KR102019331B1 - 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법 - Google Patents

모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102019331B1
KR102019331B1 KR1020170085406A KR20170085406A KR102019331B1 KR 102019331 B1 KR102019331 B1 KR 102019331B1 KR 1020170085406 A KR1020170085406 A KR 1020170085406A KR 20170085406 A KR20170085406 A KR 20170085406A KR 102019331 B1 KR102019331 B1 KR 102019331B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacterium
leu
bacteria
polypeptide
gene
Prior art date
Application number
KR1020170085406A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190004966A (ko
Inventor
정학숙
지유현
안진수
권익찬
양은경
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020170085406A priority Critical patent/KR102019331B1/ko
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to JP2019571208A priority patent/JP6980041B2/ja
Priority to RU2020100484A priority patent/RU2751357C1/ru
Priority to AU2018296934A priority patent/AU2018296934B2/en
Priority to CN201880045296.5A priority patent/CN111492058B/zh
Priority to EP18828686.8A priority patent/EP3649244A4/en
Priority to US16/026,796 priority patent/US10557156B2/en
Priority to PCT/KR2018/007526 priority patent/WO2019009593A2/en
Priority to CA3068998A priority patent/CA3068998C/en
Publication of KR20190004966A publication Critical patent/KR20190004966A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102019331B1 publication Critical patent/KR102019331B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03027—Phosphatidylglycerophosphatase (3.1.3.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01027—Undecaprenyl-diphosphate phosphatase (3.6.1.27)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 구성적으로(constitutively) 생산하는 세균, 및 이를 이용한 MLA의 생산 방법에 의하면, 간단하고 산 가수분해 없이 MLA 및 유도체를 생산하고, 자연 돌연변이체 생성의 확률이 감소하고, MLA 및 유도체를 구성적으로 발현시켜 MLA 및 유도체의 수율을 높일 수 있다.

Description

모노포스포릴 지질 Ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 Ａ 생산 방법{Bacteria constitutively producing monophosphoryl lipid A, and method for the production of monophosphoryl lipid A using the same}
모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 MLA 생산 방법에 관한 것이다.
지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)는 그람 음성 세균의 펩티도글리칸을 둘러싸는 외막의 구성 성분 중 하나이다. LPS는 지질 A와 이에 공유결합으로 결합하는 여러 종류의 당이 결합한 것으로, LPS의 성분 중 지질 A가 그람-음성 세균의 독성을 담당하는 엔도톡신이라고 알려져 있다.
지질 A는 피코그람의 양으로 세포(예를 들어 단핵구 또는 대식구)를 활성화시키므로, 면역계를 활성화시키는 매우 강력한 자극제로 사용되고 있다. 지질 A, 그의 유도체, 또는 그의 변이체들은 예를 들어 백신의 성분(아쥬반트)로 사용된다. 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)는 아쥬반트, 알러지 면역 치료, 암 면역 치료에 사용되고 있으며, 또는 치매 예방 및 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 대장균과 같은 그람 음성균의 막에 존재하는 지질 A는 2-케토-3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonate: Kdo)와 같은 당이 결합된 것이다. 따라서, MLA를 생산하기 위해, 세균의 외막으로부터 LPS를 추출한 후, LPS를 산의 존재 하에서 가열하고 탄산 나트륨의 존재 하에서 가수분해시켜 Kdo와 1-인산기, 또는 아실 사슬을 제거하거나, 화학적으로 MLA를 합성하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이러한 방법들은 과정이 복잡하고 수율이 낮은 문제가 있다.
유전공학적 방법으로 외래 유전자를 세균에 도입할 경우, 세균은 외래 유전자의 발현을 막기 위해, 자연 돌연변이를 유도하여 외래 유전자를 제거할 수 있다. 이러한 자연 돌연변이체의 생성은 유전공학적 변형의 효율을 떨어뜨리는 원인이 될 수 있다.
그러므로, 기존 방법에 비해 간단하고 산 가수분해 없이 MLA 및 유도체를 생산하고, 자연 돌연변이체 생성의 확률이 감소하고, MLA 및 유도체를 구성적으로 발현시켜 수율을 높이는 방법을 개발할 필요가 있다.
MLA를 구성적으로 생산하는 세균을 제공한다.
MLA를 높은 수율로 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 구성적으로(constitutively) 생산하는 세균을 제공한다.
상기 모노포스포릴 지질 A의 지질 A는 2개의 글루코사민(탄수화물 또는 당)에 부착된 아실 사슬로 이루어져 있고, 일반적으로 각 글루코사민에 하나의 인산 그룹을 함유한다. 아실 사슬의 개수에 따라 트리, 테트라, 펜타, 헥사, 또는 헵타 아실화된 지질 A일 수 있다. 면역계를 잘 활성화시키는 지질 A는 6개의 아실 사슬을 포함하는 지질 A로 알려져 있고, 글루코사민에 직접 부착된 4개의 아실 사슬은 길이가 10 내지 22개의 탄소로 이루어진 베타 히드록시 아실 사슬이고, 2개의 추가적인 아실 사슬은 주로 베타 히드록시기에 부착된 것일 수 있다.
상기 MLA는 2개의 글루코사민 중 하나에만 1개의 인산기가 결합된 모노포스포릴 지질을 말한다. 상기 MLA는 트리, 테트라, 펜타, 헥사, 또는 헵타 아실화된 MLA일 수 있다. 예를 들어, 상기 MLA는 1-탈인산-지질 A, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 MLA는 2-케토-3-데옥시-D-만노-옥투로소네이트(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonate: Kdo)를 포함하지 않는 것일 수 있다. Kdo는 LPS의 구성 성분으로서, 거의 모든 LPS에서 발견되는 보존된 잔기이다.
상기 MLA는 살아있는 세균의 막, 예를 들어 외막에 존재하는 것일 수 있다.
용어 "세균(bacteria)"는 원핵 세균을 말한다. 상기 세균은 그람-음성(Gram-negative) 세균일 수 있다. 그람-음성 세균은 그람 염색법에 사용되는 크리스탈 바이올렛으로 염색되지 않는 종류의 세균을 말한다. 그람-음성 세균의 막은 각각의 이중막으로 이루어진 외막과 내막으로 이루어져 있고, 얇은 펩티도글리칸 층이 존재한다. 상기 세균은 에스케리치아(Escherichia) 속 세균, 시겔라(Shigella) 속 세균, 살모넬라(Salmonella) 속 세균, 캄피로박터(Campylobacter) 속 세균, 네이세리아(Neisseria) 속 세균, 헤모필루스(Haemophilus) 속 세균, 아에로모나스(Aeromonas) 속 세균, 프란시셀라(Francisella) 속 세균, 예르시니아(Yersinia) 속 세균, 클레브시엘라(Klebsiella) 속 세균, 보르데텔라(Bordetella) 속 세균, 레지오넬라(Legionella) 속 세균, 코리네박테리아(Corynebacteria) 속 세균, 시트로박터(Citrobacter) 속 세균, 클라미디아(Chlamydia) 속 세균, 브루셀라(Brucella) 속 세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균, 헬리코박터(Helicobacter) 속 세균, 부르크홀데리아(Burkholderia) 속 세균, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 세균, 리조비움(Rhizobium) 속 세균, 메소리조비움(Mesorhizobium) 속 세균 및 비브리오(Vibrio) 속 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세균일 수 있다. 세균은 예를 들어 대장균이다.
상기 세균은 MLA를 구성적으로 생산할 수 있다. 용어 "구성적으로(constitutively)"는 발현 유도제 또는 발현 유도 자극의 존재 유무와 관계없이 생산되는 것을 의미한다.
상기 세균은 LpxE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 3개 아미노산 모티브로 이루어진(tripartite) 활성 부위와 6 개의 막 통과 헬릭스를 포함하는 지질 인산 포스파타아제에 속한다. 지질 인산 포스파타아제는 인산 모노에스테르 결합에 특이적으로 결합하는 가수분해효소로서, 인산기를 포함하는 지질로부터 인산기(phosphate group)를 제거할 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 헬리코박터 속 세균, 아퀴펙스(Aquifex) 속 세균, 프란시셀라 속 세균, 보르데텔라 속 세균, 브루셀라 속 세균, 리조비움 속 세균, 메소리조비움 속 세균, 및 포르피로모나스 속 세균으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 세균의 LpxE 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 LpxE 폴리펩티드는 헬리코박터 파이로리 유래 LpxE(Helicobactor pylori LpxE 폴리펩티드(HpLpxE)일 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드는 돌연변이된 것일 수 있다.
상기 LpxE 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 세균의 염색체에 존재하는 것일 수 있다. 상기 LpxE 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 돌연변이된 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 야행형 LpxE 폴리펩티드의 N-말단으로부터 17번째 아미노산인 세린(17Ser)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 AGC에서 TCG로 돌연변이시킨 것이다.
상기 LpxE 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 구성적으로 발현될 수 있다. 용어 "구성적으로 발현(constitutively express)"은 발현 유도제 또는 발현 유도 자극의 존재 없이도 유전자를 발현시킬 수 있다는 것을 말한다.
상기 세균은 그의 세균 염색체에서 운데카프레닐 피로포스페이트 포스파타제(undecaprenyl pyrophosphate phosphatase: Und-PP 포스파타제)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 포스파티딜글리세로포스페이트 포스파타제(phosphatidylglycerophosphate phosphatase: PGP 포스파타제)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 돌연변이된 것일 수 있다. 용어 "세균 염색체(bacterial chromosome)"는 세균의 유전 정보로서, 환형의 DNA일 수 있다. 상기 세균 염색체는 플라스미드를 제외할 수 있다. 플라스미드(plasmid)는 세균 염색체와 물리적으로 분리되어 있고 독립적으로 복제할 수 있는 환형의 DNA를 말한다.
