única. El anticuerpo (anticuerpo anti-PD-Ll 10F.9G2 o control) se dosificó intraperitonealmente dos veces por semana a 10 mg/kg. No se observaron respuestas cuando el anticuerpo de control negativo (FIG. 35A) o el anticuerpo anti-PD-L1 (FIG. 35B) se administraron solos. Cuando se administró la terapia de triplete de ARNm (ARNm que codifican IL23, IL36 gamma y OX40L), no se observaron respuestas completas (FIG. 35C) pero 4 de 15 ratones mostraron tumores con un tamaño reducido. Por otro lado, cuando se administró la terapia de triplete de ARNm en combinación con el anticuerpo anti-PD-L1, 12 de 15 ratones experimentaron tamaños de tumor reducidos o respuestas completas (FIG. 35D). Estos datos indican que los tumores refractarios al tratamiento con una terapia convencional, p. ej., un anticuerpo anti-PD-Ll, pueden tratarse de manera efectiva combinando dicha terapia con varios ARNm descritos en la presente memoria (p. ej., una terapia triple que comprende ARNm que codifican IL-23, IL-36-gamma y OX40L).
Ejemplo 21
Eficacia de las Terapias de Doblete y Triplete en el Modelo Singénico de HCC
Los experimentos anteriores mostrados anteriormente indican que las terapias de combinación de ARNm, p. ej., las terapias de combinación de IL-23/IL-36-gamma (doblete) e IL-23/IL-36-gamma/OX40L (triplete) son eficaces en los modelos de adenocarcinoma de colon MC38, linfoma de células B de ratón A20 o melanoma B16F10-AP3. Cada una de las líneas celulares usadas en la presente divulgación, p. ej., las líneas celulares H22, MC38 y B16F10, pueden usarse para modelar distintos microentornos tumorales. Las células MC38 modelan un entorno inmunosupresor, mientras que las células B16F10 modelan un entorno inmunológicamente estéril. En el presente experimento. se evaluó la eficacia de las terapias de combinación de doblete y triplete en la línea celular singénica H22, una línea celular de hepatoma que modela un microentorno tumoral inflamado.
A los ratones se les administraron 2,5 ug de cada ARNm en la terapia de combinación de triplete (IL-23/IL-36-gamma/OX40L), es decir, un total de 7,5 ug formulados en nanopartículas lipídicas del Compuesto 18, o 7,5 ug de ARNm de control (NST-FIX). Los ARNm se dosificaron intratumoralmente Q7Dx3 (N=10 ratones/grupo). Después de 30 días, todos los ratones de control tenían tumores con volúmenes superiores a 1.500 mm3 (FIG.
36A). Por el contrario, ninguno de los ratones tratados con la terapia de triplete tenía tumores con volúmenes superiores a 1.500 mm3 (FIG. 36B), lo que indica que la terapia de combinación de triplete también fue eficaz en el modelo singénico de HCC.
Ejemplo 22
Eficacia de IL-36 humana frente a IL-36 de ratón como parte de OASIS en MC38-M(R)
Para determinar la eficacia de IL-36 gamma humana frente a IL-36 de ratón en la terapia de triplete de ARNm, se diseñó un estudio en el que se ensayaron múltiples combinaciones de ARNm que codifican OX40L, IL-23 e IL-36-gamma de ratón o IL-36-gamma humana. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 11.
Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38-M se establecieron por vía subcutánea en ratones C57BL/6 como se ha descrito anteriormente.
Una vez que se establecieron los tumores, los animales se dividieron en grupos y recibieron dosis intratumorales de una de las siguientes terapias de combinación que se muestran en la siguiente tabla. Cada grupo incluía 15 animales. Cada animal se dosificó qdx4 con una dosis total de ARNm de 5 ug/ratón en un volumen de dosis total de 25ul.