상기 Und-PP 포스파타제는 운데카프레닐 피로포스페이트의 탈인산화를 촉매하여 운데카프레닐 포스페이트를 생산하는 효소이다. 운데카프레닐 포스페이트는 세균의 외피(envelope)로 보내지는 탄화수소 중합체를 위한 글리칸 생합성 중간체(intermediate)의 지질 운반체이다.
상기 Und-PP 포스파타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 bacA 유전자, pgpB 유전자, ybjG 유전자, 또는 이들의 조합일 수 있다. bacA 유전자는 과발현시 항생물질인 바시트라신(bacitracin)에 저항성을 야기하는 유전자이다. pgpB 유전자는 파스파티딜글리세롤 포스페이트(phosphatidylglycerol phosphate: PGP)를 탈인산화시켜 포스파티딜 글리세롤(Phosphatidyl glycerol: PG)을 생성하는 과정을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자로서, 상기 효소는 Und-PP 포스파타제 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 ybjG 유전자는 과발현시 Und-PP 포스파타제 활성을 증가시키고 바시트라신에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 유전자이다.
상기 PGP 포스파타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pgpB 유전자, pgpA 유전자, pgpC 유전자, 또는 이들의 조합일 수 있다. pgpA 유전자 또는 pgpC 유전자는 PGP를 포스파티딜글리세롤로 탈인산화시키는 지질 포스파타제를 암호화하는 유전자이다.
상기 세균은 예를 들어, bacA 유전자, pgpB 유전자, 및 ybjG 유전자가 돌연변이된 것일 수 있다.
용어 "유전자(gene)"은 유전 정보의 단위로서, 폴리펩티드를 암호화하는 열린 해독 틀(open reading frame: ORF) 및 유전자의 전사(transcription)를 조절하는 조절 서열(regulatory sequence)을 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역인 프로모터(promoter), 전사를 촉진할 수 있는 인핸서(enhancer), 전사를 억제할 수 있는 사일런서(silencer), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "돌연변이(mutation)"는 유전 물질의 변이를 말하고, 점 돌연변이, 격자 이동(frame shift) 돌연변이, 삽입, 결실, 역위, 전좌 등을 포함한다. 돌연변이는 결실(deletion), 삽입(insertion), 점 돌연변이(point mutation), 격자 이동 돌연변이(frame shift mutation), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 점 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이일 수 있다. 상기 돌연변이에 의해 유전 물질이 상기 세균의 게놈으로부터 결실 또는 도입될 수 있다.
상기 세균은 LpxL 폴리펩티드 및 LpxM 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 유도성(inducible) 또는 구성적(constitutive)으로 발현될 수 있다. 유도성으로 발현된다는 것은 발현 유도제 또는 발현 유도 자극(예를 들어, 열 처리)에 의해 발현된다는 것을 말한다. 구성적으로 발현된다는 것은 발현 유도제 또는 발현 유도 자극의 존재 없이도 발현된다는 것을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 PL 프로모터, PR 프로모터, 및 PR' 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 상기 PL 프로모터, PR 프로모터, 및 PR' 프로모터는 람다 파지(Lambda phage) 유래 프로모터일 수 있다.
상기 LpxL 폴리펩티드는 지질 A 생합성 라우로일전이효소(lauroyltransferase)로서, 라우로일-아실 전달 단백질(acyl carrier protein: ACP)로부터 Kdo2-지질 IVA로 라우레이트(laurate)를 전이하여 Kdo2-(라우로일)-지질 IVA를 형성하는 것을 촉매하는 효소이다. 상기 LpxL 폴리펩티드는 에스케리치아 속 세균, 시겔라 속 세균, 살모넬라 속 세균, 캄피로박터 속 세균, 네이세리아 속 세균, 헤모필루스 속 세균, 아에로모나스 속 세균, 프란시셀라 속 세균, 예르시니아 속 세균, 클레브시엘라 속 세균, 보르데텔라 속 세균, 레지오넬라 속 세균, 코리네박테리아속, 시트로박터 속 세균, 클라미디아 속 세균, 브루셀라 속 세균, 슈도모나스 속 세균, 헬리코박터 속 세균, 부르크홀데리아 속 세균, 포르피로모나스 속 세균, 리조비움 속 세균, 메소리조비움 속 세균, 및 비브리오 속 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세균의 LpxL 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 LpxL 폴리펩티드는 대장균의 LpxL 폴리펩티드(EcLpxL)일 수 있다. 상기 LpxL 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 LpxL 폴리펩티드는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 90% 동일성, 80% 동일성, 70% 동일성, 60% 동일성, 50% 동일성, 40% 동일성, 30% 동일성, 20% 동일성, 또는 10% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 LpxM 폴리펩티드는 지질 A 생합성 미리스토일전이효소(myristoyltransferase)로서, 미리스토일-아실 전달 단백질로부터 Kdo2-라우로일-지질 IVA로 미리스테이트(myristate)를 전이하여 Kdo2-지질 A를 형성하는 것을 촉매하는 효소이다. 상기 LpxM 폴리펩티드는 에스케리치아 속 세균, 시겔라 속 세균, 살모넬라 속 세균, 캄피로박터 속 세균, 네이세리아 속 세균, 헤모필루스 속 세균, 아에로모나스 속 세균, 프란시셀라 속 세균, 예르시니아 속 세균, 클레브시엘라 속 세균, 보르데텔라 속 세균, 레지오넬라 속 세균, 코리네박테리아속, 시트로박터 속 세균, 클라미디아 속 세균, 브루셀라 속 세균, 슈도모나스 속 세균, 헬리코박터 속 세균, 부르크홀데리아 속 세균, 포르피로모나스 속 세균, 리조비움 속 세균, 메소리조비움 속 세균, 및 비브리오 속 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세균의 LpxM 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 LpxM 폴리펩티드는 대장균의 LpxM 폴리펩티드(EcLpxM)일 수 있다. 상기 LpxM 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 LpxM 폴리펩티드는 서열번호 6의 핵산 서열, 또는 서열번호 6의 핵산 서열과 90% 동일성, 80% 동일성, 70% 동일성, 60% 동일성, 50% 동일성, 40% 동일성, 30% 동일성, 20% 동일성, 또는 10% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 세균은 LpxT 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, PagP 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, KdtA 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 더 돌연변이된 것일 수 있다. 상기 LpxT 폴리펩티드는 내막 단백질(Inner membrane protein) LpxT이다. 상기 LpxT 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 LpxT 폴리펩티드는 예를 들어 대장균 LpxT 폴리펩티드이다. 상기 PagP 폴리펩티드는 지질 A 팔미토일전이효소(palmitoyltransferase)로서, 팔미테이트(palmitate)를 함유하는 헵타-아실 지질 A 종류의 생합성에 필요한 폴리펩티드이다. 상기 KdtA 폴리펩티드는 지질 IVA에 Kdo를 부착시키는 효소일 수 있다. 상기 KdtA 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열과 약 90% 동일성, 약 80% 동일성, 약 70% 동일성, 약 60% 동일성, 약 50% 동일성, 약 40% 동일성, 약 30% 동일성, 약 20% 동일성, 또는 약 10% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 KdtA 폴리펩티드는 예를 들어 대장균 KdtA 폴리펩티드이다.
상기 세균은 발현 유도제, 발현 유도 자극, 또는 이들의 조합에 의한 발현 유도 없이 MLA를 생산할 수 있다. 상기 발현 유도제는 유전자의 발현을 야기할 수 있는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 유도제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside: IPTG)이다. 상기 발현 유도 자극은 유전자의 발현을 야기할 수 있는 물리적 자극으로서, 예를 들어 열 처리(heat treatment 또는 heat shock)이다.
상기 세균은 항생제의 존재 없이 배양될 수 있다. 상기 항생제는 예를 들어 카나마이신, 암피실린, 클로람페니콜 또는 이들의 조합이다.
다른 양상은 MLA를 구성적으로 생산하는 일 양상에 따른 세균을 배양하는 단계; 배양물로부터 세균을 수득하는 단계; 및 수득된 세균으로부터 MLA를 수득하는 단계를 포함하는, MLA의 생산 방법을 제공한다.
상기 MLA, 구성적, 및 세균은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 MLA를 구성적으로 생산하는 일 양상에 따른 세균을 배양하는 단계를 포함한다.
배양 방법은 공지된 것일 수 있다. 배양 방법은 예를 들어, 회분 배양(batch culture), 유가 배양(fed-batch culture), 연속 배양(continuous culture), 발효(fermentation), 또는 이들의 조합이다.
배양액의 종류, 배양 온도, 배양 조건 등은 공지된 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 15℃ 내지 약 42℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 또는 약 30℃ 내지 약 37℃일 수 있다. 배양시 진탕 없이, 또는 진탕하면서 배양할 수 있다. 배양 시간은 예를 들어 약 1 시간 내지 약 1 주일, 약 3 시간 내지 약 6일, 약 6 시간 내지 약 5일, 약 9 시간 내지 약 4일, 약 12 시간 내지 약 3일, 약 18 시간 내지 약 2일, 약 1일, 또는 밤새일 수 있다. 배지는 항생제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 항생제는 예를 들어 카나마이신, 암피실린, 클로람페니콜, 또는 이들의 조합이다.
상기 세균을 배양하는 단계는 발현 유도제, 발현 유도 자극, 또는 이들의 조합 없이 배양하는 것일 수 있다.
상기 방법은 배양물로부터 세균을 수득하는 단계를 포함한다.
배양물로부터 세균을 수득하는 방법은 공지된 것일 수 있다. 예를 들어 원심분리를 통해 배양물로부터 세균을 수득할 수 있다. 수득된 세균은 완충액으로 세척될 수 있다.
상기 방법은 수득된 세균으로부터 MLA를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 MLA는 세균의 지질로부터 분리될 수 있다. 지질을 수득하는 방법은 공지된 것일 수 있다. MLA는 물리적 또는 화학적 방법으로 수득될 수 있다. 물리적 방법은 예를 들어 초음파 또는 냉해동 반복을 수행할 수 있다. 화학적 방법은 유기 용매를 사용하여 추출하는 것일 수 있다. 유기 용매는 예를 들어, 클로로포름, 디클로로메탄(dichloromethane), 메탄올, 헥산, 이소프로필 알콜, 에틸 아세테이트, 에탄올, 부탄올, 또는 이들의 조합일 수 있다. 지질을 추출하는 방법은 예를 들어 블라이와 다이어(Bligh and Dyer) 추출법(Bligh, E.G. and Dyer, W.J., Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol.37, p.911-917)일 수 있다. 상기 방법은 지질 중 MLA를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 MLA를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 MLA의 생산 방법에 의하면, 간단하고 산 가수분해 없이 MLA 및 유도체를 생산하고, 자연 돌연변이체 생성의 확률이 감소하고, MLA 및 유도체를 구성적으로 발현시켜 MLA 및 유도체의 수율을 높일 수 있다.
도 1은 세균에서 1-탈인산-지질 A를 생성하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 EcLpxL 및 EcLpxM을 포함하는 PCR 산물을 제조하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 3은 상동 재조합 방법을 이용하여 탈인산화 효소, lpxE로 대장균 염색체의 bacA를 대체하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 4는 염색체에 삽입된 탈인산화 효소의 활성을 안정화시킨 균주를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 대장균 게놈의 bacA를 제거하고 탈인산화 효소로 대체된 균주에서 추출된 지질의 TLC 결과를 나타내는 사진이다(레인 1: 1-탈인산-지질 A를 생산하는KHSC0044(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 8개 중 2개), 레인 2: 1-탈인산-지질 A를 생산하지 못하는 KHSC0044(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 8개 중 6개), 레인 3: 1-탈인산-지질 A를 생산하는 KHSC0031(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 6개), 레인 4: 1-탈인산-지질 A를 생산하지 못하는 KHSC0031(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 1개), 레인 5: 1-탈인산-지질 A를 생산하는 대장균 KHSC0045(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 7개 모두), 레인 6: 합성된 1-탈인산-헥사 아실화된 지질 A(InvovoGen), 레인 7: 살모넬라 미네소타 R595로부터 산염기 가수분해 후 분리정제한 1-탈인산-지질 A(InvovoGen).
도 6은 대장균 KHSC0045와 KHSC0055 지질의 TLC 결과를 나타내는 사진이다. 레인1: 합성된 1-탈인산-헥사 아실화된 지질 A(InvovoGen), 레인 2: 발현 유도제를 사용하여 지질화 효소의 과발현을 유도하여 배양한 KHSC0045, 레인 3: 발현 유도제의 사용 없이 배양한 KHSC0055).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대장균 LpxL 및 대장균 LpxM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터의 준비
1.1. pWSK29-EcLpxLEcLpxM의 준비
대장균 LpxL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 대장균 W3110 게놈(GenBank Accession No. NC_000918.1)(ATCC)으로부터 하기 프라이머 쌍을 사용한 제1 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여, 리보솜 결합 부위(ribosome binding site: RBS)를 포함한 EcLpxL 폴리펩티드(GenBank Accession No. BAA35852.1, 서열번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No. AP009048.1 (c1118159..1117239, 서열번호 2)를 증폭하였다.
LpxL 정방향 프라이머 P1: 5'-CGCAGTCTAGAAAGGAGATATATTGATGACGAATCTACCCAAGTTCTC-3' (서열번호 3)
LpxL 역방향 프라이머 P2: 5'-CGCTATTATTTTTTTTCGTTTCCATTGGTATATCTCCTTCTTATTAATAGCGTGAAGGAACGCCTTC-3' (서열번호 4)
대장균 LpxM 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 상기 대장균 W3110 게놈으로부터 하기 프라이머 쌍을 사용한 제2 PCR을 수행하여, RBS를 포함한 EcLpxM 폴리펩티드(GenBank Accession No. BAA15663.1, 서열번호 5)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No. AP009048.1 (c1941907..1940936, 서열번호 6)를 증폭하였다(도 2).
LpxM 정방향 프라이머 P3: 5'-GAAGGCGTTCCTTCACGCTATTAATAAGAAGGAGATATACCAATGGAAACGAAAAAAAATAATAGCG-3' (서열번호 7)
LpxM 역방향 프라이머 P4: 5'-GCAGAAGCTTTTATTTGATGGGATAAAGATCTTTGCG-3' (서열번호 8)
상기 제1 PCR로부터 수득된 EcLpxL 폴리뉴클레오티드 및 제2 PCR로부터 수득된 EcLpxM 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, 상기 LpxL 정방향 프라이머 P1과 LpxM 역방향 프라이머 P4를 사용한 제3 PCR을 수행하여 EcLpxL 폴리뉴클레오티드와EcLpxM 폴리뉴클레오티드가 융합된 EcLpxLEcLpxM 폴리뉴클레오티드를 증폭하였다.
상기 PCR을 위해, KOD 핫 스타트 DNA 중합효소(Novagen)를 사용하였고, T3000 thermocycler(Biometra)에서 수행하였다.
증폭된 산물을 DokDo-Prep PCR purification kit(ELPIS-BIOTECH. Inc.)를 사용하여 정제하고, 정제된 산물을 pWSK29 플라스미드(Wang, R. F., and Kushner, S. R., Gene(1991), vol.100, p.195-199)에 도입하였다. 클로닝된 플라스미드를 대장균 DH5α에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시키고, LB-암피실린 플레이트에서 선별하였다. 클로닝된 플라스미드를 pWSK29-EcLpxLEcLpxM으로 명명하였다(도 2 참조).
1.2. pKHSC0004 의 준비
pWSK29-EcLpxLEcLpxM의 프로모터 서열을 PL 프로모터 서열(5'-TTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACT-3': 서열번호 9)로 변이시키기 위해, 1.1에서 준비된 pWSK29-EcLpxLEcLpxM를 주형으로 하고, 하기 프라이머쌍을 사용하여 부위-특이적 돌연변이유도(site-directed mutagenesis)를 수행하였다.
PL 프로모터 정방향 프라이머: 5'-GGCAGTGAGCGCAACGCAGAATTCTTGACATAAA TACCACTGGCGGTGATACTTTCACACAGGAAACAGCTATGACC-3' (서열번호 10)
PL 프로모터 역방향 프라이머: 5'-GGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAGTATCACCG CCAGTGGTATTTATGTCAAGAATTCTGCGTTGCGCTCACTGCC-3' (서열번호 11)
상기 PCR을 위해, Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)을 사용하였고, T3000 thermocycler(Biometra)에서 수행하였다.
부위-특이적 돌연변이유도를 수행한 후, 반응물을 Dpn1 제한 효소(ELPIS-BIOTECH. Inc.)로 처리하였다. 그 후 대장균 DH5α에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시키고, LB-암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 얻어진 플라스미드를 pKHSC0004로 명명하였다.
1.3. pBAD30 - HpLpxE - frt - kan - frt 의 준비
1.3.1. pBAD30 - HpLpxE 의 준비
헬리코박터 파이로리 LpxE(Helicobactor pylori LpxE: HpLpxE)를 암호화하는 유전자 hp0021에서, HindIII 제한효소 인식 서열을 없애기 위해, N-말단으로부터 17번째 아미노산인 세린(17Ser)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 AGC에서 TCG로 돌연변이시켰다. 돌연변이된 hp0021유전자는 Integrated DNA technology(mBiotech, ROK)에서 합성하였다.
돌연변이된 hp0021를 주형으로 하고, 하기 프라이머쌍을 사용하여 HpLpxE 아미노산 서열(서열번호 12)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 13)를 증폭하였다.
돌연변이 HpLpxE 증폭용 정방향 프라이머: 5'-GATCCTCTAGAAAGGAGATATATTGATGAAAAAATTCTTATTTAAACAAAAATTT-3' (서열번호 14)
돌연변이 HpLpxE 증폭용 역방향 프라이머: 5'-AGCTACAAGCTTTTAAGGCTTTTTGGGGC-3' (서열번호 15)
PCR을 위해, KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제(Novagen)를 사용하였고, T3000 써모사이클러(Biometra)에서 수행하였다.
1.1에 기재된 바와 같이, PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 정제하였다. 정제된 산물을 pBAD30(Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J., J Bacteriol (1995). 177(14), p.4121-4130)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 1.1에 기재된 바와 같이 대장균에 형질전환하고 선별하였다. 클로닝된 플라스미드를 pBAD30-HpLpxE로 명명하였다.
1.3.2. pBAD30 - HpLpxE - frt - kan - frt 의 준비
HindIII 제한효소 인식 서열을 양쪽에 가진 frt-kan-frt 폴리뉴클레오티드는 하기 프라이머쌍과 pKD4(Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS(2000), vol.97, p.6640-6645) 플라스미드를 주형으로 증폭하였다.
frt-kan-frt 증폭용 정방향 프라이머: 5'-GCAGAAGCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3' (서열번호 16)
frt-kan-frt 증폭용 역방향 프라이머: 5'-GCAGAAGCTTATGAATATCCTCCTTAGTTCCTAT-3' (서열번호 17)
PCR을 위해, pfu DNA 폴리머라제(ELPIS-BIOTECH. Inc.)를 사용하였고, T3000 써모사이클러(Biometra)에서 수행하였다. 1.1에 기재된 바와 같이, PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 정제하였다.
정제된 산물을 1.3.1에 기재된 바와 같이 수득된 pBAD30-HpLpxE에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 1.1에 기재된 바와 같이 대장균에 형질전환하고 선별하였다. 클로닝된 플라스미드를 pBAD30-HpLpxE-frt-kan-frt로 명명하였다.