Tabla 11
Figure imgf000308_0001
Se observó una reducción en el tamaño tumoral cuando se usó IL-36-gamma humana o IL-36-gamma de ratón; sin embargo, la eficacia de la terapia de triplete usando IL-36 gamma de ratón fue superior (FIG. 37). Los datos muestran que la monoterapia con OX40L no dio lugar a una reducción del tamaño tumoral. La monoterapia con IL-23 dio lugar a una reducción del tamaño tumoral. Sin embargo, la respuesta del tumor a IL-23 fue más lenta que la respuesta a la combinación sinérgica de IL-23 y OX40L. Se observaron reducciones en el tamaño tumoral en todas las relaciones de mIL-36-gamma a OX40 e IL-23 ensayadas (FIG. 38A). Se observó un efecto similar con respecto a la combinación de triplete de ARNm que comprendía hIL-36-gamma, aunque el efecto de estas composiciones sobre el volumen tumoral medio fue menos pronunciado (FIG. 38B). Los datos correspondientes a cada grupo en el estudio y a cada animal individual se presentan en las FIG. 39A-390. Todos los animales del Grupo 8 (monoterapia con OX40L) fueron evasores (FIG. 39H). Cuatro animales en el Grupo (monoterapia con IL-23) respondieron completamente (FIG. 39I). La combinación de las monoterapias con OX40L e IL-23 dio lugar a 9 respondedores completos (FIG. 39E). Así, la combinación de las monoterapias con OX40L e IL-23 no fue aditiva sino sinérgica. La terapia de combinación más efectiva fue una terapia triple que comprendía un ARNm que codifica OX40L, un ARNm que codifica IL-23 y un ARNm de ratón que codifica IL-36 gamma en una relación 1:1:0,125 (FIG. 39D). Dicha terapia de triplete dio lugar a 10 respuestas completas más dos animales con volúmenes tumorales por debajo de 100 mm3. De los 15 animales del grupo, 2 fueron evasores. La FIG. 40 y las FIG. 41A-41O muestran el efecto de las diferentes terapias ensayadas sobre el peso corporal.
La FIG. 42 muestra el efecto de las diferentes terapias ensayadas en la tasa de supervivencia. Ningún animal tratado con monoterapia con OX40L sobrevivió más allá del día 30 del estudio. Después del día 50, la tasa de supervivencia de los animales tratados con monoterapia con IL-23 fue ligeramente inferior al 40 %. Sin embargo, la tasa de supervivencia de los animales tratados tanto con OX40L como IL-23 fue cercana al 70 % después del día 50, lo que nuevamente indica una acción sinérgica de la combinación de OX40L e IL-23. La tasa de supervivencia más alta correspondió a los animales tratados con terapia de triplete mOX40L:mIL-23:mIL-36-gamma en una relación 1:1:1 (tasa de supervivencia por encima del 90 %) o 1:1:0,5 (tasa de supervivencia del 80 %). Las tasas de supervivencia observadas cuando se usó IL-36-gamma de ratón fueron significativamente más altas que las tasas de supervivencia observadas cuando se usó IL-36-gamma humana.
Ejemplo 23
La terapia de doblete de ARNm es tan efectiva como la terapia de triplete de ARNm en un modelo de microentorno tumoral inflamado
Los experimentos se realizaron utilizando el modelo de tumor de ratones MC38-S como modelo para un microentorno tumoral inflamado. Los tumores se implantaron y los animales se trataron con terapia de doblete de ARNm, que codificaba IL-23 y OX40L (es decir, un cebador de la respuesta inmune y una señal coestimuladora de la respuesta inmune) o con terapia de triplete de ARNm, que codificaba IL-23, IL-36-gamma y OX40L (es decir, dos cebadores de la respuesta inmune y una señal coestimuladora de la respuesta inmune). La dosis total de ARNm por tratamiento fue de 5 |jg de ARNm. La cantidad total de ARNm en cada dosis se mantuvo constante añadiendo la cantidad apropiada de ARNm de control NST. Los ARNm se administraron como dosis intratumorales únicas. El volumen tumoral se midió a lo largo del tiempo después del implante. Los resultados se muestran en la FIG. 43A (terapia de triplete de ARNm) y la FIG. 43B (terapia de doblete de ARNm). Los resultados demuestran que tanto las terapias de doblete como de triplete de ARNm fueron eficaces para inhibir el crecimiento de los tumores en los animales.