실시예 2. 대장균 스트레인의 준비
2.1. 대장균 KHSC0044( pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , bacA :: HpLpxE , kdtA::kan, W3110 ) 스트레인의 준비
2.1.1 lpxT 유전자가 게놈에서 제거된 대장균의 준비
대장균 게놈 중 LpxT 폴리펩티드(서열번호 18)를 코딩하는 lpxT 유전자(서열번호 19)에 카나마이신 카세트가 삽입된 대장균 스트레인 lpxT :: kan, W3110을 준비하였다.
pCP20 플라스미드(Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS(2000), vol.97, p.6640-6645)를 lpxT :: kan, W3110에 형질전환하였다. 선별된 대장균을 LB 고체 배지에 접종하고 42℃의 온도에서 선별하여, lpxT와 카나마이신 카세트가 제거된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, W3110을 준비하였다.
2.1.2 pagP 및 lpxT 유전자가 게놈에서 제거된 대장균의 준비
대장균 게놈 중 pagP 유전자에 카나마이신 카세트가 삽입된 대장균 스트레인 JW0617(pagP::kan)(Keio E.coli knockout library)으로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 2.1에서 준비된 △ lpxT, W3110 에 P1 바이러스를 형질도입시켰다. LB-카나마이신 고체 배지에서 선별하여, pagP 유전자 대신 pagP :: kan이 삽입된 대장균 스트레인, 즉 △ lpxT , pagP :: kan, W3110을 준비하였다.
2.1.1에 기재된 바와 같은 pCP20 플라스미드를 상기 △ lpxT , pagP :: kan, W3110에 형질전환하고 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 LB 고체 배지에 접종하고 42℃의 온도에서 선별하여, pagP와 카나마이신 카세트가 제거된 대장균 스트레인, 즉 △ lpxT , △pagP, W3110을 준비하였다.
2.1.3 lpxT 및 pagP 유전자가 게놈에서 제거되고 게놈의 bacA 유전자가 HpLpxE-frt-kan-frt 폴리뉴클레오티드로 대체된 대장균의 준비
bacA 유전자와 상동 재조합을 할 수 있는 bacA :: HpLpxE - frt - kan - frt 폴리뉴클레오티드를 준비하기 위해, 1.3.2에서 준비된 pBAD30-HpLpxE - frt - kan - frt를 주형으로 하고, 하기 프라이머쌍을 이용하여 증폭하였다.
bacA::HpLpxE-frt-kan-frt 증폭용 정방향 프라이머: 5'-AACCTGGTCATACGCAGTAGTTCGGACAAGCGGTACATTTTAATAATTTAGGGGTTTATTGATGAAAAAATTCTTATTTAAACAAAAAT-3' (서열번호 20)
bacA::HpLpxE-frt-kan-frt 증폭용 역방향 프라이머: 5'-TGACAACGCCAAGCATCCGACACTATTCCTCAATTAAAAGAACACGACATACACCGCAGCCGCCACATGAATATCCTCCTTAGTTCCTA-3' (서열번호 21)
PCR을 위해, pfu DNA 폴리머라제(ELPIS)를 사용하였고, T3000 써모사이클러(Biometra)에서 수행하였다.
1.1에 기재된 바와 같이, PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 정제하였다. 정제된 산물은 대장균 DY330(Yu, D., et. al., PNAS. (2000). 97(11), p5978-5983)에 전기천공법으로 형질전환하였다. 형질전환에 의해, DY330 게놈의 bacA 유전자 위, 아래 염기 서열과의 상동 재조합과정을 통해 bacA :: HpLpxE - frt - kan - frt, DY330 대장균을 제조하였다(도 3 참조).
bacA :: HpLpxE - frt - kan - frt, DY330 로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 상기 P1 바이러스를 2.1.2에서 준비된 대장균 △lpxT, △pagP, W3110 스트레인에 형질도입하고 LB-카나마이신 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 △lpxT, △pagP, bacA::HpLpxE-frt-kan-frt, W3110으로 명명하였다(도 3 참조).
2.1.4 lpxT 및 pagP 유전자가 게놈에서 제거되고 게놈의 bacA 유전자가 HpLpxE 유전자로 대체된 대장균의 준비
2.1.1에 기재된 바와 같은 pCP20 플라스미드를 2.1.3에 기재된 바와 같이 준비된 △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE - frt - kan - frt , W3110에 형질전환시키고 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 LB 고체 배지에 접종하고 42℃의 온도에서 선별하여, bacA와 카나마이신 카세트가 제거되고 HpLpxE가 도입된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , W3110을 준비하였다(도 3 및 도 4의 첫번째 줄에서 왼쪽 참조).
2.1.5 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인의 준비
1.1에 기재된 바와 같이 준비된 pWSK29-EcLpxLEcLpxM 플라스미드를 2.1.4에서 기재된 바와 같이 준비된 △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , W3110에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 선별하여, 대장균 pWSK29-EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인을 준비하였다(도 4의 첫번째 줄에서 가운데 참조).
2.1.6 대장균 KHSC0044 스트레인의 준비
대장균 염색체 중 KdtA 폴리펩티드(서열번호 22)를 코딩하는 kdtA 유전자(서열번호 23)에 카나마이신 카세트가 삽입되어 있고 pEcKdtA 플라스미드를 포함하고 있는 대장균, 즉 HSC1/pEcKdt(Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry(2010), vol.49(19), p.4126-4137)로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 상기 P1 바이러스를 2.1.5에서 준비된 대장균 pWSK29-EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인에 형질도입하였다(도 3 참조). 대장균을 선별하여, 대장균 KHSC0044(pWSK29-EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , kdtA :: kan, W3110)로 명명하였다(도 4의 첫번째 줄에서 오른쪽 참조).
2.2. 대장균 KHSC0031( pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , bacA::HpLpxE, kdtA :: kan , W3110 ) 스트레인의 준비
2.2.1 lpxT , pagP , ybjG 유전자가 게놈에서 제거되고 게놈의 bacA 유전자가 HpLpxE 유전자로 대체된 대장균의 준비
대장균 게놈 중 ybjG 유전자에 카나마이신 카세트가 삽입된 대장균 스트레인(JW5112(ybjG::kan))(Keio E.coli knockout library)으로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 2.1.4에서 준비된 △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , W3110에 P1 바이러스를 형질도입하였다. 대장균을 LB-카나마이신 고체 배지에서 선별하여, ybjG 유전자 대신 ybjG :: kan가 삽입된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, △pagP, bacA :: HpLpxE , ybjG :: kan, W3110을 준비하였다.
2.1.1에 기재된 바와 같은 pCP20 플라스미드를 상기 △lpxT, △pagP, bacA::HpLpxE, ybjG :: kan, W3110에 형질전환시키고 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 LB-암피실린 고체 배지에서 선별한 후, 접종하고 42℃의 온도에서 선별하여, ybjG와 카나마이신 카세트가 제거된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, △pagP, △ybjG , bacA :: HpLpxE , W3110을 준비하였다(도 4의 두번째 줄에서 왼쪽 참조)
2.2.2 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , bacA :: HpLpxE , kdtA::kan, W3110 스트레인의 준비
1.1에 기재된 바와 같이 준비된 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM 플라스미드를 2.2.1에서 기재된 바와 같이 준비된 △lpxT, △pagP, △ybjG , bacA :: HpLpxE , W3110에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하여, 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인을 준비하였다(도 4의 두번째 줄에서 가운데 참조).
2.2.3 대장균 KHSC0031 스트레인의 준비
2.1.6에 기재된 바와 같은 HSC1/pEcKdt로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 상기 P1 바이러스를 2.2.2에서 준비된 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인에 형질도입하고 LB-카나마이신/암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 KHSC0031(pWSK29 - EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, bacA :: HpLpxE , kdtA :: kan, W3110)로 명명하였다(도 4의 두번째 줄에서 오른쪽 참조).
2.3. 대장균 KHSC0045( pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , △pgpB, bacA :: HpLpxE , kdtA :: kan , W3110 ) 스트레인의 준비
2.3.1 lpxT , pagP , ybjG , 및 pgpB 유전자가 게놈에서 제거되고 게놈의 bacA 유전자가 HpLpxE 유전자로 대체된 대장균의 준비
대장균 게놈 중 pgpB 유전자에 카나마이신 카세트가 삽입된 대장균 스트레인(JW1270(pgpB::kan))(Keio E.coli knockout library)으로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 2.2.1에서 준비된 △lpxT, △pagP, △ybjG , bacA :: HpLpxE , W3110에 P1 바이러스를 형질도입시키고 LB-카나마이신 고체 배지에서 선별하여, pgpB 유전자 대신 pgpB :: kan가 삽입된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, △pagP, △ybjG , bacA :: HpLpxE , pgpB :: kan W3110을 준비하였다.
2.1.1에 기재된 바와 같은 pCP20 플라스미드를 상기 △lpxT, △pagP, △ybjG, bacA :: HpLpxE , pgpB :: kan, W3110에 형질전환시키고 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 LB 고체 배지에 접종하고 42℃의 온도에서 선별하여, pgpB와 카나마이신 카세트가 제거된 대장균 스트레인, 즉 △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110을 준비하였다(도 4의 세번째 줄에서 왼쪽 참조).
2.3.2 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , △ pgpB , bacA::HpLpxE, kdtA::kan, W3110 스트레인의 준비
1.1에서 준비된 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM 플라스미드를 2.3.1에서 준비된 △lpxT, △pagP, △ybjG , △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하여, 대장균 pWSK29- EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA::HpLpxE, W3110 스트레인을 준비하였다(도 4의 세번째 줄에서 가운데 참조).
2.3.3 대장균 KHSC0045 스트레인의 준비
2.1.6에 기재된 바와 같은 HSC1/pEcKdt(Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry(2010), vol.49(19), p.4126-4137)로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 상기 P1 바이러스를 2.3.2에서 준비된 대장균 pWSK29 - EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인에 형질도입하고 LB-카나마이신/암피실린 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 KHSC0045(pWSK29-EcLpxLEcLpxM, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , kdtA::kan, W3110)로 명명하였다(도 4의 세번째 줄에서 오른쪽 참조).
2.4. 대장균 KHSC0055( pKHSC0004 , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , △ pgpB , bacA::HpLpxE, kdtA :: kan , W3110 ) 스트레인의 준비
2.4.1 대장균 pKHSC0004 , △ lpxT , △ pagP , △ ybjG , △ pgpB , bacA :: HpLpxE , kdtA::kan, W3110 스트레인의 준비
1.2에서 준비된 pKHSC0004 플라스미드를 2.3.1에서 준비된 △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 LB-암피실린 고체 배지에서 선별하여, 대장균 pKHSC0004, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인을 준비하였다(도 4의 네번째 줄에서 왼쪽 참조).
2.4.2 대장균 KHSC0055 스트레인의 준비
대장균 염색체 중 KdtA 폴리펩티드(서열번호 22)를 코딩하는 kdtA 유전자(서열번호 23)에 카나마이신 카세트(frt-kan-frt)가 삽입되고 pEcKdtA 플라스미드를 포함하고 있는 대장균을 하기 방법으로 준비하였다.
kdtA 유전자와 상동 재조합할 수 있는 kdtA :: frt - kan - frt 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위해, pKD4(Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS(2000), vol.97, p.6640-6645) 플라스미드를 주형으로 하고, 하기 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다.
kdtA::frt-kan-frt 증폭용 정방향 프라이머:
5'-GCTAAATACATAGAATCCCCAGCACATCCATAAGTCAGCTATTTACTATGCTCGAATTGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (서열번호 24)
kdtA::frt-kan-frt 증폭용 역방향 프라이머:
5'-ATCGATATGACCATTGGTAATGGGATCGAAAGTACCCGGATAAATCGCCCGTTTTTGCATTGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCC-3' (서열번호 25)
PCR을 위해, pfu DNA 폴리머라제(ELPIS)를 사용하였고, T3000 써모사이클러(Biometra)에서 수행하였다.
1.1에 기재된 바와 같이, PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 정제하였다. 정제된 산물을 pEcKdtA(Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry(2010), vol.49(19), p.4126-4137)플라스미드를 포함하고 있는 대장균 DY330에 전기천공법으로 형질전환하였다. 형질전환에 의해, DY330 게놈의 kdtA 유전자 위, 아래 염기 서열과의 상동 재조합 과정을 통해 pEcKdtA, kdtA :: frt - kan - frt, DY330 대장균을 제조하였다(도 3 참조). pEcKdtA, kdtA :: frt - kan - frt, DY330으로부터 P1 바이러스를 준비하였다. 상기 P1 바이러스를 2.4.1에서 준비된 대장균 pKHSC0004, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , W3110 스트레인에 형질도입하고 LB-카나마이신 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 대장균을 KHSC0055(pKHSC0004, △lpxT, △pagP, △ybjG, △pgpB, bacA :: HpLpxE , kdtA :: frt - kan - frt, W3110)로 명명하였다(도 4의 네번째 줄에서 오른쪽 참조).
실시예 3. KHSC0044 , KHSC31 , KHSC0045 , 및 KHSC0055 대장균에서 지질 조성의 확인
3.1 KHSC0044 , KHSC0031 , 및 KHSC0045 의 배양
각각 2.1.6, 2.2.3, 및 2.3.3에 기재된 바와 같이 대장균 KHSC0044, KHSC0031, 및 KHSC0045을 준비하였다.
각 대장균 스톡(stock)으로부터 50 ㎍/㎖의 암피실린(EMD millipore) 및 1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)(UBP Bio)를 함유하는 LB 고체 배지에 접종하여 재배양하였다. KHSC0044(8개 콜로니), KHSC0031(7개 콜로니), 및 KHSC0045(7개 콜로니)를 선택하여 각각 50 ㎍/㎖의 암피실린(EMD millipore) 및 1 mM의 IPTG를 함유하는 3 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린 및 1 mM의 IPTG를 함유하는 200 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하여 OD600이 0.06 내지 0.1이 되게 희석하고 30℃에서 밤새 배양하였다.
3.2 KHSC0055 의 배양
2.4.2에 기재된 바와 같이 대장균 KHSC0055를 준비하였다.
KHSC0055 스톡으로부터 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지 3 ㎖에 접종하고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 200 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 밤새 배양하였다.
3.3 KHSC0044 , KHSC0031 , KHSC0045 , 및 KHSC0055 대장균으로부터 지질의 추출
3.1과 3.2에 기재된 바와 같이 배양한 대장균 배양액을 상온에서 4000x g의 속도로 약 20분 동안 원심분리하여 각 스트레인의 대장균을 수득하였다. 수득된 대장균을 30 ㎖의 PBS로 세척한 후 8 ㎖의 PBS에 재현탁하였다.
재현탁된 대장균에 10 ㎖의 클로로포름 및 20 ㎖의 메탄올을 가하고, 가끔씩 진탕하면서 약 1 시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 혼합물을 상온에서 2500x g의 속도로 약 30분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액에 10 ㎖의 클로로포름 및 10 ㎖의 물을 가하고 완전히 혼합한 다음, 상온에서 2500x g의 속도로 약 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 혼합물에서 유기 용매 층을 분리하고, 상부의 수성 층에 미리 평형화된 유기 용매 층을 첨가하여 유기 용매 층을 2회 추출하였다. 유기 용매 층을 풀링(pooling)하고, 회전 증발기에서 건조시켜 지질을 수득하였다. 수득된 지질을 5 ㎖의 4:1(v/v) 클로로포름:메탄올에 용해시키고, 수조에서 초음파를 조사하였다. 초음파가 조사된 지질을 새로운 시험관으로 옮기고, 수득된 지질을 상온에서 질소 가스 하에서 건조시킨 후 -80℃에서 보관하였다.
3.4. 지질의 TLC 분석
3.3에 기재된 바와 같이 분리된 각 스트레인의 대장균으로부터 막의 지질을 확인하였다. 양성 대조군으로 MPLA Synthetic(InvovoGen, 카탈로그 코드: tlrl-mpls, 합성된 1-탈인산-헥사아실화된 지질 A(도 5의 레인 6, 도 6의 레인 1) 및 MPLA-SM(InvovoGen, 카탈로그 코드 tlrl-mpla, 살모넬라 미네소타 R595의 LPS를 산염기 가수분해한 후 분리 정제한 1-탈인산-지질 A)(도 5의 레인 7)를 사용하였다.
얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC)를 수행하기 위해, 3.2에 기재된 바와 같이 200 ㎖의 대장균 배양액으로부터 지질을 수득하고, 수득된 총 지질의 1/3을 200 ㎕의 4:1(v/v) 클로로포름:메탄올에 용해시켰다. 그 후, 5 ㎕ 내지 15 ㎕를 10 x 10 cm HPTLC 플레이트(EMD Chemicals)에 스폿팅(spotting)하고, 40:25:4:2(v/v)의 클로로포름:메탄올:물:암모늄 히드록시드(28%(v/v) 암모니아)의 용매에서 전개하였다. 전개된 플레이트를 건조시키고, 10%(v/v) 황산(에탄올 중)으로 분무하여 시각화하고, 300℃의 핫 플레이트에서 그을렸다. 지질의 TLC 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5는 대장균 게놈의 bacA를 제거하고 탈인산화 효소로 대체된 균주에서 추출된 지질의 TLC 결과를 나타내는 사진이다. 도 4의 레인 1은 1-탈인산-지질 A를 생산하는 KHSC0044(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 8개 중 2개)이고, 레인 2는 1-탈인산-지질 A를 생산하지 못하는 KHSC0044(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 8개 중 6개)이다. 레인 3은 1-탈인산-지질 A를 생산하는 KHSC0031(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 6개)이고, 레인 4는 1-탈인산-지질 A를 생산하지 못하는 KHSC0031(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 1개)이다. 레인 5는 1-탈인산-지질 A를 안정적으로 생산하는 대장균 KHSC0045(동일한 세포 스톡에서 배양한 콜로니 7개 중 7개 모두)이고, 레인 6은 합성된 1-탈인산-헥사아실화된 지질 A(InvovoGen, 카탈로그 코드 tlrl-mpls)이다. 레인 7은 살모넬라 미네소타 R595로부터 산염기 가수분해 후 분리 및 정제한 1-탈인산-지질 A(InvovoGen, 카탈로그 코드: tlrl-mpla)이다.
도 6은 대장균 KHSC0045와 KHSC0055지질의 TLC 결과를 나타내는 사진이다. 도 6에서 레인 1은 합성된 1-탈인산-헥사아실화된 지질 A(InvovoGen, 카탈로그 코드 tlrl-mpls)이고, 레인 2는 과발현 유도제를 사용하여 지질화 효소의 과발현을 유도하여 배양한 KHSC0045이고, 및 레인 3은 과발현 유도제의 사용 없이 배양한 KHSC0055이다.
도 5에 나타난 바와 같이, KHSC0044 및 KHSC0031은 각각 하나의 콜로니로부터 만들어진 세포 스톡임에도 불구하고, 선택된 8개의 KHSC0044 콜로니 중에서 1-탈인산-지질 A가 검출된 경우(레인 1, 8개의 콜로니 중 2개)와 검출되지 않는 경우(레인 2, 8개의 콜로니 중 6개), 선택된 7개의 KHSC0031 콜로니 중에서 1-탈인산-지질 A 가 검출된 경우(레인 3, 7개의 콜로니 중 6개)와 검출되지 않는 경우(레인 4, 7개의 콜로니 중 1개)가 존재함을 확인하였다. 이에 반해, KHSC0045는 선택된 7개의 콜로니 모두에서 1-탈인산-지질 A가 검출됨을 확인되었다(레인 5).