Estos datos indican que el tratamiento efectivo de un tumor que tiene un microentorno tumoral inflamado se puede lograr utilizando ARNm(s) que codifica(n) un cebador de la respuesta inmune único y una señal coestimuladora de la respuesta inmune única (es decir, terapia de doblete de ARNm).

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un ARNm que codifica un polipéptido IL-23 para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el tratamiento es en combinación con ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma.
2. Un ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el tratamiento es en combinación con ARNm que codifica un polipéptido IL-23.
3. Una combinación de ARNm, en donde un primer ARNm codifica un polipéptido IL-23 y un segundo ARNm codifica un polipéptido IL-36-gamma.
4. La combinación de ARNm de la reivindicación 3, que comprende además un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.
5. Una combinación de ARNm como se define en la reivindicación 3 o 4, para su uso en un método para tratar el cáncer.
6. El ARNm para el uso de la reivindicación 1 o 2 o la combinación para el uso de la reivindicación 5, en donde el tratamiento comprende además la administración de un ARNm que codifica un polipéptido OX40L.
7. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el tratamiento y/o la combinación presenta además un polipéptido inhibidor de puntos de control o un ARNm que codifica un polipéptido inhibidor de puntos de control, en donde, opcionalmente, el polipéptido inhibidor de puntos de control es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, anti-CTLA4 o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo que se une específicamente a PD-1, PD-L1 o CTLA4, o una combinación de los mismos, en donde además, opcionalmente, el polipéptido inhibidor de puntos de control se selecciona de los anticuerpos anti-PDl nivolumab o pembrolizumab, de los anticuerpos anti-PD1-Ll atezolizumab, avelumab, durvalumab, o de los anticuerpos anti-CTLA-4 tremelimumab o ipilimumab, o una combinación de los mismos.
8. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde al menos uno de los ARNm se formula para ser encapsulado en una nanopartícula lipídica.
9. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de la reivindicación 8, en donde la nanopartícula lipídica comprende un aminolípido ionizable, en donde, opcionalmente, la nanopartícula lipídica comprende una relación molar de 20-60 % de aminolípido ionizable; 5-25 % de fosfolípido: 25-55 % de esterol; y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG; y/o, opcionalmente, el aminolípido ionizable es el Compuesto 18:
Figure imgf000310_0001
10. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde al menos dos de los ARNm se formulan en composiciones separadas.
11. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde todos los ARNm se formulan para ser encapsulados en la misma nanopartícula lipídica.
12. El ARNm para uso o combinación para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 5-10, en donde el método engloba la administración separada de uno o más de los ARNm concurrentemente o secuencialmente.
13. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde
(a) el ARNm que codifica un polipéptido IL-23
(i) codifica tanto un polipéptido IL-12p40 como un polipéptido IL-23p19; y/o
(ii) codifica un polipéptido IL-12p40, un polipéptido IL-23p19 y un conector posicionado operativamente entre el polipéptido I L-12p40 y el polipéptido IL-23p19, en donde, opcionalmente, el conector es un conector Gly/Ser, en donde, opcionalmente, el conector Gly/Ser comprende (GnS)m, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 y m es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, en donde además, opcionalmente, n es 6 y m es 1, o además, opcionalmente, el conector tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 136-139; o
(iii) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 o 140, o
(iv) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 141, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 141, o
(v) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 142, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 142, y/o
(b) el ARNm que codifica un polipéptido IL-36-gamma
(i) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a las SEQ ID NO: 10, 12 o 16, o
(ii) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 143, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 143, o
(iii) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 144, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 144,
14. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4­ 13, en donde el ARNm que codifica un polipéptido OX40L
(i) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a las SEQ ID NO: 2 y 21, o
(ii) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 145, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 145, o
(iii) comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 146, o al menos un 70 % o un 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 146,
15. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde cualquiera de dichos ARNm comprende además uno o más sitios de unión de microARN (miR), en donde, opcionalmente
(a) uno o más de dichos sitios de unión de miR están localizados en una 3' UTR; y/o
(b) uno o más de dichos sitios de unión de miR es un sitio de unión de miR-122, además, opcionalmente, un sitio de unión de miR-122-3p, un sitio de unión de miR-122-5p o ambos; y/o
(c) el ARNm comprende una 3' UTR que comprende al menos un sitio de unión de miR-122-5p.
16. El ARNm para uso, la combinación o la combinación para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde uno o más de los ARNm comprenden al menos un nucleósido modificado químicamente, opcionalmente, en donde el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, Nl-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos, además, opcionalmente, en donde el al menos un nucleósido modificado químicamente es Nlmetilpseudouridina, además, opcionalmente, en donde el ARNm es un ARNm completamente modificado con Nl-metilpseudouridina.
17. El ARNm para uso o combinación para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 5-15, en donde (a) el método es un método para reducir o disminuir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento tumoral; y/o (b) el método es un método para inducir la proliferación de células T, inducir la infiltración de células T en un tumor, inducir una respuesta de células T de memoria, aumentar el número de células NK; y/o
(c) el método es un método para
(i) cebar las células dendríticas;
(ii) promover la maduración de las células dendríticas;
(iii) promover la producción de citoquinas y/o quimioquinas en las células presentadoras de antígenos;
(iv) expandir o mantener las células Thl7;
(v) potenciar la diferenciación de Th1 y/o Th9; y
(vi) cualquier combinación de (c)(i)-(v);
(d) el método es un método para activar, estimular, promover o potenciar la proliferación de las células T, la supervivencia de las células T, el reclutamiento de las células T o una combinación de los mismos; y/o (e) el método es un método para activar, estimular, promover o potenciar la proliferación de las células NK, la supervivencia de las células NK, el reclutamiento de las células NK o una combinación de los mismos;
(f) el método es un método para
(i) promover o potenciar la expansión y/o función de las células T;
(ii) promover o potenciar el desarrollo de las células Th1, Th2 y/o Th9;
(iii) inhibir o suprimir el desarrollo y/o actividad de Treg;
(iv) promover o potenciar el desarrollo y/o actividad de las células de memoria; y
(v) cualquier combinación de (f)(i)-(iv);
(g) la administración de ARNm o combinación al sujeto da lugar a (i) un aumento en el nivel de granulocitos en una o más muestras obtenidas del sujeto en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36-gamma u OX40L; (ii) un aumento en el nivel de células dendríticas de presentación cruzada en una o más muestras obtenidas del sujeto en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL -36-gamma, u OX40L; (iii) un aumento en la relación de células T efectoras a supresoras en una o más muestras obtenidas del sujeto en relación con un nivel umbral o en relación con la relación después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (iv) un aumento en el nivel de células T efectoras de memoria en una o más muestras obtenidas del sujeto en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L; (v) un aumento en el nivel de expresión de PDL1 en una o más muestras obtenidas del sujeto en relación con un nivel umbral o en relación con el nivel después de la administración de un único polinucleótido que codifica un polipéptido IL-23, IL-36- gamma, u OX40L; o (vi) una combinación de los mismos; y/o
(h) uno o más de (i) infiltración de células T en un tumor del sujeto, (ii) infiltración de células T en un tumor del sujeto; y/o (iii) respuesta de células T de memoria en el sujeto, está/están dirigidas a una respuesta inmune antitumoral; y/o
(i) el método comprende la administración intratumoral de uno o más de dichos ARNm.
ES17727999T 2016-05-18 2017-05-18 Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos Active ES2932516T3 (es)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662338483P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338467P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338506P 2016-05-18 2016-05-18
US201662338496P 2016-05-18 2016-05-18
US201662404173P 2016-10-04 2016-10-04
US201662404175P 2016-10-04 2016-10-04
US201662415424P 2016-10-31 2016-10-31
US201662438942P 2016-12-23 2016-12-23
US201662438945P 2016-12-23 2016-12-23
US201762443693P 2017-01-07 2017-01-07
US201762472513P 2017-03-16 2017-03-16
US201762480400P 2017-04-01 2017-04-01
PCT/US2017/033395 WO2017201325A1 (en) 2016-05-18 2017-05-18 Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2932516T3 true ES2932516T3 (es) 2023-01-20

Family

ID=59009786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17727999T Active ES2932516T3 (es) 2016-05-18 2017-05-18 Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos

Country Status (18)

Country Link
US (10) US10172808B2 (es)
EP (2) EP3458474B1 (es)
JP (2) JP7194594B2 (es)
KR (2) KR102482867B1 (es)
CN (2) CN116726203A (es)
AU (2) AU2017266929B2 (es)
CA (1) CA3024917A1 (es)
DK (1) DK3458474T3 (es)
ES (1) ES2932516T3 (es)
HR (1) HRP20221135T8 (es)
HU (1) HUE059955T2 (es)
LT (1) LT3458474T (es)
MA (1) MA45035A (es)
PL (1) PL3458474T3 (es)
PT (1) PT3458474T (es)
RS (1) RS63625B1 (es)
SI (1) SI3458474T1 (es)
WO (1) WO2017201325A1 (es)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
RS63030B1 (sr) 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularno isporučivanje terapeutskih sredstava
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
RS63135B1 (sr) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx Inc Postupci upotrebe polinukleotida koji kodiraju ox40 ligand
JP2019519516A (ja) 2016-05-18 2019-07-11 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド がんの治療のためのｍＲＮＡ併用療法
KR102482867B1 (ko) 2016-05-18 2023-01-02 모더나티엑스, 인크. 면역 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 조합물 및 이의 용도
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MX2019011004A (es) * 2017-03-15 2020-08-10 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administracion intracelular de agentes terapeuticos.
WO2018170336A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
US12077501B2 (en) 2017-06-14 2024-09-03 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
WO2019067464A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University THERAPEUTIC AGENTS SPECIALLY ADMINISTERED BY EXOSOMES FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP3710020A4 (en) * 2017-11-14 2021-06-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center IL-36 SECRECTING IMMUNOREACTIVE CELLS AND RELATED USES
CN110055275A (zh) * 2018-01-19 2019-07-26 科济生物医药（上海）有限公司 一种质粒载体对、其修饰的免疫细胞及其应用
US20210061843A1 (en) * 2018-01-22 2021-03-04 Modernatx, Inc. Multimeric polynucleotides and uses thereof
EP4008333A1 (en) * 2018-02-19 2022-06-08 Combined Therapeutics, Inc. Compositions and methods for organ-protective expression and modulation of coding ribonucleic acids
CN113015540A (zh) * 2018-09-14 2021-06-22 莫得纳特斯公司 使用mrna治疗剂治疗癌症的方法和组合物
US20220001026A1 (en) * 2018-11-08 2022-01-06 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
US12042527B2 (en) 2019-01-08 2024-07-23 Modernatx, Inc. Use of mRNAs encoding OX40L, IL-23 and IL-36gamma in combination with immune checkpoint blockade for treating particular cancers
JOP20210186A1 (ar) 2019-01-10 2023-01-30 Janssen Biotech Inc مستضدات البروستاتا المستحدثة واستخداماتها
US20240108747A1 (en) * 2019-03-21 2024-04-04 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle conjugates and uses thereof
EP3946449A4 (en) * 2019-03-25 2022-11-09 Ohio State Innovation Foundation COMBINED IMMUNOREGULATION AND ITS USES
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
CA3139714A1 (en) 2019-07-12 2021-01-21 Wassana Yantasee Therapeutic constructs for co-delivery of mitotic kinase inhibitor and immune checkpoint inhibitor
KR20220101077A (ko) 2019-09-19 2022-07-19 모더나티엑스, 인크. 치료제의 세포내 전달을 위한 분지형 꼬리 지질 화합물 및 조성물
WO2021072172A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
AU2020366209A1 (en) 2019-10-15 2022-05-19 Board Of Regents Of The University Of Nebraska mRNA encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for treating Parkinson's disease
US12018289B2 (en) 2019-11-18 2024-06-25 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
TW202204309A (zh) 2020-04-09 2022-02-01 大陸商蘇州艾博生物科技有限公司 脂質奈米粒子組成物
WO2021204179A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Nucleic acid vaccines for coronavirus
AU2021270587A1 (en) 2020-05-14 2022-12-08 Modernatx, Inc. LNP compositions comprising an mRNA therapeutic and an effector molecule
EP4157319A1 (en) * 2020-05-28 2023-04-05 Modernatx, Inc. Use of mrnas encoding ox40l, il-23 and il-36gamma for treating cancer
AU2021297248A1 (en) 2020-06-23 2023-02-02 Modernatx, Inc. LNP compositions comprising mRNA therapeutics with extended half-life
US11611540B2 (en) * 2020-07-01 2023-03-21 Vmware, Inc. Protection of authentication data of a server cluster
CN111931428B (zh) * 2020-07-06 2023-06-20 武汉第二船舶设计研究所(中国船舶重工集团公司第七一九研究所) 一种用于优化海洋核动力平台的方法及系统
CN114073677B (zh) * 2020-08-20 2023-06-09 深圳深信生物科技有限公司 一种脂质纳米颗粒
CN112516378B (zh) * 2020-12-02 2022-02-11 浙江工业大学 一种植酸/丝素蛋白/煅烧白云石骨粘合剂的制备方法
WO2022120560A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种mRNA剂型的免疫抑制剂及其在制备肿瘤治疗药物中的应用
EP4277654A1 (en) 2021-01-18 2023-11-22 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
US20240148794A1 (en) 2021-02-12 2024-05-09 Modernatx, Inc. Lnp compositions comprising payloads for in vivo therapy
JP2024512026A (ja) 2021-03-24 2024-03-18 モデルナティエックス インコーポレイテッド オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療を目的とした脂質ナノ粒子及びオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240207444A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
CN115611757A (zh) * 2021-07-16 2023-01-17 江苏慧聚药业股份有限公司 mRNA传递剂的合成
EP4395748A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
EP4408871A1 (en) 2021-10-01 2024-08-07 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CN114231624A (zh) * 2021-10-28 2022-03-25 苏州大学附属第一医院 一种环状非编码rna在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用
EP4422698A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
EP4426340A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding integrin beta-6 and methods of use thereof
NL2030022B1 (en) 2021-12-03 2023-06-21 Wisdom Pharmaceutical Co Ltd SYNTHESIS OF mRNA TRANSMITTER
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
CN115304756B (zh) * 2022-01-30 2023-05-09 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
WO2023159197A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Modernatx, Inc. Mrnas encoding checkpoint cancer vaccines and uses thereof
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2023246840A1 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Wuhan Houxian Biopharmaceutical Co. Ltd. Combination of il-12 and ox40l for cancer immunotherapy
WO2024015724A1 (en) * 2022-07-10 2024-01-18 Precigen, Inc. POLYCISTRONIC miRNA CONSTRUCTS FOR IMMUNE CHECKPOINT INHIBITION
WO2024026254A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
WO2024064874A2 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel secretory signal peptides
CN115869332A (zh) * 2022-10-27 2023-03-31 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 递送至体内后在肝脏少表达的mRNA药物及其制备方法
US20240156949A1 (en) 2022-10-28 2024-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic Acid Based Vaccine
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease
CN115671045B (zh) * 2022-12-30 2023-04-07 华南理工大学 非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用
WO2024182301A2 (en) 2023-02-27 2024-09-06 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase (galt) for the treatment of galactosemia
WO2024184500A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 CureVac SE Novel lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2024206329A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Modernatx, Inc. Nucleic acid molecules encoding bi-specific secreted engagers and uses thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5082767A (en) 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
US6140496A (en) 1990-10-09 2000-10-31 Benner; Steven Albert Precursors for deoxyribonucleotides containing non-standard nucleosides
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
JP3748378B2 (ja) 1998-04-23 2006-02-22 タカラバイオ株式会社 Ｄｎａの合成方法
WO2000018778A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 Phylos, Inc. Synthesis of codon randomized nucleic acids
EP3214175A1 (en) 1999-08-24 2017-09-06 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human ctla-4 antibodies and their uses
DK1857122T3 (da) 2001-06-05 2011-03-21 Curevac Gmbh Stabiliseret mRNA med forøget G/C-indhold, kodende for et viralt antigen
DE60231901D1 (de) 2001-11-14 2009-05-20 Toyo Boseki Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
CA2409775C (en) 2001-12-03 2010-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro
CA2480504A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Evelina Angov Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
NZ563193A (en) 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
EP1907590B1 (en) 2005-06-30 2012-09-19 Archemix LLC T7 rna polymerase and methods for the generation of fully 2'-modified nucleic acid transcripts
DK1907424T3 (en) 2005-07-01 2015-11-09 Squibb & Sons Llc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED death ligand 1 (PD-L1)
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
WO2007113648A2 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
US20080046192A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Richard Lathrop Polypepetide-encoding nucleotide sequences with refined translational kinetics and methods of making same
CA2673029C (en) 2006-12-22 2017-03-28 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
EP2170959B1 (en) 2007-06-18 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
EP2205618B1 (en) 2007-09-26 2016-11-09 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
AU2008323770B2 (en) * 2007-11-07 2014-08-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for treatment of microbial disorders
SG10201408165WA (en) 2007-12-11 2015-01-29 Scripps Research Inst Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
PT2279254T (pt) * 2008-04-15 2017-09-04 Protiva Biotherapeutics Inc Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico
CN102036652B (zh) 2008-04-25 2016-04-13 西北大学 适于螯合胆甾醇的纳米结构
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
US7561973B1 (en) 2008-07-31 2009-07-14 Dna Twopointo, Inc. Methods for determining properties that affect an expression property value of polynucleotides in an expression system
US8126653B2 (en) 2008-07-31 2012-02-28 Dna Twopointo, Inc. Synthetic nucleic acids for expression of encoded proteins
US8401798B2 (en) 2008-06-06 2013-03-19 Dna Twopointo, Inc. Systems and methods for constructing frequency lookup tables for expression systems
SI2350129T1 (sl) 2008-08-25 2015-11-30 Amplimmune, Inc. Sestavki PD-1 antagonistov in postopek njihove uporabe
CN108997498A (zh) 2008-12-09 2018-12-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
US20110082055A1 (en) 2009-09-18 2011-04-07 Codexis, Inc. Reduced codon mutagenesis
US20130017199A1 (en) 2009-11-24 2013-01-17 AMPLIMMUNE ,Inc. a corporation Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
EP2619307A1 (en) 2010-09-21 2013-07-31 RiboxX GmbH Method for synthesizing rna using dna template
US9107887B2 (en) 2011-03-10 2015-08-18 Provectus Pharmaceuticals, Inc. Combination of local and systemic immunomodulative therapies for enhanced treatment of cancer
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
PL3351261T3 (pl) * 2011-10-11 2021-12-06 Universität Zürich Lek złożony zawierający IL-12 i środek do blokowania cząsteczek hamujących komórki T w terapii nowotworów
SI2785375T1 (sl) 2011-11-28 2020-11-30 Merck Patent Gmbh Protitelesa proti PD-L1 in uporabe le-teh
NZ628270A (en) 2012-02-14 2016-09-30 Merial Inc Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and ox40 proteins, and vaccines made therefrom
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
SG11201407190TA (en) 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
EP3434774A1 (en) 2013-01-17 2019-01-30 ModernaTX, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
CN106102774A (zh) * 2013-12-17 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
BR112016024644A2 (pt) 2014-04-23 2017-10-10 Modernatx Inc vacinas de ácido nucleico
US10682400B2 (en) 2014-04-30 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Combination vaccine devices and methods of killing cancer cells
EP3603661A3 (en) 2015-04-22 2020-04-01 CureVac AG Rna containing composition for treatment of tumor diseases
KR102482867B1 (ko) 2016-05-18 2023-01-02 모더나티엑스, 인크. 면역 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 조합물 및 이의 용도
JP2019519516A (ja) 2016-05-18 2019-07-11 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド がんの治療のためのｍＲＮＡ併用療法
KR102019331B1 (ko) 2017-07-05 2019-09-09 한국과학기술연구원 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법

Also Published As

Publication number Publication date
HUE059955T2 (hu) 2023-01-28
SI3458474T1 (sl) 2022-10-28
PL3458474T3 (pl) 2022-11-14
DK3458474T3 (da) 2022-09-26
CN109476718A (zh) 2019-03-15
HRP20221135T8 (hr) 2023-02-03
US20190111003A1 (en) 2019-04-18
US10285950B2 (en) 2019-05-14
US20230026381A1 (en) 2023-01-26
CA3024917A1 (en) 2017-11-23
MA45035A (fr) 2019-03-27
US20190105281A1 (en) 2019-04-11
KR20230008243A (ko) 2023-01-13
PT3458474T (pt) 2022-11-08
WO2017201325A1 (en) 2017-11-23
US10322091B2 (en) 2019-06-18
LT3458474T (lt) 2022-10-10
AU2023210606A1 (en) 2023-08-24
HRP20221135T1 (hr) 2022-11-25
US10322090B2 (en) 2019-06-18
KR20190020299A (ko) 2019-02-28
AU2017266929A8 (en) 2019-03-14
KR102482867B1 (ko) 2023-01-02
US11596609B2 (en) 2023-03-07
US20210038529A1 (en) 2021-02-11
US20200113844A1 (en) 2020-04-16
US11071716B2 (en) 2021-07-27
JP2023022326A (ja) 2023-02-14
US20180318229A1 (en) 2018-11-08
EP4137509A1 (en) 2023-02-22
US10172808B2 (en) 2019-01-08
WO2017201325A8 (en) 2018-08-30
RS63625B1 (sr) 2022-10-31
AU2017266929B2 (en) 2023-05-11
EP3458474B1 (en) 2022-07-06
US20190105280A1 (en) 2019-04-11
JP7194594B2 (ja) 2022-12-22
CN116726203A (zh) 2023-09-12
AU2017266929A1 (en) 2019-01-17
JP2019519517A (ja) 2019-07-11
US10406113B2 (en) 2019-09-10
US20190060246A1 (en) 2019-02-28
CN109476718B (zh) 2023-07-04
US20230041964A1 (en) 2023-02-09
US11185510B2 (en) 2021-11-30
US11344504B1 (en) 2022-05-31
EP3458474A1 (en) 2019-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2932516T3 (es) Combinaciones de ARNm que codifican polipéptidos inmunomoduladores y usos de los mismos
US11660341B2 (en) mRNA combination therapy for the treatment of cancer
US11311602B2 (en) Polynucleotides encoding interleukin-12 (IL12) and uses thereof