이러한 결과는 대장균의 게놈에 탈인산화 효소를 삽입하는 경우, 대장균은 1-탈인산-지질 A를 생산하는 균주에서 삽입된 탈인산화 효소의 활성을 불활성화시켜 1-탈인산-지질 A를 생산하지 못하는 균주들로 쉽게 자연돌연변이체 대장균을 형성함을 알 수 있다.
따라서 탈인산화 효소를 게놈에 삽입하고 1-탈인산-지질 A를 생성하기 위해, 대장균의 게놈에 존재하는 운데카프레닐 피로포스페이트 포스파타제(undecaprenyl pyrophosphate phosphatase: Und-PP 포스파타제) 유전자(bacA, pgpB, 또는 ybjG) 또는 포스파티딜글리세로포스페이트 포스파타제(phosphatidylglycerophosphate phosphatase: PGP 포스파타제) 유전자(pgpB, pgpA, 또는 pgpC)의 각각 혹은 이들의 조합을 게놈에서 제거하여야(도 5의 레인 1, 레인 3, 또는 레인 5), 대장균으로부터 1-탈인산-지질 A를 안정적으로 생성하고 자연 돌연변이의 확률이 감소한 살아있는 대장균을 수득할 수 있음을 확인하였다.
KHSC0045 대장균은 배양시 지질화 효소를 과발현시켜야만 1-탈인산-헥사아실화된 지질 A를 효과적으로 생성할 수 있다. 합성된 1-탈인산-헥사 아실화된 지질 A(도 6의 레인 1)와 과발현 유도제를 사용하여 지질화 효소의 과발현을 유도하여 배양한 KHSC0045를 양성 대조군으로 사용하여 막 지질 성분을 비교한 결과, pKHSC0004로 형질전환시킨 대장균 KHSC0055는 과발현 유도제의 사용 없이도 1-탈인산-헥사 아실화된 지질 A(도 6의 레인 3)를 효과적으로 생산하는 살아있는 대장균임을 확인하였다(도 6의 레인 3).
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Bacteria constitutively producing monophosphoryl lipid A, and method for the production of monophosphoryl lipid A using the same <130> KI-118433-KR <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli LpxL polypeptide <400> 1 Met Thr Asn Leu Pro Lys Phe Ser Thr Ala Leu Leu His Pro Arg Tyr 1 5 10 15 Trp Leu Thr Trp Leu Gly Ile Gly Val Leu Trp Leu Val Val Gln Leu 20 25 30 Pro Tyr Pro Val Ile Tyr Arg Leu Gly Cys Gly Leu Gly Lys Leu Ala 35 40 45 Leu Arg Phe Met Lys Arg Arg Ala Lys Ile Val His Arg Asn Leu Glu 50 55 60 Leu Cys Phe Pro Glu Met Ser Glu Gln Glu Arg Arg Lys Met Val Val 65 70 75 80 Lys Asn Phe Glu Ser Val Gly Met Gly Leu Met Glu Thr Gly Met Ala 85 90 95 Trp Phe Trp Pro Asp Arg Arg Ile Ala Arg Trp Thr Glu Val Ile Gly 100 105 110 Met Glu His Ile Arg Asp Val Gln Ala Gln Lys Arg Gly Ile Leu Leu 115 120 125 Val Gly Ile His Phe Leu Thr Leu Glu Leu Gly Ala Arg Gln Phe Gly 130 135 140 Met Gln Glu Pro Gly Ile Gly Val Tyr Arg Pro Asn Asp Asn Pro Leu 145 150 155 160 Ile Asp Trp Leu Gln Thr Trp Gly Arg Leu Arg Ser Asn Lys Ser Met 165 170 175 Leu Asp Arg Lys Asp Leu Lys Gly Met Ile Lys Ala Leu Lys Lys Gly 180 185 190 Glu Val Val Trp Tyr Ala Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Arg Ser Ser 195 200 205 Val Phe Val Pro Leu Phe Ala Val Glu Gln Ala Ala Thr Thr Thr Gly 210 215 220 Thr Trp Met Leu Ala Arg Met Ser Gly Ala Cys Leu Val Pro Phe Val 225 230 235 240 Pro Arg Arg Lys Pro Asp Gly Lys Gly Tyr Gln Leu Ile Met Leu Pro 245 250 255 Pro Glu Cys Ser Pro Pro Leu Asp Asp Ala Glu Thr Thr Ala Ala Trp 260 265 270 Met Asn Lys Val Val Glu Lys Cys Ile Met Met Ala Pro Glu Gln Tyr 275 280 285 Met Trp Leu His Arg Arg Phe Lys Thr Arg Pro Glu Gly Val Pro Ser 290 295 300 Arg Tyr 305 <210> 2 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Escherichia coli LpxL polypeptide <400> 2 atgacgaatc tacccaagtt ctccaccgca ctgcttcatc cgcgttattg gttaacctgg 60 ttgggtattg gcgtactttg gttagtcgtg caattgccct acccggttat ctaccgcctc 120 ggttgtggat taggaaaact ggcgttacgt tttatgaaac gacgcgcaaa aattgtgcat 180 cgcaacctgg aactgtgctt cccggaaatg agcgaacaag aacgccgtaa aatggtggtg 240 aagaatttcg aatccgttgg catgggcctg atggaaaccg gcatggcgtg gttctggccg 300 gaccgccgaa tcgcccgctg gacggaagtg atcggcatgg aacacattcg tgacgtgcag 360 gcgcaaaaac gcggcatcct gttagttggc atccattttc tgacactgga gctgggtgcg 420 cggcagtttg gtatgcagga accgggtatt ggcgtttatc gcccgaacga taatccactg 480 attgactggc tacaaacctg gggccgtttg cgctcaaata aatcgatgct cgaccgcaaa 540 gatttaaaag gcatgattaa agccctgaaa aaaggcgaag tggtctggta cgcaccggat 600 catgattacg gcccgcgctc aagcgttttc gtcccgttgt ttgccgttga gcaggctgcg 660 accacgaccg gaacctggat gctggcacgg atgtccggcg catgtctggt gcccttcgtt 720 ccacgccgta agccagatgg caaagggtat caattgatta tgctgccgcc agagtgttct 780 ccgccactgg atgatgccga aactaccgcc gcgtggatga acaaagtggt cgaaaaatgc 840 atcatgatgg caccagagca gtatatgtgg ttacaccgtc gctttaaaac acgcccggaa 900 ggcgttcctt cacgctatta a 921 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LpxL forward primer P1 <400> 3 cgcagtctag aaaggagata tattgatgac gaatctaccc aagttctc 48 <210> 4 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LpxL reverse primer P2 <400> 4 cgctattatt ttttttcgtt tccattggta tatctccttc ttattaatag cgtgaaggaa 60 cgccttc 67 <210> 5 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli LpxM polypeptide <400> 5 Met Glu Thr Lys Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Phe Asp Lys 1 5 10 15 Ser Phe Arg His Pro Arg Tyr Trp Gly Ala Trp Leu Gly Val Ala Ala 20 25 30 Met Ala Gly Ile Ala Leu Thr Pro Pro Lys Phe Arg Asp Pro Ile Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Arg Phe Ala Gly Arg Leu Gly Lys Ser Ser Arg Arg 50 55 60 Arg Ala Leu Ile Asn Leu Ser Leu Cys Phe Pro Glu Arg Ser Glu Ala 65 70 75 80 Glu Arg Glu Ala Ile Val Asp Glu Met Phe Ala Thr Ala Pro Gln Ala 85 90 95 Met Ala Met Met Ala Glu Leu Ala Ile Arg Gly Pro Glu Lys Ile Gln 100 105 110 Pro Arg Val Asp Trp Gln Gly Leu Glu Ile Ile Glu Glu Met Arg Arg 115 120 125 Asn Asn Glu Lys Val Ile Phe Leu Val Pro His Gly Trp Ala Val Asp 130 135 140 Ile Pro Ala Met Leu Met Ala Ser Gln Gly Gln Lys Met Ala Ala Met 145 150 155 160 Phe His Asn Gln Gly Asn Pro Val Phe Asp Tyr Val Trp Asn Thr Val 165 170 175 Arg Arg Arg Phe Gly Gly Arg Leu His Ala Arg Asn Asp Gly Ile Lys 180 185 190 Pro Phe Ile Gln Ser Val Arg Gln Gly Tyr Trp Gly Tyr Tyr Leu Pro 195 200 205 Asp Gln Asp His Gly Pro Glu His Ser Glu Phe Val Asp Phe Phe Ala 210 215 220 Thr Tyr Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Leu Met Lys Val Cys 225 230 235 240 Arg Ala Arg Val Val Pro Leu Phe Pro Ile Tyr Asp Gly Lys Thr His 245 250 255 Arg Leu Thr Ile Gln Val Arg Pro Pro Met Asp Asp Leu Leu Glu Ala 260 265 270 Asp Asp His Thr Ile Ala Arg Arg Met Asn Glu Glu Val Glu Ile Phe 275 280 285 Val Gly Pro Arg Pro Glu Gln Tyr Thr Trp Ile Leu Lys Leu Leu Lys 290 295 300 Thr Arg Lys Pro Gly Glu Ile Gln Pro Tyr Lys Arg Lys Asp Leu Tyr 305 310 315 320 Pro Ile Lys <210> 6 <211> 972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Escherichia coli LpxM polypeptide <400> 6 atggaaacga aaaaaaataa tagcgaatac attcctgagt ttgataaatc ctttcgccac 60 ccgcgctact ggggagcatg gctgggcgta gcagcgatgg cgggtatcgc tttaacgccg 120 ccaaagttcc gtgatcccat tctggcacgg ctgggacgtt ttgccggacg actgggaaaa 180 agctcacgcc gtcgtgcgtt aatcaatctg tcgctctgct ttccagaacg tagtgaagct 240 gaacgcgaag cgattgttga tgagatgttt gccaccgcgc cgcaagcgat ggcaatgatg 300 gctgagttgg caatacgcgg gccggagaaa attcagccgc gcgttgactg gcaagggctg 360 gagatcatcg aagagatgcg gcgtaataac gagaaagtta tctttctggt gccgcacggt 420 tgggccgtcg atattcctgc catgctgatg gcctcgcaag ggcagaaaat ggcagcgatg 480 ttccataatc agggcaaccc ggtttttgat tatgtctgga acacggtgcg tcgtcgcttt 540 ggcggtcgtc tgcatgcgag aaatgacggt attaaaccat tcatccagtc ggtacgtcag 600 gggtactggg gatattattt acccgatcag gatcatggcc cagagcacag cgaatttgtg 660 gatttctttg ccacctataa agcgacgttg cccgcgattg gtcgtttgat gaaagtgtgc 720 cgtgcgcgcg ttgtaccgct gtttccgatt tatgatggca agacgcatcg tctgacgatt 780 caggtgcgcc caccgatgga tgatctgtta gaggcggatg atcatacgat tgcgcggcgg 840 atgaatgaag aagtcgagat ttttgttggt ccgcgaccag aacaatacac ctggatacta 900 aaattgctga aaactcgcaa accgggcgaa atccagccgt ataagcgcaa agatctttat 960 cccatcaaat aa 972 <210> 7 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LpxM forward primer P3 <400> 7 gaaggcgttc cttcacgcta ttaataagaa ggagatatac caatggaaac gaaaaaaaat 60 aatagcg 67 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LpxM reverse primer P3 <400> 8 gcagaagctt ttatttgatg ggataaagat ctttgcg 37 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL promoter nucleotide sequence <400> 9 ttgacataaa taccactggc ggtgatact 29 <210> 10 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer amplifying PL promoter <400> 10 ggcagtgagc gcaacgcaga attcttgaca taaataccac tggcggtgat actttcacac 60 aggaaacagc tatgacc 77 <210> 11 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer amplifying PL promoter <400> 11 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaagtatc accgccagtg gtatttatgt caagaattct 60 gcgttgcgct cactgcc 77 <210> 12 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Helicobactor pylori LpxE mutant <400> 12 Met Lys Lys Phe Leu Phe Lys Gln Lys Phe Cys Glu Ser Leu Pro Lys 1 5 10 15 Ser Phe Ser Lys Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ile Leu Leu 20 25 30 Gly Ile Phe Ala Pro Phe Pro Lys Val Pro Lys Gln Pro Ser Val Pro 35 40 45 Leu Met Phe His Phe Thr Glu His Tyr Ala Arg Phe Ile Pro Thr Ile 50 55 60 Leu Ser Val Ala Ile Pro Leu Ile Gln Arg Asp Ala Val Gly Leu Phe 65 70 75 80 Gln Val Ala Asn Ala Ser Ile Ala Thr Thr Leu Leu Thr His Thr Thr 85 90 95 Lys Arg Ala Leu Asn His Val Thr Ile Asn Asp Gln Arg Leu Gly Glu 100 105 110 Arg Pro Tyr Gly Gly Asn Phe Asn Met Pro Ser Gly His Ser Ser Met 115 120 125 Val Gly Leu Ala Val Ala Phe Leu Met Arg Arg Tyr Ser Phe Lys Lys 130 135 140 Tyr Phe Trp Leu Leu Pro Leu Val Pro Leu Thr Met Leu Ala Arg Ile 145 150 155 160 Tyr Leu Asp Met His Thr Ile Gly Ala Val Leu Thr Gly Leu Gly Val 165 170 175 Gly Met Leu Cys Val Ser Leu Phe Thr Ser Pro Lys Lys Pro 180 185 190 <210> 13 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleodide encoding Helicobactor pylori LpxE mutant <400> 13 atgaaaaaat tcttatttaa acaaaaattt tgtgaaagcc tgcccaaatc gttttctaaa 60 actttgttag cgctcagttt gggcttgatt ttattaggca tttttgcgcc tttccctaaa 120 gtccctaaac agcctagcgt gcctttaatg tttcatttca ccgagcatta tgcgcgcttt 180 atccctacga ttttatctgt ggcgattccc ttaatccaaa gagatgcggt agggcttttt 240 caagtcgcta acgcttctat cgctacaacc cttctcacgc acaccaccaa aagagcctta 300 aaccatgtaa caatcaacga tcagcgtttg ggcgagcgcc cttatggagg taatttcaac 360 atgccaagcg ggcattcgtc tatggtgggt ttggcggtgg cgtttttaat gcgccgctat 420 tcttttaaaa aatacttttg gctcttgccc ctagtccctt tgaccatgct cgctcgcatt 480 tatttagaca tgcacaccat tggcgcggtg ctgaccgggc ttggcgttgg aatgttgtgc 540 gtaagccttt ttacaagccc caaaaagcct taa 573 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying HpLpxE mutant <400> 14 gatcctctag aaaggagata tattgatgaa aaaattctta tttaaacaaa aattt 55 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Helicobactor pylori LpxE mutant <400> 15 agctacaagc ttttaaggct ttttggggc 29 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying frt-kan-frt <400> 16 gcagaagctt gtgtaggctg gagctgcttc 30 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying frt-kan-frt <400> 17 gcagaagctt atgaatatcc tccttagttc ctat 34 <210> 18 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli LpxT polypeptide <400> 18 Met Ile Lys Asn Leu Pro Gln Ile Val Leu Leu Asn Ile Val Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Phe Leu Ser Trp Tyr Ile Pro Val Asn His Gly Phe Trp Leu 20 25 30 Pro Ile Asp Ala Asp Ile Phe Tyr Phe Phe Asn Gln Lys Leu Val Glu 35 40 45 Ser Lys Ala Phe Leu Trp Leu Val Ala Leu Thr Asn Asn Arg Ala Phe 50 55 60 Asp Gly Cys Ser Leu Leu Ala Met Gly Met Leu Met Leu Ser Phe Trp 65 70 75 80 Leu Lys Glu Asn Ala Pro Gly Arg Arg Arg Ile Val Ile Ile Gly Leu 85 90 95 Val Met Leu Leu Thr Ala Val Val Leu Asn Gln Leu Gly Gln Ala Leu 100 105 110 Ile Pro Val Lys Arg Ala Ser Pro Thr Leu Thr Phe Thr Asp Ile Asn 115 120 125 Arg Val Ser Glu Leu Leu Ser Val Pro Thr Lys Asp Ala Ser Arg Asp 130 135 140 Ser Phe Pro Gly Asp His Gly Met Met Leu Leu Ile Phe Ser Ala Phe 145 150 155 160 Met Trp Arg Tyr Phe Gly Lys Val Ala Gly Leu Ile Ala Leu Ile Ile 165 170 175 Phe Val Val Phe Ala Phe Pro Arg Val Met Ile Gly Ala His Trp Phe 180 185 190 Thr Asp Ile Ile Val Gly Ser Met Thr Val Ile Leu Ile Gly Leu Pro 195 200 205 Trp Val Leu Leu Thr Pro Leu Ser Asp Arg Leu Ile Thr Phe Phe Asp 210 215 220 Lys Ser Leu Pro Gly Lys Asn Lys His Phe Gln Asn Lys 225 230 235 <210> 19 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Escherichia coli LpxT polypeptide <400> 19 atgattaaaa atttgccgca aatagtgttg ttgaatattg tcggcctcgc gctgtttctt 60 tcctggtata tccccgttaa tcatggattc tggttgccga ttgatgcgga tattttttat 120 ttctttaatc agaaactggt cgaaagtaag gcctttttgt ggctggttgc attgaccaac 180 aatcgcgcct tcgacggttg ttcactgctg gcgatgggta tgttgatgct gagtttctgg 240 ctgaaagaaa acgcccctgg cagacgacgt atcgtgatta ttggtctggt catgctatta 300 actgcagtgg tattaaacca gctgggtcag gcattaattc ctgtaaaacg ggccagccca 360 acattgactt ttaccgatat taaccgcgtc agcgaactgc tctctgttcc cacgaaagat 420 gcctcacgag atagctttcc cggcgatcac ggcatgatgc tgcttatttt ttcggcattc 480 atgtggcgtt atttcggcaa agttgcaggc cttatcgccc ttattatttt tgtggttttt 540 gcatttccca gagtaatgat tggcgcacac tggtttactg acatcattgt cggttcgatg 600 accgtgatat tgatcggttt gccctgggtg ttgctgacgc cattaagtga tcgattaatc 660 accttttttg acaaatcact accaggaaaa aacaaacatt tccaaaacaa ataa 714 <210> 20 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer amplifying bacA::HpLpxE-frt-kan-frt <400> 20 aacctggtca tacgcagtag ttcggacaag cggtacattt taataattta ggggtttatt 60 gatgaaaaaa ttcttattta aacaaaaat 89 <210> 21 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer amplifying bacA::HpLpxE-frt-kan-frt <400> 21 tgacaacgcc aagcatccga cactattcct caattaaaag aacacgacat acaccgcagc 60 cgccacatga atatcctcct tagttccta 89 <210> 22 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli KdtA polypeptide <400> 22 Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu 1 5 10 15 Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg 20 25 30 Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro 35 40 45 Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala 50 55 60 Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile 65 70 75 80 Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala 85 90 95 Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp 100 105 110 Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile 115 120 125 Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg 130 135 140 Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala 145 150 155 160 Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg 165 170 175 Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val 180 185 190 Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys 195 200 205 Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu 210 215 220 Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr 225 230 235 240 His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu 245 250 255 Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu 260 265 270 Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr 275 280 285 Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val 290 295 300 Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp 305 310 315 320 Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro 325 330 335 Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr 340 345 350 Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu 355 360 365 Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu 370 375 380 Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu 385 390 395 400 Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu 405 410 415 Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His 420 425 <210> 23 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Escherichia coli KdtA polypeptide <400> 23 atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60 ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120 ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180 actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240 accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300 gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360 gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420 ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480 gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540 gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600 gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660 gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720 cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780 aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840 gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900 acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960 ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020 gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080 cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140 gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200 gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260 ccaccgaaaa cgcattga 1278 <210> 24 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer amplifying kdtA::frt-kan-frt <400> 24 gctaaataca tagaatcccc agcacatcca taagtcagct atttactatg ctcgaattgc 60 gtgtaggctg gagctgcttc 80 <210> 25 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer amplifying kdtA::frt-kan-frt <400> 25 atcgatatga ccattggtaa tgggatcgaa agtacccgga taaatcgccc gtttttgcat 60 tgaatatcct ccttagttcc tattcc 86

Claims (16)

  1. 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 구성적으로(constitutively) 생산하는 세균으로서,
    LpxE 폴리펩티드를 포함하고,
    상기 세균의 염색체에서 운데카프레닐 피로포스페이트 포스파타제(undecaprenyl pyrophosphate phosphatase: Und-PP 포스파타제)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 포스파티딜글리세로포스페이트 포스파타제(phosphatidylglycerophosphate phosphatase: PGP 포스파타제)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 돌연변이된 세균.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 MLA는 1-탈인산-지질 A, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 세균.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 LpxE 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 세균의 염색체에 존재하는 것인 세균.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 Und-PP 포스파타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 bacA 유전자, pgpB 유전자, ybjG 유전자, 또는 이들의 조합인 것인 세균.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 PGP 포스파타제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pgpB 유전자, pgpA 유전자, pgpC 유전자, 또는 이들의 조합인 것인 세균.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 bacA 유전자, pgpB 유전자, 및 ybjG 유전자가 돌연변이된 것인 세균.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이는 결실(deletion), 삽입(insertion), 점 돌연변이(point mutation), 격자 이동 돌연변이(frame shift mutation), 또는 이들의 조합인 것인 세균.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 점 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이인 것인 세균.
  9. 청구항 1에 있어서, LpxL 폴리펩티드 및 LpxM 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 세균.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 유도성(inducible) 또는 구성적(constitutive)으로 발현되는 것인 세균.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 PL 프로모터, PR 프로모터, 및 PR' 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 의해 발현되는 것인 세균.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 LpxT 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, PagP 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, KdtA 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이 더 돌연변이된 것인 세균.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 세균은 발현 유도제, 발현 유도 자극, 또는 이들의 조합에 의한 발현 유도 없이 MLA를 생산하는 것인 세균.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 발현 유도제는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside: IPTG)인 것인 세균.
  15. 청구항 1의 세균을 배양하는 단계;
    배양물로부터 세균을 수득하는 단계; 및
    수득된 세균으로부터 MLA를 수득하는 단계를 포함하는, MLA의 생산 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 세균을 배양하는 단계는 발현 유도제, 발현 유도 자극, 또는 이들의 조합 없이 배양하는 것인 방법.
KR1020170085406A 2017-07-05 2017-07-05 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법 KR102019331B1 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170085406A KR102019331B1 (ko) 2017-07-05 2017-07-05 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법
RU2020100484A RU2751357C1 (ru) 2017-07-05 2018-07-03 Бактерия, конститутивно продуцирующая монофосфориллипид А, и способ получения монофосфориллипида А с использованием бактерии
AU2018296934A AU2018296934B2 (en) 2017-07-05 2018-07-03 Bacterium constitutively producing monophosphoryl lipid A and method of producing monophosphoryl lipid A by using bacterium
CN201880045296.5A CN111492058B (zh) 2017-07-05 2018-07-03 组成性产生单磷酰脂质a的细菌和利用细菌产生单磷酰脂质a的方法
JP2019571208A JP6980041B2 (ja) 2017-07-05 2018-07-03 モノホスホリル脂質ａを構成的に生産する細菌、及び細菌を利用したモノホスホリル脂質ａ生産方法
EP18828686.8A EP3649244A4 (en) 2017-07-05 2018-07-03 BACTERIA CONSTITUTIOUSLY PRODUCING A MONOPHOSPHORYL LIPID A AND PROCESS FOR PRODUCING A MONOPHOSPHORYL LIPID A USING THE BACTERIA
US16/026,796 US10557156B2 (en) 2017-07-05 2018-07-03 Bacterium constitutively producing monophosphoryl lipid A and method of producing monophosphoryl lipid A by using bacterium
PCT/KR2018/007526 WO2019009593A2 (en) 2017-07-05 2018-07-03 BACTERIUM PRODUCING COMPONENTLY A MONOPHOSPHORYLATED LIPID A AND METHOD FOR PRODUCING A MONOPHOSPHORYLATED LIPID USING THE BACTERIUM
CA3068998A CA3068998C (en) 2017-07-05 2018-07-03 Bacterium constitutively producing monophosphoryl lipid a and method of producing monophosphoryl lipid a by using bacterium

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170085406A KR102019331B1 (ko) 2017-07-05 2017-07-05 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190004966A KR20190004966A (ko) 2019-01-15
KR102019331B1 true KR102019331B1 (ko) 2019-09-09

Family

ID=64903817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170085406A KR102019331B1 (ko) 2017-07-05 2017-07-05 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10557156B2 (ko)
EP (1) EP3649244A4 (ko)
JP (1) JP6980041B2 (ko)
KR (1) KR102019331B1 (ko)
CN (1) CN111492058B (ko)
AU (1) AU2018296934B2 (ko)
CA (1) CA3068998C (ko)
RU (1) RU2751357C1 (ko)
WO (1) WO2019009593A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022055176A1 (ko) 2020-09-11 2022-03-17 주식회사 유바이오로직스 수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법
KR20240066996A (ko) 2022-11-03 2024-05-16 주식회사 유바이오로직스 호흡기세포융합바이러스 백신 조성물

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017266929B2 (en) 2016-05-18 2023-05-11 Modernatx, Inc. Combinations of mRNAs encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
US20220259633A1 (en) * 2019-08-29 2022-08-18 Eubiologics Co., Ltd. Method for producing monophosphoryl lipid a
CN117106836B (zh) * 2023-10-25 2024-02-06 北京量维生物科技研究院有限公司 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030031684A1 (en) * 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
WO2013130779A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Synthetic lipid biology for combinatorial engineering of endotoxin
KR101694941B1 (ko) * 2014-09-04 2017-01-10 한국과학기술연구원 모노포스포릴 지질 a를 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 a 생산 방법
KR101761348B1 (ko) * 2016-01-06 2017-07-26 한국과학기술연구원 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a를 생산하는 세균, 및 이를 이용한 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a 생산 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, JIUZHOU et al., 'Construction of an Escherichia coli mutant producing monophosphoryl lipid A', Biotechnology Letters, 2011, Vol.33, No.5, pp.1013-1019

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022055176A1 (ko) 2020-09-11 2022-03-17 주식회사 유바이오로직스 수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법
KR20240066996A (ko) 2022-11-03 2024-05-16 주식회사 유바이오로직스 호흡기세포융합바이러스 백신 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CA3068998C (en) 2023-01-17
CN111492058A (zh) 2020-08-04
CN111492058B (zh) 2024-03-05
EP3649244A2 (en) 2020-05-13
AU2018296934B2 (en) 2021-07-29
CA3068998A1 (en) 2019-01-10
AU2018296934A1 (en) 2020-02-20
JP6980041B2 (ja) 2021-12-15
RU2751357C1 (ru) 2021-07-13
US20190010528A1 (en) 2019-01-10
US10557156B2 (en) 2020-02-11
KR20190004966A (ko) 2019-01-15
WO2019009593A2 (en) 2019-01-10
WO2019009593A3 (en) 2019-04-11
JP2020524520A (ja) 2020-08-20
EP3649244A4 (en) 2021-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102019331B1 (ko) 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법
KR20200027496A (ko) 푸코실트랜스퍼라제 및 푸코실화된 올리고사카라이드의 제조에서 그의 용도
JP4567887B2 (ja) グルコサミンを製造するためのプロセス及び物質
KR101761348B1 (ko) 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a를 생산하는 세균, 및 이를 이용한 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a 생산 방법
KR20230104755A (ko) 시알일화 화합물의 인 비보 합성
KR20220114632A (ko) 숙주 세포에서 시알릴화 올리고당의 생산
JP5977678B2 (ja) Ｔｌｒ４／ｍｄ−２の外膜アゴニストを欠く生存可能なグラム陰性細菌
Mao et al. Sinorhizobium meliloti functionally replaces 3-oxoacyl-acyl carrier protein reductase (FabG) by overexpressing NodG during fatty acid synthesis
Zhou et al. Identification of four secondary acyltransferases for lipid A biosynthesis in Vibrio parahaemolyticus
KR101694941B1 (ko) 모노포스포릴 지질 a를 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 a 생산 방법
Hugouvieux-Cotte-Pattat et al. PehN, a polygalacturonase homologue with a low hydrolase activity, is coregulated with the other Erwinia chrysanthemi polygalacturonases
Zhao et al. Construction of a novel Escherichia coli expression system: relocation of lpxA from chromosome to a constitutive expression vector
KR101718508B1 (ko) 2-데옥시-실로-이노소스 생합성 경로를 가지는 재조합 고초균 및 이를 이용한 2-데옥시-실로-이노소스의 제조방법
KR20210027132A (ko) 모노포스포릴 지질 ａ를 생산하는 방법
US20220259633A1 (en) Method for producing monophosphoryl lipid a
KR102070415B1 (ko) 신규한 알파-아가레이즈 및 이를 이용한 한천 유래 홀수 개의 올리고당 생산 방법
Tu et al. Red/ET recombineering enhances extracellular lipase production by Burkholderia glumae
Jaeger Metabolism and Recycling of N-Acetylmuramic Acid in Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant